Recentemente, com o intuito de identificar genes associados com invasão e proliferação tumoral, identificamos por PCR em tempo real, um aumento de aproximadamente cem vezes da proteína PLP2 em glioblastomas em relação a tecidos normais. Até o momento não há nenhum relato da identificação desta proteína em astrocitomas. Portanto, neste trabalho clonamos e expressamos em bactérias, as alças externas da PLP2 em fusão com a proteína SUMO, com o objetivo de obtermos anticorpos policlonais para serem usados na identificação da PLP2 em tumor humano por western blotting. Realizamos também a expressão da PLP2 fusionada com a EGFP em células de mamífero, para estudar sua distribuição celular, observamos que a PLP2 se concentra em toda a membrana celular e estudos sobre o transito da PLP2 nas células, indicam que ela possa estar envolvida em processos quimiotáticos via CCR1 sugerindo o envolvimento da PLP2 de alguma forma no processo tumorigênico. / Recently, in order to identify genes associated with tumoral invasion and proliferation, identified by real time PCR, an increase of about one hundred times of PLP2 protein in glioblastomas when compared to normal tissue. So far, there is no report of identification of this protein in astrocytomas. Therefore in this study, we cloned and expressed in bacteria the external handles of PLP2 fused with SUMO protein in order to obtain polyclonal antibodies for use in identifying the PLP2 in human tumor by western blotting. We also expressing the PLP2 fused with EGFP in mammalian cells to study its cellular distribution, we observed that focuses PLP2 across the cell membrane and studies on the traffic of PLP2 cells, indicate that it may be involved in chemotactic processes via CCR1 suggesting the involvement of PLP2 somehow in the tumorigenic process.

A toxoplasmose é uma protozoose altamente prevalente que atinge pelo menos um bilhão de indivíduos no mundo. A infecção causada pelo Toxoplasma gondii é benigna e assintomática, mas pode causar perdas visuais ou morte em fetos e pacientes imunossuprimidos. Isto pode ser controlado com diagnóstico e instituição de tratamento, mas depende da determinação de infecção ativa ou recente. O diagnóstico parasitológico é complexo, demorado e só executado em poucos centros, sendo a sorologia específica essencial no diagnóstico da doença. A avidez de anticorpos IgG tem sido utilizada para determinação da infecção recente, porém os testes convencionais de avidez só permitem uma estimativa indireta destes anticorpos a partir dos anticorpos totais e os de alta avidez. A quantificação destes anticorpos de baixa avidez seria interessante devido aos altos títulos na fase aguda da infecção ou como marcadores da atividade da doença. Padronizamos um ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando o pH como agente caotrópico, para permitir a determinação e quantificação dos anticorpos de baixa avidez. Na padronização utilizamos amostras de soro de coelhos experimentalmente infectados ou amostras do banco de material biológico do Laboratório de Protozoologia do IMTSP. Nossos resultados mostraram que pH 3,5 apresentou poder caotrópico semelhante a uréia 6M (r2= 0,9909), e que nos soros experimentais, os anticorpos de alta avidez foram resistentes aos dois caotrópicos associados. Os anticorpos recuperados na eluição com pH 3.5 ou Uréia eram semelhantes quanto a especificidade antigênica por imunomarcação ou Western Blot. A neutralização do anticorpo eluído por pH permitiu seu reensaio por ELISA após 1 hora de renaturação, com a quantificação direta dos anticorpos de baixa avidez.. A reprodutibilidade intra e inter teste foi superior a 95%, embora com resultados piores para o pH 3,5. Uma vez padronizada a reação, foram analisadas 150 amostras de soros humanos com sorologia e avidez conhecidas, composta por grande maioria de soros de alta avidez. As