A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.

O transplante de órgãos é hoje uma opção de tratamento de várias doenças terminais. Apesar de todos os progressos no campo do transplante, o principal problema enfrentado ainda é a rejeição. As principais moléculas responsáveis pela resposta alogeneica e subsequente rejeição ao enxerto, são os antígenos leucocitários humanos (HLA, do inglês Human Leucocyte Antigens). Porém, existem evidências que anticorpos dirigidos a antígenos não-HLA estão associados com rejeição de transplantes. Neste estudo, foi investigada a presença de anticorpos anti-célula endotelial (AACE) em 11 pacientes que perderam seus rins transplantados devido à rejeição humoral irreversível e em 2 com perda por trombose de veia renal. A ausência de anticorpos anti-HLA contra o doador foi verificada antes do transplante, da rejeição e antes e depois da transplantectomia, através da realização de provas cruzadas usando as técnicas mais sensíveis. Anticorpos não-HLA presentes em nove eluatos reagiram com EAHy.926. Eluatos positivos e negativos contra linhagem EAHy.926 foram testados contra cortes histológicos de 6 rins sadios para detecção de quais estruturas renais são reconhecidas por esses anticorpos. A reação foi avaliada pelo método de imunofluorescência indireta. Dos 13 eluatos testados, 4 (isotipo IgG) e 5 (isotipo IgM) reagiram com forte fluorescência nos glomérulos e endotélio arterial, mas não foi verificada reação na cápsula de Bowman e no epitélio tubular. Não foi observado polimorfismo na reatividade dos eluatos. Em onclusão, verificamos que os anticorpos não-HLA têm um importante papel na rejeição humoral. Estes estão reconhecendo antígenos de um sistema provavelmente não-polimórfico nas células de endoteliais presentes, principalmente, nos capilares glomerulares. / The transplant of organs is today an option of treatment to several terminal diseases. In spite of all the progress in the field of the transplants, the rejection remains a problem to be solved. The main target molecules for the allogenic response and subsequent allograft rejection are the human leukocyte antigens (HLA). However, there are growing evidences that non-HLA antibodies are associated with transplant rejection. In this study it was investigated the presence of anti-endothelial cell antibodies (AECA) in 11 patients who had early lost their transplanted kidney by irreversible humoral rejection and in 2 ones from renal venal thrombosis. The absence of anti-HLA antibodies against the donor was verified by the negativity of crossmatches performed using the most sensitive assays, at the transplant, at the rejection, and before and after the transplantectomy Antibodies from 9 eluates bound to EAHy.926. Positive and negatives eluates were tested against frozen sections from 6 normal kidneys in order to define the structures to which they were reactive. The reactivity was identified by indirect immunofluorescence method. From 13 eluates evaluated, 4 (isotipe IgG) and 5 (isotipe IgM) reacted to the glomerulus and renal arterial endothelium with intense fluorescence but they did not react to the Bowmans capsule and tubular epithelium. No polymorphism was observed in eluates reactivity. In conclusion, we have shown that non-HLA antibodies may represent a cause of the humoral rejection. These antibodies are probably recognizing antigens of a nonpolymorphic system in endothelial cells present, mainly, in the glomerular capillaries.

