A própolis vermelha brasileira tem atraído interesses científicos e econômicos devido às suas variadas atividades biológicas. Este produto natural possui composição química variada de acordo com a região na qual é encontrado, sendo necessária uma completa caracterização química para cada tipo de própolis, a fim de se elucidar os compostos presentes e responsáveis pela atividade biológica observada. Neste trabalho, buscou-se caracterizar quimicamente os extratos da própolis vermelha brasileira, avaliar sua atividade antitumoral, bem como alguns mecanismos de morte celular, além de investigar o padrão proteico de células tumorais de laringe (Hep-2) e não tumorais de rim (Hek-293) tratadas e não tratadas com extratos da própolis vermelha através da análise proteômica comparativa. A caracterização química mostrou que a própolis apresenta moléculas complexas, principalmente isoflavonoides, que possuem importantes atividades biológicas, dentre elas a atividade antitumoral. A atividade citotóxica de duas frações e do extrato hidroalcoólico da própolis foi avaliada na linhagem tumoral Hep-2, a qual se revelou mais citotóxica nos tratamentos com as frações investigadas. Os ensaios de citometria mostraram que as células que receberam tratamento apresentaram menor potencial de membrana mitocondrial, maior quantidade de células em apoptose tardia (TUNEL e Anexina-V/PI), menor geração de espécies reativas do oxigênio e o aumento de fragmentação do DNA. Além disto, as colorações revelaram a presença de corpos apoptóticos e condensação de cromatina. A análise proteômica permitiu a comparação dos mapas proteicos da linhagem Hep-2, na ausência ou presença de extratos da própolis vermelha, com a linhagem não tumoral Hek-293. Estas proteínas foram classificadas de acordo com os processos biológicos as quais estão envolvidas. Além disto, doze proteínas identificadas na linhagem Hep-2 apresentaram expressão reduzida comparada ao grupo controle, dentre as quais muitas estão presentes em grande quantidade em outros tumores e são consideradas biomarcadores tumorais. Os resultados, de forma geral, mostram que a própolis interfere em um conjunto de eventos intracelulares e, assim, passa a ser uma candidata promissora para inibir o crescimento celular e contribuir para os diferentes passos relacionados com o processo de carcinogênese. Embora os mecanismos moleculares pelos quais a própolis vermelha interaja com o metabolismo das células permaneçam ainda desconhecidos, estudos adicionais servirão para melhor elucidar a atividade antitumoral da própolis vermelha brasileira e de suas frações. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2017-04-18T16:59:16Z No. of bitstreams: 1 Tese Caroline Olivieri da Silva Frozza.pdf: 11179534 bytes, checksum: b2ae6a4dfa6013728ea3f7c81bc40380 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T16:59:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Caroline Olivieri da Silva Frozza.pdf: 11179534 bytes, checksum: b2ae6a4dfa6013728ea3f7c81bc40380 (MD5) Previous issue date: 2017-04-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / The Brazilian red propolis has attracted scientific and economic interests due to its varied biological activities. This natural product has diversify chemical composition according to the region in which it is found, then it is necessary a complete chemical characterization for each type of propolis, in order to elucidate the present compounds and responsible for the biological activity observed. In this work, we attempted to chemically characterize the extracts of Brazilian propolis, evaluate their antitumor activity as well as some cell death mechanisms, and to investigate the protein profile of larynx tumor cells treated and not treated with propolis extracts through comparative proteomic analysis. The chemical characterization showed that propolis has complex molecules, particularly isoflavones, which present significant biological activities, such as antitumor activity. The cytotoxic activity of two fractions and of the hydroalcoholic extract of propolis was assessed in Hep-2 tumor cell line, which proved to be more cytotoxic treatments in the investigated fractions. Flow cytometric assays showed that treated cells had lower mitochondrial membrane potential, increased amount of cells in late apoptosis (TUNEL and Annexin-V / PI), less generation of reactive oxygen species and increase in DNA fragmentation. Furthermore, the staining revealed the presence of apoptotic bodies and chromatin condensation. The proteomic analysis has allowed comparison of the maps of the protein Hep-2 cell line, in the absence or presence of propolis extracts, with non-tumor cell line Hek-293. These proteins were classified according to the biological processes which they are related. Besides, twelve identified proteins in Hep-2 showed reduced expression from the control group. Between them, many are presented in large quantities in other tumors and are considered tumor biomarkers. The results in general show that propolis interferes with a series of intracellular events and hence becomes a promising candidate to inhibit cell growth and contribute to the different steps relating to the process of carcinogenesis. Although the molecular mechanisms by which propolis interact with the metabolism of the cells remain unknown, further study will serve to better elucidate the antitumor activity of Brazilian propolis and its fractions.

