A dificuldade de transformação de tecido adulto de espécies lenhosas é uma barreira ainda a ser contornada para a maioria das cultivares de laranja doce de importância na citricultura brasileira. Esta dificuldade está relacionada ao alto nível de contaminação, ao baixo potencial regenerativo e à baixa capacidade de transformação de tecidos adultos de espécies lenhosas. Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar o protocolo de transformação genética de tecido adulto de três cultivares de laranja doce. Com ajustes no cultivo in vitro, foi possível obterem-se gemas adventícias transgênicas via Agrobacterium tumefaciens de três cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra e Valência, utilizando material adulto como fonte de explantes. As gemas transgênicas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e confirmados pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento 817 pb, correspondente a parte do gene uidA amplificada. A utilização de meio de co-cultivo com a adição de auxinas e citocininas (2,0 mg L-1 de 2,4 D; 2,0 mg L-1 de AIA e 1,0 mg L-1 de 2-iP), foi o mais eficiente para as três cultivares avaliadas. Meios de seleção com altas concentrações de citocinina (3 mg L-1) favoreceram a regeneração e, conseqüentemente, a transformação de gemas adventícias para as três cultivares estudadas. O uso da sonicação não foi eficiente para diminuir a contaminacão endofítica. Além disso, esta operação diminuiu a eficiência de transformação dos explantes. As eficiências médias de transformação genética encontradas para as três cultivares foram 2,5% para laranja Hamlin, 1,4% para laranja Pêra e 3,7% para laranja Valência. / The difficulty of tissue transformation of adult woody species is still an obstacle to be overcome for most sweet orange cultivars in the Brazilian citrus industry. This difficulty is related to the high level of contamination, low regenerative potential and low transformation capacity of adult tissues of woody species. Thus, the objective of this work was to optimize the protocol for genetic transformation of adult tissue of three cultivars of sweet orange. Therefore, with in vitro culture adjustments, it was possible to obtain transgenic adventitious buds though Agrobacterium tumefaciens of three sweet orange cultivars (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra and Valencia, using adult material as explants source. The transgenic buds were identified as transgenic by the GUS histochemical test and confirmed by the PCR analysis, which showed fragment amplification of 817 bp corresponding to the part of the amplified uidA gene. The use of co-culture media rich in auxins and cytokinins (2.0 mg L-1 of 2.4 D, 2.0 mg L-1 of AIA and 1.0 mg L-1 of 2-iP) was more efficient for all three cultivars. Selection media with high concentrations of cytokinin (3 mg L-1) promoted the regeneration and, consequently, the transformation of adventitious buds in the three cultivars. The use of sonication was not effective to reduce endophytic contamination. Moreover, this procedure reduced transformation efficiency of explants. The average efficiencies of genetic transformation for the three varieties were 2.5% for Hamlin, 1.4% for Pêra and 3.7% for Valência.

Agrobacterium tumefaciens est une bactérie du sol responsable de la galle du collet chez les plantes lorsqu'elle possède le plasmide Ti (Tumor inducing) dit de virulence (pTi). La bactérie transfère un morceau d’ADN du pTi dans le génome de la plante qui code d'une part la production d’hormones de plantes, à l’origine de la formation de tumeurs colonisées par les bactéries et d'autre part la production de petites molécules (opines) qui servent de nutriment à A. tumefaciens. L'opine, agrocinopine A induit la production de signaux quorum sensing à l’origine de la dissémination du plasmide de virulence vers des bactéries non pathogènes. Agrobacterium radiobacter K84, une bactérie non pathogène, produit de l’agrocine 84, un antibiotique qui tue A. tumefaciens.L’import et le catabolisme de l’agrocinopine A sont réalisés par l’opéron acc présent sur le pTi. La protéine périplasmique (PBP) AccA associée à un transporteur ABC importe l’opine dans le cytoplasme qui est ensuite dégradée par AccF et AccG. AccR régule l’expression de l’opéron acc et celle du facteur de transcription TraR, central dans la signalisation quorum sensing. AccA importe l’agrocine 84 qui est activée par AccF. Mon travail de doctorat a permis par des études structure-fonction de caractériser la spécificité d'AccA et d’AccF et d’initier l’étude du facteur de transcription AccR. L’étude structurale de la PBP en complexe avec l’agrocinopine A, l’agrocine 84 et des dérivés de ces molécules a révélé que seul le motif pyranose-2-phosphate commun aux 2 molécules était reconnu par AccA. Cela a été confirmé par microcalorimétrie et autofluorescence. Le motif pyranose-2-phosphate permettrait donc l’entrée de toute molécule qui le possède à une extrémité. La structure de l’enzyme AccF a montré que là encore seul le groupement pyranose-2-phosphate est reconnu. A partir de la structure obtenue et de modélisation du substrat dans le site actif, un mécanisme enzymatique original pour l’hydrolyse de la liaison phosphodiester est proposé. Les mesures d’affinité par microcalorimétrie montrent que seuls l’arabinose-2-phosphate et le glucose-2-phosphate sont capables de fixer AccR. Des expériences in cellulo ont confirmé qu'ils régulent bien l'expression du QS.Mes travaux apportent un éclairage nouveau sur l’import et l'utilisation de l’agrocinopine chez A. tumefaciens. La spécificité de reconnaissance de la PBP pour une partie de la molécule importée est observée chez d’autres PBP, et ouvre la voie à la conception de molécules antibiotiques qui, à l’image de l’agrocine 84, utilisent une stratégie de type « cheval de Troie ». / Agrobacterium tumefaciens is a soil bacterium responsible of the crown gall in plants when it possesses the Tumor inducing plasmid (pTi) which is also the virulence plasmid. The bacterium transfers a piece of DNA from the pTi into the plant genome. The transferred DNA codes for plant hormone synthesis, leading to the formation of tumors which are colonized by bacteria, on one hand, and on the other hand, for the synthesis of small molecules (opines) that are used as nutrients by A. tumefaciens. The opine agrocinopine A induces the production of quorum sensing signals responsible for the spread of the virulence plasmid from pathogenic to nonpathogenic bacterium. Agrobacterium radiobacter K84, a nonpathogenic bacterium, produces the agrocin 84, an antibiotic that kills A. tumefaciens.Import and catabolism of agrocinopine A are operated by acc operon, present on the pTi. The periplasmic binding protein AccA (PBP AccA) associated with the ABC transporter imports the opine into the periplasm where it is degraded by AccF and AccG. AccR regulates the expression of the acc operon and that of the transcription factor TraR, central in quorum sensing signaling. AccA also imports agrocin 84, which is activated by AccF. My PhD work focused on AccA and AccF specificity through structure-function studies and I initiated the study of the transcription factor AccR. The structural study of AccA in complex with agrocinopine A, agrocin 84 and derivatives from these molecules revealed that only the pyranose-2-phosphate motif, common in these two molecules, was recognized. Microcalorimetry and autofluorescence measurements confirmed this conclusion. The pyranose-2-phosphate motif would allow any compound possessing this motif at one end to be transported. The structure of the enzyme AccF showed that again only the pyranose-2-phosphate group is recognized. From the structure and molecular modelling of the substrate in the active site, an original mechanism of the phosphodiester bond cleavage is proposed. Microcalorimetry affinity measures showed that only the arabinose-2-phosphate and glucose-2-phosphate are capable of interacting with AccR. In cellulo experiments confirm that both compounds regulate the expression of quorum sensing.My work sheds light on import and use of agrocinopine in A. tumefaciens. Recognition specificity of the PBP AccA for a part of the imported molecule is observed in other PBPs and opens new ways for rational design of antibiotic compounds that, similarly to agrocin 84, would use the “Trojan horse” strategy.