A lipoproteína de baixa densidade eletronegativa (LDL-) é um importante antígeno envolvido na patogênese da aterosclerose. A LDL(-) provoca resposta inflamatória e imunológica, levando à produção de autoanticorpos anti-LDL(-) e a formação subsequente de imunocomplexos (IC-LDL-), os quais também contribuem com o processo aterosclerótico. Diante disso, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de imunoensaios para quantificação plasmática de LDL(-), anti-LDL(-) e IC-LDL(-), assim como o desenvolvimento de ferramentas aplicáveis em um biossensor para LDL(-). Após a padronização de cada ELISA, foram avaliadas as características de desempenho dos métodos: limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão intra e inter-ensaios, exatidão, linearidade de diluição e interferentes. Os LD e LQ do ELISA para LDL(-) foram 0,423 mg/L e 0,517 mg/L de LDL(-), respectivamente. As concentrações plasmáticas de LDL(-) apresentaram linearidade quando os plasmas foram diluídos 1:1000, 1:2000, 1:4000 e 1:8000. Os LD e LQ do ELISA para anti-LDL(-) foram 0,0028 mg/L e 0,0032 mg/L de anti-LDL(-), respectivamente. Os plasmas apresentaram linearidade na diluição quando diluídos 1:100, 1:200, 1:400 e 1:800. Os LD e LQ do ELISA para IC-LDL(-) foram 0,023 g/L e 0,034 g/L de IC-LDL(-), respectivamente. Os plasmas apresentaram linearidade quando diluídos 1:12,5, 1:25, 1:50 e 1:100. Os três ELISAs apresentaram precisão intra e inter-ensaios e recuperação dentro dos limites requeridos para imunoensaios. Para o desenvolvimento de um biossensor para LDL(-), uma proteína recombinante, denominada GFP5-scFv, foi expressa em bactérias Escherichia coli da linhagem BL21(DE3). Para obtenção dessa proteína foi realizada a inserção da sequência de DNA de um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LDL(-) em um vetor bacteriano com a sequência de DNA da proteína verde fluorescente (GFP5). Dessa forma, a GFP5-scFv é fluorescente e tem afinidade pela LDL(-). Também foram sintetizadas nanopartículas de ouro, as quais podem ser eficientemente utilizadas na supressão da emissão da fluorescência de GFP5-scFv. Portanto, os imunoensaios validados e os aplicativos desenvolvidos para o biossensor são ferramentas que tem potencial para serem utilizadas na avaliação da patogênese da aterosclerose. / The electronegative low-density lipoprotein (LDL) is an important antigen involved in the pathogenesis of atherosclerosis. The LDL(-) causes inflammatory and immune response, leading to production of autoantibodies anti-LDL(-) and the subsequent formation of immune complexes (IC-LDL), which also contribute to the atherosclerotic process. Thus, this study aimed to develop and validate immunoassays for quantification of plasma LDL(-), anti-LDL(-) and LDL-IC(-) as well as developing tools applicable to a biosensor for LDL(-). After the standardization of each ELISA, were evaluated the performance characteristics of methods: limits of detection (LD) and quantification (LQ), intra- and inter-assays precision, accuracy, linearity of dilution and interferences. The LD and LQ of LDL(-) ELISA were 0.423 mg/L and 0.517 mg/L of LDL(-), respectively. Plasmas showed linearity when diluted 1:1000, 1:2000, 1:4000 and 1:8000. The LD and LQ of anti-LDL(-) ELISA were 0.0028 mg/L and 0.0032 mg/L of anti-LDL(-), respectively. Plasmas showed linearity when diluted 1:100, 1:200, 1:400 and 1:800. The LD and LQ of IC-LDL(-) ELISA were 0.023 g/L and 0.034 g/L of LDL-IC(-), respectively. Plasma showed linearity when diluted 1:12.5, 1:25, 1:50 and 1:100. The three ELISAs showed good intra- and inter-assays precision and recovery within the limits required for immunoassays. To develop a biosensor for LDL(-), a recombinant protein, called GFP5-scFv was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) strain. The obtainment of this protein was performed inserting the DNA sequence of an anti-LDL(-) single chain variable fragment (scFv) in a bacterial vector with a DNA sequence of green fluorescent protein (GFP5). Thus, the scFv-GFP5 is fluorescent and has affinity for LDL(-). Were also synthesized gold nanoparticles, which can be efficiently used for quenching the fluorescence emission of GFP5-scFv. Therefore, immunoassays validated and developed applications for the biosensor are tools that have potential to be used in evaluating the pathogenesis of atherosclerosis.

