Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O CD3 como alvo terapêutico de anticorpos, pode induzir a depleção parcial dos linfócitos T circulantes, provocando uma imunossupressão, que pode ser explorada clinicamente. Com isso, a busca por anticorpos anti-CD3 humanizados tem relevância biotecnológica. Entretanto, o CD3 é um antígeno de membrana de difícil preparação. Desse modo, procuramos obter um antígeno mimético ao CD3 que se ligue com alta afinidade a um anticorpo conhecidamente imunomodulador, o anticorpo monoclonal OKT3, de forma a facilitar a busca de novos anticorpos terapeuticos. Para isso utilizou-se o biopanning, por phage display, para selecionar peptídeos ligantes, a partir de uma biblioteca de peptídeos randômicos constrita de sete resíduos, PhDC7C (Biolabs). Um protocolo de seleção baseado em seleção negativa com IgG2a de camundongo, seguido de três ciclos sucessivos de seleção positiva. Para validação desses biopanning foi feita a titulação dos ciclos comparando-os a uma curva padrão, usando a biblioteca original amplificada por PCR, que foi utilizada para normalizar a quantidade de DNA. Foram obtidas sub-bibliotecas com um título em torno de 106 pfu/mL. Essas sub-bibliotecas foram analisadas por sequenciamento de DNA de alto desempenho e por bioinformática em busca de peptídeos selecionados especificamente pelo paratopo do anticorpo OKT3, um anti-CD3. Com a análise de bioinformática foi permitido à comparação das sequencias obtidas aos bancos de dados, existentes. Assim, foram excluídos, os peptídeos conhecidamente resultante de seleção inespecífica. Em conclusão, não foi possível encontrar um peptídeo ligante ao alvo de interesse. Provavelmente o viés encontrado na biblioteca, interferiu no sucesso da técnica, mas modificações no protocolo de seleção deverão ser considerados na seleção de peptídeos ligantes, que sirvam de mimotopos. / Anti-CD3 antibodies, a target for antibody therapy, may induce partial depletion of circulating T lymphocytes, causing immunosuppression, which can be explored clinically. Thus, a search for humanized anti-CD3 antibodies has a biotechnological relevance. However, CD3 is a difficult-to-prepare membrane antigen. Thus, we aim to obtain a CD3 antigen mimetic that binds with high affinity to a known immunomodulatory anti-CD3, the mouse monoclonal antibody OKT3. We use a seven-residue, phage display peptide library PhDC7C (Biolabs) to select for OKT3 mAb ligands peptides. The screening involves a negative selection with mouse IgG2a and three successive positive selection cycles. The validation of biopanning was done with PCR, which was used to quantify the amount of DNA. Sub-libraries with a titer of about 106 pfu / ml were obtained. These sub-libraries were analyzed by high-throughput DNA sequencing and by bioinformatics in search peptides selected specifically for the paratope of the OKT3 molecule. With a bioinformatics analysis it was possible to compare the sequences with the existing databases. Thus, peptides known as non-specific binding were excluded. However, a peptide binding to the target of interest could not be found. Further improvement in selection techinique may yield to specific OKT3 binding mimotopes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / A doença de Chagas afeta cerca de 8 milhões de pessoas ao redor do mundo e cerca de um terço dessas desenvolve as formas graves da doença, sendo o maior caso de cardiomiopatia causada na América Latina e também está entre o maior causador de mortes dentro das doenças tropicais negligenciadas. Mesmo sendo conhecida há 111 anos, os mecanismos que desenvolvem a patologia continuam um enigma, principalmente se tratando de estudos em humanos. Apesar disso, hoje é indiscutível o papel da resposta imune do hospedeiro frente ao agente etiológico, o Trypanosoma cruzi, no controle da infecção ou na sua disseminação, além dos mecanismos desencadeados na fase inicial da doença serem determinantes para o estabelecimento de uma fase crônica. Uma das primeiras células imunes a interagir com este patógeno são as céluls dendríticas (DCs), as quais são responsáveis por intermediar uma resposta imune não específica para uma específica e que possui uma função determinante dentro da patologia.. Este trabalho então visa uma análise da resposta inicial que é desencadeada em DCs frente ao T. cruzi a partir da validação de genes que foram vistos como diferencialmente expressos no trancriptoma realizado da interação inicial ente DCs e T. cruzi após 12h. Alguns desse genes modulados diferencialmente sob ação do patógeno foram o ligante da superfamília de fator necrose tumoral, membro 18 (TNFSF18), ligante 9 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL9) e peptidase específica de ubiquitina 18 (USP18), que possuíram sua expressão aumentada sob infecção. Essa superexpressão constatada por RNA-seq, foi confirmada neste estudo através de RT-qPCR após um processo de padronização e escolha de critérios rigorosos para garantir a qualidade da interpretação dos dados e poder comparar com veracidade os dados provenientes de duas metodologias distintas. Ficou comprovado então que a expressão gênica dessa interação patógeno-hospedeiro poderia ser atestada por RT-qPCR, viabilizando estudos posteriores de outros genes e também em uma população amostral maior, permitindo assim analisar a resposta inicial de forma mais abrangente. Isso tornará possível garimpar genes que tenham um papel fundamental na infecção e estuda-los com mais profundidade. Também é importante ressaltar que não necessariamente um aumento de expressão de transcrito reflete no nível proteico, como foi aferido neste trabalho ao mensurar algumas citocinas como IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 e IL-12, em que houve aumento de expressão de TNF sob infecção que condiz com seu nível de transcrito detectado, porém IL-10 que também foi supraregulado a nível transcricional, não possuía o mesmo comportamento a nível proteíco, tendo uma regulação