A própolis vermelha é uma resina natural produzida por abelhas do gênero Apis a partir de exsudados vegetais e tem atraído a atenção dos pesquisadores de todo o mundo devido à sua potente atividade em diversos modelos biológicos. Essa resina natural é rica em polifenóis e compostos voláteis, sendo que mais 300 compostos químicos já foram identificados em amostras de diferentes regiões. Técnicas de identificação química de alta precisão são imprescindíveis para a correta elucidação dos compostos químicos presentes nas amostras e para o entendimento dos efeitos biológicos. Neste estudo, buscou-se utilizar técnicas de fracionamento como uma metodologia capaz de ser explorada em estudos envolvendo amostras de própolis vermelha, buscando-se a identificação e caracterização de frações ativas, bem como o uso de modelos celulares de câncer de cólon para o screening de moléculas bioativas. As frações ativas foram identificadas por meio HPLC-MS e ESI-MS/MS, evidenciando uma composição química complexa baseada em compostos fenólicos e flavonoides. Entre os resultados obtidos, destacam-se as frações 05 e 06, as quais foram capazes de produzir inibição significativa sobre as linhagens tumorais HT-29 e HCT-116, respectivamente, com menores efeitos sobre as células não-tumorais. As frações obtidas no estudo apresentaram menor diversidade química do que a encontrada no extrato total da própolis, favorecendo a sua bioatividade in vitro, e, como resultado, esta técnica pode favorecer a descoberta e o desenvolvimento de novos fármacos utilizando a própolis como fonte de potencial de moléculas contra o câncer. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2017-04-26T12:12:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Denis Amlton dos Santos.pdf: 1867020 bytes, checksum: 9a2b6e047762ce4edebdc69379893739 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-26T12:12:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Denis Amlton dos Santos.pdf: 1867020 bytes, checksum: 9a2b6e047762ce4edebdc69379893739 (MD5) Previous issue date: 2017-04-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Red propolis is a natural resin produced by bees of the genus Apis from plant exudates and has attracted the attention of researchers worldwide due to its potent activity in several biological models. This natural resin is rich in polyphenols and volatile compounds and more than 300 chemical compounds have been identified in samples from different regions. High precision chemical identification techniques are essential for the correct elucidation of the chemical compounds present in the samples and for the understanding of the biological effects. In this study, we sought to use fractionation techniques as a methodology able to be explored in studies involving samples of red propolis, seeking the identification and characterization of active fractions, as well as the use of cellular models of colon cancer for screening of bioactive molecules. The active fractions were identified by techniques of HPLC-MS and ESI-MS/MS, evidencing a complex chemical composition based on phenolic compounds an flavonoids. Among the obtained results, we highlight the fractions 05 and 06, which are able to produce significant inhibition on the HT-29 and HCT-116 tumor lines.The fractions obtained in this study showed lower chemical diversity than that found in the total extract of propolis, favoring its bioactivity, and as a result, this technique may favor the discovery and development of new drugs using propolis as a potential source of molecules against cancer.

Made available in DSpace on 2015-12-02T01:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000476504-Texto+Parcial-0.pdf: 560629 bytes, checksum: 87ce59a68d7f4e868fc301fa05c033ef (MD5) Previous issue date: 2015 / Melanoma is a malignant tumor that develops anywhere on the skin is 1 to 3% of all malignant neoplasms, and also affects men and women, especially in light skin. The development of melanoma may be associated with excessive sun exposure, sunburn, fair skin, blond or red hair, lots of freckles on their shoulders and backs, family history and presence of actinic keratosis. The chemotherapeutic strategies have been based on the use of dacarbazine and temozolomide. In addition to these monoclonal antibodies are also being used, such as ipilimumab, approved in 2011 for the palliative treatment of patients with metastatic cancer. Many studies are underway to evaluate the anticancer activity of compounds like resveratrol. Resveratrol, 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene (RESV) is a natural phenolic stilbene which has, among the most important properties, antioxidant, anticarcinogenic - inhibiting various cellular events associated with three major stages of carcinogenesis: started, promotion and progression - anti-inflammatory, antiplatelet, antifungal and estrogen. Resveratrol analogs were synthesized by