La inestabilitat genòmica, característica intrínseca de la majoria de cèl·lules tumorals, es defineix com la capacitat que presenta una cèl·lula de generar alteracions genètiques a un ritme elevat, tenint com a conseqüència la generació d'una elevada heterogeneïtat cel·lular. Des de l'inici de l'estudi de la inestabilitat genòmica, el càncer colorectal ha esdevingut un estereotip del comportament de les cèl·lules tumorals. El càncer colorectal pot ser subdividit en dues formes diferents: els que presenten inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) i són majoritàriament diploides, i els caracteritzats per cariotips poliploides i amb inestabilitat cromosòmica (CIN). Una part important del treball ha estat basat en l'ús de línies cel·lulars de càncer de còlon humanes. Una de les línies més utilitzades com a model de CIN és la línia cel·lular SW480. L'aplicació de les tècniques M-FISH, la cenM-FISH i mMCB va permetre descriure el cariotip molecular amb alteracions que prèviament no havien estat identificades i definir els punts de trencament (Camps et al., 2004, Oncol Rep).Per estudiar la interrelació entre la inestabilitat de microsatèl·lits i la inestabilitat cromosòmica vam utilitzar les línies de càncer de còlon KM12 com a model cel·lular, concloent que ambdós subtipus d'inestabilitats podien coexistir en una mateixa cèl·lula (Camps et al., 2004, Int J Cancer). Aquest model també ens va servir per demostrar l'evolució cariotípica de les cèl·lules originàries del tumor de còlon i les poblacions altament metastàtiques a fetge, concloent que la tetraploïdia era un fenomen genotípic clau per explicar les condicions fenotípiques de la metàstasi.Mitjançant tècniques de citogenètica molecular vam quantificar la inestabilitat cromosòmica, tant la numèrica com l'estructural, de dues línies cel·lulars de càncer de còlon, la HCT-116 (amb MSI), i la SW480 (amb CIN). Per abordar la inestabilitat cromosòmica estructural, ens vam centrar en l'estudi de les reorganitzacions cromosòmiques no clonals per cada divisió cel·lular. Per altra banda, per l'estudi de la inestabilitat numèrica vam recórrer a l'obtenció de cèl·lules binucleades. Aquests experiments ens van donar una idea del dinamisme amb el qual les alteracions numèriques tenien lloc en la línia cel·lular SW480 i els seus subclons. Alhora, ens van permetre deduir quin era l'origen més freqüent de les aneuploïdies en aquestes cèl·lules, la no-disjunció o la pèrdua anafàsica. La línia cel·lular HCT-116, cromosòmicament estable, presentava unes taxes d'alteracions estructurals i d'aneuploïdia molt baixes. Els resultats d'aquest treball ens van permetre demostrar que la inestabilitat cromosòmica numèrica era invariable entre la línia cel·lular parental SW480 i els seus subclons, però per altra banda, la taxa d'inestabilitat cromosòmica estructural augmentava dràsticament quan es generaven els sublcons a partir d'una sola cèl·lula (Camps et al., 2005, FASEB J). Aquests resultats explicarien l'heterogeneïtat estructural que presenten les cèl·lules tumorals in vivo, possible origen de les diferents subpoblacions cel·lulars, i l'elevada taxa d'aneuploïdia.Finalment, vam utilitzar un total de trenta-un tumors de còlon per analitzar les diferències genòmiques i els patrones d'expressió entre tumors que presentaven inestabilitat de microsatèl·lits i tumors que no la presentaven. La utilització de la hibridació genòmica comparada convencional i sobre microxips de cDNA van permetre descriure alteracions genòmiques amb una gran precisió i identificar gens que podrien estar involucrats en la carcinogènesis colorectal (Camps et al., 2006, Carcinogenesis). Alguns dels gens proposats i associats per primera vegada amb el càncer de còlon són RASA1 y FER, y DPEP1, localitzats en les bandes citogenètiques 5q13q21 y 16q24.3, respectivament.

El Agrandamiento gingival farmacológico -AGIF- es un dismorfismo gingival provocado por la inducción de fármacos antiepilépticos -Fenitoína-, antagonistas del calcio -Nifedipina- e inmunosupresores -Ciclosporina-. En los primeros casos de AGIF, se creía que la alteración histopatológica residía en un aumento de la población celular de los fibroblastos -Hipótesis nula-. Este estudio quiere demostrar que esta alteración se produce en la matriz extracelular -fibras colágenas y glicosaminoglicanos de la sustancia fundamental:Los fármacos inductores del Agrandamiento gingival no provocan una hiperplasia gingival secundaria a la proliferación celular de fibroblastos -Hipótesis alternativa-.Para ello se proponen unos objetivos:1-Determinar si cultivos de fibroblastos de encía humana son sensibles a la acción de fármacos inductores de Agrandamiento gingival.2-Observar el efecto de estos fármacos en cultivos primarios de fibroblastos procedentes de las muestras examinadas -estudio de la viabilidad celular-.3-Cuantificar si hay efecto farmacológico en la transcripción génica del Factor de Crecimiento Transformador ß (TGFß), del colágeno y de la colagenasa.4-Observar si hay efecto farmacológico en la síntesis del colágeno y del TGFß.Se tomaron muestras gingivales de pacientes, una de ellas sin relación con la administración de fármacos inductores conocidos de Agrandamiento gingival. Otra muestra se tomó de un paciente transplantado renal sometido desde hacía 2 años a ciclosporina -125 mg/12h-. Se observaronn las muestras a microscopía óptica para ver las características histopatológicas y una porción se fragmentó en explantes y se cultivó en medio esencial para conseguir un número determinado de fibroblastos. Se aplicaron los tres fármacos inductores a unas dosis preestablecidas -según estudios in Vitro consultados- y se observó la Viabilidad de los fibroblastos para el análisis de la proliferación celular. En una segunda fase, se estudió la expresión del mRNA de tres proteínas implicadas en la patogenia del AGIF -colágeno, colagenasa y TGFβ-. Finalmente se observó la traducción proteica del colágeno y del TGFβ.Los resultados permitieron comprobar que no se produjeron cambios en la proliferación fibroblástica para la inducción con nifedipina y ciclosporina. Fenitoína produjo una reducción de esta proliferación como si hubiera un efecto tóxico del fármaco. En la transcripción génica de las proteínas consideradas se observaron aumentos para los tres fármacos inductores. En la expresión proteica del colágeno tampoco se apreciaron cambios.En base a las muestras analizadas se puede considerar que hay una afectación en la matriz extracelular por la inducción farmacológica al comprobar aumentos significativos en mRNA de colágeno, TGFβ y colagenasa. Aunque hay factores que pueden actuar en la post-transcripción que alteren la expresión de estas proteínas y la actividad de la colagenasa. Las conclusiones del estudio han sido:1. Los fibroblastos gingivales de cultivos primarios son sensibles a fármacos inductores de Agrandamiento gingival -fenitoína, nifedipina y ciclosporina-.2. Los fármacos inductores de Agrandamiento gingival no provocan hiperplasia gingival secundaria a la proliferación celular de fibroblastos.3. Los fármacos inductores provocan un incremento significativo de la transcripción del TGFß, colágeno y colagenasa.4. Los fármacos inductores no producen un incremento de la traducción del colágeno, con repercusión en la matriz extracelular.