importante e decisiva na expressão pelo hospedeiro. / Chagas disease affects around 8 million people worldwide and about one-third of them develops severe forms of the disease, being the largest case of cardiomyopathy caused in Latin America and also among the largest cause of death within neglected tropical diseases. Even though it has been known for 111 years, the mechanisms that develop pathology remain an enigma, especially when it comes to studies in humans. Despite this, the role of the host immune response to the etiologic agent, Trypanosoma cruzi, in the control of the infection or its dissemination is indisputable, besides the mechanisms triggered in the initial phase of the disease are determinant for the establishment of a chronic phase. One of the first immune cells to interact with this pathogen is the dendritic cells (DCs), which are responsible for being a mediator between a less specific immune response to a more specific and that has a determining function within the pathology. This work then aims an analysis of the initial response that is triggered in DCs against T. cruzi from a transcriptome performed from the initial interaction between DCs and T. cruzi after 12h. Some of these genes differentially modulated under the action of the pathogen were the tumor necrosis factor, member 18 (TNFSF18), CXC (CXCL9) motif chemokine ligand 9 and ubiquitin 18 specific peptidase (USP18), which had their expression considerably infection. This overexpression verified by RNA-seq was confirmed in this study through RT-qPCR after a process of standardization and selection of strict criteria to guarantee the quality of data interpretation and to be able to compare data from two different methodologies. It was then proved that the differential gene expression obtained in the transcriptome, a robust but more expensive and inaccessible technique, could be attested by RT-qPCR, allowing further studies of other genes and also in a larger sample population, thus allowing an analysis of the initial response in DCs by the T, I crossed more comprehensively in order to mine genes that have a fundamental role in the infection and study them in more depth. It is also important to note that not necessarily an increase in transcript expression reflects at the protein level, as measured in this work when measuring some cytokines such as IFN-γ, TNF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-2 and IL-12, in which there was an increase in expression of TNF under infection that matches its detected level of transcript, but IL-10, which was also supraregulated at the transcriptional level, did not have the same behavior at the protein level, having an important and decisive regulation in expression by the host.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são condições tumorais prostáticas não relacionadas, de alta prevalência e que afetam homens com idade avançada. Suas etiologias não são bem compreendidas, havendo poucos fatores de risco reconhecidos, o que torna difícil a identificação dos indivíduos suscetíveis a estas doenças. A condição imunológica é um fator determinante no desenvolvimento e progressão tumoral. O antígeno leucocitário humano G (HLA-G) é uma molécula imunomodulatória relacionada a mecanismos de tolerância imunológica. Inúmeras evidências vêm apoiando o papel do HLA-G como um mecanismo de escape das células tumorais da imunidade antitumoral, sugerindo que a expressão desta molécula em pacientes com câncer possa ser prejudicial. Em condições patológicas e fisiológicas da próstata, pouco se conhece sobre o papel do HLA-G. No presente trabalho, investigamos a influência do HLA-G em câncer de próstata e hiperplasia prostática benigna. Participaram do estudo homens do sul do Brasil com CaP, HPB e indivíduos saudáveis predominantemente euro-descendentes. Inicialmente, oito polimorfismos da região 3’ não traduzida (UTR) do gene HLA-G foram analisados em 468 indivíduos, incluindo o polimorfismo de inserção/deleção de 14 pares de bases (rs371194629), e os polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) na posição +3003T/C (rs1707), +3010C/G (rs1710), +3027A/C (rs17179101), +3035C/T (rs17179108), +3142G/C (rs1063320), +3187A/G (rs9380142) e +3196C/G (rs1610696) do gene. Também foi caracterizado o perfil de expressão da proteína HLA-G em 53 tecidos cancerosos/hiperplásicos (CaP/HPB) e em porções avaliadas como normais de próstatas provenientes de pacientes com CaP e HPB. Por fim, o perfil imunológico sistêmico foi investigado em cada condição estudada através da caracterização do perfil de citocinas séricas Th1/Th2/Th17 nos três grupos (n=89). Para tanto, foram dosadas as citocinas interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon gama (IFN-γ) e IL-17A. Nesse estudo, encontramos evidência de uma influência significativa de polimorfismos da 3’UTR do gene HLA-G na suscetibilidade ao CaP e nossos dados apoiam o uso da variante +3003 como um tag SNP para o risco de câncer de próstata. Além disso, foi possível diferenciar tecidos de próstata com câncer de tecidos com hiperplasia e tecidos normais pelo nível de expressão da proteína HLA-G. Uma expressão elevada foi observada predominantemente nos tecidos com CaP, não sendo comum níveis elevados de expressão de HLA-G em tecidos normais e com HPB. Tais resultados fornecem evidência de considerável influência da expressão proteica de HLA-G no desenvolvimento de CaP. Como um potencial mecanismo de escape das células cancerosas da próstata da imunidade antitumoral, o HLA-G representa um potencial alvo terapêutico para CaP. Quanto ao perfil imunológico sistêmico nas condições avaliadas, observamos nível elevado de IL-10 e TNF-α diferenciando homens com CaP dos saudáveis, enquanto níveis elevados de IFN-γ e IL-17A diferenciaram pacientes com HPB dos com CaP. Concluindo, nossos dados apontam um perfil relacionado à tolerância imunológica em câncer de próstata, influenciado pelo HLA-G e capaz de favorecer o desenvolvimento deste câncer. Já em HPB, que apesar de ser uma condição tumoral, é benigna, indícios de maior responsividade do sistema imune foram encontrados. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are unrelated prostatic tumoral conditions, highly prevalent and affecting aged men. Their etiologies are not well understood, with few risk factors recognized, which make the identification of susceptible individuals to the disease difficult. The immunological condition is determinant in tumor development and progression. The human leukocyte antigen G (HLA-G) is an immunomodulatory molecule related to mechanisms of immunological tolerance. Several pieces of evidence have supported the role of HLA-G as an escape mechanism of tumor cells from antitumor immunity, suggesting that the expression of this molecule in cancer patients can be harmful. In pathological and phisiological prostate conditions, little is known about the role of HLA-G. In the present work, we investigated the influence of HLA-G in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. Men from South Brazil with PCa, BPH and healthy individuals predominantly euro-descendant were included in the study. Firstly, eight HLA-G 3′ untranslated region (UTR) polymorphisms were analyzed in 468 individuals, including the 14 bp insertion/deletion polymorphism (rs371194629) and the single nucleotide polymorphisms (SNP) at gene position +3003T/C (rs1707), +3010C/G (rs1710), +3027A/C (rs17179101), +3035C/T (rs17179108), +3142G/C (rs1063320), +3187A/G (rs9380142) and +3196C/G (rs1610696). The profile of HLA-G protein expression was characterized in 53 cancerous/hyperplastic (PCa/BPH) and in areas evaluated as normal prostate tissues provenient from patients with PCa and BPH. Finally, the systemic immunological profile was investigated in each studied condition through the characterization of the Th1/Th2/Th17 serum cytokine profile in the three groups (n=89). For that, the concentration of interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interferon gamma (IFN-γ), and IL-17A cytokines was measured. In this study, we found evidence of a significant influence of HLA-G 3′UTR polymorphisms in PCa susceptibility and our data support the use of the +3003 variant as a tag SNP for PCa risk. In addition, it was possible diferentiate prostate tissues with cancer from with hyperplasia and normal tissues through the level of HLA-G protein expression. An elevated expression was observed predominantly in PCa tissues, but elevated level of HLA-G expression was not common in normal and BPH prostate tissues. These results provide evidence of a considerable influence of HLA-G protein expression in PCa development. As a possible escape mechanism of prostate tumor cells from antitumor immunity, HLA-G represents a potential therapy target in PCa. About the systemic immunological profile in the evaluated conditions, high IL-10 and TNF-α level differentiated PCa patients from healthy men, while high IFN-γ and IL-17A level differentiated BPH from PCa patients. In conclusion, our data point out to a profile related to immunological tolerance in PCa, influenced by HLA-G and able to favour the cancer development. In BPH, a benign tumor condition, the data point out to a higher responsiveness of the immune system.

Anemia falciforme (AF) é considerada a doença monogênica mais prevalente no Brasil, e resulta de uma mutação pontual no gene da beta-globina que leva à produção de uma molécula de hemoglobina anormal (HbS). A HbS polimeriza quando submetida a baixas tensões de oxigênio, precipitando e causando a deformação dos eritrócitos pois torna rígida sua membrana plasmática que apresentará uma série de alterações e danos. Além disso, a falcemização dos eritrócitos ocasiona anemia severa, lesão de isquemia/reperfusão, superprodução de espécies reativas de oxigênio, inflamação e vaso-oclusão (VO). A VO manifesta-se clinicamente como crises de dor, ou crises vaso-oclusivas (CVOs) que pode levar ao bloqueio de vasos e capilares e ao comprometimento de órgãos. Estes pacientes possuem alta susceptibilidade a infecções, principalmente na infância. Os mecanismos envolvidos no desenvolvimento da VO, no entanto, não estão totalmente elucidados. Estudos acerca deste tema têm sugerido que a VO seria o resultado da interação entre eritrócitos falcêmicos, leucócitos, plaquetas, células endoteliais e substâncias presentes no plasma dos indivíduos afetados. Tais observações como que AF seria o resultado de uma resposta inflamatória exacerbada que estes indivíduos desenvolvem, levaram à formulação da hipótese de que a anemia falciforme se comporta como uma condição inflamatória crônica e sugerindo que uma modulação do sistema imune poderá ser útil para a regulação da sintomatologia clínica. Salientando a carência de dados na literatura referentes à correlação de polimorfismos descritos para genes do sistema imune e a patofisiologia da AF, nosso estudo tem como objetivo principal: Analisar a correlação para polimorfismos descritos para genes do sistema imune e correlacionar-lho com a patofisiologia da AF. Sabemos que o HLA-G é uma molécula HLA não-clássica, que mostrou ser expressa em sítios de inflamação e nas doenças inflamatórias. Na região promotora além de ser altamente polimórfica, encontramos a região UTR 3' que parece desempenhar um papel importante na regulação da expressão do HLA-G. Então, dentre dos polimorfismos avaliados específicamente temos os dos genes HLA-G (14pb) e MiRNA (+3142). Nossos resultados indicam que os polimorfismos do HLA-G de 14pb e +3142 em 93 pacientes com AF, 21 pacientes apresentaram uma infecção pelo VHC e 16 pacientes com AF (22,2%) eram homozigotos para o genótipo +3142C e nenhum deles era positivo para HCV. Nenhum dos resultados obtidos indicou qualquer tipo de imunodeficiência mas pelo contrário, sugerem a existência de uma tendência inflamatória crônica na clínica da AF. Assim fica evidente a importância do polimorfismo +3142 sobre a susceptibilidade a infecções entre os pacientes com SCD.