Orientador: Sofia Rocha Lieber / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T00:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_SimoneCorteBatistadeSouza_M.pdf: 12986126 bytes, checksum: 56f6e541e8fd3c63c90b4163763aa88d (MD5) Previous issue date: 1998 / Abstract: Pregnancy can be considered as a very successful all graft, but the underlying mechanism is not yet completely understood. HLA all tigens compatibility is very important in c1inic transplant due to their all ore cognition by immune system. Nevertheless, genetic differences between maternal and paternal HLA antigens seem to be an important factor for implantation and development of the concept. Such differences lead to immune active responses but, at same time, they help the development of tolerant responses, important to embryo acceptance. So, couples sharing HLA antigens are more subjected to Recurrent Spontaneous Abortion (RSA). As the fetus can be considered a half-all genetic graft, the patient's previous immunization with husband's lymphocytes could be helpful, since it could induce, in patient sera, the arising of both citotoxic antibodies and mixed Lymphocyte culture (MLC) blocking factors, both against husband's . antigens. Those factors have been seen as important for the normal pregnancies and reflect the immune tolerant status of the pregnant women. Hence, the aims of this study was: (1) to examine the HLA compatibility degree in 111 RSA couples and in 161 fertile couples; (2) to define the incidenceofcitotoxic antibodies against husband's lymphocytes (cross match assay) and MLC blocking factors in 291 RSA patients serum; (3) to verify the changes in previous cited factors ill 178 RSA patients submitted to immune therapy. The therapy consisted of 2 to 6 intradermal inoculations, every four weeks, containing 80 X 106 husband or husband plus unrelated donor mononuc1ear cells; (4) to evaluate the relevance of cytotoxic antibodies and MLC blocking factors in 101 cases of pregnancy outcome. We have found that, in our own population, the number of shared HLA antigens was greater in RSA couples than in normal fertile couples. Additional1y, cytotoxic antibodies and MCL blocking factors were found in low frequency (around 12%) in RSA patients. The immune therapy induced the development aft antibodies against husband's lymphocytes in 84,5% of the cases, as well as MCL blocking factors in 71,5% aft the cases, most of them being not specific to husband's lymphocyte responses. Citotoxic antibodies also reacted against to the cross reacting HLA antigens group bin addition to the husband HLA c1ass I antigens, in 52 % of the patients. The miscarriage incidence fell down to 25,7% with the immunization. But the use of cross match and MLC inhibition assays were found to be a limited value in predicting the pregnancy outcome. We did not find significant differences between term and abortion groups concerning these two factors. Since most of the 17 patients of fertile control group studied were in a 12-week-period of pregnancy, it was difficult to evaluate the direct effects of the blocking factors in sera. It is possible that those factors could be absorbed in the fetus-placenta compartment. Where they could contribute to down regulating HLA molecules and with the help of cytokine profile TH2 could induce the immune tolerance to fetal antigens. So, there is a need for an additional in vitro functional test that gives a qualitative assessment of immunotolerant status before pregnancy establishment. This would enable the clinidian to predict the need of additional immunizations for any particular patient. The results suggest an important aid of immunotherapy in the RSA treatment. However, the assays used in this study resulted in a poor predictive test of miscarriage. Nevertheless the cross match and MCL inhibition tests could be used as a first step for monitoring patients who had undergone immune therapy. The couple HLA typing could help define the inclusion or not of unrelated donor in immunizatioti protocols / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Evidências epidemiológica e imunológica sugerem que o desenvolvimento da imunidade natural contra doença meningocócica pode está associado com a reação cruzada de antígenos em comuns com Neisseria meningitidis e outras bactérias comensais, como Neisseria lactamica. O Objetivo deste trabalho foi de investigar a imunogenicidade de antígenos de vesículas de membrana externa (OMV) de N. lactamica, com ou sem a presença de Bordetella pertussis (BP), utilizada como adjuvante. Grupos de camundongos neonatos da linhagem BALB/c foram imunizados com antígenos de N. lactamica. Os resultados de nossos estudos mostraram o predomínio de altos títulos de anticorpos dos isótipos IgG e IgM com alta e intermediária avidez, depois das imunizações pela via (i.n) com N. lactamica. A análise do soro por immunoblot mostrou proteínas com reatividade cruzada entre as espécies do gênero Neisseria e os anticorpos monoclonais utilizados neste trabalho. Estes resultados sugerem que antígenos de N. lactamica e N. meningititdis em comum, possam ser importantes na imunidade natural contra doença meningocócica, e no desenvolvimento de vacina. / Immunological and epidemiological evidences suggest that the development of natural immunity to meningogoccal disease may be associated with crossreactive antigens together with Neisseria meningitidis and other commensal bacteria, like Neisseria lactamica. The present study aimed to investigate the immunogenicity of antigens of outer membrane vesicles (OMV) of N. lactamica with or without the presence of Bordetella pertussis (BP) used as an adjuvant. Groups of neonate BALB/c mice were immunized intranasally antigens of N. lactamica. The results of our studies showed the predominance of high titers of antibodies of IgG and IgM isotipes with high and intermediate avidity after intranasal immunization with N. lactamica. Immunoblot analysis of serum showed cross-reactivity proteins between the species of the gender Neisseria and the monoclonal antibodies used in this study. These results suggest that antigens of N. lactamica and N. meningitidis in common may be important in natural immunity against meningogoccal disease and in the development of vaccine.