De las numerosas discapacidades que pueden afectar a la humanidad, la lesión o enfermedad grave de la médula espinal constituye una de las calamidades más devastadoras en la vida de una persona. Recientemente, se ha producido un progresivo interés en el estudio de las alteraciones crónicas de la función cardiovascular, causa de una reducción de la capacidad al ejercicio de muchos lesionados medulares, así como del aumento de la morbi-mortalidad.Datos recientes muestran que las alteraciones cardiovasculares se han convertido en la primera causa de mortalidad entre las personas afectas de una LM.La posibilidad de conocer con detalle estas alteraciones representa el primer paso de cara a reducir factores de riesgo y así posibilitar mejoras en la calidad de vida y longevidad en los lesionados medulares.En las personas afectas de una lesión medular, la capacidad física se encuentra reducida debido a la pérdida directa del control motor y de la regulación simpática por debajo del nivel lesional. Los clínicos e investigadores en el campo de la neurorrehabilitación necesitan encontrar y poder comparar valores para los diferentes componentes de la actividad física (consumo de oxígeno, fuerza muscular de miembros superiores y función respiratoria), de cara a determinar cuales son los focos de atención de la rehabilitación. Es necesario poder monitorizar los cambios de la actividad física para conocer la eficacia y efectividad de los programas de rehabilitación a los que son sometidos las personas que han sufrido una lesión medular. El objetivo de la tesis, es la de integrar los diferentes componentes de la actividad física del sujeto que ha sufrido una lesión medular, su adaptación fisiológica al ejercicio, el análisis de que factores pueden influir en la calidad de vida de este colectivo, el análisis de los valores cardiorrespiratorios en respuesta al ejercicio comparados con sujetos normales y cuales son las posibles actuaciones que podemos realizar de cara a reducir los factores de riesgo cardiovascular, más habituales en los lesionados medulares que en la población general, y en definitiva, intentar incidir en parámetros de calidad de vida. Como conclusiones destacaremos que la adaptación a la actividad física en esta población muestra unas características específicas y, deben ser evaluadas de esta manera, proponiendo un cálculo teórico de consumo máximo de 02 diferente en los lesionados medularesel. Asimismo debemos intentar incrementar la actividad física en los lesionados medulares, ya que el desplazamiento en silla de ruedas o los ejercicios realizados en un programa de rehabilitación convencional no son suficientes de cara a mejorar indicadores de salud. El suplemento con ácidos grasos del grupo omega-3, aunque parece que puede reducir la mortalidad por enfermedad cardiovascular en la población LM estudiada, no se observaron modificaciones en el pérfil lipídico como factor de riesgo. Finalmente, el suplemento con ácidos grasos del grupo omega-3 ha demostrado que mejora de forma significativa la capacidad funcional de los lesionados medulares, sobre todo en los diferentes parámetros relacionados con la evaluación de la fuerza.