diagnosticar precozmente y tratar a los individuos enfermos de forma apropiada. Por otro lado, el estudio de las personas infectadas permite aplicar, medidas de prevención y evitar que estas personas desarrollen la enfermedad. La prueba de la tuberculina (PT) ha sido utilizada durante los últimos 100 años como herramienta para el diagnóstico de la infección tuberculosa. Su principal inconveniente radica en que la mayoría de proteínas presentes en el PPD no son específicas de Mycobacterium tuberculosis. Esto provoca una disminución en la especificidad de la prueba, ya que individuos sensibilizados por exposición previa a micobacterias no tuberculosas (MNT) o vacunados con la BCG también responden inmunológicamente al PPD. Además, la PT presenta una baja sensibilidad en pacientes con alteraciones en la inmunidad celular. 70 La citoquina efectora clave en el control de la infección micobacteriana para la activación de los macrófagos y el desarrollo de la inmunidad protectora contra M. tuberculosis es el IFN-g. Por lo tanto, un método de inmunodiagnóstico basado en la cuantificación in vitro de la respuesta inmune celular puede ser una alternativa a la PT. En los últimos años, se han descrito dos antígenos específicos de M. tuberculosis: Early Secretory Antigen Target-6 (ESAT-6) y Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10). Estos antígenos están ausentes en la cepa vacunal de la BCG y en la mayoría de MNT. También se ha estudiado un tercer antígeno llamado TB7.7. En este sentido han sido desarrollados diferentes métodos de cuantificación de la respuesta inmune celular utilizando estos antígenos específicos micobacterianos para la estimulación de las células T sensibilizadas y para la detección in vitro de IFN-g. En base a esta tecnología se han estandarizado dos técnicas comerciales: Quantiferon Gold In tube (QFN-G-IT) y T-SPOT.TB. QFN-G-IT estimula los linfocitos presentes en muestras de sangre total con los antígenos ESAT-6, CFP-10 y TB7.7 en un mismo tubo, y determina la producción de IFN-g mediante técnica de ELISA. Por otro lado, TSPOT. TB requiere una separación de células mononucleares para estimularlas con los antígenos ESAT-6 y CFP-10 por separado, y el IFN-g se detecta mediante ELISPOT. De esta forma, la Tesis se ha centrado en la estandarización y evaluación clínica de estas técnicas inmunológicas para el diagnóstico de la infección tuberculosa y TB activa, así como su aplicabilidad en la práctica clínica en pacientes adultos y pediátricos (inmunocompetentes e inmunodeprimidos), y el estudio del efecto de las MNT sobre la positividad de la PT. Finalmente, la Tesis se completa con la evaluación de nuevos marcadores y antígenos alternativos en el diagnóstico in vitro de la TB. En resumen, las técnicas basadas in vitro son más específicas que la PT, ya que están menos influenciadas por la vacuna de la BCG y la sensibilización a MNT. Por lo tanto, el uso de estas técnicas puede ayudar a reducir el número de quimioprofilaxis innecesarias en población adulta y pediátrica. La detección de IFN-g liberado por las células T sensibilizadas tras estimular con antígenos específicos de M. tuberculosis es una herramienta diagnóstica alternativa en el diagnóstico de la infección tuberculosa en población inmunocompetente e inmunodeprimida. Además, estas técnicas in vitro pueden ayudar en el inmunodiagnóstico de la TB activa. Por otro lado, el estudio de nuevos antígenos específicos y biomarcadores es una herramienta potencial para el estudio de la respuesta del huésped contra M. tuberculosis durante el tratamiento y la búsqueda de nuevos marcadores para el diagnóstico de la infección tuberculosa y TB activa. / The bases of tuberculosis (TB) control programs consist of a diagnosis and correct treatment of patients with active TB. An essential factor for controlling the spread of this disease is the ability to diagnose infected individuals in their early stages before they become infectious to others through the progression to active TB. The tuberculin skin test (TST) has been until now the only tool available for the diagnosis of latent tuberculosis infection (LTBI). Unfortunately, this test has some disadvantages because of its poor specificity that lead to false positive results by the BCG vaccine strain and nontuberculous mycobacteria (NTM) cross-reaction. Moreover, TST has a low sensibility in groups with impaired cellular immunity giving false negative results. CD4 T cells represent the major players in the protection against TB. Of greatest relevance are the T helper (Th) 1 cells, that produce IFN-g. The IFN-g cytokine activates macrophages for the development of a protective immunity against Mycobacterium tuberculosis. Therefore, an immunodiagnostic assay based on the in vitro quantification of this cellular immune response could be an alternative to the TST for the diagnosis of LTBI. In the last years, two specific M. tuberculosis antigens have been described. These antigens are early secretory antigenic target 6 (ESAT-6) and culture filtrate protein 10 (CFP-10), absent in BCG strain and in the majority of NTM. A new third M. tuberculosis antigen called TB7.7 has been also studied. In vitro assays for the diagnosis of LTBI, based on the detection of IFN-g secreted by effector T cells stimulated with these specific antigens, have been developed. There are two commercially available IFN-g T-cell based assays: QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFN-G-IT) and T-SPOT.TB, both approved by the U.S. Food and Drug Administration. QFN-G-IT test stimulates whole-blood with ESAT-6, CFP- 10 and TB7.7 in the same tube, and measures the concentration of IFN-g in supernatants with an ELISA assay. On the other hand, T-SPOT.TB assay stimulates isolated peripheral blood mononuclear cells with ESAT-6 and CFP-10 separately, and detects number of IFN-g producing T cells by means of an ELISPOT. In this sense, the main objectives of this Thesis are the standardization and clinical evaluation of these new immunological assays for the diagnosis of LTBI and active TB, their application in clinical practice in adult and pediatric immunocompetent and immunosuppressed population, and the evaluation of NTM effect in the LTBI diagnosis. Finally, we study and evaluate new antigens and potential biomarkers for the diagnosis of active TB and LTBI. In summary, IFN-g tests are more specific than TST because they are less affected by BCG vaccination and NTM sensitization. So, the utilization of these assays can help to reduce unnecessary LTBI treatment among adult and pediatric population. Therefore, detection of IFN-g produced by T cells after M. tuberculosis specific antigen stimulation is an alternative diagnostic tool for LTBI in immunocompetent and immunosuppressed patients. In addition, IFN-g assays could help in the immunodiagnosis of active TB. On the other hand, the study of new specific antigens and biomarkers is a potential tool for studying host immune response during anti-TB therapy and finding novel diagnostic markers for active TB and M. tuberculosis infection.

El antígeno B (EgAgB) es una lipoproteína presente en la larva del parásito cestodo Echinococcus granulosus, agente causante de la zoonosis conocida como hidatidosis, enfermedad endémica en nuestra región. Esta proteína pertenece a una familia de proteínas exclusivas de cestodos que unen ligandos hidrofóbicos, conocidas como HLBPs. A nivel proteico, el EgAgB está formado por subunidades de ~8 kDa codificadas por genes polimórficos pertenecientes a 5 subfamilias distintas (EgAgB8/1 a EgAgB8/5); mientras que su componente lipídico está formado por una amplia variedad de lípidos, incluyendo lípidos neutros y polares. El hecho de que muchos de estos lípidos no pueden ser sintetizados de novo por el parásito hace suponer que el EgAgB podría estar involucrado en la adquisición de estos compuestos desde el hospedador, como ha sido propuesto para otras HLBPs. Esto implicaría que el EgAgB interactué con componentes del hospedador para adquirir estos ligandos. En este sentido, existe evidencia de que el EgAgB es capaz de interactuar con células del sistema inmune, modulando su respuesta, lo que a su vez favorecería el establecimiento y permanencia del parásito. Sin embargo, para poder comprender los mecanismos asociados a esta modulación a nivel molecular y determinar si la proteína es capaz de transportar e intercambiar los lípidos, es imprescindible avanzar en el conocimiento estructural y funcional de esta partícula compleja. Con este fin, durante el desarrollo de este trabajo se purificaron las subunidades recombinantes EgAgB8/1, EgAgB8/2 y EgAgB8/3, logrando obtenerlas de forma libre de lípidos. Se logró determinar que estas subunidades son capaces de interaccionar consigo mismas aún en ausencia de lípidos, formando oligómeros de entre 40 y 60 kDa, distintos a los que se han reportado previamente en la literatura en presencia de los ligandos. Por otro lado, se analizó la capacidad de distintos ligandos lipídicos de unirse a estas subunidades y se pudieron determinar constantes de disociación en el orden submicromolar empleando antroiloxi-derivados de ácidos grasos. Más aún, se evaluó la capacidad de las subunidades EgAgB8/2 y EgAgB8/3 de transferir estos derivados hacia membranas fosfolipídicas modelo. Utilizando distintos tipos de vesículas se pudo establecer que ambas subunidades son potencialmente capaces de transferir los ácidos grasos. En el caso de las subunidad EgAgB8/2, la transferencia ocurriría por un mecanismo que involucra un contacto directo con la membrana, mientras que en el caso de EgAgB8/3 la cinética de la transferencia estaría determinada por la disociación del complejo proteína-ligando. Asimismo, para ambas proteínas se pudo determinar que las interacciones electroestáticas tienen importancia en el mecanismo, dado que la transferencia se ve favorecida en el caso de vesículas con mayor carga neta negativa, como ocurre en el caso de vesículas ricas en cardiolipina. Por otro lado, con el fin de evaluar la capacidad de las subunidades libres de lípidos de interactuar con células del sistema inmune, particularmente con monocitos y macrófagos, se encontró que las subunidades EgAgB8/1 y EgAgB8/3 libres de lípidos son reconocidas por estas células, mientras que la subunidad EgAgB8/2 no presenta unión a los monocitos y es pobremente reconocida por los macrófagos. Asimismo, se pudo determinar que la fosfatidilcolina que estaría expuesta en la partícula nativa de EgAgB participaría en la unión, posiblemente modificando la forma en que se exponen las subunidades de EgAgB para que sean reconocidas por las células. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la partícula de EgAgB puede ser reconocida por células del sistema inmune a través de algunas de sus subunidades y el hecho de que en proximidad de una membrana fosfolipídica algunas subunidades pueden ser capaces de transferir sus ligandos, apoya la idea de que EgAgB pueda intercambiar lípidos interaccionando con células del hospedador.

En este trabajo de Tesis nos hemos propuesto investigar el efecto de alteraciones estructurales en el LPS sobre la integridad de la membrana externa, la síntesis y secreción de otros componentes bacterianos y en particular sobre la patogenicidad y persistencia de la bacteria en el hospedador. El estudio de esta molécula resultó ser un verdadero desafío ya que es una de las moléculas menos caracterizadas dentro del género Bordetella. Esto se debe quizás a que durante muchos años las investigaciones sobre Bordetella estuvieron focalizadas fundamentalmente sobre los factores de virulencia de naturaleza proteica. Así, las propiedades del LPS en el entorno natural de la bacteria y su interacción con otros componentes bacterianos constituyen aspectos muy poco explorados. En relación a este último punto existen numerosos estudios que sugieren una conexión entre toxinas de la familia RTX (repetición en toxina) y el LPS. Se ha reportado que mutaciones específicas que modifican el ensamblaje del core interno del LPS (cluster rfa, 17, 48, 312) afectan la secreción y la biosíntesis de la toxina RTX-Hemolisina (Hly) de <i>Escherichia coli</i>. <i>Bordetella spp.</i> sintetiza una toxina RTX, la AC-Hly (136,154). En estudios de la secreción hemos determinado que la secreción de esta toxina en medios de cultivo suplementados con un agente derivado de las ciclodextrinas se ve incrementada correlativamente con un incremento en la liberación de LPS al medio extracelular. Se ha podido determinar además la presencia de vesículas de membrana externa en sobrenadantes de cultivo, las cuales contienen LPS y AC-Hly. En este marco no sólo abordaremos el rol del LPS y el de su variabilidad estructural en la patogénesis y persistencia en el hospedador en sí mismo sino también su posible relación con la expresión de otros factores de virulencia y en particular se analizará si el fenómeno observado para la hemolisina de E.coli puede ser extendido a la AC-Hly de Bordetella spp. Para esclarecer estos aspectos hemos dirigido nuestras investigaciones hacia la construcción y caracterización tanto in vitro como in vivo de mutantes en B. bronchiseptica que presentan un fenotipo de LPS alterado, en particular un fenotipo "deep rough". La elección de este tipo de alteración se basó por un lado, en la necesidad de obtener un mutante con una modificación profunda en la estructura del LPS que posibilite la adjudicación de algún rol de esta molécula en el curso de la infección; y por otro lado, en que diferentes aislamientos de pacientes con infección crónica de B. bronchiseptica presentaron un fenotipo de LPS del tipo deep rough o rugoso profundo. / Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432438-Texto+Completo-0.pdf: 2038170 bytes, checksum: 505895940d1e38c8e3925441d22f197d (MD5) Previous issue date: 2011 / Nematode worms in the genus Angiostrongylus are intra-arterial parasites of rodents. A. costaricensis lives in mesenteric system while A. cantonensis inhabits the pulmonary arteries. Man is an accidental host and the worm may cause eosinophilic gastroenteritis or meningitis due to migration of A. cantonensis’ young adult worms through central nervous system tissues. Molecular methods for diagnosis of human disease are important since parasitological diagnosis is prevented by lack of larval elimination in feces. Immunodiagnostic methods based on crude antigens lack both specificity and sensibility. Efforts where directed towards analysis of fractions for detection of antigens with better performance in immunodiagnosis for the improvement of molecular diagnosis of angiostrongyliasis. The possibility of heterologous antigens was also tested, A. cantonensis’ proteins being standardized in ELISA for the detection of anti-A. costaricensis’ antibodies. Analysis of fractions was initiated with the study of proteins extracted from the reproductive tract (RT) from female worms of A. cantonensis, several fraccionation protocols were tested and protein recognition by sera from infected humans was probed by Western blot (WB). Protein A immunoaffinity columns were loaded with sera from infected patients but recovery of antigens was unsuccessful. The RT extract was fractionated at sub-cellular level and the cellular membrane fraction (F2) was subsequently separated according to isoeletric point intervals. Proteins at several pH intervals were recognized by positive sera in WB. These antigens may be useful as antibody targets for the immunodiagnosis of angiostrongyliasis. Molecular cloning of relevant antigens is a desirable aim for future studies, leading to permanent sources of well-defined antigens and the reduction of the labor intensive in vivo production of these reagents. / Vermes do gênero Angiostrongylus são parasitos intra-arteriais em roedores. A. costaricensis vive no sistema mesentérico, enquanto A. cantonensis habita as artérias pulmonares de ratos. No homem, hospedeiro acidental destas parasitoses, elas causam a gastroenterite eosinofílica e meningite devido à migração de adultos jovens de A. cantonensis nos tecidos do sistema nervoso central. O exame parasitológico de fezes não pode ser utilizado para diagnóstico humano das angiostrongilíases porque não são encontradas larvas nas fezes, o que torna importante o desenvolvimento de técnicas moleculares. Os métodos de imunodiagnóstico empregando antígenos brutos apresentam reatividade cruzada com outras parasitoses e também resultados falso-negativos. Com o objetivo de aprimorar o diagnóstico molecular das angiostrongilíases, direcionamos os esforços na tentativa de reduzir a complexidade dos extratos de antígenos a fim de encontrar proteínas mais específicas e sensíveis para o diagnóstico. Primeiramente foi testado o uso de antígenos de A. cantonensis para o diagnóstico de A. costaricensis pela técnica de ELISA.A partir disso, antígenos de tubo reprodutor (TR) de fêmeas de A. cantonensis foram fracionados por diversas técnicas e sua reatividade a soros controle foi testada por Western blot (WB). Colunas de proteína A foram incubadas com soro de pacientes infectados, porém este fracionamento não teve sucesso. Foi realizado o fracionamento subcelular dos extratos TR e com a fração de antígenos de membrana celular (F2) foi realizado o fracionamento por ponto isoelétrico. As frações de pH apresentaram reatividade específica aos soros controle positivos quando submetidas ao WB, sugerindo que as proteínas encontradas possam ser importantes alvos para o diagnóstico das angiostrongilíases. A possibilidade de clonar as proteínas de interesse para produção em grande escala, poderá constituir fonte permanente de antígenos com redução do volume de trabalho e do emprego de animais no laboratório.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000408007-Texto+Completo-0.pdf: 7713390 bytes, checksum: bf92d92b7f1e311023e32849423ed23c (MD5) Previous issue date: 2008 / The tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous ectoparasite of bovines, widely distributed in herds from America, Asia, Africa and Oceania. The use of acaricides is the main method for tick control, however it may become unfeasible due to the cost of drugs and labor required to apply the treatment, as well as the increasing appearance of resistant ticks to various acaricides. In addition, chemical residues in food and environmental pollution are major concerns nowadays. The development of an immunological control method as an alternative for the chemical control depends on finding out antigenic molecules that generate a protective immune response. As bovines develop resistance to ticks during successive infestations, the analysis of the immune responses developed by infested bovines may become of great importance in the search for protective antigens. ELISA and Western Blot were used to investigate the pattern of antibody responses of six bovines infested twelve times with R. microplus (six heavy infestations followed by six light infestations) against salivary gland, gut and larvae extracts. During heavy infestations, bovine IgG levels were shown to be higher, and a decrease in the number and weight of ticks that completed the parasitic cycle was observed. The pattern changed starting from the seventh infestation, showing a decrease in IgG levels, and an initial increase followed by a significant decrease in the proportion of ticks that completed the parasitic cycle. The number of molecules recognized by Western Blot was higher from sera collected following heavy infestations than after light infestations, although a great variation in the profiles detected could be seen when the bovines were compared. These results indicate that IgG responses to different tick antigens may not be generally associated with bovine resistance, and that infestation levels modulate the magnitude of humoral responses and possibly the immune mechanisms in the natural acquisition of tick resistance. / O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago de bovinos, amplamente distribuído nos rebanhos da América, Ásia, África e Oceania. O uso de acaricidas é o principal método para o controle do carrapato, porém o custo das drogas e da mão-de-obra requerida para aplicar o tratamento, o aparecimento crescente de carrapatos resistentes a vários acaricidas, a permanência de resíduos químicos nos alimentos e a poluição ambiental decorrente do seu uso tornam importante o desenvolvimento de outras formas de controle. O desenvolvimento de um método de controle imunológico como uma alternativa para o controle químico depende da identificação de moléculas antigênicas que geram uma resposta imune protetora. Como bovinos desenvolvem resistência ao carrapato durante sucessivas infestações, a análise da resposta imune desenvolvida por bovinos infestados pode tornar-se de grande importância na busca por antígenos protetores. ELISA e Western Blot foram utilizados para investigar o padrão de respostas de anticorpos de seis bovinos infestados doze vezes com R. microplus (seis infestações pesadas seguidas por seis infestações leves) contra extratos de glândula salivar, intestino e larva. Durante infestações pesadas foram observados níveis maiores de IgGs reconhecendo extratos protéicos de glândula salivar, intestino e larva, e uma diminuição no número e no peso de carrapatos que completam o ciclo parasitário. O padrão mudou iniciando na sétima infestação, mostrando uma diminuição nos níveis de IgG, e um aumento inicial seguido por uma significante diminuição na proporção de carrapatos que completam o ciclo parasitário. O número de moléculas reconhecidas em Western Blot foi maior pelos soros das infestações pesadas do que das infestações leves, embora uma grande variação nos perfis detectados pode ser visto entre os bovinos. Esses resultados indicam que níveis de anticorpos contra o carrapato não estão necessariamente relacionados de forma direta com níveis de resistência. Além disso, infestações pesadas e leves parecem modular de forma diferente a magnitude da resposta humoral e possivelmente os mecanismos imunes na aquisição natural de resistência ao carrapato.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000407730-Texto+Completo-0.pdf: 978627 bytes, checksum: 207551daea7acbf96e0c911484083687 (MD5) Previous issue date: 2008 / Herpes Simplex Vírus-1 (HSV-1) is a member of Herpesrviridae family and alphaherpesvirinea subfamily widely spread among human beings. This virus begins the infection through epithelial cells from skin and mucosal surface reaching the peripheral nervous system. HSV-1 infects the oral mucosa and establishes latency in trigeminal ganglia. Sometimes by action of endogenous or exogenous factors these viruses returns to active form leading to viral reactivation. During this process the virus can relocalizes on oral mucosal (hepetial genvivostomatites), optical nerve (ocular keratites) and central nervous system (encephalitis). In case of pregnancy, the reactivation could be asymptomatic; it could be dangerous because the virus can infect the baby during the childbirth, leading to neurological conditions and sometimes death. The process of latency is governed by latency associated transcripts (LAT genes) an immunological response as T cells. The cells that block the viruses from reactivation from the nerve are the memory CD8+ T cells. These lymphocytes stay adsorbed to neuron membrane interacting with the epitope SSIEFARL from a gB glycoprotein of HSV-1 envelop. SSIEFARL CD8+ T lymphocytes produces cytokines as IFN-у that penetrates into neuron and blocks the expression of genes involved in virion assembly and formation. When the number of CD8+ T cells reduces the viruses returns to active form. The proliferation and function of CD8+ T cells is controlled by cytokines, mainly IL-15 and IL-21. Several studies have shown that this cytokines have crucial a role in homeostatic proliferation of CD8+ T cells. In this study plasmid coding to IL-15 and IL-21 were elaborated to investigate the role of these cytokine on HSV-1 memory CD8+ T cell proliferation. In vitro, pIL-21 increased the frequency of CD8+ T cells in presence or absence of TCR stimulation. When administered during effector phase of HSV-1 infection pIL-15 and pIL-21 increased the numbers of antigen specific CD8+ T cells that produce IFN-у. For memory studies an adoptive transfer system was applied. SSIEFARL transgenic cells from CD90. 2+ donor mice were transferred to CD90. 1+ holster mice. The CD90. 1+ holster was infected with HSV-1 intraperitoneally and tread with each cytokine plasmid or combination, gB coding plasmid was used as antigen source. The resulted showed the pIL-15 or pIL-21 alone can induce proliferation of HSV-1 memory CD8+ T cells and that antigen did not have significant influence when provide together with the cytokines plasmids. However, the combination of pIL-15, pIL-21 and pgB together was more efficient to cell numbers and IFN-у production. / Herpes Simplex Vírus-1 (HSV-1) é um membro da família Herpesviridae e subfamília alfaherpesvirinea bastante disseminado entre os seres humanos. Esse vírus inicia seu processo de infecção a partir das células epiteliais da superfície da pele e mucosas, atingindo o sistema nervoso periférico. O HSV-1 inicia a infecção através da mucosa oral e fica localizado na forma latente no nervo trigêmio da face, algumas vezes, pela ação de fatores endógenos ou exógenos, esse vírus volta a sua forma ativa, ocasionando a reincidiva. Nesse processo de reativação do vírus ele pode se localizar, na mucosa oral (gengivoestomatite herpética), no nervo óptico (queratite herpética) e no sistema nervoso central (encefalite). No caso da gestante, a reativação herpética pode ser assintomática, o que pode infectar o filho no momento do parto, levando a danos neurológicos irreversíveis ou a morte. O processo de latência é coordenado por dois mecanismos principais, a expressão dos genes LAT e a resposta imunológica. As células da resposta imune que bloqueiam a reativação viral a partir do nervo são os linfócitos T CD8+ de memória. Esses linfócitos ficam justapostos à membrana do corpo celular do neurônio, interagindo com o epítopo SSIEFARL de uma glicopoteína gB do envelope viral. Os linfócitos T CD8+ SSIEFARL específicos produzem citocinas, como IFN-у, que penetram no neurônio e impedem a expressão de genes que estão envolvidos na construção do capsídeo, determinantes para formação de novos vírions. Quando o número dessas células diminui, o vírus volta a sua forma ativa. A proliferação e função das células T CD8+ é controlada por citocinas, principalmente a IL-15 e a IL-21. Muitos estudos indicam que elas têm um papel na proliferação homeostática de células T CD8+.Nesse trabalho, foram elaboradas construções gênicas com o DNA da IL-15 e da IL-21 para avaliar o potencial dessas citocinas na otimização da resposta T CD8+ de memória ao HSV-1. In vitro, a IL-21 aumentou a freqüência de células T CD8+, com ou sem estimulação de TCR. Na fase efetora, a IL-15 e IL-21 aumentaram os números de células T CD8+ antígenoespecíficas produtoras de IFN-у. Para os estudos de memória foi utilizado um sistema de transferência de células SSIEFARL transgênicas de camundongos CD90. 2 doadores para camundongos CD90. 1 receptores. Os camundongos receptores foram infectados com HSV-1 pela rota intraperitoneal e tratados com o plasmídeo contendo de cada citocina ou a combinação deles, um plasmídeo que codificava a glicoproteína gB do HSV-1 foi utilizado com fonte de antígeno Os resultados mostraram que cada pIL-15 ou pIL-21 isoladamente induz a proliferação de células T CD8+ de memória ao herpes e que a administração do antígeno não teve grande influência. Por outro lado, a combinação de pIL-15, pIL-21 e pgB foi mais eficiente, tanto no aumento dos números de células T CD8+, quanto na expressão de IFN-у.