medidas de avidez por porcentagem mostraram um resultado errático, atribuído ao uso de grande maioria de anticorpos de alta avidez, embora a medida dos anticorpos recuperados mantivesse correlação com estimativa a partir da medida indireta (r2= 0.48). Esta abordagem permite a determinação direta dos anticorpos de baixa avidez, que são os anticorpos inicialmente produzidos em um desafio antigênico. Nosso ensaio é semelhante ao imunológico, já que a apresentação de antígenos por exossomos ácidos de células dendríticas foliculares no centro germinativo parece ser o sistema de seleção de clones produtores de anticorpos de alta avidez. As perspectivas futuras de uso da medida dos anticorpos de baixa avidez na toxoplasmose são imensas, desde a relação com a gravidade da doença, pela sua quantidade, ou da presença de infecção recente, principalmente em infecção congênita ou e em imunossuprimidos, ou a reatividade da doença crônica, como na toxoplasmose ocular. / Toxoplasmosis is a highly prevalent protozoosis, affecting at least one billion people worldwide. The infection caused by Toxoplasma gondii is asymptomatic and benign but it can cause visual losses in addition to death in fetuses and immunocompromised patients. The agent can be controlled by early diagnosis and treatment, but this therapy depends on the determination of active or recent infection. The parasitological diagnosis is complex, time consuming and only performed in few centers, so specific serology is essential for diagnosis. The IgG avidity tests has been used to determine recent infection, but avidity conventional tests only provide an indirect estimate of low avidity antibodies from the total and high avidity antibodies. The quantification of low avidity antibodies would be interesting due to high titers in the acute phase of infection or as markers of disease activity. Using reversible chaotrope such as pH, we standardized an enzyme immunoassay (ELISA) to allow the determination and quantification of low avidity antibodies. For standardization we used serum samples from experimentally infected rabbits or samples of biological material bank of the Laboratory of Protozoology, IMTSP. Our results showed that pH 3.5 is a chaotrope similar to 6M urea (r2 = 0.9909) in avidity ELISA, and high avidity antibodies had similar resistance to two associated chaotrope in experimental sera. The antibodies recovered on elution with pH 3.5 or urea had similar antigen specificity by immunostaining or Western blot. The neutralizing antibody eluted by pH allowed retest by ELISA after 1 hour of refolding, with direct quantification of antibodies of low avidity. The reproducibility inter and intra test were above 95%, but with worse results for pH 3.5. After standardization, we analyzed 150 samples of human sera with known serology and avidity, composed by a large majority of high avidity samples. Avidity as percent of high avidity antibodies showed erratic results in chaotrope comparison, attributed to the majority of high avidity samples, although the direct measure of low avidity IgG kept correlation with the indirect estimate (r2 = 0.48). This approach allows the direct determination of low avidity antibodies that are early produced in an antigen challenge. Our test is similar to the biology of antibody selection, since antigen presentation by acid exosomes of follicular dendritic cells in germinal center seems to be the system of selection of clones that produce high avidity antibodies. The prospective use of the quantification of low avidity antibodies in toxoplasmosis are attractive, either by the quantitative relationship with the severity of the disease; or the increased presence in recent infections, especially in congenital infection and in immunosuppressed patients, or their relative increase in reactivated chronic disease, such as ocular toxoplasmosis.