Orientador: Flávia Hebeler Barbosa Trovão / Resumo: Bibliotecas conformacionais de anticorpos vem constituindo importantes ferramentas na investigação científica de imunoglobulinas expressas em diferentes situações biológicas incluindo patologias. O conhecimento e elucidação estrutural de anticorpos diferenciais produzidos em patologias distintas pode representar ferramenta molecular fundamental para a intervenção na fisiopatologia da doença; incluindo diagnóstico diferencial, identificação de biomarcadores, terapêutica baseada em imunoglobulinas para bloqueio de patógenos bem como, contribuir para a constituição de painéis de anticorpos capazes de identificar epítopos agregando, também, informações para avanços no desenvolvimento de vacinas. A maior dificuldade atualmente reportada na literatura científica é a obtenção in vitro dos fragmentos Fab (Fragment Antigen Binding) devido à ausência de informações metodológicas das fases experimentais necessárias à construção do Fab, substrato essencial a construção de bibliotecas de anticorpos. Uma abordagem ainda inédita neste contexto é o desenvolvimento de uma metodologia experimental eficiente para a obtenção de bibliotecas de Fab na infecção pelo vírus ZIKA (ZIKV). A infecção pelo vírus ZIKA (ZIKV) vem sendo associada à casos de microcefalia em neonatos de gestantes infectadas e síndrome de Guillain-Barré, a neutralização viral baseada em anticorpos dirigidos contra epítopos específicos é pouco conhecida, a maioria dos estudos se referem a outros Flavivirus. A resposta imunológi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Conformational libraries of antibodies have become important tools for the scientific investigation of immunoglobulins expressed under different biological situations, including pathological conditions. The knowledge and structural elucidation of differential antibodies produced during distinct pathological conditions may be fundamental for intervention in the pathophysiology of diseases, including differential diagnosis, biomarker identification, immunoglobulin-based therapy for pathogen blocking, and constitution of antibody panels for identifying epitopes for vaccine advancement. Currently, the greatest difficulty reported in the scientific literature is the lack of methodological information for the experimental phases necessary for in vitro construction of Fab (Antigen Binding Fragment), an essential substrate for antibody library construction. In this context, an efficient experimental methodology for obtaining Fab libraries in ZIKA (ZIKV) virus infection is as yet unreported. ZIKV infection has been associated with cases of microcephaly in neonates of infected pregnant women and those with Guillain-Barré syndrome. However, viral neutralization based on antibodies directed against specific epitopes is not well understood, therefore, most studies have been carried out on other Flaviviruses. The humoral immune response is essential for protection against Flaviviruses; hence, it is important to understand the mechanisms of the host immune system against this virus. Thus, t... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Patrícia Pintor dos Reis / Resumo: Os anticorpos são proteínas altamente específicas, com síntese estimulada pela presença de um antígeno, que podem ser usados como ferramentas em pesquisa, diagnóstico clínico, acompanhamento de patologias, inferência in silico e terapêutica. Diferentes metodologias baseadas no uso de anticorpos vêm sendo descritas e, a grande maioria delas utilizando como ferramenta a construção por técnicas moleculares da fração de ligação ao antígeno (Fab) ou as frações variáveis da imunoglobulina. O estudo e aplicação dos anticorpos desenvolvidos in vitro na prática médica humana cresceu muito nos últimos anos, no entanto o mesmo não ocorreu no campo da medicina veterinária, área que carece de estudos nesse sentido. Assim, este estudo buscou realizar a criação de uma biblioteca de frações variáveis de anticorpos em hiperplasia e neoplasia mamária em cães e criar um banco de dados gerado por sequenciamento em larga escala de sequências destes anticorpos para disponibilização pública, contribuindo, assim, para futuras aplicações e avanços científicos no campo da medicina veterinária. / Abstract: Antibodies are highly specific proteins, with stimulated synthesis by the presence of an antigen, which can be used as tools in research, clinical diagnosis, pathology monitoring, in silico inference and therapeutics. Different methodologies based on the use of antibodies have been described and the majority of them uses molecular techniques to construct the antigen binding fraction (Fab) or the variable fractions of the immunoglobulin. Description and application of antibodies developed in vitro in the human medical practice has grown a lot in the last years, however the same has not occurred in veterinary medicine field. Thus, this study aimed to create a library of variable fractions of antibodies in mammary hyperplasia and neoplasia in dogs and to create a database generated by large-scale sequencing of these antibodies for public availability, thus contributing to future applications and scientific advances in veterinary medicine. / Doutor