El escaldado superficial es una alteración fisiológica que se manifiesta en manzanas y perasdespués de un periodo de frigoconservación, durante la comercialización de los frutos. Lossíntomas se caracterizan por manchas irregulares en la piel de color marrón más o menososcuro. Pese a no afectar al sabor ni a la textura, esta alteración causa importantes pérdidaseconómicas, ya que en el mercado europeo no se admiten frutos con síntomas de escaldadopara el consumo en fresco. La variedad de manzanas Granny Smith es especialmente sensible,pudiendo llegar a alcanzar incidencias del orden del 100%, tras varios meses defrigoconservación.Para un control efectivo del escaldado superficial es importante conocer el origen bioquímicode la alteración, el cual todavía no ha sido determinado completamente. Se cree que estárelacionado con la oxidación del ct-fanasemo, compuesto volátil de la cutícula de los frutos.Los productos de esta oxidación, comúnmente conocidos como trieno conjugados, podríanalterar las células epidérmicas causando su desorganización y muerte, y por tanto la alteraciónen el color de la piel.Hasta la fecha, el escaldado superficial se ha controlado mediante tratamientos poscosecha condifenilamina o con etoxiquina, siendo ambos antioxidantes muy efectivos para evitar sudesarrollo. Sin embargo, existe una preocupación creciente por el nivel de residuos tóxicos enlos frutos, que ha obligado a buscar nuevos métodos de control. Desde hace unos años se estánensayando otros compuestos menos polémicos, tanto a nivel de legislación como a nivel deconsumidor. Así, los recubrimientos a base de esteres de sacarosa, formulados únicamente coningredientes permitidos en los alimentos, o los antioxidantes asimismo de uso alimentario,tienen una mayor aceptación. Los métodos físicos, consistentes en la modificación de laconcentración gaseosa durante la conservación, también son bien considerados y además estánconsiguiendo resultados muy satisfactorios.El objetivo del presente estudio ha sido ensayar diversos tratamientos, alternativos a lautilización de difenilamina, para el control del escaldado superficial. Asimismo se evaluó elefecto de los tratamientos a nivel fisiológico y cualitativo, para intentar determinar sumecanismo de acción sobre la alteración.Los ensayos se llevaron a cabo con manzanas Granny Smith (Malus domestica Borkh.)recolectadas en Lleida, en campos comerciales. En un estudio de cuatro años, correspondientea cuatro campañas frutícolas, se ensayaron diversos métodos de control para el escaldado,concretamente tratamientos poscosecha durante las dos primeras, y conservación enatmósferas controladas durante las dos últimas. Las manzanas se trataron mediante bañosposcosecha con disoluciones acuosas de difenilamina (DPA); de "Semperfresh" (recubrimientosucroéster) aplicado solo o junto con butilhidroxitolueno, palmitato de ascorbiloy/o galato depropilo o ct-tocoferol; y de CaCl2. Los baños se realizaron inmediatamente después de lacosecha o a las 6 semanas de permanecer los frutos en la cámara frigorífica de atmósferanormal, para evaluar el efecto del momento de aplicación sobre la eficacia del tratamiento. Losfrutos control no se bañaron. En las dos últimas campañas los frutos se recolectaron en dosfechas distintas, para evaluar el efecto del estado de madurez en el momento de la recolecciónsobre la incidencia de alteración. Tras cada cosecha, los frutos se conservaron en cámaras deatmósfera controlada (AC) con distintas condiciones gaseosas: AC estándar, AC con bajooxigeno (LO) y AC con muy bajo oxígeno (ULO). Como control los frutos se conservaron enatmósfera normal. En la cuarta campaña se ensayó la conservación en atmósfera normal, enAC estándar, o en LO, con y sin tratamiento previo de DPA.Las determinaciones analíticas se realizaron después de cada cosecha y después de variosmeses de conservación, durante los 10 días siguientes a la salida de la cámara, considerándoseeste intervalo de tiempo a 20 °C el periodo de vida útil del fruto. En las tres primeras campañasse realizaron las siguientes evaluaciones fisiológicas: producción de etileno, contenido de ácido1-aminociclopropano-l-carboxflico (ACC), actividad de la enzima ACC oxidasa y producciónde CO2 (para la medida de la respiración de los frutos). Como parámetros cualitativos sedeterminaron el peso, la firmeza, la acidez y el contenido en sólidos solubles. La incidencia deescaldado se evaluó visualmente y se determinó un índice de escaldado en base al porcentajede superficie de fruto afectada. En las dos últimas campañas se evaluó también el contenidoen la piel del frutos de a-farnaseno y de compuestos trieno conjugados (CTH).Adicionalmente, en este trabajo se han considerado los resultados obtenidos en el"Departament of Agricultural Botany" de la Universidad de Reading (Reino Unido), donde serealizaron ensayos paralelos a los de Lleida, y fruto de ambos se elaboraron dos publicacionesque se presentan en esta Tesis en el apartado correspondiente a los resultados.El mecanismo de acción de los diversos tratamientos sobre el metabolismo del etileno fuedistinto. El recubrimiento con Semperfresh creó una atmósfera interna en el fruto con unelevado nivel de CO2 que redujo la producción de etileno, reduciendo el contenido de ACC.La adición al recubrimiento de palmitato de ascorbilo bajó el nivel de O2 interno, lo cual pudoafectar a la actividad de la enzima ACC oxidasa. La concentración gaseosa mantenida en lascámaras de AC también afectó a la síntesis de etileno, inhibiéndola. Los baños poscosecha conCaCl2 disminuyeron la producción de etileno pero sin afectar al contenido de ACC ni a laactividad de la ACC oxidasa. El tratamiento con DPA, en cambio, no redujo la producción deetileno después de 4 y 6 meses de frigoconservación, detectándose niveles semejantes a los delcontrol.Los tratamientos que retrasaron el proceso de maduración, al inhibir la producción de etileno,retrasaron también el descenso de los parámetros de calidad durante la conservación en frío,especialmente la firmeza y la acidez. Los frutos recubiertos con Semperfresh presentaronmejores índices de calidad, respecto a los parámetros estudiados, que los tratados con DPAo los frutos control. Asimismo, los frutos conservados en AC estándar o con bajo O2mantuvieron valores de firmeza, acidez y sólidos solubles superiores a los alcanzados enatmósfera normalEl tratamiento con DPA evitó o redujo el desarrollo del escaldado superficial, confirmándosesu eficacia en el control de esta alteración. El recubrimiento con Semperfresh aplicado solo ojunto con un antioxidante de uso alimentario no evitó el desarrollo de escaldado, en lascondiciones del presente estudio. Solamente la aplicación de Semperfresh más palmitato deascorbilo, y también Semperfresh más palmitato de ascorbilo y galato de propilo, ejercieronun limitado control. El tratamiento con CaCl2 fue el más efectivo de los baños poscosecha,exceptuando el DPA. En general, la aplicación de los tratamientos a las 6 semanas de lafrigoconservación fiïe menos eficaz que la aplicación realizada inmediatamente después de lacosecha. Adicionalmente, la interrupción de la frigoconservación para aplicar el tratamiento,modificó los parámetros de calidad de los frutos, reduciendo la firmeza, la acidez y elcontenido en sólidos solubles.La conservación en AC, especialmente con baja concentración de O2, redujo la incidencia deescaldado, a niveles equiparables a los obtenidos con DPA. La menor incidencia de laalteración tuvo una alta correlación positiva con el contenido de CTH determinados alprincipio del periodo de frigoconservación y una alta correlación negativa con los valores defirmeza y acidez, determinados al final de dicho periodo.La susceptibilidad al escaldado superficial varió en función de la fecha de cosecha. Todos lostratamientos ensayados, incluido el DPA, perdieron eficacia en frutos de cosechas tempranas.El comportamiento de esta alteración y la manifestación de sus síntomas es típico de laenfermedad del frío (más conocida como "chilling injury"). La mayor susceptibilidad de losfrutos en estado prematuro, nos ha llevado a considerar que las manzanas de la variedadGranny Smith son sensibles al frío en función de su edad fisiológica, de manera que comomenos avanzado sea su estado de madurez, mayor es la sensibilidad al frío.Palabras clave: Malus domestica, manzanas, Granny Smith, escaldado superficial, fisiologíaposcosecha, etileno, calidad, difenilamina, antioxidantes de uso alimentario, recubrimientos,calcio, frigoconservación, atmósfera controlada, a-farnaseno, compuestos trieno conjugados.