Esporos de Bacillus subtilis podem ser utilizados como veículos vacinais capazes de expressar ou adsorver proteínas heterólogas em sua superfície. Estudos recentes indicaram que esporos de B. subtilis também conferem um forte efeito adjuvante para vacinas baseadas em proteínas purificadas administradas por via parenteral. Nesse cenário, o objetivo do presente projeto foi avaliar o papel adjuvante dos esporos de B. subtilis e viabilizar sua utilização como carregadores de vacinas de DNA pelo método da biobalística (gene gun). Nesta metodologia, os esporos foram utilizados como substitutos das micropartículas de ouro usualmente empregadas, mantendo a capacidade de transfecção de células eucarióticas in vitro, e produção de anticorpos específicos em camundongos C57BL/6 imunizados com o plasmídeo vacinal pgDE7h (que codifica para uma forma atóxica da oncoproteína E7 do HPV-16). Além disso, esporos de B. subtilis foram capazes de ativar células dendríticas in vitro e, quando coadministrados a pgDE7h pela via intramuscular, conferiram um aumento de 50% na proteção anti-tumoral de animais previamente transplantados com a linhagem tumoral TC-1 (que expressa a proteína E7 do HPV-16), em uma relação dose-dependente. / Bacillus subtilis spores can be used as vaccine vehicles capable of to display or adsorb heterologous proteins in its surface. Recent studies have indicated that spores of B. subtilis confer a strong adjuvant effect for vaccines based on purified proteins administered by the parenteral route. In this scenario, the objective of this project is to evaluate the adjuvant role of B. subtilis spores e viabilize its use as DNA vaccine carriers of biolistic method (gene gun). In this methodology, the spores are used as gold microparticles substitutes usually employed, maintaining the ability to transfect eukaryotic cells in vitro and production of specific antibodies in C57BL / 6 mice immunized with the vaccine plasmid pgDE7h (encoding a non-toxic form of the E7oncoprotein of HPV-16). Additionally, spores of B. subtilis were able to activate dendritic cells in vitro when co-administered intramuscularly to pgDE7h, conferring an increase of 50% of anti-tumor protection in animals previously transplanted with the TC-1 tumor cell line (expressing the E7 protein of HPV-16) in a dose-dependent manner.

Escherichia enterotoxigênica e Escherichia coli produtora da toxina de Shiga (STEC) são globalmente envolvidas em doenças diarreicas e produzem a toxina termolábil e a toxina de Shiga (Stx1 e Stx2), as quais são prejudiciais ao homem. O diagnóstico é uma importante ferramenta para o correto tratamento e controle de surtos. Assim, testes imunocromatográficos (ICs) para ETEC e STEC baseados na detecção das toxinas foram desenvolvidos e padronizados utilizando anticorpos policlonais conjugados ao ouro coloidal (PAbs) e seus correspondentes anticorpos monoclonais (MAbs) anti-LT (IgG2b, 4,9 x 10-11 M), anti-Stx1 (IgG1, 2,5 x 10-10 M) e anti-Stx2 (IgG1, 6,1 x 10-10 M). Os três testes ICs detectaram até 15,6 ng/mL de LT, 15,6 ng/mL de Stx1 e 62,5 ng/mL de Stx2 e não apresentaram reatividade cruzada com os isolados não produtores da respectiva toxina alvo. Estes resultados demonstram a viabilidade e aplicabilidade dos testes ICs como ferramentas no diagnóstico de E. coli diarreiogênicas. / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are worldwide involved in diarrheal diseases and produce the heat-labile (LT) and the Shiga (Stx1 and Stx2) toxins, which, cause injuries to man. The diagnosis is an important tool for the correct treatment and control of outbreaks. Thus, immunochromatographic assays (ICs) for ETEC and STEC based on toxins detection were developed and standardized using polyclonal antibodies-gold conjugated (PAbs) and their corresponding monoclonal antibodies (MAbs): anti-LT (IgG2b, 4.9 x 10-11 M), anti-Stx1 (IgG1, 2.5 x 10-10 M) and anti-Stx2 (IgG1, 6.1 x 10-10 M). The three ICs detect up to 15.6 ng/mL of LT, 15.6 ng/mL of Stx1 and 62.5 ng/mL of Stx2 and showed no cross-reaction with non-producers isolates of the respective target toxin. These results demonstrate the feasibility and applicability of the test ICs as diagnostic tools for diarrheagenic E. coli.

Dois peptídeos, designados Let#1 e Let#2, foram delineados do segundo laço extracelular da proteína NaPi2b. Após conjugação, os peptídeos induziram produção de anticorpos específicos em coelhos e camundongos. Os anticorpos com maiores títulos foram selecionados para ensaios complementares. Estes anticorpos reconheceram os peptídeos conjugados aos carreadores pelos métodos de ELISA e WB, não havendo reação cruzada quando testados com a proteína carreadora livre e com antígeno sintético inespecífico. Após a completa validação, foi possível observar que os anticorpos anti-peptídeos reconhecem NaPi2b nativa, presente na superfície de células OV-CAR, bem como mostraram reconhecimento de um alvo comum em todos os soros analisados, mesmo quando o soro era considerado negativo para COV pelo teste comercial. Este reconhecimento não foi observado quando as amostras foram analisadas pelo soro pré-imune dos animais teste, sugerindo um reconhecimento específico dos anticorpos produzidos. / Two peptides, designated Let#1 and Let#2, were outlined from the second extracellular loop of the NaPi2b protein. After conjugation, the peptides induced the production of specific antibodies in rabbits and mice. Antibodies with higher titers were selected for complementary tests. These antibodies recognized peptides conjugated to the carrier by ELISA and WB, with no cross-reaction when tested with the free carrier protein and nonspecific synthetic antigen. After complete validation, it was observed that the anti-peptide antibodies recognize native NaPi2b protein present on the OV-CAR cell surface and showed recognizing a common target in all sera tested, even when the serum was considered negative for ovarian carcinonoma by commercial test. This recognition was not observed when the samples were analyzed by pre-immune serum of test animals, suggesting specific recognition of antibodies produced.

A predisposição genética associada à predisposição dos neonatos em gerar uma resposta do tipo Th2 ao alérgeno pode favorecer o desenvolvimento de alergia no período neonatal. O presente projeto tem como proposta investigar os mecanismos regulatórios decorrentes da imunização com ovalbumina pré-concepção na resposta IgE da prole. A imunização materna transfere intensamente anticorpos à prole pelas vias placentária e da amamentação. Além disto, a imunização materna é capaz de inibir o desenvolvimento da resposta IgE da prole, aumentar a expressão de CD80 nas células dendríticas (DCs) da prole e manter equilibrado o percentual de células TCD4+CD25+FoxP3+. As DCs da prole co-cultivadas com células T antígeno-específicas induzem células T reguladoras. A imunização materna influencia diretamente no sistema imune do neonato essencialmente por anticorpos que impedem a sensibilização da prole e modulam negativamente a resposta alérgica. / Genetic predisposition in association to the predisposition of neonates to generate a Th2-type response to the allergen can favor the development of allergy in the neonatal period. This project aimed to investigate the regulatory mechanisms in the preconception immunization with ovalbumin in the offspring IgE response. Maternal immunization transferred intensively antibodies to offspring through both placenta and breastfeeding routes. Moreover, maternal immunization is able to inhibit the development of IgE response of the offspring, increase the CD80 expression on dendritic cells (DCs) from offspring and to maintain balanced the percentage of CD4 + CD25 + FoxP3 + T cells. The DCs from offspring co-cultured with antigen-specific T cells induce regulatory T cells. Maternal immunization directly influences the infant\'s immune system mainly by antibodies preventing the offspring sensitization and negatively modulating the allergic response.

Introdução: Os anticorpos antiproteína P ribossomal (anti-P) são considerados marcadores sorológicos específicos do Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) e estão associados a acometimento hepático nesta doença. As semelhanças entre a hepatite autoimune (HAI) e a hepatite associada ao LES levou ao questionamento se o anticorpo anti-P também estaria presente na HAI. Objetivo: Avaliar a frequência e significância clínica do anticorpo anti-P em uma grande coorte de pacientes com HAI. Métodos: Foram analisados os soros de 96 pacientes com HAI, coletados no diagnóstico e comparados com 82 soros de indivíduos saudáveis. Todos os soros foram testados para a presença do anticorpo anti-P pelo método de ELISA, do anticorpo anti-DNA de dupla fita pelo método de imunofluorescência indireta usando Crithidia luciliae e do anticorpo anti-Sm pelo método de ELISA. Os critérios de exclusão adotados foram a presença de outros anticorpos específicos de LES como o anti-DNA de dupla fita (n=1) e o anti-Sm (n=2) ou se o paciente apresentasse o diagnóstico de LES definido pelo Colégio Americano de Reumatologia (n=0). Os prontuários médicos foram revisados para dados demográficos, clínicos e resultados de exames laboratoriais relacionados a hepatopatia e anticorpos específicos de HAI. Resultado: Títulos moderados ou alto (> 40 U) de anti-P foram encontrados em 9,7% (9/93) dos pacientes com HAI e em nenhum dos controles (p = 0,003). No diagnóstico, os pacientes com anti-P positivo ou negativo apresentavam características demográficas/clínicas semelhantes, como a frequência de cirrose (44,4% vs 28,5%, p = 0,44) e exames laboratoriais relacionados a hepatite (p > 0,05). Entretanto, ao final do seguimento destes pacientes (média de 10,2 ± 4,9 anos), os pacientes positivos para anticorpos anti-P apresentaram uma maior frequência de cirrose quando comparados a pacientes negativos para anti-P (100% vs 60%, p = 0,04). Conclusão: a demonstração da presença do anticorpo anti-P em pacientes com HAI sem evidência de LES sugere um mecanismo comum de acometimento hepático nestas duas doenças. Além disso, a presença deste anticorpo parece predizer um pior prognóstico nos pacientes com HAI / Background: Autoantibodies to ribosomal P proteins (anti-rib P) are specific serological markers for systemic lupus erythematosus (SLE) and are associated with liver involvement in this disease. The similarity in autoimmune background between autoimmune hepatitis (AIH) and SLE- associated hepatitis raises the possibility that anti-rib P antibodies might also have relevance in AIH. Aims: To evaluate the frequency and clinical significance of anti-rib P antibodies in a large AIH cohort. Methods: Sera obtained at diagnosis of 96 AIH patients and of 82 healthy controls were tested for IgG anti-ribosomal P protein by ELISA. All of the sera were also screened for other lupus-specific autoantibodies, three patients with the presence of anti-dsDNA (n=1) and anti-Sm (n = 2) were excluded. Results: Moderate to high titers (> 40 U) of anti-rib P antibody were found in 9.7% (9/93) of the AIH patients and none of the controls (P = 0.003). At presentation, AIH patients with and without anti-rib P antibodies had similar demographic/clinical features, including the frequency of cirrhosis (44.4% vs. 28.5%, P = 0.44), hepatic laboratorial findings (p > 0.05). Importantly, at the final observation (follow-up period 10.2 ± 4.9 years), the AIH patients with anti-rib P had a significantly higher frequency of cirrhosis compared to the negative group (100% vs. 60%, P = 0.04). Conclusion: The novel demonstration of anti-rib P in AIH patients without clinical or laboratory evidence of SLE suggests a common underlying mechanism targeting the liver in these two diseases. In addition, this antibody appears to predict the patients with worse AIH prognoses

Introdução: O papel do sistema HLA na evolução do transplante é indiscutível. Dados da literatura internacional e do nosso laboratório têm mostrado que este não é o único sistema envolvido nos processos de RMA (rejeição mediada por anticorpo) Esse fato é comprovado a partir da constatação de que transplantes realizados entre irmãos com total identidade HLA também são alvos da RMA. Entretanto, os alvos antigênicos desses anticorpos permanecem desconhecidos, dificultando assim o diagnostico e tratamento da RMA não-HLA. No transplante renal a presença desses anticorpos têm sido associada com anticorpos anti células endoteliais, células epiteliais tubulares, podocitos, células mesangiais e monócitos. Nosso objetivo neste estudo foi avaliar a presença e a relevância clínica de anticorpos contra a megalina, membro da família de receptores de LDL, expressa na membrana apical dos túbulos proximais, com importante papel na reabsorção de proteínas no rim. Métodos: Soros pré-transplante de 105 pacientes submetidos a transplante renal, realizado no Serviço de Transplante Renal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (UTR-HC-FMUSP) foram testados por ELISA contra 2 peptídeos da megalina estudados e sintetizados em nosso laboratório. (convencionalmente chamados 18 e 19) Resultado: Não foi detectada a presença de anticorpos do isotipo IgG nas amostras prétransplante dos pacientes estudados. Entretanto, foi detectada a presença de anticorpos do isotipo IgM anti-peptídeo 18 em 33 (31,4%) amostras de soro e anti-peptídeo 19 em 23 (21,9%). Para avaliar a significância clinica desses anticorpos dividimos os pacientes em 2 grupos: pacientes com pelo menos 1 episodio de rejeição aguda (Grupo I) e pacientes sem rejeição (Grupo II) e observamos a distribuição dos pacientes positivos nos 2 grupos. O numero de pacientes com anticorpos anti-peptídeo 18 foi igualmente distribuída nos dois grupos. (12/42, 28,5% no Grupo I e 21/63, 33,3% no Grupo II p=ns). A maioria dos pacientes com anticorpos anti-peptídeo 19 pertenciam ao grupo I (17/42, 40,5% ; 6/63, 9,5% p=0,0003). Esta analise demonstrou uma boa correlação entre presença de anticorpos anti-peptídeo 19 no soro pré-transplante e rejeição. Conclusão: Nossos dados sugerem que anticorpos IgM anti-megalina no pré-transplante podem ser um fator de risco na rejeição do aloenxerto renal. É importante salientar que a nosso conhecimento este é o primeiro estudo envolvendo megalina e rejeição no transplante clínico. / Background. Preformed donor-specific human leukocyte antigen (HLA)- antibodies are accountable for the majority of antibody-mediated rejections (AMR). However, recipients of HLA identical kidneys can develop AMR implicating putative pathogenic antibodies that are directed against non-HLA antigens. Unknown immune targets and consecutive lack of detection methods make non-HLA AMR particularly difficult to diagnose and treat. In renal transplant rejection, the presence of antibodies to non-HLA has been associated with antibodies against endothelial cells, tubular epithelial cells, podocytes, mesangial cells and monocytes. The aim of this study was to evaluate the presence and clinical relevance of preformed antibodies against megalin, a member of the LDL receptor family, expressed on the apical membrane of proximal tubules. Megalin performs a central role in renal protein reabsorption. Methods. Pré-transplant sera of 105 recipients of kidney allograft transplanted at Serviço de Transplante Renal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (STRHCFMUSP) were tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) against 2 megalin-peptides (conventionally named 18 and 19) studied and synthetized in our laboratory. Results. Antibodies were not detected in pretranplant sera when tested for IgG isotype. However, in 33 (31,4%) sera we detected the presence of IgM antibodies to megalin-peptide18 and in 23 (21,9%) to megalin-peptide 19. To evaluate the clinical significance of these antibodies we divided the patients in 2 groups: Group I - 42 patients with at least one rejection episode during the first post-transplant year and Group II - 63 patients without any rejection episode and observed the distribution of positive patients in each of the 2 groups. Patients with megalin-peptide18 antibodies had the same distribution in both groups. (12/42, 28, 5% Group I and 21/63, 33,3% no Group II p=ns). However, patients with megalinpeptide19 antibodies were more frequent in group I. (17/42, 40,5% group I and 6/63, 9,5% group II p=0,0003). This analysis demonstrated a good correlation between preformed anti-megalin-peptide19 antibodies and allograft rejection Conclusion. Our data suggest that presence of IgM megalin antibodies before transplantation might be a risk factor for kidney allograft rejection. To our knowledge, this is the first study involving megalin and rejection in clinical transplantation.

No semi-árido paraibano há poucos relatos de ocorrência da raiva, há quem afirme que os caprinos, ovinos e asininos são resistentes à doença e a prática de vacinação é incomum. Este trabalho visou estudar a situação da raiva na região semi-árida de Patos-PB, estabelecendo o diagnóstico desta enfermidade em diferentes espécies de animais domésticos e silvestres. Foram capturados 12 exemplares de raposas (Dusicyon vetulus), por meio de armadilha; 192 morcegos insetívoros (Molossus molossus), capturados no Centro de Saúde e Tecnologia Rural - CSTR, Universidade Federal de Campina Grande - UFCG, em Patos, e oito morcegos insetívoros (M. molossus) encaminhados por moradores desta cidade. As raposas capturadas foram submetidas à colheita de sangue e em seguida sacrificadas com uso de Ketamina e T-61. Outras 287 raposas e oito guaxinins (Procyon cancrivorous) atropelados e mortos nas rodovias que servem o município de Patos foram examinados, além de 74 amostras de diferentes espécies de animais domésticos, enviados pelo setor de Patologia do Hospital Veterinário do CSTR-UFCG. Os animais silvestres, uma vez transportados ao Laboratório de Virologia do CSTR-UFCG, foram necrópsiados e os fragmentos do cérebro, submetidos à prova de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC) para o diagnóstico da raiva. Dos 581 materiais examinados, 50 (8,60%) foram positivos à IFD, dos quais 47 (8,09%) se confirmaram à ICC. Relativamente às espécies, 19/41 amostras de bovinos; 12/299 de raposas; 1/5 de ovinos e 2/6 de caninos apresentaram resultados positivos para ambas as provas. Amostras procedentes de caprinos, eqüinos e morcegos apresentaram resultados discrepantes entre as provas de IFD e ICC, de 2/6 e 1/6; 3/11 e 2/11; e 9/200 e 8/200, respectivamente. As amostras de vírus foram enviadas ao Laboratório de Raiva da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, para extração do material nucléico, tipificação antigênica e genética. A tipificação antigênica e genética com base no gene M1 foi realizada no "Canadian Food and Inspection Agency", Fallowfield, Otawa, Canadá, patrocinado pela IICA – "Inter-American Institutes for Cooperation on Agriculture". A caracterização genética do gene N e o estudo filogenético foram realizados no laboratório do "National Institute of Infectious Diseases", Toyama, Tóquio, pelos pesquisadores do "College of Bioresources Sciences" da Nihon University, Kanagawa, Japão. O estudo do comportamento biológico das amostras foi realizado em camundongos, pela inoculação por via intracerebral, avaliando-se os períodos de incubação e clínico, no seu primo-isolamento. O comportamento biológico de um isolado de raposa foi estudado em caprinos e ovinos inoculados experimentalmente por via intramuscular. A mesma amostra foi utilizada para o desafio de asininos e eqüinos vacinados com uma vacina comercial de vírus inativado. Estes animais apresentaram níveis mensuráveis de anticorpos anti-rábicos neutralizantes e os resultados do desafio indicaram a eficácia da vacina contra o isolado de raposa. Os resultados da tipificação antigênica e genética permitem concluir que: na região estudada a epidemiologia da raiva é complexa, revelando existir variantes distintas, mantidas em cães domésticos, raposas, morcegos insetívoros e morcegos hematófagos. / In the semiarid of the State of Paraíba there are few reports of rabies occurrence, and it is said that caprines, ovines and asinines are resistant to rabies and the use of vaccines in these species is uncommon. This work aimed to study the situation of rabies in the semiarid of Patos-PB, establishing the diagnosis in domestic and wild animals. For the study, 12 foxes (Dusicyon vetulus) were captured alive; 192 insectivorous bats (Molossus molossus), captured at the "Centro de Saúde e Tecnologia Rural-CSTR", of the "Universidade Federal de Campina Grande-UFCG", Patos-PB; and 8 bats (M. molossus) sent by residents of the city of Patos. Captured foxes were submitted to blood collection and then sacrificed using ketamine and T-61. Other 287 foxes and 8 raccoons (Procyon cancrivorus) road-kills collected from the roads serving the Patos municipality were examined. Other 74 samples from different domestic animals sent by the Pathology section of the Veterinary Hospital of the CSTR-UFCG were also included. The wild animals, once shipped to the Virology