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-12-13T12:38:59Z No. of bitstreams: 1 marne-chagas.pdf: 1100888 bytes, checksum: 7a199f01e03cd65e615b7c57af7901f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-13T12:38:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marne-chagas.pdf: 1100888 bytes, checksum: 7a199f01e03cd65e615b7c57af7901f0 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O surgimento de resistência a antimicrobianos em bactérias está se agravando ano após ano, constituindo-se um problema de saúde pública em hospitais e centros de tratamento ao redor do mundo. No Brasil, a resistência a meticilina em Staphylococcus aureus(MRSA) chega a 29 % dos casos detectados anualmente. Atualmente, a metodologia convencional para a identificação de MRSA pode levar 48 horas, portanto, este trabalho tem por objetivo o desenvolvimento de um teste para diagnóstico rápido baseado na tecnologia de imunocromatografia de fluxo lateral usando um anticorpo específico contra a proteína PBP2a, a qual confere resistência ao Staphylococcus aureus, permitindo a identificação em minutos, a partir de colônias isoladas. O anticorpo monoclonalanti-PBP2a foi purificado e empregado em um processo de conjugação a microesferas de látex coloridas para a implementação do teste rápido. Os resultados iniciais demonstraram a capacidade do anticorpo de reconhecer a PBP2a em amostras de MRSA, porém foram observados problemas de inespecificidade que deverão ser solucionados para dar confiabilidade ao teste proposto. / The emergence of antibiotic resistance in bacteria is getting worse year after year, becoming a public health problem in hospitals and treatment centers around the world. In Brazil, methicillin resistance in Staphylococcus aureus(MRSA) reaches 29% of cases detected annually. Currently, the conventional methodology for identification of MRSA may take 48 hours of lengthyphenotypical tests, so this work aims at developing a rapid diagnostic test based onthe lateral flow immunochromatography protocol using a specific antibody against the protein PBP2a, which confers the methicillin-resistance phenotype to Staphylococcus aureus, allowing a prompt identification from isolated colonies. The monoclonal antibody anti-PBP2a was purified and used in a process of conjugation to colored latex microspheres for the implementation of the rapid test. Initial results demonstrated the ability of the antibody to recognize the PBP2a in samples of MRSA, but inespecificity issues will have to be solved to improve reliability of the test proposed.

Made available in DSpace on 2016-06-28T12:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 320.pdf: 1676340 bytes, checksum: 711128ac80440a81a6bb4dc9ff8ef57b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 3 320.pdf.txt: 125592 bytes, checksum: 94d4fa2436a2862cb43733491b5ab4ce (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 320.pdf: 1676340 bytes, checksum: 711128ac80440a81a6bb4dc9ff8ef57b (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A Filariose Linfática (FL) no Brasil é causada pela espécie Wuchereria bancrofti e consiste em um problema de saúde pública. O principal foco ativo de transmissão atualmente no país é a Região Metropolitana do Recife - PE, que desde 2003 iniciou o Programa de Controle/Eliminação da FL, tendo como estratégia principal o Tratamento Coletivo (TC) com Dietilcarbamanzina (DEC). Este trabalho, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, analisou o TC nessas áreas, acompanhando 30 moradores, no período de 2003 a 2009. Para essa análise além das ferramentas tradicionais da pesquisa filarial - Filtração (MF/mL de sangue) e Antígeno Circulante Filarial (Og4C3) - também foi utilizada a pesquisa de anticorpos através de um antígeno recombinante (Bm14). Essa nova metodologia desenvolvida é recomendada para ser empregada como uma forma de avaliar o progresso dos programas de controle e eliminação da FL nas áreas sob intervenção. Os resultados obtidos indicam redução na positividade para a FL pelas três metodologias: o Bm14 reduziu de 90 por cento para 80,00 por cento, o Og4C3 de 100 por cento para 60,00 por cento e a microfilaremia (MF) de 100 por cento para 0 por cento. A análise da densidade de MF/mL de sangue e a positividade para o Bm14 revelou que o grupo com maior densidade de MF/mL no sangue (= 57 MF/mL) apresentou maior percentual de redução na positividade para o anticorpo do que o grupo de menor densidade ( 57 MF/mL) em 2009. A taxa de anticorpos-positivos apresentou um percentual de redução de 11,11 por cento no último ano. A diminuição nas taxas de positividade apresentadas pelo Bm14 e o padrão de decaimento observado na análise das Densidades Óticas média e mediana do anticorpo durante os seis anos da pesquisa indicam que o monitoramento dos anticorpos com o antígeno recombinante Bm14 foi capaz de reconhecer indivíduos infectados e também de identificar redução dos níveis de anticorpos produzidos por eles após exposição aos parasitos filariais. Sugerindo que o TC com DEC teria surtido efeito na eliminação dos vermes adultos e conseqüente desaparecimento das microfilárias da circulação sanguínea