Los mecanismos moleculares implicados en la progresión de la leucemia mieloide crónica (LMC) a la crisis blástica (CB) permanecen en gran medida por dilucidar. De cara a profundizar en el estudio de estos mecanismos, en la presente tesis se estudiaron las alteraciones de los genes p16 y survivina en esta enfermedad. Así, en el primer trabajo se analizó mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real y de PCR convencional semicuantitativa la presencia de deleciones de p16 en una serie de 42 pacientes con LMC Ph-positiva estudiados de forma secuencial en su fase crónica y en la CB. Además, se determinó el estado de metilación de p16 en las distintas fases de la enfermedad y se investigó la posible relación de las alteraciones del citado gen con las características clínico-hematológicas de los pacientes y el pronóstico de la CB. Los resultados mostraron que 6 de las 21 muestras (29%) de pacientes con CB linfoide tenían deleciones homocigotas de p16, frente a la ausencia total de éstas en la fase crónica y en la CB mieloide. Por otra parte, ninguno de los casos analizados presentó hipermetilación del promotor de p16. A su vez, no se observó la existencia de un perfil clínico-hematológico característico de la CB con deleción de p16, a excepción de su fenotipo linfoide exclusivo. Por último, la respuesta al tratamiento y la supervivencia de los pacientes con CB linfoide no dependió de la existencia de deleciones de p16. El objetivo del segundo trabajo fue analizar mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real el patrón de expresión del gen de survivina en una serie de 16 pacientes con LMC Ph-positiva estudiados de forma secuencial en las distintas fases evolutivas de la enfermedad. Asimismo, se investigaron las posibles correlaciones entre la expresión de survivina, el índice de proliferación celular y el perfil clínico de la LMC. Los resultados evidenciaron una sobreexpresión significativa de survivina tanto en la fase crónica como en la CB de la LMC, en comparación con los niveles detectados en granulocitos de donantes sanos. Con todo, los niveles de expresión de survivina fueron considerablemente mayores en la CB que en la fase crónica, con una mediana siete veces superior, siendo el incremento de expresión más pronunciado en las CB de estirpe mieloide que en las linfoides. Por otro lado, se observó un incremento significativo de la proliferación celular en la CB, con una mediana de expresión de Ki-67 casi tres veces superior a la de la fase crónica, sin registrarse diferencias significativas en función del fenotipo de la CB. A pesar de que tanto survivina como Ki-67 experimentaron un incremento de expresión en la CB, no se observó una correlación significativa entre ambos parámetros. Tampoco se observó una asociación significativa entre los niveles de survivina y el perfil clínico-hematológico de la CB.Los trabajos que conforman la presente tesis han permitido ampliar el conocimiento acerca de dos alteraciones moleculares (deleción homocigota de p16, sobreexpresión de survivina) que se asocian frecuentemente con la progresión de la LMC a la CB, lo que sugiere su posible implicación en la patogénesis de la CB. / The molecular abnormalities involved in the evolution of chronic myeloid leukemia (CML) to the blast crisis (BC) are poorly understood. The aim of the present thesis was to contribute to a better knowledge of the mechanisms involved in CML progression. In the first study, a sequential assessment by both quantitative real-time PCR and conventional semiquantitative PCR of p16 exon 2 deletions was performed in 42 CML patients in whom paired DNA samples from the chronic phase and the BC were available. The methylation status of the promoter region of p16 gene was also studied by methylation-specific PCR. Homozygous p16 deletions were detected in 6 of 21 patients with lymphoid BC, whereas they were not observed in chronic phase CML nor in 21 patients with myeloid BC. Hypermethylation of p16 gene was not detected in any of the lymphoid BC cases. The clinical profile, therapeutic response and survival did not significantly differ in p16 deleted and p16 germline lymphoid BC patients.In the second work, the expression of the survivin gene was studied by quantitative real-time PCR in the chronic phase of CML and at BC in 16 patients in whom sequential RNA samples from the two phases of the disease were available. Survivin was significantly overexpressed both in the chronic phase and the BC as compared to granulocytes from controls. In BC, survivin expression was 7-fold higher than in chronic phase, with such an increase being more pronounced in the myeloid than in the lymphoid cases. Despite overexpression of both survivin and Ki-67 at BC, no significant correlation between their expression levels was observed. These data support a possible role for p16 gene deletions and survivin overexpression in the pathogenesis of the progression of CML.

DE LA TESI:El diagrama complet de les pertorbacions genètiques i epigenètiques que afecten el càncer colorectal (CCR) està lluny de ser totalment conegut. L'LOH és una de les alteracions més recurrents en CCR així com en d'altres neoplàsies. Acostuma a ser un bon indicador de la presència de gens rellevants per a la carcinogènesi. L'estudi de les alteracions somàtiques en gens situats en aquestes regions recurrents de desequilibri al·lèlic ha estat fonamental en el passat per la identificació d'alguns dels gens supressors tumorals més coneguts, com és el cas de p53, Smad4, p16, APC o Rb. Els desequilibris al·lèlics a 4p s'han associat amb una major agressivitat i un pitjor pronòstic en pacients de CCR, malgrat que els gens diana d'aquests alteracions resten encara per ser identificats. En aquesta tesi s'ha dut a terme un treball d'anàlisi genètica integral per a una regió crítica situada a 4p15 am la intenció de localitzar-hi els gens que més probablement estiguin contribuint a la progressió tumoral. Hem realitzat un exhaustiu treball d'al·lotipat mitjançant la utilització de marcadors microsatèl·lit, sobre un model de tumors xenoempeltats en ratolins atímics. Hem identificat una regió crítica en al que els gens candidats han estat analitzats d'acord a les seves possibles alteracions somàtiques genètiques i/o epigenètiques. També hem analitzat els patrons d'expressió dels gens candidats per tal d'identificar possibles alteracions transcripcionals. Mitjançant prediccions de regulació transcripcional bioinformàtiques hem trobat que PI4K2B i STIM2 són dos gens regulats per TCF4/B-catenina. Això ha estat confirmat mitjançant immunoprecipitació de cromatines. Hem avaluat el valor pronòstic de les alteracions en aquests dos gens i el seu valor com predictors de la resposta al tractament basat en el 5-FU de pacients de CCR. A més, hem realitzat experiments de depleció mitjançada per siRNA sobre línies cel·lulars de CCR, alhora que hem transfectat de forma estable aquests dos gens. Finalment hem realitzat assajos de formació de tumors en ratolins immunodeprimits per comprovar si la sobreexpressió dels nostres gens candidats té o no un efecte en la formació dels tumors generats a partir de línies cel·lulars. Els patrons de LOH identificats a 4p descarten que, com s'havia proposat, es doni en l'estadi metastàtic una acumulació d'aquestes alteracions. L'LOH detectat no correlaciona amb la dosi gènica, és a dir que les pèrdues d'heterozigositat no comporten una pèrdua de material genètic i probablement són la conseqüència de processos de recombinació mitòtica i/o pèrdua i duplicació associats a un escenari d'inestabilitat cromosòmica. Els gens d'aquesta regió crítica no són portadors de mutacions, microdelecions ni delecions en homozigosi, ni tampoc presenten alteracions en els patrons de metilació de les seves regions promotores. Per contra, vam trobar que PI4K2B i STIM2 estaven significativament sobreexpressats en pacients afectes de CCR i metàstasi hepàtiques (MH) independentment de la presència o no d'LOH, i que, a més, la seva transcripció estava sot control del complex TCF4/B-catenina. Els nivells elevats de PI4K2B, tant de proteïna com d'mRNA estan assocats a un millor pronòstic i una millor resposta al tractament quimioteràpic dels pacients de CCR. Finalment, els estudis de depleció amb siRNA han demostrat que el silenciament d'aquests dos gens comporta un increment significatiu de la proliferació cel·lular i que la sobreexpressió en línies cel·lulars de STIM2 resulta en una disminució del volum tumoral i per tant té un efecte de supressió de la proliferació. Conclusions: Hem identificat PI4K2B i STIM2 com a gens diana de les alteracions recurrents a 4p15 i hem demostrat que són dianes transcripcional de la via de B-catenina. La sobreexpressió d'aquests dos gens té un efecte supressor de la proliferació cel·lular, que alhora, té un impacte en el pronòstic i el tractament dels pacients de càncer colorectal.

La hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) comprende un conjunto de trastornos hereditarios de la esteroidogénesis, causados por la deficiencia de alguna de las enzimas necesarias para la conversión del colesterol en cortisol. El más frecuente es el déficit en 21-hidroxilasa, responsable de cerca del 90% de los casos de HSC. El déficit en 21-hidroxilasa es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva, causado por una alteración genética en el gen CYP21B que codifica la enzima.Esta enfermedad presenta un espectro muy amplio de manifestaciones clínicas; desde formas severas que se presentan al nacimiento, en las que la virilización puede ir o no acompañada de un síndrome pierde sal, hasta formas más leves en que los signos de virilización se presentan más tardíamente. La incidencia de las formas clásicas de este déficit, oscila alrededor de 1:10.000-15.000 nacimientos, mientras la de las formas no clásicas se ha estimado en 1:1.000 en la población blanca, con marcadas variaciones étnicas.El objetivo ha sido la caracterización clínica, biológica y genética de la HSC por déficit en 21-hidroxilasa de una población de la Comunitat Autònoma de Catalunya, con el fin de poder realizar un diagnóstico etiológico concluyente y establecer el consejo genético familiar completo.Han colaborado 53 familias (106 cromosomas no emparentados) con al menos un hijo diagnosticado de HSC por déficit en 21-hidroxilasa, siendo el total de individuos estudiados de 214. De este total, 71 son pacientes que según los síntomas clínicos fueron clasificados en: 13 SW; 5 SV y 53 NC; 102 son progenitores y 41 son hermanos de dichos pacientes, ninguno de ellos clínicamente afecto.Para la determinación de la función hormonal se practicó una prueba de estimulación con corticotropina (test de ACTH), con valoración de las concentraciones plasmáticas de 17-hidroxiprogesterona antes y tras 30 minutos de la inyección. La determinación de los antígenos de Clase I y Clase II del Sistema HLA, se realizó mediante la técnica de Microlinfocitotoxicidad. El análisis genético consistió en la detección de grandes reordenamientos mediante la técnica de "Southern blot", y la detección de nueve de las mutaciones puntuales más comunes mediante el diseño de una nueva metodología en la que se emplean dos estrategias según la mutación a detectar: ganancia o pérdida de al menos una diana de restricción en el producto de PCR amplificado a partir de DNA genómico o creación de una diana de restricción por amplificación (ACRS-PCR) y posterior digestión con una enzima de restricción apropiada.El test de ACTH se confirma como fiable, ya que no se observaron falsos positivos ni falsos negativos en los valores obtenidos de 17-hidroxiprogesterona post estimulación. El nomograma de 17-hidroxiprogesterona proporciona un patrón hormonal que facilita, en la mayoría de los casos, el diagnóstico de las distintas formas de presentación clínica del déficit. No se observó la presencia del antígeno HLA-Bw47 en ninguno de los grupos analizados. Las formas no clásicas se encuentran significativamente asociadas al haplotipo HLA-B14-DR1, mientras que las formas clásicas al antígeno HLA-B5(w51).La metodología utilizada para el análisis molecular del gen ha permitido detectar la mutación causal en el 89,62% de los cromosomas afectos, evaluados globalmente, consolidándose ésta como altamente efectiva en el diagnóstico de esta patología. Las mutaciones más frecuentes observadas han sido: Intrón 2 (50%) en SW; Intrón 2 (50%) y I172N (16,6%) en SV y V281L (61,5%) en NC. El análisis de los pedigrees ha permitido diagnosticar veintiséis formas crípticas y revelar en dos casos la presencia de mutaciones originadas de novo. La concordancia hallada entre el genotipo y el fenotipo ha sido del 97,2%, de ahí, que las predicciones desde el genotipo han de ser hechas todavía con gran cautela.