modification of substituents on both rings, without altering the double bond between them: one by the fusion of benzene and other two by fusing a heterocyclic ring; these newly synthesized analogues showed anticancer activity, vasodilatory and anti-tyrosinase. In this paper we propose the synthesis of resveratrol analogues in order to evaluate the biological activity of these. The structural change of resveratrol stilbene modified (alternate double bond between the carbons of the double nitrogens) may be a promising strategy to improve the pharmacological parameters. The replacement of hydroxyl groups by methyls and acetyls can increase the molecular stability, so that there is decreasing susceptibility in the reaction phase II conjugation in vivo, significantly potentiate the cytotoxic activity. Assay in cell culture using melanoma line, B16F10, showed that compounds synthesized had IC50 less than resveratrol. In evaluating the IC50 of the compounds synthesized in fibroblasts, 3T3 line, we see that showed higher values than in melanoma strain except Redresv001 compound, suggesting a specificity of the synthesized compounds in these cancer cells. Among the compounds, methylated Redresv003 and acetylated Redresv004 and Redresv005 have greater prominence, because of having antiproliferative activity at lower concentrations, are selective for cancer tested lineage and maintain their activity long period of time (72 hours), suggesting that did not generate resistance in the B16F10 line. For the qualitative analysis of the mechanism of cell death, we find that the Redresv003, Redresv004 and Redresv005 compounds showed differences compared to the control for apoptosis assay and also by autophagy, suggesting no specific target for action based on these assays. / O melanoma é uma lesão maligna que se desenvolve em qualquer lugar da pele, representa de 1 a 3% de todas as neoplasias malignas e atinge igualmente homens e mulheres, principalmente em peles claras. O desenvolvimento do melanoma pode estar associado à exposição excessiva ao sol, queimaduras solares, pele clara, cabelos loiros ou ruivos, grande quantidade de sardas nos ombros e dorsos, histórico familiar e presença de ceratose actínica. As estratégias quimioterápicas têm sido baseadas no uso de dacarbazina e da temozolomida. Além desses, anticorpos monoclonais também estão sendo utilizados, como o ipilimumabe, aprovado em 2011, para o tratamento paliativo de pacientes com câncer metastático. Muitos estudos estão em andamento para avaliação da atividade antineoplásica de compostos como o resveratrol. Resveratrol, 3,5,4´-trihidroxi-trans-estilbeno (RESV), é um estilbeno fenólico natural que possui, dentre as propriedades mais significativas, a antioxidante, anticarcinogênica - inibindo diversos eventos celulares associados com os 3 maiores estágios da carcinogênese: início, promoção e progressão – anti-inflamatória, antiplaquetária, antifúngica e estrogênica. Análogos do resveratrol foram sintetizados pela modificação de substituintes em ambos os anéis, não alterando a dupla ligação entre eles: um pela fusão de benzeno e outros dois pela fusão de um anel heterocíclico; esses análogos recentemente sintetizados apresentaram atividade antineoplásica, vasodilatadora e antitirosinase. Nesse trabalho propomos a síntese de análogos do Resveratrol com o intuito de avaliar a atividade biológica destes. A alteração estrutural de estilbeno modificado do resveratrol (substituição da ligação dupla entre carbonos pela dupla entre nitrogênios) pode ser uma estratégia promissora para melhorar os parâmetros farmacológicos. substituição de grupos hidroxilas por metilas e acetilas pode aumentar a estabilidade molecular, fazendo com que haja diminuição da suscetibilidade na reação de conjugação de fase II in vivo, além de potencializar significativamente a atividade citotóxica. Ensaios em cultura celular utilizando linhagem de melanoma, B16F10, demonstraram que os compostos sintetizados apresentaram IC50 menor que do resveratrol. Ao avaliarmos o IC50 dos compostos sintetizados em fibroblastos, linhagem 3t3, vimos que apresentaram valores maiores que na linhagem de melanoma, exceto o composto Redresv001, sugerindo uma especificidade dos compostos sintetizados nessas células neoplásicas. Dentre os compostos, o metilado Redresv003 e os acetilados Redresv004 e Redresv005 apresentam melhores resultados, pelo fato de possuírem atividade antiproliferativa em menores concentrações, serem seletivos para a linhagem cancerígena testada e por manterem sua atividade em longo período de tempo (72 horas), sugerindo que não geraram resistência na linhagem B16F10. Pela análise qualitativa do mecanismo de morte celular, verificamos que os compostos Redresv003, Redresv004 e Redresv005 apresentaram diferença em relação ao controle para ensaio de apoptose e também por autofagia, sugerindo não haver alvo específico para ação com base nesses ensaios.

Objetivo: Contribuir para o desenvolvimento do candidato a antitumoral (LaSOM 65) através da avaliação farmacocinética pré-clínica em roedores de diferentes doses pelas vias i.v., p.o e i.p. e avaliação da toxicidade aguda do composto. Metodologia: LaSOM 65 foi administrado a ratos Wistar nas doses de 1 mg/kg i.v. bolus (n = 8), 10 e 30 mg/kg p.o. e 30 e 90 mg/kg i.p. (n = 6/grupo). As concentrações plasmáticas foram quantificadas por CL-UV em método desenvolvido e validado. A ligação às proteínas foi determinada por ultrafiltração e a distribuição tecidual foi avaliada por homogeneizado de tecido após administração i.v. de 1 mg/kg (n = 3 animais/ponto de coleta). Para o ensaio de toxicidade aguda, dose única de 1, 2,5 e 5 mg/kg i.v. e 50, 100 e 150 mg/kg p.o. de LaSOM 65 foi administrada aos animais. Ganho de peso, massa relativa dos tecidos, determinação de parâmetros bioquímicos e hematológicos e uma observação clínica detalhada foram realizados para a avaliação de possíveis efeitos tóxicos. Resultados e Discussão: LaSOM 65 apresentou farmacocinética linear na faixa de dose de 1 a 30 mg/kg (i.v., p.o. e i.p.). Após dose i.v. apresentou um CL = 0,85 ± 0,18 L/h/kg, t1/2 = 1,8 ± 0,7 h e Vd = 1,76 ± 0,24 L/kg. Para a dose de 90 mg/kg i.p. um aumento no Vd (3,2 ± 0,8L/Kg) e t1/2 (2,9 ± 0,9 h) foi observado. O composto apresentou boa biodisponibilidade para as administrações extravasculares (58 e 50% p.o. e 73 e 61% i.p.). A ligação às proteínas foi de 84,7 ± 1,6%. O composto distribuiu-se nos tecidos investigados tendo no pulmão a maior taxa de penetração (ASCtecido/plasma = 2,7) e o cérebro a menor (ASCtecido/plasma = 0,4). Piloereção, diarréia, letargia e dispneia foram os sinais clínicos observados imediatamente após administrações i.v., os quais regrediram após 3 h. Para a via oral nenhuma alteração foi observada. Nenhum outro parâmetro avaliado demonstrou efeitos tociológicos para o LaSOM 65. Conclusões: LaSOM 65 demonstrou uma rápida distribuição tecidual e uma rápida eliminação após administração i.v. Sua boa biodisponibilidade e uma possível ausência de toxicidade apresentada por esta via permitem seu uso oral. A baixa penetração cerebral sugere que desenvolvimento no âmbito farmacotécnico será necessário visando seu uso para o tratamento de gliomas. / Purpose: To contribute with the development of a new anticancer candidate (LaSOM 65) by investigating its pre-clinical pharmacokinetics in rodents after administration of different doses by three routes (i.v., p.o. and i.p.) and acute toxicological evaluation of the compound. Methodology: LaSOM 65 was administrated to Wistar rats in the 1 mg/kg i.v. bolus (n = 8), 10 and 30 mg/kg p.o. and 30 and 90 mg/kg i.p. dose (n = 6/group). Plasma concentrations were determined by a development and validated LC-UV method. Protein binding was determined by ultrafiltration and tissue penetration was investigated in tissue homogenates after i.v. administration of 1 mg/kg (n = 3 animals/time point). For the acute toxicological assay, single administration of LaSOM 65 at the doses of 1, 2.5 and 5 mg/kg i.v. and 50, 100 and 150 mg/kg p.o. were given to the rats. Weight gain, organ relative mass, biochemical and hematological parameters and a detailed clinical observation were evaluated to determine LaSOM 65 toxicity. Results and Discussion: LaSOM 65 showed linear pharmacokinetic between 1 and 30 mg/kg (i.v., p.o and i.p.) with CL = 0.85 ± 0.18 L/h/kg, t1/2 = 1,8 ± 0,7 h and Vd = 1.76 ± 0.24 L/kg after i.v. dosing. After 90 mg/kg i.p. dosing an increase in Vd (3.2 ± 0.8 L/kg) and t1/2 (2.9 ± 0.9 h) were observed. The compound showed good bioavailability after p.o. (58 and 50%) and i.p. (73 and 61%) dosing. The protein biding was 84.7 ± 1.6%. LaSOM 65 distributed into the tissues investigated with a higher penetration ratio into lung (AUCtissue/plasma = 2.7) than into brain (AUCtissue/plasma = 0.4). Piloerection, diarrhea, lethargy and dyspnea were the clinical signs observed immediately after the i.v. administrations and they regressed 3 h post-dosing. No alterations were observed after p.o. dosing. Conclusions: LaSOM 65 showed a rapid tissue distribution and elimination after i.v. administration. Its good bioavailability together with the probably absence of toxicity for the oral route allowed its use by this route. The low brain penetration suggests that a pharmaceutical development will be necessary if LaSOM 65 is intended for the treatment of glioma.

O câncer é a principal causa de morte nos paises economicamente desenvolvidos e a segunda em paises em desenvolvimento, resultado, em parte, da grande falta de especificidade dos tratamentos atualmente disponíveis. Por outro lado, uma aplicação clínica muito específica, denominada letalidade sintética, foi recentemente proposta. Nesta abordagem terapêutica os inibidores de poli(ADP-ribose) polimerases (PARP), também conhecidos como PARPis, mostraram-se capazes de induzir a morte celular seletiva em células tumorais com defeitos em BRCA1 e BRCA2 (ambas envolvidas no reparo de quebras duplas - DSBR). Assim, a excitante possibilidade de eliminar as células cancerígenas de maneira seletiva fez com que os PARPis passassem de interessantes ferramentas moleculares às mais promissoras drogas anticâncer da atualidade. Contudo, os mecanismos básicos envolvidos na citotoxicidade dos PARPis continuam pouco conhecidos e suas aplicações restritas a um pequeno grupo de cânceres. Por este motivo, neste trabalho, a citotoxicidade do Olaparib (um inibidor de PARP) foi investigada em um painel de linhagens de câncer colorretal (CRC). Os resultados demonstraram que o Olaparib é uma droga de ação lenta, cuja citotoxicidade pode ser modulada por defeitos genéticos em MLH1 (envolvido no reparo de bases mal-emparelhadas) e no supressor tumoral PTEN. Por outro lado, observou-se que o fenótipo MSI (Instabilidade de microssatélites) e os defeitos genéticos em p53 não influenciaram a citotoxicidade do Olaparib. Além disso, linhagens com resistência adquirida a Oxaliplatina (Oxp) e a 5-Fluorouracil (5- Fu) não apresentaram efeito refratário ao Olaparib, enquanto que linhagens com resistência adquirida a SN-38 (metabólito ativo do Irinotecano) apresentaram um forte efeito refratário. Finalmente, as associações de Oxp ou 5-Fu com Olaparib foram capazes de sensibilizar células com resistência relativa e adquirida. Juntos, estes resultados sugerem uma série de novas possibilidades para o emprego de inibidores de PARP no tratamento de CRC. / Cancer is the main cause of death in developed countries and the second in lessdeveloped countries, that results in part from the low specific treatments available. However, a very specific therapeutic approach, called synthetic lethality, was recently proposed. The best documented synthetic lethal interaction was reported between poly(ADP-ribose) polymerases inhibitors (PARPis) and defects in BRCA1 and BRCA2 (both involved in double-strand break repair - DSBR), which may induce selective cancer cells death. Therefore, the exciting possibility to selectively kill cancer cells has been moving PARPis from interesting molecular tools to the forefront of cancer therapy research. However, the basic mechanisms involved in PARPis cytotoxicity are still poorly studied and its clinical applications are restricted to a small number of malignances. Herein, the Olaparib (PARPi) cytotoxicity was investigated in a colorectal cancer (CRC) cell line panel. The results demonstrated that Olaparib is a slow action drug, which may have its effects increased in cells with MLH1 (involved in mismatch repair) and PTEN (tumor supressor) defects. On the other hand, neither the MSI (microsatellite instability) phenotype nor the p53 defects were observed to influence on Olaparib cytotoxicity. Further, neither Oxp nor 5-Fu resistant cell lines presented cross-resistance to Olaparib, whereas a pronounced cross-resistance was observed for SN-38 (Irinotecan metabolite) resistant cell line. Finally, Olaparib associations with Oxaliplatin or 5-Fluorouracil were shown to sensitize cells with both relative and acquired resistances. Together, these results suggest a series of new possible uses for PARP inhibitors in CRC treatment.

Objetivo: AC04 é um derivado acridínico com elevada atividade contra tumores sólidos em camundongos. O objetivo deste trabalho foi investigar a farmacocinética no plasma e a distribuição tecidual em ratos Wistar após administração i.v. bolus bem como o metabolismo in vitro e in vivo do AC04. Metodologia: AC04 foi submetido à oxidação in vitro com catalisador de Jacobsen, modelo que biomimetiza o CYP450. O produto obtido na reação foi caracterizado por 1H RMN e analisado por CLAE-EM/EM. O AC04 também foi incubado em meio microssomal de ratos para confirmar a formação do produto observado in vitro com catalisador. Para a avaliação farmacocinética, uma dose única de 1,5 mg/kg foi administrada a ratos Wistar por i.v. bolus (n = 7) e amostras de sangue foram coletadas da veia lateral da cauda até 120 h após administração. AC04 e o 1-oxo-AC04 foram separados do plasma por desproteinização com acetonitrila e analisados por método de CLAE-EM/EM previamente validado. A fração ligada a proteínas foi determinada por ultrafiltração e a distribuição tecidual foi avaliada após administração de 1,5 mg/kg i.v. bolus (n = 3 animais/tempo). Resultados: A oxidação do AC04 pelo catalisador de Jacobsen resultou na formação de um metabólito, 1-oxo-AC04, o mesmo formado pela incubação da fração microssomal e in vivo após administração da droga a roedores. O modelo aberto de dois compartimentos descreveu adequadamente o perfil de concentração plasmática do AC04, possibilitando a determinação de CL de 3,4 ± 3,4 L/h/kg, Vdss de 137,9 ± 91,4 L/kg, t1/2 de 45,5 ± 31,5 h e ASC0-∞ de 788 ± 483 ng·h/mL. A ligação a proteínas plasmáticas foi de 98,1 ± 1,6%. A penetração no pulmão, fígado e baço foi de 1077, 410 e 355 respectivamente, enquanto no cérebro foi de 0,54. O AC04 se acumula no tecido adiposo com um fator de penetração de 30. O t1/2 do 1-oxo-AC04 foi de 23,2 ± 10,4 h. Conclusões: O conjunto de resultados sugere que, apesar da pequena fração livre no plasma livre, AC04 é capaz de se acumular em diferentes tecidos, o que pode ser um componente importante para sua ação em tumores sólidos, além de ter uma meia-vida longa. A reação de oxidação de Jacobsen e o metabolismo in vitro com fração microssomal possibilitaram a identificação do mesmo metabólito obtido in vivo. / Purpose: AC04 is an acridine derivative with high activity against solid tumors in mice. The goal of this work was to investigate the plasma pharmacokinetics and tissue distribution of the drug in Wistar rats after bolus i.v. administration as well as the its in vitro and in vivo metabolism. Methodology: AC04 was submitted in vitro oxidation by Jacobsen catalyst, a biomimetic CYP450 model. The product obtained in the reaction was characterized by (1H NMR) and analyzed by LC-MS/MS. AC04 was also incubated with rats microsomal fraction to confirm the formation of the product observed in vitro with the catalyst. A single 1.5 mg/kg i.v. bolus dose of AC04 was given to Wistar rats (n = 7) and blood samples were harvested from the lateral tail vein up to 120 h after dosing. AC04 and 1-oxo-AC04 were separated from plasma by deproteinization with acetonitrile and analyzed by LC-MS/MS with a previously validated method. Protein binding fraction was performed by ultrafiltration and AC04 tissue disposition was evaluated after 1.5 mg/kg i.v. bolus (n = 3 animals/point) Results: The Jacobsen-catalyzed oxidation of AC04 resulted in the formation of one metabolite, 1-oxo-AC04. The same metabolite was observed with microsomal incubation and in vivo, after AC04 dosing to Wistar rats. A two-compartment open model adequately fitted the individuals plasma profiles of AC04 resulting in a CL of 3.4 ± 3.4 L/h/kg, a Vdss of 137.9 ± 91.4 L/kg, a t1/2 of 45.5 ± 31.5 h and a ASC0-∞ of 788 ± 483 ng·h/mL. AC04 plasma protein binding was 98.1 ± 1.6%. Lung, liver and spleen showed a penetration of 1077, 410 e 355 respectively, while brain penetration was of 0.54. The AC04 accumulates in the adipose tissue with a penetration factor of 30. The 1-oxo-AC04 metabolite showed a t1/2 of 23.2 ± 10.4 h. Conclusions: The Jacobsen oxidation reaction and the in vitro metabolism by microsomes allowed the identification of the same metabolite observed in vivo. The results suggest that despite the small free plasma fraction, AC04 is capable to accumulate in different tissues, which may contribute to its activity in solid tumor, besides its long half-life.

Introdução: A cisplatina pode causar danos permanentes à cóclea, inicialmente pelas células ciliadas externas da espira basal, apresentando como conseqüências alterações da seletividade frequencial da cóclea e perda auditiva neurossensorial irreversível. A audiometria de altas freqüências, por avaliar freqüências auditivas acima de 8.000 Hz, tem sido considerada como método eficaz para monitoramento e diagnóstico precoce da ototoxicidade em indivíduos expostos à cisplatina. O objetivo deste trabalho foi avaliar a audição de pacientes pediátricos que receberam cisplatina através da audiometria de altas freqüências e comparar com os resultados da audiometria tonal limiar e emissões otoacústicas por produto de distorção. Pacientes e métodos: Pacientes do Serviço de Oncologia Pediátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre que receberam quimioterapia com cisplatina entre 1991 e 2008, foram incluídos nas análises. Resultados: Quarenta e dois pacientes foram avaliados. A mediana de idade à avaliação foi 14.5 anos (4 a 37 anos). Foi detectada alteração auditiva nas frequências convencionais em 24 pacientes (57%), alterações nas emissões otoacústicas foram encontradas em 27 (64%) pacientes e, quando submetidos à audiometria de altas frequências esta anormalidade foi observada em 36 indivíduos (86%). Conclusão: Os resultados sugerem que a audiometria de altas freqüências é mais efetiva do que a audiometria tonal limiar e as emissões otoacústicas por produto de distorção para detectar alterações auditivas, podendo ser exame útil na prática clínica para monitoramento e diagnóstico precoce em pacientes tratados com medicações ototóxicas. / Introduction: Cisplatin may cause permanent cochlear damage by changing cochlear frequency selectivity and can lead to irreversible sensorineural hearing loss. High-frequency audiometry is able to assess hearing frequencies above 8,000 Hertz (Hz); hence, it has been considered a high-quality method to monitor and diagnose early and asymptomatic signs of ototoxicity in patients receiving cisplatin. The aims were to evaluate hearing losses induced by cisplatin in pediatric patients through high-frequency audiometry and compare the diagnostic efficacy to standard pure-tone audiometry and distortion-product otoacoustic emissions Patients and methods: Patients who had received cisplatin chemotherapy between 1991 and 2008 at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre Pediatric Unit, Brazil, were included in the analysis. Results: Forty-two patients were evaluated. The median age at study assessment was 14.5 years (range 4 to 37 years). Hearing loss was detected in 24 patients (57%) at conventional frequencies. Alterations of otoacoustic emissions were found in 64% of evaluated patients and hearing loss was observed in 36 patients (86%) when high-frequency test was added. The mean cisplatin dose was significantly higher (p=0,046) for patients with hearing impairment at conventional frequencies. Conclusion: The results suggest that high-frequency audiometry is more effective than pure-tone audiometry and distortion product otoacoustic emissions in detecting hearing loss, particularly at higher frequencies. It may be a useful tool the clinic for early diagnosis and monitoring of patients treated with ototoxic drugs to prevent further deterioration of hearing function.

O câncer é uma das principais causas de morte no Brasil e no mundo. É a segunda principal causa de morte, perdendo apenas para as doenças cardiovasculares, tornando-se um grande desafio para as autoridades de saúde pública. No Brasil, foram estimados aproximadamente 580.000 novos casos para 2014. A capacidade que alguns tumores têm de alcançarem outros órgãos faz do câncer uma doença ameaçadora, em que a metástase é responsável por 90% das mortes. A terapia antineoplásica atual baseia-se na quimioterapia, radioterapia ou remoção cirúrgica da massa tumoral. Embora eficazes em muitos casos, os fármacos antitumorais apresentam alta toxicidade, limitando seu amplo emprego. Além disso, as células tumorais podem adquirir resistência a esses compostos. Nesse cenário, as alquilfosfocolinas (APC) surgem como uma classe promissora de agentes antitumorais. O protótipo da classe das APC corresponde à miltefosina, fármaco aprovado clinicamente para o uso tópico de metástases cutâneas de câncer de mama. No entanto, este fármaco apresenta toxicidade gastrintestinal e ação hemolítica. Neste trabalho, realizamos o planejamento e a síntese de análogos alcóxicicloalquílicos da miltefosina, visando compostos com maior atividade citotóxica frente a células tumorais. A síntese foi realizada em quatro etapas, partindo-se de alcoóis previamente sintetizados a partir de dióis simétricos (10-cicloalquilmetoxi1-decanol). Estes reagiram com oxicloreto de fósforo e, subsequentemente, com a N-metiletanolamina. Por fim, uma etapa de metilação com iodeto de metila resultou nos compostos planejados. Os compostos obtidos foram o 10-cicloexilmetoxi decilfosfocolina e o 10-ciclobutilmetoxi decilfosfocolina que resultaram em um rendimento global de 37% e 29%, respectivamente, e pureza cromatográfica de 98% e 96%, respectivamente. No ensaio de viabilidade celular os compostos obtidos demonstraram menor atividade citotóxica que a miltefosina nas concentrações de 40 µM, 50 µM e 60 µM frente às linhagens celulares H358 e A549. Entretanto, em ensaio de colônia os compostos apresentaram aproximadamente 50% de inibição das células Hela, nas concentrações de 30 µM, 60 µM e 100 µM. Assim é importante que a atividade dos compostos seja investigada frente a outras linhagens