Human neurocysticercosis (NC) is an important but neglected cause of epilepsy in developing countries where the parasite occurs. Expression of single-chain variable fragment (scFv) antibodies on the surface of bacteriophage is widely used to prepare antibodies with pre-defined specificities. A phage antibody library was selected against peptides displayed on phages coupled to beads and total saline extract of Taenia solium metacestodes immobilized on microtiter plate wells. After two rounds of selection 96 phage clones of each panning were selected, tested for scFv expression and specificity to each target. Specific clones were further analyzed by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), Dot-blot, sequencing and immunofluorescence. After selection, three clones were used for antigen capture to characterize its targets for future immunodiagnostic assays development. Total saline extract was fractionated on ion exchange resin diethylaminoethyl (DEAE), and fractions were tested by ELISA to detect sera IgG from: NC, other parasites and health controls (40 each). The fractions with best diagnostic parameters (sensitivity, specificity, area under curve and likelihood ratio, calculated by TG-ROC) were selected and subjected to antigen capture using each purified scFv clone. Each captured fraction was tested by ELISA to detect IgG in 30 serum samples from each group. In immunofluorescence tests, no fluorescence was observed in negative controls, and all clones showed a non-uniform staining profile, and their targets were elucidated through mass spectrometry. After ion exchange fractionation and ELISA tests, DEAE S2 fraction showed to be the best one and was used to capture new antigens. DEAE S2 showed 93.3% specificity. Among all clones, A4 and B6 captured antigens from saline extract and DEAE S2 fraction, respectively, with the best diagnostic parameters. In conclusion, antibody phage display technology is a potential approach for the study of antigen-antibody interactions, which can be used to further elucidate the biology of interaction on neurocysticercosis and to capture new antigens with potential applications in NC diagnosis and therapeutics. / A neurocistocercose humana (NC) é uma doença muito importante, porém negligenciada e é a maior causa de epilepsia em países em desenvolvimento onde a parasitose ocorre. A expressão de fragmentos de cadeia única das regiões variáveis de anticorpo (scFv) na superfície de bacteriófagos é amplamente utilizada para obter anticorpos com especificidades pré-definidas. Uma biblioteca de anticorpos foi utilizada para a seleção de clones específicos à peptídeos expostos em fagos acoplados a beads e ao extrato salino total de Taenia solium (S) imobilizado em placas de microtitulação. Após dois ciclos de seleção, 96 clones de anticorpos foram selecionados contra cada alvo, testados para expressão do scFv e especificidade pelo alvo. Aqueles clones que se mostraram específicos foram melhor analisados por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), Dot blot, sequenciamento e imunofluorescência. Três clones foram selecionados para serem utilizados na captura antigênica e caracterização do antígeno verdadeiro e para captura de novos antígenos com potencial aplicação em testes diagnósticos. O extrato S foi fracionado em resina de troca iônica diethylaminoethyl (DEAE) para obter frações que foram posteriormente testadas por ELISA para detectar IgG em amostras de soro de pacientes: com NC, outras parasitoses e saudáveis, 40 amostras cada grupo. A fração com melhores parâmetros diagnósticos (sensibilidade, especificidade, área sob a curva e likelihood ratio, calculadas por TG-ROC) foi selecionada e sujeita à captura antigênica usando cada clone de scFv purificado. Cada fração capturada foi testada por ELISA para detectar IgG em 30 amostras de soro de cada grupo. Nos testes de imunofluorescência, nenhuma fluorescência foi observada com os controles negativos e todos os clones mostraram um padrão de marcação não uniforme, seus antígenos alvo foram elucidados por espectrometria de massas. Após fracionamento por troca iônica e ELISA, a fração DEAE S2 se mostrou a melhor e foi utilizada para a captura de novos antígenos. A fração DEAE S2 mostrou especificidade de 93,3%. Dentre todos os clones, o A4 e o B6 capturaram antígenos do extrato S e fração DEAE S2, respectivamente, com os melhores parâmetros diagnósticos. Em conclusão a tecnologia de exposição de anticorpos em fagos é uma técnica potencial para o estudo de interações antígeno-anticorpo utilizadas para melhor elucidar a a biologia da interação na NC e para capturar novos antígenos potencialmente aplicáveis para o diagnóstico da NC. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas