A deprivação maternal é conhecida por promover alterações neuroquímicas, comportamentais e da estrutura cerebral que persistem ao longo da vida. Aqui investigamos se os déficits cognitivos em ratos deprivados podem ser relacionados com uma disfunção no sistema colinérgico e na síntese de proteínas relacionadas aos processos mnemônicos. Ratas Wistar prenhas foram colocadas em caixas individuais e mantidas no biotério no ciclo claro/escuro (12:12 horas) com comida e água a vontade. Após o parto, as mães foram separadas dos seus filhotes por 3 horas, por dia, a partir do dia 1 pós-parto (PND-1) até o PND-10. Para fazer isto, as mães foram removidas das caixas residência e colocadas em uma caixa diferente, enquanto os filhotes permaneceram na caixa original, a qual foi transferida para outra sala mantida a temperatura de 32°C. Quando adultos com 120-150 d ias de idade, os animais machos deprivados e não deprivados foram divididos em duas etapas experimentais: 1) Foram sacrificados para medirmos a acetilcolinesterase (AchE) ou treinados no reconhecimento de objetos e no reconhecimento social, ou 2) Foram treinados e testados na esquiva inibitória e no Morris water maze ou foram treinados e sacrificados para mensurarmos o fator de transcrição CREB e a síntese das proteínas ERK1/2 após o treinamento em 3 diferentes tempos. Na primeira etapa, a deprivação maternal repetida afeta a memória no reconhecimento de objetos e no reconhecimento social. Além disso, ratos deprivados mostraram aumento na atividade da AchE no hipocampo e no córtex perirrinal. A administração oral de inibidores da AchE donepezil ou galantamina (1mg/kg) 30 min antes da sessão de treino reverteu os prejuízos na memória causados pela deprivação maternal. Na segunda etapa, mostramos que a deprivação maternal repetida também afeta a memória aversiva e espacial. Os animais treinados na esquiva inibitória mostraram déficits cognitivos quando testados na memória de curta (2 horas) e de longa duração (24 horas) após o treino. Além disso, a análise densitométrica das proteínas revelou que ratos deprivados treinados na esquiva não aumentaram a fosforilação de CREB e ERK1/2 após o treino. Da mesma forma, ratos deprivados não foram hábeis em reter o aprendizado reverso no labirinto aquático de Morris, mas aqui, os déficits cognitivos podem ser relacionados com o menor aumento da fosforilação do CREB e da ERK1/2 somente 2 horas após o treino no aprendizado reverso. Esses dados sugerem que a deprivação materna afeta os processos mnemônicos em ratos adultos, e que estes prejuízos podem ser mediados por modificações no sistema colinérgico ou na síntese de proteínas. / Maternal deprivation is known to result in long-lasting neurochemical, behavioral and brain structural effects. Here we investigated whether the cognitive aspects of these deficits might be related to a disruption of the cholinergic system and protein synthesis correlated with mnemonic process. Pregnant Wistar rats were individually housed and maintained on a 12:12 h light/dark cycle with food and water freely available. The mothers were separated from their pups for 3 h per day from postnatal day 1 (PND-1) to PND- 10. To do that, the dams were moved to a different cage and the pups maintained in the original home cage, which was transferred to a different room kept at 32ºC. After they reached 120-150 days of age, maternal-deprived and non-deprived male rats were either sacrificed for brain acetylcholinesterase (AchE) and protein (CREB and ERK1/2) measurement, or trained in an object recognition, social recognition, inhibitory avoidance and Morris water maze tasks and divided in two sets of experiments: 1) Complete repeated maternal deprivation affects recognition and social memory and there was increased acetylcholinesterase activity in hippocampus and perirhinal cortex of the deprived rats. Oral administration of the acetylcholinesterase inhibitors, donepezil or galantamine (1mg/kg) 30 min before training session reversed the memory impairments caused by maternal deprivation. 2) Complete maternal deprivation also affects aversive and spatial memory. These animals showed memory deficits in STM and LTM in inhibitory avoidance. Furthermore, densitometric analysis of proteins revealed that deprived rats did not increase the phosphorylation of ERK and CREB after training. Similarly, deprived rats did not able to retain the reversed learning in the Morris water maze but here, the cognitive deficit can be related with the increase in the protein phosphorylation measurement only 2 hours after training in reversed learning compared to non deprived rats. That findings suggest that maternal deprivation affects memory processing at adulthood and that this impairment can be mediated by modification of the cholinergic system or in the protein synthesis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:38:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 321926.pdf: 5018655 bytes, checksum: 99c33611d4b6e07eb4220bbf382d48cd (MD5) Previous issue date: 2013 / Evidências acumuladas ao longo das duas últimas décadas sugerem umaassociação positiva entre a hipercolesterolemia e o desenvolvimento dadoença de Alzheimer esporádica. Estudos prospectivos demonstraramque esta relação parece ser idade-dependente, sendo ahipercolesterolemia um possível fator de risco para o desenvolvimentoda doença de Alzheimer décadas após. A hipercolesterolemia