A dificuldade de transformação de tecido adulto de espécies lenhosas é uma barreira ainda a ser contornada para a maioria das cultivares de laranja doce de importância na citricultura brasileira. Esta dificuldade está relacionada ao alto nível de contaminação, ao baixo potencial regenerativo e à baixa capacidade de transformação de tecidos adultos de espécies lenhosas. Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar o protocolo de transformação genética de tecido adulto de três cultivares de laranja doce. Com ajustes no cultivo in vitro, foi possível obterem-se gemas adventícias transgênicas via Agrobacterium tumefaciens de três cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra e Valência, utilizando material adulto como fonte de explantes. As gemas transgênicas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e confirmados pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento 817 pb, correspondente a parte do gene uidA amplificada. A utilização de meio de co-cultivo com a adição de auxinas e citocininas (2,0 mg L-1 de 2,4 D; 2,0 mg L-1 de AIA e 1,0 mg L-1 de 2-iP), foi o mais eficiente para as três cultivares avaliadas. Meios de seleção com altas concentrações de citocinina (3 mg L-1) favoreceram a regeneração e, conseqüentemente, a transformação de gemas adventícias para as três cultivares estudadas. O uso da sonicação não foi eficiente para diminuir a contaminacão endofítica. Além disso, esta operação diminuiu a eficiência de transformação dos explantes. As eficiências médias de transformação genética encontradas para as três cultivares foram 2,5% para laranja Hamlin, 1,4% para laranja Pêra e 3,7% para laranja Valência. / The difficulty of tissue transformation of adult woody species is still an obstacle to be overcome for most sweet orange cultivars in the Brazilian citrus industry. This difficulty is related to the high level of contamination, low regenerative potential and low transformation capacity of adult tissues of woody species. Thus, the objective of this work was to optimize the protocol for genetic transformation of adult tissue of three cultivars of sweet orange. Therefore, with in vitro culture adjustments, it was possible to obtain transgenic adventitious buds though Agrobacterium tumefaciens of three sweet orange cultivars (Citrus sinensis L. Osbeck), Hamlin, Pêra and Valencia, using adult material as explants source. The transgenic buds were identified as transgenic by the GUS histochemical test and confirmed by the PCR analysis, which showed fragment amplification of 817 bp corresponding to the part of the amplified uidA gene. The use of co-culture media rich in auxins and cytokinins (2.0 mg L-1 of 2.4 D, 2.0 mg L-1 of AIA and 1.0 mg L-1 of 2-iP) was more efficient for all three cultivars. Selection media with high concentrations of cytokinin (3 mg L-1) promoted the regeneration and, consequently, the transformation of adventitious buds in the three cultivars. The use of sonication was not effective to reduce endophytic contamination. Moreover, this procedure reduced transformation efficiency of explants. The average efficiencies of genetic transformation for the three varieties were 2.5% for Hamlin, 1.4% for Pêra and 3.7% for Valência.

O melhoramento genético das plantas cítricas, pelos métodos tradicionais, é dificultado por uma série de características da biologia de reprodução da espécie. Assim a utilização de técnicas modernas de biotecnologia, como a cultura de tecidos, a manipulação genética e a biologia molecular, têm se mostrado atrativas para o melhoramento genético da cultura. O objetivo deste trabalho é avaliar a transformação genética em variedades de laranja doce (Citrus sinensis) usando o gene xylA como gene de seleção. O trabalho foi realizado com a estirpe EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pNOV1457, com o gene xylA. Os isolados da bactéria foram mantidos em meio de cultura YEP suplementado com os antibióticos (ácido nalidíxico, canamicina e estreptomicina). Segmentos de epicótilo foram incubados, por um período de 20 minutos, com a suspensão bacteriana. Após a inoculação, os segmentos foram secos em papel toalha estéril, e incubados em placa de petri (100 x 15 mm) contendo o meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1), em ausência de luz, à temperatura de 24 C, por um período de 3 dias, com acetoseringona e sem acetoseringona durante o cocultivo. Após o co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração, constituído do meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xilose (15 mg.L-1). A transformação genética foi confirmada pela detecção do gene xylA nas plantas regeneradas por PCR. A extração do DNA foi feita pelo método de Dellaporta et al. (1983) e as reações de PCR foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research) utilizandose "primers" específicos para detecção do gene xylA. Analisando os dados obtidos verificou-se que foram obtidas plantas transgênicas, utilizando-se o sistema xylA/xilose, de 3 variedades de laranja doce Hamlin, Valência e Natal, com uma eficiência de transformação genética variando de 1 - 3%, em função do experimento e da variedade. A atividade da enzima xilose isomerase foi confirmada pelo teste clorofenol vermelho. Esse trabalho concluiu que é possível a regeneração de plantas transgênicas de variedades de laranja doce utilizando-se o sistema de seleção positiva xylA/xilose. / The genetic improvement of the citric plants, by traditional methods, is made difficult by a series species biology reproduction characteristics. The use of modern biotechnology techniques, as tissue culture, the genetic manipulation and molecular biology, have shown attractive for the culture genetic improvement. The objective of this work was to evaluate the genetic transformation in varieties of sweet orange (Citrus sinensis) using the gene xylA as selection gene. The work was carried out with the EHA 101 Agrobacterium tumefaciens, containing the plasmid pNOV1457, whith the gene xylA. The bacterium was culture in YEP media supplemented with antibiotics (nalidixic acid, kanamicyn e streptomycin). Epicotyl segments were incubated, for 20 min, with the bacterial suspension. After inoculation, the segments were dry in a sterile paper, and incubated in a petri dish (100 x 15mm) containing the medium EME + BAP (1 mg.L-1), in dark, at the temperature of 24 °C, for a period of 3 days, with and without acetoseryngone during the co-culture period. After the co-culture, the explants were transferred to culture medium of selection and regeneration, consisting of medium EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xylose (15 mg.L-1). The genetic transformation was confirmed by the gene detection by PCR. The DNA extraction was done by Dellaporta et al. (1983). PCR reactions were done in a thermal cycler PTC-100 (MJ Research) using specific "primers" for gene xylA detection. The enzyme xilose isomerase activity was confirmed by the red clorofenol test. It is possible to regenerate sweet orange transgenic plants using the positive select system based on xylA gene, of 3 sweer orange varieties Hamlin, Valencia and Natal, with a genetic transformation efficiency of 1-3%.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.

O Brasil é o maior produtor de laranja doce do mundo. O histórico da citricultura brasileira é marcado por uma sucessão de doenças causadas por diferentes agentes etiológicos. Entre as principais doenças que afetam a cultura, têm levado a maiores prejuízos, as bacterianas, com destaque para o cancro cítrico causado por Xanthomonas citri subsp. citri e o Huanglongbing associado a três espécies de \"Candidatus Liberibacter\". Devido à ausência de cultivares de laranja doce resistentes a estas doenças, a transformação genética é uma alternativa promissora para obtenção de plantas resistentes. Uma das estratégias no uso da transgenia para conferir ação contra bactérias é a inserção de genes que codificam peptídeos antimicrobianos como o D4E1, um peptídeo sintético, que tem apresentado eficiência no controle de doenças fúngicas e bacterianas de várias culturas, in vivo e in vitro. Este trabalho foi realizado com o objetivo de obter plantas transgênicas de laranja doce das cultivares \'Hamlin\', \'Pêra\' e \'Valência\', via Agrobacterium tumefaciens, expressando o gene D4E1, dirigido pelos promotores CaMV35S (Cauliflower mosaic virus 35S promoter) de expressão constitutiva ou pelo AtPP2 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2) com expressão preferencial no floema, visando obter plantas resistentes a doenças bacterianas. Foram obtidas 13 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 10 da cultivar \'Pêra\' e 8 da cultivar \'Valência\', contendo a construção gênica CaMV35S/D4E1 e 19 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 6 da cultivar \'Pêra\' e 15 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica AtPP2/D4E1. As plantas transgênicas apresentaram um a três eventos de inserção do T-DNA no genoma. Os níveis de expressão do transgene dirigido pelo promotor de expressão preferencial no floema foi menor comparado ao das plantas contendo o transgene dirigido pelo promotor de expressão constitutiva. Os resultados da expressão do transgene permitem selecionar plantas com maior expressão de cada uma das construções gênicas, para que, futuramente, estas sejam multiplicadas e avaliadas quanto à resistência ao cancro cítrico e ao HLB. / Brazil is the largest sweet orange producer in the world. The history of the Brazilian citrus industry is marked by a series of diseases caused by different etiologic agents. Among the diseases affecting the culture, those caused by bacteria are the ones that have caused more significant losses, especially the citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri, and huanglongbing (HLB) associated with three \"Candidatus Liberibacter\" bacteria species. Due to the absence of genetic resistance to these diseases in commercial sweet orange cultivars, the genetic transformation is a promising alternative to produce resistant plants. One of the strategies to produce transgenic resistant plants to bacteria is the use of genes that code for antimicrobial peptides, such as D4E1, a antimicrobial synthetic peptide, which has shown efficient results controlling diseases caused by bacteria and fungi in several crops, through in vitro and in vivo experiments. The aim of this study was to produce \'Hamlin\', \'Pêra\' and \'Valencia\' sweet orange transgenic plants, via Agrobacterium tumefaciens, expressing the D4E1 gene driven by the constitutive promoter Cauliflower mosaic virus (CaMV35S) or Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPP2), a promoter preferentially expressed in the phloem. It was possible to regenerate 13 \'Hamlin\' transgenic lines, 10 \'Pêra\' transgenic lines and 8 \'Valencia\' transgenic lines bearing the gene construct CaMV35S/D4E1, whereas 19 \'Hamlin\' transgenic lines, 6 \'Pêra\' transgenic lines and 15 \'Valencia\' transgenic lines bearing the AtPP2/D4E1 gene construct were regenerated. The transgenic plants had one to three T-DNA insertion events in the genome. The transgene expression levels in transgenic plants for D4E1 gene driven by the phloem preferential promoter were lower than the transgenic expression levels of the transgene driven by the constitutive promoter. Transgene expression levels results may allow the selection of those plants with higher expression levels of each genetic construct for future multiplication and evaluation for citrus canker and HLB resistance.

A obtenção de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma ferramenta biotecnológica de grande valor, contribuindo nos programas de melhoramento. Plantas transgênicas contendo genes de peptídeos antibacterianos são uma boa alternativa nos programas visando resistência às bactérias. A cecropina é um peptídeo isolado de inseto que apresenta ação antibacteriana contra diversas bactérias, entre elas, a Xylella fastidiosa causadora da clorose variegada dos citros (CVC). Com isso, este trabalho teve dois objetivos: 1) obter plantas transgênicas dos cultivares copa de laranja 'Hamlin' e laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 dirigido pelos promotores do gene da fenilalanina amônia-liase (PAL) clonado de citros (CsPP) e de Arabidopsis thaliana (AtPP), que conferem expressão gênica nos vasos do xilema. Obter plantas transgênicas de laranja 'Hamlin' e laranja 'Valência' com o gene GUS dirigido pelo promotor AtPP. 2) avaliar plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39 inoculadas com Xylella fastidiosa. As transformações genéticas foram realizadas através do co-cultivo de explantes, coletados de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais), com Agrobacterium tumefaciens. Para isso, utilizou-se a estirpe EHA-105 de A. tumefaciens contendo os vetores binários CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 ou AtPP-GUS/2201. A seleção das gemas transformadas foi feita em meio de cultura contendo o antibiótico canamicina, e para confirmação da transformação foram realizados teste histoquímico GUS e análises moleculares de PCR e 'Southern blot'. As gemas regeneradas foram microenxertadas em citrange 'Carrizo' ou laranja 'Hamlin' não transgênicos. Foi possível a obtenção de gemas transformadas para todos os cultivares, porém a regeneração de plantas ocorreu para laranja 'Hamlin' transformada com os vetores CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 e AtPP-GUS/2201. Para a avaliação da resistência de plantas transgênicas a Xylella fastidiosa foram selecionadas nove plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39, sendo que em quatros plantas o gene está sendo dirigido pelo promotor CsPP e nas outras cinco plantas pelo promotor CaMV 35S. Essas plantas foram multiplicadas por borbulhia e inoculadas mecanicamente com Xylella fastidiosa. Foram realizados isolamentos primários e quantificações bacterianas aos quatro e dez meses após a inoculação da bactéria para verificar a eficiência da inoculação e movimentação sistêmica da bactéria. Avaliações sintomáticas foliares também foram feitas aos oito meses após a inoculação. Os resultados dos isolamentos aos quatro meses mostraram que a inoculação da bactéria