L'atròfia muscular espinal (AME) és una malaltia autosòmica recessiva que es caracteritza per la degeneració i pèrdua de les neurones motores de la banya anterior de la medul·la espinal, el que porta a una paràlisi muscular progressiva a causa de la denervació i atròfia de les fibres musculars. La seva incidència és d'1 de cada 6000/10000 naixements i la freqüència de portadors a la població és aproximadament 1 en 50. La meitat dels casos són formes greus (tipus I) que moren abans dels dos anys d'edat. L'AME està causada per l'absència del gen SMN1 (Survival Motor Neuron) que codifica una proteïna completa i funcional. En canvi, tots els afectats tenen una forma homòloga d'aquest gen, SMN2 que codifica una proteïna incompleta que no pot evitar les manifestacions de la malaltia. Els objectius d'aquesta tesi han estat l'estudi de la malaltia durant el desenvolupament fetal i el període neonatal als teixits principalment afectats (medul·la espinal i múscul esquelètic), a fi i efecte de caracteritzar els mecanismes que porten a la pèrdua de les neurones motores i a l'afectació muscular. En primer lloc, es va poder detectar un increment de la mort neuronal per apoptosi a la banya anterior de la medul·la espinal a fetus AME tipus I respecte als controls. Les neurones motores romanents no van presentar canvis morfològics aparents. Paradoxalment, en el període postnatal es van detectar signes de degeneració neuronal però no d'apoptosi, indicant l'existència de dos mecanismes: un prenatal, amb un augment de la vulnerabilitat del DNA i un altre posterior que porta a la degeneració de les neurones motores. A les neurones motores dels fetus AME es va observar també una regulació alterada del patró d'expressió de les proteïnes anti-apotòtiques Bcl-2 i Bcl-XsubL que podria fer-les més susceptibles a la mort cel·lular programada que s'observa durant el desenvolupament. Al múscul esquelètic de fetus AME es van detectar canvis tant en la mida dels miotubs com en la distribució al comparar-los amb els control, encara que no es va detectar un augment en el nombre de cèl·lules amb el DNA fragmentat ni una alteració en l'expressió de Bcl-2 i Bcl-XsubL. La funció colinèrgica de les neurones motores fetals es va analitzar mitjançant l'enzim colina acetiltransferasa (ChAT), l'expressió del qual apareix a mida que s'estableixen les unions sinàptiques i el contacte amb el múscul. Es va observar una reducció de la seva expressió als fetus AME respecte els control encara que la proporció de neurones ChAT negatives fou similar en ambdós grups. La disminució global de ChAT a l'AME podria ser deguda al menor nombre de neurones i les neurones romanents tindrien una funció colinèrgica similar a la dels controls. Finalment, es va caracteritzar l'expressió del gen SMN2 a fetus AME comparant-se amb els controls (que presenten SMN1 i SMN2). La proteïna SMN2 té un patró d'expressió temporal i espacial similar al de SMN1 a la medul·la i al múscul, tot i que els nivells són inferiors als AME. En canvi, a teixits no afectats per la malaltia com el ronyó, pulmó o intestí, l'expressió és gairebé idèntica als dos grups. Aquí, SMN2 deu compensar l'absència de SMN1, mentre que la medul·la espinal i el múscul tindrien una regulació més específica de SMN2 que comportaria l'aparició de la malaltia.

La producció de mol·luscs bivalves va moure als anys 2001 i 2002 més de 13 milions d'euros només a Catalunya, corresponents a la comercialització de 5 mil tones de marisc per any; en tot l'Estat Espanyol la producció del 2001 fou de més 256 mil tones. La importància econòmica dels mol·luscs bivalves creix paral·lelament al seu consum arreu del món. No obstant, el caràcter filtrador i bioacumulador d'aquest mol·luscs ha comportat que el seu consum sovint s'hagi vist associat a malalties causades per biotoxines i patògens microbians. L'aplicació de normatives dirigides a controlar aquests factors de risc ha contribuït a la disminució dels problemes sanitaris causats per biotoxines i bacteris d'origen. fecal. Tanmateix, els paràmetres establerts no han estat d'utilitat en el cas dels membres del gènere Vibrio, els quals formen part de la microbiota marina, ni del virus humans, ja que els indicadors bacterians clàssics tenen un comportament molt diferent al d'ambdós grups. En el cas dels virus humans, el problema es veu agreujat per les dificultats tècniques que la seva detecció comporta. És per això que diversos autors han proposat els bacteriòfags de bacteris entèrics com a indicadors. D'altra banda, també s'ha proposat la utilització de virus humans, en concret dels adenovirus detectats mitjançant PCR, com a índex molecular de la contaminació vírica d'origen humà. Amb tot, fins al moment la comunitat científica no ha arribat a un consens ni pel que fa a la tria de l'indicador o indicadors més apropiats ni tampoc pel que fa a un mètode de detecció dels patògens vírics en bivalves. Estudis anteriors a la present tesi han avaluat la contaminació vírica en mol·luscs bivalves i la seva relació amb els diferents microorganismes models proposats; no obstant, aquests estudis s'han dut a terme utilitzant una gran varietat de metodologies i centrant-se en zones de producció molt concretes. En el marc de la Unió Europea, mancava un estudi comparatiu de zones de producció situades en zones geogràficament molt diverses i per tant, molt diferents a tots nivells, però que han de complir certes normatives establertes per la Unió Europea. En aquesta tesi, s'ha validat i estandarditzat un mètode de detecció molecular de virus humans en mol·luscs bivalves molt sensible i de fàcil aplicació. També hem desenvolupat una RT-PCR Multiplex per la detecció simultània d'adenovirus, enterovirus i virus de l'hepatitis A, de forma que es redueix el cost econòmic i temporal que la detecció molecular clàssica comporta. D'altra banda, durant 18 mesos s'ha estudiat de forma simultània la distribució de virus humans en mol·luscs bivalves i de diferents microorganismes proposats com a indicadors en diferents àrees de producció d'Espanya, Grècia, Regne Unit i Suècia. Durant aquest estudi he aïllat dos dels virus de major importància en l'etiologia de malalties associades al consum de marisc, virus de l'hepatitis A i norovirus, en mol·luscs bivalves destinats al consum humà i procedents de zones de producció d'Espanya, Grècia i Regne Unit. Els adenovirus humans són els virus més prevalents en totes les àrees estudiades i presentaren una relació estadísticament significativa amb la resta de virus humans estudiats, fets que aconsellen la seva utilització com a índex molecular de contaminació vírica d'origen humà. Pel que fa als bacteriòfags de bacteris entèrics que també han estat proposats com a microorgaismes model, les anàlisis mostraren que els fags F-específics d'ARN són l'únic grup de fags que presenta una relació estadísticament significativa amb tots els virus humans, tot i això, la capacitat predicitiva dels fags F-ARN és més forta amb els norovirus i en zones amb nivells d'Escherichia coli més elevats, de fet, serien útils com a model de norovirus al Regne Unit.

En l'experiència clínica, els foniatres i logopedes especialitzats en trastorns de la veu han afirmat que les disfonies tenen relació amb la personalitat del pacient. Estudis previs de Roy i Bless indiquen una relació entre els trets de personalitat neuroticisme i extraversió, definits per Eysenck, i les disfonies funcionals i els nòduls vocals. Aquests estudis proposen que les teories de Gray poden explicar aquesta relació. Gray proposa l'existència de dos sistemes biològics d'activació i d'inhibició conductual que responen a una major sensibilitat del subjecte a les recompenses i els càstigs, respectivament. El 2011, Torrubia et al. presenten, un qüestionari per a la valoració d'aquests dos sistemes. Partint dels treballs de Roy i Bless, l'estudi que presentem pretén aportar evidències sobre la influència dels trets de personalitat en la presència d'alteracions de la veu. S'han administrat els qüestionaris EPQ-RS d'Eysenck i SCSRQ de Torrubia a un grup experimental de 141 pacients atesos per alteracions de la veu i ha un grup control de 99 persones sense alteracions vocals. A tots ells se'ls va administrar també el qüestionari Voice Handicap Index-10 i es van recollir diverses mostres de la seva veu que van ser analitzades amb el programa MDVP per obtenir el paràmetre Dysphonia Severity Index descrit per Wuyts, i van ser valorades amb el paràmetre Grade del GRBAS d'Hirano per cinc logopedes experts en alteracions vocals. Els resultats han estat analitzats amb el paquet estadístic PASW 18. Els resultats mostren diferències estadísticament significatives entre el grup experimental i el grup control en relació al tret neuroticisme en el test EPQ (z = 6.951, p <.01) i en relació a la sensibilitat al càstig en el test SCSRQ (z = 2.207; p <.05). Les dades mostren també diferències estadísticament significatives entre els dos grups pel que fa als valors del DSI (z = 9.320, p <.01). Per a aquesta mesura s'ha establert un valor de tall, amb la corba ROC, en la puntuació 3.7. També s'han obtingut diferències significatives en les puntuacions totals del VHI-10 (z = 10.351, p <.001) i un valor de tall de 7. El paràmetre G ha presentat diferències significatives (z = 10.959, p <.001) i un valor de tall en la puntuació 1. Les tres mesures de la disfonia correlacionen amb els resultats dels qüestionaris de personalitat per als trets neuroticisme (DSI rs = -. 