familiar éuma doença genética do metabolismo das lipoproteínas cujo modo deherança é autossômico codominante e que se caracteriza por níveismuito elevados de colesterol plasmático. O fenótipo clínico dehipercolesterolemia familiar é geralmente decorrente de defeitos no geneLDLR, que codifica o receptor de lipoproteínas de baixa densidade(LDL). Recentemente, um estudo prospectivo demonstrou que pacientescom hipercolesterolemia familiar de meia-idade apresentam umaelevada incidência de comprometimento cognitivo leve em comparaçãoa indivíduos sem hipercolesterolemia familiar. Neste contexto, acaracterização do comprometimento cognitivo leve em modelosexperimentais de hipercolesterolemia familiar torna-se imperativa,visando tanto o desenvolvimento de abordagens terapêuticas epreventivas, quanto o entendimento de mecanismos molecularesresponsáveis pelo declínio cognitivo associado com ahipercolesterolemia. Os resultados desta tese demonstram quecamundongos nocaute para o receptor de LDL (LDLr-/-) de quatorzemeses (?meia-idade?), um modelo experimental de hipercolesterolemiafamiliar, apresentaram prejuízos cognitivos em testes de memóriaoperacional, de referência espacial e de procedimento. Também foiobservado um desequilíbrio no sistema antioxidante dependente daglutationa (GSH) e um aumento na atividade da enzimaacetilcolinesterase (AChE) no córtex pré-frontal dos camundongosLDLR-/- de ?meia-idade?. O fármaco hipolipemiante probucol e oexercício físico voluntário (rodas de correr) diminuíram de modosignificativo os níveis de colesterol plasmático de camundongos LDLr-/-,todavia, apenas o exercício físico voluntário foi capaz de atenuar osprejuízos cognitivos dos camundongos LDLr-/-. Por outro lado, aexposição a uma dieta hipercolesterolêmica (1,25 % de colesterol) pordois meses também induziu déficits cognitivos em camundongos Swiss,bem como aumentou significativamente a atividade da enzima AChE nocórtex pré-frontal e hipocampo. De modo interessante, a exposição decélulas de neuroblastoma humano da linhagem SH-5Y6Y à LDLtambém induziu um aumento na atividade da enzima AChE. Ademais,foi demonstrado que camundongos LDLr-/- parecem apresentar umamaior susceptibilidade a insultos neurotóxicos, como à neurotoxicidadeinduzida pela exposição crônica ao metilmercúrio (MeHg). Emconjunto, os achados do presente estudo caracterizam principalmente apresença de comprometimento cognitivo leve em camundongos LDLr-/-de ?meia-idade?, tal como observado em pacientes comhipercolesterolemia familiar de meia-idade. Os resultados deste estudoencorajam estudos adicionais para investigar o valor terapêutico doexercício físico regular no controle do comprometimento cognitivo leveem pacientes com hipercolesterolemia familiar, bem como a associaçãode fármacos hipolipemiantes com inibidores da enzima AChE notratamento da doença de Alzheimer. <br> / Abstract : Accumulating evidence over the past decades compellingly argues thatpeople with high serum cholesterol concentration in midlife have asignificantly higher risk of Alzheimer?s disease (AD) in later life.Familial hypercholesterolemia (FH) is an inherited metabolic disordercharacterized by high levels of plasma low density lipoproteins (LDL).FH remains the most common monogenic disorder of lipoproteinmetabolism, and it is mainly due to mutations in the LDL receptor(LDLr) gene that leads to the plasma accumulation of cholesterol esterladenLDL particles. It was recently showed that middle age patientswith FH show a particularly high incidence of mild cognitiveimpairments (MCI). Thus, the characterization of MCI in experimentalmodels of FH aimed at developing therapeutic and preventiveapproaches for the cognitive decline associated withhypercholesterolemia is imperative. The results presented herein showthat middle-aged low-density lipoprotein receptor-deficient (LDLr-/-)mice, an experimental model of FH, exhibit working, spatial reference,and procedural memory impairments, which were associated with theoccurrence of antioxidant imbalance, oxidative damage, and putativedecrease of cholinergic signaling in the prefrontal cortex. The lipidloweringdrug probucol and physical exercise (voluntary running wheel)similarly decreased total plasma cholesterol levels in LDLr-/- mice,however, only physical exercise mitigated the spatial memory deficits ofLDLr-/- mice. Moreover, mild hypercholesterolemia was modeled inSwiss mice (high fat/cholesterol diet) in order to evaluate primarybiochemical events linked to hypercholesterolemia-induced cognitiveimpairments. An impaired short-term object location memory wasobserved in hypercholesterolemic mice, which was associated with anincreased acetylcholinesterase (AChE) activity within the prefrontalcortex and hippocampus. Notably, LDL cholesterol significantlyincreased in a dose-dependent manner the activity of AChE in SHSY5Yhuman neuroblastoma cells. Finally, hypercholesterolemic LDLr-/- mice were more susceptible to methylmercury (MeHg)-inducedcerebellar glial activation, suggesting that hypercholesterolemia in itselfmay pose a risk factor in MeHg-induced neurotoxicity. Overall, thisstudy corroborated previous clinical data regarding the observation ofMCI in FH patients. The present findings may have importantimplications, since they provide an opportunity for clinical interventionssuch as control of vascular risk factors that minimize, arrest, or evenreverse cognitive deterioration.

Considerando que a deficiência hormonal causada pela ovariectomia promove alterações nas atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, acetilcolinesterase (AChE) e ectonucleotidases e pode prejudicar a memória em ratas, no presente trabalho nós investigamos a influência do exercício físico sobre a ativação da Na+,K+-ATPase e acetilcolinesterase em hipocampo e córtex cerebral causada pela ovariectomia em ratas adultas, bem como sobre a hidrólise de nucleotídeos de adenosina no córtex cerebral e no soro. Também investigamos o efeito do exercício sobre a memória espacial e aversiva em ratas adultas ovariectomizadas. Ratas Wistar adultas foram divididas em quatro grupos: sham (submetidas à cirurgia sem a remoção dos ovários), exercício, ovariectomizadas (Ovx) e Ovx+exercício. Trinta dias após a cirurgia, os animais foram submetidos a um mês de exercício físico por 20 min, três vezes por semana. Logo após, as ratas foram decapitados, o soro coletado e o hipocampo e córtex cerebral dissecados, ou foram submetidas às tarefas de esquiva inibitória e labirinto aquático de Morris. Os dados demonstraram que o exercício físico reverte a ativação das atividades da Na+,K+-ATPase e AChE em hipocampo e córtex cerebral de ratas ovariectomizadas. A ovariectomia diminuiu a hidrólise de AMP no córtex cerebral e não alterou a hidrólise de nucleotídeos de adenosina sérica. Exercício per se diminuiu a hidrólise de ADP e AMP em córtex cerebral. Resultados também mostraram que ratas ovariectomizadas apresentaram prejuízo na memória aversiva e espacial (memória de referência e de trabalho), quando comparadas ao grupo controle (sham). Confirmando nossa hipótese, o déficit na memória foi revertido pelo exercício físico. Nossos achados mostram que a ovariectomia prejudica significativamente a memória/aprendizado aversiva e espacial e altera as enzimas Na+,K+-ATPase e AChE, e que o exercício físico preveniu tais efeitos. Esses dados sugerem que o exercício físico pode se mostrar uma estratégia importante para minimizar déficits cognitivos encontrados em mulheres pósmenopáusicas. / Hormone deficiency following ovariectomy causes activation of Na+,K+- ATPase and acetylcholinesterase (AChE), that has been related to cognitive deficits in experimental animals, and memory impairment. Considering that physical exercise presents neuroprotector effects, we decide to investigate whether exercise training would affect enzyme activation in hippocampus and cerebral cortex, as well as adenosine nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of ovariectomized rats, and ovariectomy-induced memory deficits in inhibitory avoidance and Morris water maze tasks. Female adult Wistar rats were assigned to one of the following groups: sham (submitted to surgery without removal of the ovaries), exercise, ovariectomized (Ovx) and Ovx plus exercise. Thirty days after surgery, animals were submitted to one month of exercise training for 20 min, three times per week. After, rats were euthanized, blood serum was collected and hippocampus and cerebral cortex were dissected, or rats were tested in inhibitory avoidance and Morris water maze tasks. Data demonstrated that exercise reversed the activation of Na+,K+-ATPase and AChE activities both in hippocampus and cerebral cortex of ovariectomized rats. Ovariectomy decreased AMP hydrolysis in cerebral cortex and did not alter adenosine nucleotides hydrolysis in blood serum. Exercise per se decreased ADP and AMP hydrolysis in cerebral cortex. On the other hand, AMP hydrolysis in blood serum was increased by exercise in ovariectomized adult rats. Results also show that ovariectomized rats presented impairment in aversive memory and spatial navigation, both in reference and working memory protocols, when compared to sham group (control). Confirming our hypothesis, ovariectomized rats submitted to exercise had those impairments prevented. We conclude that ovariectomy significantly impairs aversive and spatial reference learning/memory and related enzymes, and that physical exercise prevents such effects. These findings support that physical exercise might constitute an important strategy to minimize cognitive deficits found in postmenopausal women.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:45:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:50:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000003.pdf: 911776 bytes, checksum: 157643f210a8dc4b9b4da249344c2332 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Os testes de triagem por serem sensíveis, específicos, rápidos e de baixo custo, vêm sendo largamente utilizados no monitoramento de contaminantes químicos, como os agrotóxicos, visando à prevenção de riscos para a saúde humana. Estes tipos de testes têm sido aplicados no monitoramento de um grande número de amostras, permitindo que a análise cromatográfica seja realizada apenas em amostras potencialmente não-conformes, o que reduz substancialmente o custo. O leite bovino é um alimento essencial na dieta do ser humano e, especialmente, de crianças e são poucos os trabalhos de monitoramento de resíduos de agrotóxicos, neste tipo de alimento, realizados no Brasil. O aparecimento de resíduos de agrotóxicos no leite pode ocorrer pelo uso de rações e pastagens contaminadas, ou pelo tratamento, com agrotóxicos, especialmente alguns organofosforados, contra ectoparasitas que atacam os animais. Desenvolveu-se um método de extração de resíduos de agrotóxicos organofosforados (OFs) em leite bovino para detecção qualitativa desta classe de substâncias através da inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) e posterior confirmação pela cromatografia gasosa (CG).Através das pesquisas realizadas estabeleceu-se um protocolo de extração dos agrotóxicos OFs de amostras de leite bovino para posterior detecção utilizando o kit enzimático e confirmação pela cromatografia em fase gasosa, bem como as condições ideais de análise usando o kit desenvolvido pelo Laboratório de Toxicologia Enzimática (ENZITOX) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ)

como animais de estimação. Entretanto, existem poucas informações sobre a fisiologia, inclusive do trato gastrointestinal (TGI) e as enfermidades a este associadas. O TGI destes animais é longo e apresenta complexidade similar a dos lagomorfos: ceco com uma porção sacular espiralada, seguida de uma porção tubular que se continua em um cólon ascendente longo. Estas características, em associação com o fornecimento de uma dieta rica em grãos e leguminosas, são condições que permitem o fácil acometimento de cólica timpânica (CT), que se caracteriza pela distensão acentuada da parede do ceco, devido ao acúmulo dos gases produzidos em excesso durante a digestão fermentativa. Considerando que o acometimento de uma enfermidade promova alterações morfológicas e funcionais do sistema nervoso entérico (SNE), o roedor C. lanigera foi utilizado para avaliar as alterações in situ da atividade das enzimas acetilcolinesterase (AChE) e diaforase da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH-d) dos neurônios do plexo mientérico (PM) em um modelo experimental de CT provocado por alteração da dieta. Após as duas semanas de timpanismo, um grupo de animais voltou a receber dieta balanceada por 20 dias associado a um antiinflamatório (cetoprofeno) no sprimeiros 5 dias do período de dieta normal. O timpanismo foi confirmado pela análise dos sintomas e por meio do teste de von Frey. Verificou-se maior sensibilidade abdominal nos animais do grupo timpânico e recuperado (dieta de indução até D18 e, após, a mesma dieta do grupo controle assossiada ao medicamento cetoprofeno) durante o período da doença (11° ao 18° dia após início da dieta alterada). O tratamento medicamentoso e normalização da dieta (D23), o grupo recuperado mostrou uma sensibilidade abdominal semelhante a do grupo controle. A necrópsia revelou um aumento de volume no ceco e cólon ascendente dos animais timpânicos e isquemia nas junções jejuno-ileal, ileocecal e no cólon ascendente, com infarto nos vasos sanguíneos mesentéricos ao longo do intestino. Nos animais recuperados não foi observado infarto nos vasos sanguíneos mesentéricos. O PM da C. lanigera normal constitui-se de uma extensa rede ganglionar de formato retangular e uniforme, cujos gânglios se dispõem no sentido dos feixes de fibras da camada muscular longitudinal e estão conectados entre si por ramos nervosos calibrosos. O PM divide-se em três redes distintas: o plexo primário (formado por gânglios médios e grandes e feixes de fibras nervosas de primeira ordem), secundário (constituído por gânglios pequenos e feixes de segunda ordem) e terciário (somente feixes de fibras de terceira ordem, que seguem paralelamente às fibras musculares longitudinais). Os gânglios possuem aspecto polimórfico em todas as porções analisadas do TGI. A CT resultou na distensão da parede visceral e, consequentemente, do plexo, tornando a rede menos densa, os gânglios alongados e as conexões mais finas entre as células adjacentes. 9Continua) O tratamento recuperou o aspecto controle do PM. As mensurações da área e do número de gânglios com atividade AChE obtida nos três grupos experimentais, mostrou um aumento significativo na área gânglionar total dos animais timpanizados em relação ao grupo controle. Não foi observada diferença significativa no número total de gânglios e nas médias das áreas dos xii diferentes tamanhos ganglionares entre os três grupos. Entretanto, no cólon ascendente houve uma diferença significativa entre o número de gânglios entre os grupos timpânico e recuperado. Os resultados permitem inferir que a CT provoca alteração no metabolismo colinérgico dos gânglios mientéricos. Os seis diferentes tipos morfológicos de neurônio, segundo classificação de Stach, mostraram atividade NADPH-d. O número de neurônios com atividade NADPH-d mostraram redução diferenciada entre as diferentes partes do intestino e de forma específica ara alguns dos seis tipos celulares Estas diferenças são discutidas de acordo com o papel fucional dos tipos neuronais propostos na literatura. De uma maneira geral, a diminuição da atividade NADPH-d dos tipos celulares propostos em outros animais como motoneurônios indicou que a CT afeta a principal função exercida pelo PM, de motilidade, especialmente das porções sacular do ceco e do cólon transverso. A diminuição do tipo neuronal II, considerado sensorial, afetado significativamente em todas as porções do cólon, coincide com a maior distensão observada neste na CT. As alterações observadas só não se mostraram reversíveis na porção sacular do ceco e no cólon ascendente, contudo foram reversíveis nas demais porções analisadas. / The chinchilla (Chinchilla lanigera) evokes great interest in fur commercialization and as pets. However, there are few informations about its physiology, especially the gastrointestinal tract (GIT) and its diseases. The GIT of these animals is long and has a complexity similar to lagomorphs: cecum with a coiled saccular portion, followed by a tubular portion which continues in a long ascending colon. These characteristics in association with a diet rich in grains and legumes facilitates the onset of tympanic colic (TC), which is characterized by marked distension of the cecum wall due to excessive accumulation of gases produced by fermentative digestion. Considering the onset of an illness can cause morphological and functional modifications of the enteric nervous system (ENS), the rodent C. lanigera was used to asses in situ modifications on the activity of the enzymes acetylcholinesterase (AChE) and diaphorase nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH-d) in myenteric plexus (MP) neurons, using an experimental model of TC induced by dietary alterations. After two weeks of receiving the tympanism-inducing diet, the same diet of the control group was given to the recovery group, along with an anti-inflammatory drug (ketoprofen) for five days. The tympanism was confirmed by symptom analyses and by the Von Frey test. The tympanic and recovery groups showed and increase of abdominal sensibility after the onset of the disease (between the 11th and 18th days of the period in which the tympanism-inducing diet was given). With the drug treatment and the re-establishment of the diet (at day 23) the recovery group showed an abdominal sensibility similar to the control group. The necropsy revealed an increase of the cecum and ascending colon volumes in the tympanic animals, in addition to ischemia in the jejunoileal and ileocecal junctions and in the ascending colon, with mesenteric blood vessels infarction. In the recovery animals mesenteric blood vessels infarction was not present. The MP of a healthy C. lanigera is formed by an extensive ganglionar network of rectangular and uniform shape, and the ganglia are arranged in the same direction of the fiber bundles of the longitudinal muscle layer and are connected to each other by thick nerve branches. The MP is divided in three distinct networks: the primary plexus (formed by medium and large ganglia and bundles of nerve fibers of the first order); the secondary plexus (formed by small ganglia and bundles of second order); and the tertiary plexus (only bundles of third order fibers, which run parallel to the longitudinal muscle fibers). The ganglia showed a polymorphic aspect in all analyzed portions of the GIT. The TC resulted in distension of the gut wall and, therefore, the plexus, making the network less dense, the ganglia elongated and thinner connections between adjacent cells. The treatment restored the aspect of the MP to normal. Measurements of area and number of ganglia obtained with AChE activity in the three experimental groups revealed a significant increase in total ganglia area in the tympanic animals compared to the control group. There was no significant difference in the total number of ganglia and the mean of the areas of different ganglia sizes between the three groups. However, in the ascending colon there was a significant difference between the number of ganglia of the tympanic and recovery groups. These results demonstrate that the TC alters the cholinergic metabolism of myenteric ganglia. The six different morphological types of neurons, xiv according to Stach’s classification, had NADPH-d activity. The neurons with NADPH-d activity showed a differential reduction between different intestinal portions and between the six cell types. These differences are discussed according with the functional role of the neuronal types proposed by the literature. The decreased activity of NADPH-d in cell types proposed as motoneurons in other animals indicated that the TC affects the main function performed by the MP, which is the motility, especially in the saccular portions of the cecum and transverse colon. The decrease in type II cells, which are considered sensory neurons and were significantly affected in all portions of the colon, coincides with the largest distension of this portion observed in the TC. The changes observed were not reversible only in the saccular portion of the cecum and in the ascending colon, being reversible in the other analyzed portions.

A deprivação maternal é conhecida por promover alterações neuroquímicas, comportamentais e da estrutura cerebral que persistem ao longo da vida. Aqui investigamos se os déficits cognitivos em ratos deprivados podem ser relacionados com uma disfunção no sistema colinérgico e na síntese de proteínas relacionadas aos processos mnemônicos. Ratas Wistar prenhas foram colocadas em caixas individuais e mantidas no biotério no ciclo claro/escuro (12:12 horas) com comida e água a vontade. Após o parto, as mães foram separadas dos seus filhotes por 3 horas, por dia, a partir do dia 1 pós-parto (PND-1) até o PND-10. Para fazer isto, as mães foram removidas das caixas residência e colocadas em uma caixa diferente, enquanto os filhotes permaneceram na caixa original, a qual foi transferida para outra sala mantida a temperatura de 32°C. Quando adultos com 120-150 d ias de idade, os animais machos deprivados e não deprivados foram divididos em duas etapas experimentais: 1) Foram sacrificados para medirmos a acetilcolinesterase (AchE) ou treinados no reconhecimento de objetos e no reconhecimento social, ou 2) Foram treinados e testados na esquiva inibitória e no Morris water maze ou foram treinados e sacrificados para mensurarmos o fator de transcrição CREB e a síntese das proteínas ERK1/2 após o treinamento em 3 diferentes tempos. Na primeira etapa, a deprivação maternal repetida afeta a memória no reconhecimento de objetos e no reconhecimento social. Além disso, ratos deprivados mostraram aumento na atividade da AchE no hipocampo e no córtex perirrinal. A administração oral de inibidores da AchE donepezil ou galantamina (1mg/kg) 30 min antes da sessão de treino reverteu os prejuízos na memória causados pela deprivação maternal. Na segunda etapa, mostramos que a deprivação maternal repetida também afeta a memória aversiva e espacial. Os animais treinados na esquiva inibitória mostraram déficits cognitivos quando testados na memória de curta (2 horas) e de longa duração (24 horas) após o treino. Além disso, a análise densitométrica das proteínas revelou que ratos deprivados treinados na esquiva não aumentaram a fosforilação de CREB e ERK1/2 após o treino. Da mesma forma, ratos deprivados não foram hábeis em reter o aprendizado reverso no labirinto aquático de Morris, mas aqui, os déficits cognitivos podem ser relacionados com o menor aumento da fosforilação do CREB e da ERK1/2 somente 2 horas após o treino no aprendizado reverso. Esses dados sugerem que a deprivação materna afeta os processos mnemônicos em ratos adultos, e que estes prejuízos podem ser mediados por modificações no sistema colinérgico ou na síntese de proteínas. / Maternal deprivation is known to result in long-lasting neurochemical, behavioral and brain structural effects. Here we investigated whether the cognitive aspects of these deficits might be related to a disruption of the cholinergic system and protein synthesis correlated with mnemonic process. Pregnant Wistar rats were individually housed and maintained on a 12:12 h light/dark cycle with food and water freely available. The mothers were separated from their pups for 3 h per day from postnatal day 1 (PND-1) to PND- 10. To do that, the dams were moved to a different cage and the pups maintained in the original home cage, which was transferred to a different room kept at 32ºC. After they reached 120-150 days of age, maternal-deprived and non-deprived male rats were either sacrificed for brain acetylcholinesterase (AchE) and protein (CREB and ERK1/2) measurement, or trained in an object recognition, social recognition, inhibitory avoidance and Morris water maze tasks and divided in two sets of experiments: 1) Complete repeated maternal deprivation affects recognition and social memory and there was increased acetylcholinesterase activity in hippocampus and perirhinal cortex of the deprived rats. Oral administration of the acetylcholinesterase inhibitors, donepezil or galantamine (1mg/kg) 30 min before training session reversed the memory impairments caused by maternal deprivation. 2) Complete maternal deprivation also affects aversive and spatial memory. These animals showed memory deficits in STM and LTM in inhibitory avoidance. Furthermore, densitometric analysis of proteins revealed that deprived rats did not increase the phosphorylation of ERK and CREB after training. Similarly, deprived rats did not able to retain the reversed learning in the Morris water maze but here, the cognitive deficit can be related with the increase in the protein phosphorylation measurement only 2 hours after training in reversed learning compared to non deprived rats. That findings suggest that maternal deprivation affects memory processing at adulthood and that this impairment can be mediated by modification of the cholinergic system or in the protein synthesis.

Considerando que a deficiência hormonal causada pela ovariectomia promove alterações nas atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, acetilcolinesterase (AChE) e ectonucleotidases e pode prejudicar a memória em ratas, no presente trabalho nós investigamos a influência do exercício físico sobre a ativação da Na+,K+-ATPase e acetilcolinesterase em hipocampo e córtex cerebral causada pela ovariectomia em ratas adultas, bem como sobre a hidrólise de nucleotídeos de adenosina no córtex cerebral e no soro. Também investigamos o efeito do exercício sobre a memória espacial e aversiva em ratas adultas ovariectomizadas. Ratas Wistar adultas foram divididas em quatro grupos: sham (submetidas à cirurgia sem a remoção dos ovários), exercício, ovariectomizadas (Ovx) e Ovx+exercício. Trinta dias após a cirurgia, os animais foram submetidos a um mês de exercício físico por 20 min, três vezes por semana. Logo após, as ratas foram decapitados, o soro coletado e o hipocampo e córtex cerebral dissecados, ou foram submetidas às tarefas de esquiva inibitória e labirinto aquático de Morris. Os dados demonstraram que o exercício físico reverte a ativação das atividades da Na+,K+-ATPase e AChE em hipocampo e córtex cerebral de ratas ovariectomizadas. A ovariectomia diminuiu a hidrólise de AMP no córtex cerebral e não alterou a hidrólise de nucleotídeos de adenosina sérica. Exercício per se diminuiu a hidrólise de ADP e AMP em córtex cerebral. Resultados também mostraram que ratas ovariectomizadas apresentaram prejuízo na memória aversiva e espacial (memória de referência e de trabalho), quando comparadas ao grupo controle (sham). Confirmando nossa hipótese, o déficit na memória foi revertido pelo exercício físico. Nossos achados mostram que a ovariectomia prejudica significativamente a memória/aprendizado aversiva e espacial e altera as enzimas Na+,K+-ATPase e AChE, e que o exercício físico preveniu tais efeitos. Esses dados sugerem que o exercício físico pode se mostrar uma estratégia importante para minimizar déficits cognitivos encontrados em mulheres pósmenopáusicas. / Hormone deficiency following ovariectomy causes activation of Na+,K+- ATPase and acetylcholinesterase (AChE), that has been related to cognitive deficits in experimental animals, and memory impairment. Considering that physical exercise presents neuroprotector effects, we decide to investigate whether exercise training would affect enzyme activation in hippocampus and cerebral cortex, as well as adenosine nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of ovariectomized rats, and ovariectomy-induced memory deficits in inhibitory avoidance and Morris water maze tasks. Female adult Wistar rats were assigned to one of the following groups: sham (submitted to surgery without removal of the ovaries), exercise, ovariectomized (Ovx) and Ovx plus exercise. Thirty days after surgery, animals were submitted to one month of exercise training for 20 min, three times per week. After, rats were euthanized, blood serum was collected and hippocampus and cerebral cortex were dissected, or rats were tested in inhibitory avoidance and Morris water maze tasks. Data demonstrated that exercise reversed the activation of Na+,K+-ATPase and AChE activities both in hippocampus and cerebral cortex of ovariectomized rats. Ovariectomy decreased AMP hydrolysis in cerebral cortex and did not alter adenosine nucleotides hydrolysis in blood serum. Exercise per se decreased ADP and AMP hydrolysis in cerebral cortex. On the other hand, AMP hydrolysis in blood serum was increased by exercise in ovariectomized adult rats. Results also show that ovariectomized rats presented impairment in aversive memory and spatial navigation, both in reference and working memory protocols, when compared to sham group (control). Confirming our hypothesis, ovariectomized rats submitted to exercise had those impairments prevented. We conclude that ovariectomy significantly impairs aversive and spatial reference learning/memory and related enzymes, and that physical exercise prevents such effects. These findings support that physical exercise might constitute an important strategy to minimize cognitive deficits found in postmenopausal women.

Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-24T13:48:59Z No. of bitstreams: 1 SAMUEL ANDRADE DO NASCIMENTO - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2015..pdf: 5482564 bytes, checksum: 07458737252bdc2848bf45e49123f07d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-24T13:48:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SAMUEL ANDRADE DO NASCIMENTO - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2015..pdf: 5482564 bytes, checksum: 07458737252bdc2848bf45e49123f07d (MD5) Previous issue date: 2015-07-09 / Neste trabalho, apresentamos um estudo das propriedades optoeletrônicas, vibracionais e termodinâmicas de inibidores de acetilcolinesterase, realizadas por meio de cálculos quânticos através da teoria do funcional da densidade, utilizando a aproximação da densidade local (Local Density Approximation - LDA) e a aproximação do gradiente generalizado (Generalized Gradient Approximation - GGA). As moléculas em estudo possuem a capacidade de inibir a ação da enzima acetilcolinesterase, que age diretamente nas transmissões sinápticas no sistema nervoso central; atribui-se a estes inibidores a capacidade de colaborar para melhores níveis de acetilcolina no organismo humano; acetilcolina por sua vez é um neurotransmissor, e sua presença no organismo é essencial a manutenção e desenvolvimento cognitivo humano; acredita-se ainda que a ausência deste neurotransmissor conduz ao estado de demência, causando uma doença conhecida por Mal de Alzheimer. Os medicamentos selecionados para este estudo foram a Tacrina, o Donepezil, a Rivastigmina, a Galantamina e a Fisostigmina. Para a realização dos cálculos foi utilizado o software de simulação computacional Conformers aplicado para os cálculos conformacionais e para as demais propriedades o DMol³. As propriedades foram obtidas para a estrutura molecular de menor energia de cada molécula, sendo possível realizar estudo sobre os orbitais moleculares HOMO e LUMO, densidade de estado (PDOS), além dos espectros de absorção óptica, Infravermelho (Infrared - IR) e espalhamento Raman. As propriedades termodinâmicas calculadas foram a entropia, entalpia, energia livre e a capacidade térmica. Todos os cálculos foram realizados utilizando os funcionais LDA/PWC e GGA/PBE. / In this work we present a study for a optoeletronic, vibrational and thermodynamic properties of Acetylcholinesterase Inhibitors, conducted through quantum calculations by Density Functional Theory, using the Local Density Approximation - LDA and Generalized Gradient Approximation - GGA. These molecules have the capacity to inhibit the action of the enzyme acetylcholinesterase, which acts directly on synaptic transmission in the central nervous system. One credits to these inhibitors the ability to contribute to improved levels of acetylcholine in the human body, on the other hand acetylcholine is a neurotransmitter and its presence in the organism is essential to maintenance and development human cognitive; it is believed that the absence of this neurotransmitter leads to dementia state, causing the known Alzheimer's disease. The selected drugs for this study were Tacrine, Donepezil, Rivastigmine, Galantamine and Physostigmine. For the implementation of the calculation we used the computer simulation software Conformers applied for the conformational calculations and for the other properties the DMol³. The properties were obtained for the lowest energy molecular structure for each molecule, It is possible to carry out study on the molecular orbitals HOMO and LUMO, density of state (PDOS), Besides the optical absorption spectra, infrared (IR) and Raman scattering. The calculated thermodynamic properties were entropy, enthalpy, free energy and the thermal capacity. All calculations were performed using functional LDA/PWC and GGA/PBE.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / Ethylmalonic acid (EMA) accumulates in tissues and biological fluids of patients suffering from short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCADD) and ethylmalonic encephalopathy (EE), diseases characterized by neurological alterations, includingdevelopmental delay, intellectual disability,and neuromuscular symptoms. However, the pathophysiology ofbrain dysfunction in these patients is still uncertain. In this context, the aim of the present study was to investigate in vivo, in vitro, and in silicoeffects ofEMA on acetylcholinesterase (AChE)activity, important enzyme for termination of cholinergic synapses, in cerebral cortex of30-day-old male Wistarrats. For in vivoexperiments, the animals were dividedinto two groups: EMA group, which received threesubcutaneous EMA administrations(5 μmol/g; 90 minutes of interval), and control group, which received three saline solution administrations in the same conditions.One hour after the last administration, the animals were euthanized by decapitation and the cerebral cortex of each animal werecleaned and isolated for analysis of AChE activity and its expression.For in vitroexperiments, cerebral cortex homogenates from animals without previous manipulation were incubated in the absence or presence of different concentrations of EMA(0.5, 1 and 2.5 mM)for 1 h. Immediately after, these homogenates were used for the determination of AChE activity.First, it was observed that EMA administrationincreased AChE activity when compared to control group.The same effect was observed in in vitroexperiment after one hour of incubation.In an attempt to elucidate the mechanisms by which EMA activated AChE, it was evaluated the expression of this enzyme by measuring messenger ribonucleic acid (mRNA) levels and it was not verified any difference between groups, indicating that EMA did not affect AChE expression.In order to evaluate the interaction between EMA and AChE from Rattus norvegicus(rAChE), as well as the affinity between acetylcholine (ACh) and rAChE previously bonded to EMA (halo-AChE) and in the absence of EMA, it was carried out in silicoexperiments by molecular docking. It is noteworthy that phenilalanine 295 is part of acyl binding, that recognizes the entrance of molecules within the gorge. Additionaly, the atomic intermolecular detail fromEMA docking within rAChE showed hydrogen bonds between EMA and phenylalanine 295 and arginine 296 residues from rAChE, with 2.4 Å and 2.6 Å of distances, respectively. It was also observed that ACh bonded near the catalytic triad of rAChE in halo-AChE andthat the energy value of this affinity is more negative (-5.2 kcal/mol) when compared to the affinity from ACh within apo-AChE (-5.0 kcal/mol). Taken together, the present results suggest an activation of AChE caused by EMA andthatthis effect is possible due to an allosteric effect. These alterations might collaborate to the brain damage and intellectual disability found in patients affected by SCADD and EE. / O ácido etilmalônico (EMA) acumula-seem tecidose líquidosbiológicos de pacientes acometidos peladeficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta (SCADD) epelaencefalopatia etilmalônica (EE), erros inatos do metabolismo (EIM) caracterizados por alterações neurológicas heterogêneas, incluindoatraso no desenvolvimento, deficiência intelectuale sintomas neuromusculares. No entanto, a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nesses pacientes ainda não é completamente conhecida. Oobjetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vivo, in vitroe in silicodo EMA sobre a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE), enzima importante para finalização das sinapses colinérgicas,em córtex cerebral de ratos.Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos com 30 dias de vida. Para os experimentos in vivo, os animais foram divididos em dois grupos: grupo EMA, que recebeu 3 administrações subcutâneas do EMA(6μmol/g; 90 minutos de intervalo), e controle, que recebeu 3 administrações de solução salina nas mesmas condições.Uma hora após a última administração, os animais sofreram eutanásia por decapitação e os córtices cerebraisforam limpos e isolados para determinação da atividade e expressão da AChE. Para os experimentos in vitro, córtices cerebrais de animais sem prévia manipulação foram homogeneizados e incubados na presença de diferentes concentrações de EMA (0,5, 1 e 2,5 mM) por 1 h. Imediatamente após, os homogeneizados foram utilizados para a determinação da atividade da AChE.Inicialmente, foi observadoum aumento daatividade da enzima AChE no grupo que recebeu administraçõesde EMA em comparação ao grupo controle. O mesmo efeito foi observado in vitroapós uma hora de incubação na presença de EMA.Na tentativa de elucidar o mecanismo pelo qual o EMA ativa a AChE, foi avaliada a expressão desta enzima através da medida dos níveis de ácido ribonucleico mensageiro (RNAm). Entretanto não houve nenhuma diferença significativa entre os grupos, indicando que este ácido orgânico não altera aexpressão desta enzima.Foram então investigados parâmetros in silicopara avaliar a interação do EMA com a AChE de Rattus norvegicus(rAChE), bem como a afinidade do seu substrato (acetilcolina; ACh)com arAChEpreviamente ligada ao EMA (halo-AChE) e na ausência de EMA (apo-AChE)por docagemmolecular.Adicionalmente, odetalhamento atômico intermolecular da docagem do EMA em rAChEevidenciou a formação de ligações de hidrogênio entre o EMA e os resíduos fenilalanina 295 e arginina 296 de rAChE a 2,4 Å e 2,6 Å de distância, respectivamente. Vale ressaltar que o resíduo fenilalanina 295 faz parte do sítio de ligação acil, que reconhece a entrada de moléculas na região catalítica. Também observou-se que a ACh se liga próximo à tríade catalítica da halo-AChE,e o valor de energia dessa ligação é mais negativo (-5,2 kcal/mol) quando comparado ao valor de energia de ligação da ACh àapo-AChE(-5,0 kcal/mol). Tomados em conjunto, os resultados do presente trabalho sugeremuma ativação da AChE causada pelo EMA, e tal efeito possivelmente se deve a um efeito alostérico. Tais alteraçõespodem colaborar para o dano cerebral e o dano cognitivoencontradosnos pacientes acometidos por SCADD e EE.