Laboratory of the CSTR-UFCG, were necropsied and brain fragments were submitted to the fluorescent antibody test (FAT) and mouse inoculation test (MIT) for rabies diagnosis. Among the 581 materials, 50 (8.60%) were positive by FAT, and 47 (8.09%), confirmed by MIT. Concerned to animal species, 19/41 bovines; 12/299 foxes; 1/5 ovines; and 2/6 canines were positive for both FAT and MIT. Caprine, equine and bat samples presented discrepant results between the FAT and MIT, from 2/6 to 1/6; 3/11 to 2/11; 9/200 to 8/200, respectively. All the isolates were sent to the Rabies Laboratory of the "Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal", "Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia", "Universidade de São Paulo-FMVZ-USP", for extraction of nucleic materials, to perform the antigenic and genetic typing. Antigenic and genetic typing based on M1 gene was conducted at the Canadian Food and Inspection Agency, Fallowfield, Otawa, Canada, sponsored by the IICA – Inter-American Institutes for Cooperation on Agriculture. The genetic characterization of the N gene and the phylogenetic analyses were made at the National Institute of Infectious Diseases, Toyama, Tokyo, by the researchers of the College of Bioresources Sciences, Nihon University, Kanagawa, Japan. The biologic behavior of the isolates was studied in mice through intracerebral inoculation by registering the incubation and the clinical periods at its first passage. The biologic behavior of a fox isolate was assessed in caprines and ovines, by experimental inoculation through intramuscular route. The same isolate was used for the challenge of asinines and equines that had been vaccinated with a commercially available inactivated virus vaccine. The vaccinated animals showed measurable levels of neutralizing antirabies antibodies and the results of challenge indicated the efficacy of this vaccine against the fox isolate. According to the results of antigenic and genetic typing, it can be concluded that in the region, the epidemiology of rabies is complex, revealing the existence of virus variants maintained in populations of domestic dogs, foxes and hematophagous and insectivorous bats.

Toxina de Shiga produzida por linhagens de Escherichia coli (STEC) causa a Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU), uma doença severa. A Stx é uma toxina AB5 formada pela monomérica subunidade A catalítica, com efeito inibitório da síntese proteica, e cinco subunidades B, envolvidas na ligação ao receptor glicolipídico na superfície das células alvo. A proteína Stx2DAB foi administrada em camundongos combinada com diferentes adjuvants: toxina termo-lábel (LT) derivada de E. coli enterotoxigênica, a flagelina FliCi de S. Typhimurium, hidróxido de alumínio ou adjuvante de Freund. Adicionalmente os animais foram imunizados com toxina desnaturada. Os resultados mostraram que os soros dos animais imunizados com a Stx2DAB e adjuvante de Freund apresentaram os maiores títulos de anticorpos anti-Stx2 com a proteção máxima de 77% ao desafio letal com a toxina Stx2, entretanto animais imunizados com a toxina desnaturada não apresentaram proteção. Os resultados mostram o potencial protetor do antígeno vacinal como vacina de subunidade e a importância da conformação na proteção. / Shiga toxin (Stx)-producing Escherichia coli strains (STEC) cause the Hemolytic Uremic Syndrome (HUS), a severe illness. The Stx is an AB5 toxin and comprises a single catalytic A subunit, endowed with protein synthesis inhibitory effect, and five B subunits, involved in the binding to glycolipid receptors on the surface of target cells. The protein Stx2DAB was administered to mice combined with different adjuvants: a heat-labile toxin (LT), derived from enterotoxigenic E. coli (ETEC) strains, the flagellin FliCi of S. Typhimurium, alum or Freund\'s adjuvant. Additionally mice were immunized with denatured toxin. The results showed that sera from mice immunized with recombinant Stx2DAB plus Freund adjuvant displayed the highest anti-Stx2 antibody titers with maximum protection of 77% to a lethal challenge with the Stx2 holotoxin, however animals immunized with denatured toxin showed no protection, despite high serum titers achieved. The results show the potential protector of vaccine antigen as a vaccine subunit and the importance of conformation in the protection.