437, p> .001; VHI-10 rs =.416, p> .001; paràmetre G rs = .446, p> .001) i sensibilitat al càstig (VHI-10 rs = .231, p> .01; paràmetre G rs = .144, p> .05). Els resultats confirmen les informacions aportades per investigacions anteriors respecte a la influència del neuroticisme en la disfonia. En el mateix sentit, podem concloure que el tret introversió està més present en la població amb alteracions de la veu. Els resultats de l'escala de sensibilitat al càstig permeten pensar que les teories de Gray poden orientar sobre els factors emocionals en les alteracions vocals. Així mateix, els resultats permeten concloure que els instruments de mesura de la qualitat vocal són fiables, complementaris i vàlids per a la discriminació de persones que pateixen alteracions de la veu. / En la experiencia clínica, los foniatras y logopedas especializados en trastornos de la voz han afirmado que las disfonías tienen relación con la personalidad del paciente. Estudios previos de Roy y Bless indican una relación entre los rasgos de personalidad neuroticismo y extroversión, definidos por Eysenck, y las disfonías funcionales y los nódulos vocales. Estos estudios proponen que las teorías de Gray pueden explicar esta relación. Gray propone la existencia de dos sistemas biológicos de activación y de inhibición conductual que responden a una mayor sensibilidad del sujeto a las recompensas y los castigos, respectivamente. En 2011, Torrubia et al. presentaron un cuestionario para la valoración de estos dos sistemas. Partiendo de los trabajos de Roy y Bless, el estudio que presentamos pretende aportar evidencias sobre la influencia de los rasgos de personalidad en la presencia de alteraciones de la voz. Se han administrado los cuestionarios EPQ-RS de Eysenck y SCSRQ de Torrubia a un grupo experimental de 141 pacientes atendidos por alteraciones de la voz y a un grupo control de 99 personas sin alteraciones vocales. A todos ellos se les administró también el cuestionario Voice Handicap Index-10 y se recogieron diversas muestras de su voz que fueron analizadas con el programa MDVP para la obtención del parámetro Dysphonia Severity Index descrito por Wuyts, y fueron valoradas con el parámetro Grade del GRBAS de Hirano por cinco logopedas expertos en alteraciones vocales. Los resultados han sido analizados con el paquete estadístico PASW 18. Los resultados muestran diferencias estadísticamente significativas entre el grupo experimental y el grupo control en relación al rasgo neuroticismo en el test EPQ (z = 6.951; p< .01) y en relación a la sensibilidad al castigo en el test SCSRQ (z = 2.207; p< .05). Los datos muestran también diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos con respecto a los valores del DSI (z = 9.320, p < .01). Para esta medida se ha establecido un valor de corte, con la curva ROC, en la puntuación 3.7. También se han obtenido diferencias significativas en las puntuaciones totales del VHI-10 (z = 10.351; p< .001) y un valor de corte de 7. El parámetro G ha presentado diferencias significativas (z = 10.959; p< .001) y un valor de corte en la puntuación 1. Las tres mediciones de la disfonía correlacionan con los resultados de los cuestionarios de personalidad para los rasgos neuroticismo (DSI rs = -.437, p>.001; VHI-10 rs = .416, p>0.001; parámetro G rs = .446, p>0.001) y sensibilidad al castigo (VHI-10 rs = .231, p>.01; parámetro G rs = .144, p>.05). Los resultados confirman las informaciones aportadas por investigaciones anteriores respecto a la influencia del neuroticismo en la disfonía. En el mismo sentido, podemos concluir que el rasgo introversión está más presente en la población con alteraciones de la voz. Los resultados de la escala de sensibilidad al castigo permiten pensar que las teorías de Gray pueden orientar sobre los factores emocionales en las alteraciones vocales. Asimismo, los resultados permiten concluir que los instrumentos de medida de la calidad vocal son fiables, complementarios y válidos para la discriminación de personas que sufren alteraciones de la voz. / In clinical experience, phoniatricians and speech therapists who specialize in voice disorders have argued that dysphonia is related to the patient's personality. Previous studies by Roy and Bless indicate a relationship between the personality traits neuroticism and extraversion, defined by Eysenck, and functional dysphonia and vocal nodules. These studies suggest that Gray's theories can explain this relationship. Gray proposes the existence of two biological systems of activation and behavioral inhibition, which respond to increased sensitivity of the subject to reward and punishment, respectively. In 2011, Torrubia et al. presented a questionnaire for the assessment of these two systems. Based on the work of Roy and Bless, the study presented aims to provide evidence on the influence of personality traits in the presence of voice disorders. Administered questionnaires were Eysenck's EPQ-RS and SCSRQ of Torrubia to an experimental group of 141 patients with voice disorders and a control group of 99 people with no vocal alterations. All of them answered the Voice Handicap Index-10 questionnaire and several samples of their voices were analyzed with the MDVP program so as to obtain Dysphonia Severity Index parameter described by Wuyts. These samples were evaluated with the parameter Grade of Hirano’s GRBAS by five speech pathologists specialized in voice disorders. The results were analyzed using the statistical package PASW 18. The results showed statistically significant differences between the experimental and control groups in relation to trait neuroticism on the EPQ test (z = 6951, p <.01) and in relation to sensitivity to punishment in SCSRQ test (z = 2207; p <.05). The data also showed statistically significant differences between the two groups regarding DSI values (z = 9320, p <.01). For this measure cutoff with ROC curve has been established in the score 3.7. Significant differences were also obtained in total scores of HIV-10 (z = 10,351, p <.001) and a cutoff value of 7. The parameter G has presented significant differences (z = 10,959, p <.001) and a cutoff in the score 1. All three measures of dysphonia correlated with the results of the questionnaires of personality traits neuroticism (r = -. 437 DSI, p> .001; VHI-10 r = .416, p> .001; parameter G r = .446, p <.001) and sensitivity to punishment (VHI-10 r = .231, p> 0.01; parameter G r = .144, p> .05). The results confirm the information provided by previous research on the influence of neuroticism in dysphonia. Also, we can conclude that introversion trait is more present in people with voice disorders. The relationship between the results of the sensitivity scale to punishment suggests that Gray's theories can shed some light on emotional factors in voice disorders. Finally, the results suggest that measurement instruments used for voice quality are reliable, complementary and valid for the discrimination of people with voice disorders.