foi eficiente, já que houve crescimento bacteriano na maioria das placas com meio de cultura. A movimentação sistêmica da bactéria pôde ser detectada no isolamento aos dez meses. Das nove plantas avaliadas, uma planta transgênica apresentou crescimento populacional menor do que a da planta controle, indicando uma resistência ao patógeno. Nas avaliações sintomáticas foliares, as plantas transgênicas não diferiram do controle. / The production of genetically modified plants has become an important biotechnological tool, contributing with breeding programs. Transgenic plants expressing antibacterial peptides genes are a good alternative for breeding programs aiming to obtain bacterial resistance. Cecropin is a peptide isolated from an insect, which presents antibacterial effect against several bacteria including the citrus variegated chlorosis in which the causal agent is Xylella fastidiosa. This work had two objectives: 1) genetically transform 'Hamlin' and 'Pêra' sweet oranges scions with the cecropin MB39 gene under the control of the phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene promoter, cloned from citrus (CsPP) and from Arabidopsis thaliana (AtPP). This promoter confers gene expression within the xylem vessels. Obtain transgenic plants of 'Hamlin' and 'Valência' sweet oranges with the GUS gene under the control of the AtPP promoter. 2) Evaluate the resistance to Xylella fastidiosa of 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene. Co-culture of explants with Agrobacterium tumefaciens was used to genetically transform in vitro plants (epicotyl segments) and greenhouse plants (internodal segments). A. tumefaciens strain EHA-105 containing the CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 or AtPP-GUS/2201 binary vectors were used for transformation. Culture medium containing the antibiotic kanamycin was used for selection of transformed buds. Confirmation of transgenesis was carried out by GUS assays, PCR and Southern blot analysis. Regenerated buds were in vitro grafted on non-transgenic 'Carrizo' citrange or 'Hamlin' sweet orange rootstocks. Transformed buds were obtained for all cultivars, however plant regeneration was only obtained for 'Hamlin' sweet orange transformed with vectors CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 and AtPP-GUS/2201. Nine 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene were selected for the Xylella fastidiosa resistance experiment. Four transgenic lines were controlled by the CsPP promoter and the other five lines were controlled by the CaMV 35S promoter. These transgenic lines were graft propagated and mechanically inoculated with Xylella fastidiosa. Primary isolations and bacterial quantifications were conducted on the fourth and tenth month after inoculation in order to detect inoculation efficiency and bacterial systemic movement. Leaf symptom evaluations were executed eight months after inoculations. The bacterial isolation results from the fourth month indicated that inoculations were successful, since bacterial growth could be detected in the majority of culture mediums. Systemic movement of bacteria within the plants was detected after ten months. From the nine transgenic lines tested, one presented reduced pathogen growth when compared to controls indicating resistance. Transgenic lines did not differ from controls regarding leaf symptoms.

O Brasil é o maior produtor de laranja doce do mundo. O histórico da citricultura brasileira é marcado por uma sucessão de doenças causadas por diferentes agentes etiológicos. Entre as principais doenças que afetam a cultura, têm levado a maiores prejuízos, as bacterianas, com destaque para o cancro cítrico causado por Xanthomonas citri subsp. citri e o Huanglongbing associado a três espécies de \"Candidatus Liberibacter\". Devido à ausência de cultivares de laranja doce resistentes a estas doenças, a transformação genética é uma alternativa promissora para obtenção de plantas resistentes. Uma das estratégias no uso da transgenia para conferir ação contra bactérias é a inserção de genes que codificam peptídeos antimicrobianos como o D4E1, um peptídeo sintético, que tem apresentado eficiência no controle de doenças fúngicas e bacterianas de várias culturas, in vivo e in vitro. Este trabalho foi realizado com o objetivo de obter plantas transgênicas de laranja doce das cultivares \'Hamlin\', \'Pêra\' e \'Valência\', via Agrobacterium tumefaciens, expressando o gene D4E1, dirigido pelos promotores CaMV35S (Cauliflower mosaic virus 35S promoter) de expressão constitutiva ou pelo AtPP2 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2) com expressão preferencial no floema, visando obter plantas resistentes a doenças bacterianas. Foram obtidas 13 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 10 da cultivar \'Pêra\' e 8 da cultivar \'Valência\', contendo a construção gênica CaMV35S/D4E1 e 19 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 6 da cultivar \'Pêra\' e 15 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica AtPP2/D4E1. As plantas transgênicas apresentaram um a três eventos de inserção do T-DNA no genoma. Os níveis de expressão do transgene dirigido pelo promotor de expressão preferencial no floema foi menor comparado ao das plantas contendo o transgene dirigido pelo promotor de expressão constitutiva. Os resultados da expressão do transgene permitem selecionar plantas com maior expressão de cada uma das construções gênicas, para que, futuramente, estas sejam multiplicadas e avaliadas quanto à resistência ao cancro cítrico e ao HLB. / Brazil is the largest sweet orange producer in the world. The history of the Brazilian citrus industry is marked by a series of diseases caused by different etiologic agents. Among the diseases affecting the culture, those caused by bacteria are the ones that have caused more significant losses, especially the citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri, and huanglongbing (HLB) associated with three \"Candidatus Liberibacter\" bacteria species. Due to the absence of genetic resistance to these diseases in commercial sweet orange cultivars, the genetic transformation is a promising alternative to produce resistant plants. One of the strategies to produce transgenic resistant plants to bacteria is the use of genes that code for antimicrobial peptides, such as D4E1, a antimicrobial synthetic peptide, which has shown efficient results controlling diseases caused by bacteria and fungi in several crops, through in vitro and in vivo experiments. The aim of this study was to produce \'Hamlin\', \'Pêra\' and \'Valencia\' sweet orange transgenic plants, via Agrobacterium tumefaciens, expressing the D4E1 gene driven by the constitutive promoter Cauliflower mosaic virus (CaMV35S) or Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPP2), a promoter preferentially expressed in the phloem. It was possible to regenerate 13 \'Hamlin\' transgenic lines, 10 \'Pêra\' transgenic lines and 8 \'Valencia\' transgenic lines bearing the gene construct CaMV35S/D4E1, whereas 19 \'Hamlin\' transgenic lines, 6 \'Pêra\' transgenic lines and 15 \'Valencia\' transgenic lines bearing the AtPP2/D4E1 gene construct were regenerated. The transgenic plants had one to three T-DNA insertion events in the genome. The transgene expression levels in transgenic plants for D4E1 gene driven by the phloem preferential promoter were lower than the transgenic expression levels of the transgene driven by the constitutive promoter. Transgene expression levels results may allow the selection of those plants with higher expression levels of each genetic construct for future multiplication and evaluation for citrus canker and HLB resistance.

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Manguezais são ecossistemas localizados na confluência de terra e mar, característicos de áreas tropicais e subtropicais, cobrindo cerca de 18,1 milhões de hectares do planeta. A grande biodiversidade encontrada nestes ambientes ressalta a importância da busca por conhecimentos à seu respeito, como o estudo sobre novos princípios ativos derivados de microrganismos endofíticos presentes nas plantas de manguezais. Desta forma, o propósito do presente trabalho foi determinar a diversidade genética da comunidade de fungos endofíticos presentes em folhas e ramos das principais espécies arbóreas de manguezais de Cananéia e Bertioga (situados no estado de São Paulo, Brasil), e avaliar o potencial biotecnológico destes fungos em relação à produção de antibióticos contra os patógenos humanos Staphylococcus aureus e Escherichia coli, e contra o fitopatógeno Xanthomonas axonopodis citri . Os resultados da primeira etapa do trabalho, que envolveu o isolamento e a caracterização de fungos endofíticos filamentosos, mostraram que a comunidade fúngica associada às plantas de manguezais é formada por pelo menos 35 gêneros diferentes, sendo que os gêneros mais frequentes foram Diaporthe, Fusarium, Trichoderma, Colletotrichum e Xylaria. Grande parte dos gêneros encontrados neste trabalho é de fungos de solo, indicando que eles estão adaptados às condições adversas dos manguezais. Os resultados mostraram que, dentre as linhagens produtoras de antibiótico, 29,41% pertencem ao gênero Diaporthe, o qual apresentou maior frequência na comunidade fúngica estudada. Após a avaliação de 344 fungos quanto ao potencial de atividade antimicrobiana, foi selecionada a linhagem 41.1(1) de D. phaseolorum, um endófito de folha de Laguncularia racemosa, para elucidação da estrutura química do seu antibiótico purificado. Por meio das técnicas de Ressonância Magnética Nuclear e de Espectrometria de Massas o antibiótico foi identificado como ácido 3-hidroxipropiônico o qual apresentou atividade frente aos patógenos humanos Staphylococcus aureus e Salmonella tiphy. A estrutura química deste antibiótico foi modificada por meio de reação química de esterificação de Fischer-Speier para avaliar a relação da estrutura química e atividade biológica deste composto. O produto final da reação química de esterificação do antibiótico ácido 3-hidroxipropiônico não apresentou atividade antimicrobiana, indicando que o grupo hidroxila removido na reação é importante na atividade farmacológica desse composto. Além disso, a linhagem 41.1(1) de D. phaseolorum foi transformada geneticamente pelo sistema Agrobacterium tumefaciens, visando a obtenção de transformantes deficientes para produção de antibiótico e, com isso, a identificação de genes relacionados com a via de biossíntese do antibiótico ácido 3-hidroxipropiônico. A análise das sequências que flanqueiam o T-DNA, obtidas por TAIL-PCR, mostraram que os genes interrompidos nos transformantes estão relacionados com proteínas de domínios conservados envolvidos com diferentes funções como: translação de proteínas, homeostase do íon orgânico Mg2+, transporte intracelular, migração, adesão e proliferação celular e outras funções celulares. A caracterização da biblioteca de agrotransformantes constitui uma ferramenta importante para o estudo da biologia molecular de fungos que produzem compostos bioativos por meio do seu metabolismo secundário. / Mangroves are ecosystems situated beyond land and sea. They are more frequently found in tropical and subtropical areas englobing around 18.1 millions of hectares in the planet. The great biodiversity found in these ecosystems shows the importance of researching them, including studies regarding new compounds derived from endophytic fungi that inhabit these ecosystems. Therefore, the goal of this study was to determine the genetic diversity of the fungal endophytic community found in leaves and branches of the main arboreal species from mangrove of Cananéia and Bertioga (situated in São Paulo state, Brazil), and to evaluate the biotechnological potential of these fungi concerning the production of antibiotics against the human pathogens Staphylococcus aureus and Escherichia coli, and against the phytopathogen Xanthomonas axonopodis citri . The results of the first part of this work, including the isolation and characterization of the filamentous endophytic fungi, showed that the mangrove fungal community is made up of at least 35 different genera, from which the most frequent are Diaporthe, Fusarium, Trichoderma, Colletotrichum and Xylaria. Most of the fungal genera found in this study come from soil, which suggests that they are adapted to the adverse conditions of mangroves. The results show that among the antibiotic-produncing strains, 29.41% belong to the genus Diaporthe, which was the most frequently found in the studied fungal community. After the analysis of 344 fungi regarding the antibiotic activity potential, a strain of D. phaseolorum (a leaf endophyte of Laguncularia racemosa) was selected to unveil the chemical structure of their purified antibiotic. The nuclear magnetic resonance and the mass spectrometry techniques allowed the identification of the antibiotic as 3-hidroxypropionic acid, which displayed activity against the pathogens Staphylococcus aureus and Salmonella tiphy. The chemical structure of this antibiotic was modifyed by the chemical reaction of Fischer-Speier sterification in order to evaluate the chemical structure and biological activity of this compound. The final product of the chemical reaction of 3-hidroxipropionic acid sterification had no antibiotic activity, which suggests that the hydroxil group removed from the reaction is important to the pharmachological activity of this compound. Additionally, the strain 41.1(1) of D. phaseolorum was genetically transformed by the Agrobacterium tumefaciens system, in order to generate antibioticdeficient transformants, which would help to identify genes related to the biosynthesis pathway of the 3- hidroxypropionic acid antibiotic. The TAIL-PCR analysis revealed that the interrupted genes in the tranformants are related to proteins from conserved domains involved in different functions such as protein translation, Mg2+ ion homeostasis, intracellular transport, migration, adhesion and cellular proliferation and other cellular functions. The characterization of the agrotransformants library is an important tool to unveiling the molecular biology of fungi that produce bioactive compounds by the secondary metabolism.