celulares tumorais, visto que apresentaram efeitos antiproliferativos, sendo potencialmente promissoras como quimioterápicos. / Cancer is a leading cause of death worldwide. It configures alone second leading cause of death, displaced only by cardiovascular disease, a major challenge for public health authorities. In Brazil, around 580,000 new cases are estimated in 2014. The ability of some tumors to reach other organs makes cancer a threatening condition as metastasis is responsible for 90 % of deaths. The antineoplastic therapy is based on the current chemotherapy, radiation therapy or surgical removal of the tumor mass. While effective in many cases, antitumor drugs have high toxicity, what limits their widespread use. Furthermore, tumor cells may acquire resistance to these compounds. In this scenario, the alkylphosphocoline (APC) arise as a promising class of antitumor agents. The prototype of APC class is miltefosine, a clinically approved drug for topical cutaneous metastases of breast cancer. However, this drug shows gastrointestinal toxicity and hemolytic activity. In this work, design and synthesis of alcoxycycloalkyl analogs of miltefosine, targeting compounds with increased cytotoxic activity against tumor cells. The synthesis was carried out in four stages, starting with alcohols previously synthesized from symmetrical diols (10-cycloalkylmethoxy1-decanol). These reacted with phosphorus oxychloride and subsequently with N-methylethanolamine. Finally, a step methylation with methyl iodide resulted in the planned compounds. The analogous compounds that have been proposed are 10-cycloexylmethoxy decylphosphocholine and 10-cyclobutylmethoxy decylphosphocholine, which were obtained with a overall yield of 37% and 29% and had a chromatographic purity of 98% and 96% respectively. Nevertheless, the compounds showed lower cytotoxicity than miltefosine at 40 mM, 50 mM and 60 mM, in the cell viability assay employing A549 and H358 cell lines. However, in the colony assay the compounds showed approximately 50% inhibition of Hela cells at concentrations of 30 µM, 60 µM and 100 µM. Therefore, further biological tests should be performed ir order to better investigate the potential of these compounds as novel chemotherapeutic agents.

O câncer é a principal causa de morte nos paises economicamente desenvolvidos e a segunda em paises em desenvolvimento, resultado, em parte, da grande falta de especificidade dos tratamentos atualmente disponíveis. Por outro lado, uma aplicação clínica muito específica, denominada letalidade sintética, foi recentemente proposta. Nesta abordagem terapêutica os inibidores de poli(ADP-ribose) polimerases (PARP), também conhecidos como PARPis, mostraram-se capazes de induzir a morte celular seletiva em células tumorais com defeitos em BRCA1 e BRCA2 (ambas envolvidas no reparo de quebras duplas - DSBR). Assim, a excitante possibilidade de eliminar as células cancerígenas de maneira seletiva fez com que os PARPis passassem de interessantes ferramentas moleculares às mais promissoras drogas anticâncer da atualidade. Contudo, os mecanismos básicos envolvidos na citotoxicidade dos PARPis continuam pouco conhecidos e suas aplicações restritas a um pequeno grupo de cânceres. Por este motivo, neste trabalho, a citotoxicidade do Olaparib (um inibidor de PARP) foi investigada em um painel de linhagens de câncer colorretal (CRC). Os resultados demonstraram que o Olaparib é uma droga de ação lenta, cuja citotoxicidade pode ser modulada por defeitos genéticos em MLH1 (envolvido no reparo de bases mal-emparelhadas) e no supressor tumoral PTEN. Por outro lado, observou-se que o fenótipo MSI (Instabilidade de microssatélites) e os defeitos genéticos em p53 não influenciaram a citotoxicidade do Olaparib. Além disso, linhagens com resistência adquirida a Oxaliplatina (Oxp) e a 5-Fluorouracil (5- Fu) não apresentaram efeito refratário ao Olaparib, enquanto que linhagens com resistência adquirida a SN-38 (metabólito ativo do Irinotecano) apresentaram um forte efeito refratário. Finalmente, as associações de Oxp ou 5-Fu com Olaparib foram capazes de sensibilizar células com resistência relativa e adquirida. Juntos, estes resultados sugerem uma série de novas possibilidades para o emprego de inibidores de PARP no tratamento de CRC. / Cancer is the main cause of death in developed countries and the second in lessdeveloped countries, that results in part from the low specific treatments available. However, a very specific therapeutic approach, called synthetic lethality, was recently proposed. The best documented synthetic lethal interaction was reported between poly(ADP-ribose) polymerases inhibitors (PARPis) and defects in BRCA1 and BRCA2 (both involved in double-strand break repair - DSBR), which may induce selective cancer cells death. Therefore, the exciting possibility to selectively kill cancer cells has been moving PARPis from interesting molecular tools to the forefront of cancer therapy research. However, the basic mechanisms involved in PARPis cytotoxicity are still poorly studied and its clinical applications are restricted to a small number of malignances. Herein, the Olaparib (PARPi) cytotoxicity was investigated in a colorectal cancer (CRC) cell line panel. The results demonstrated that Olaparib is a slow action drug, which may have its effects increased in cells with MLH1 (involved in mismatch repair) and PTEN (tumor supressor) defects. On the other hand, neither the MSI (microsatellite instability) phenotype nor the p53 defects were observed to influence on Olaparib cytotoxicity. Further, neither Oxp nor 5-Fu resistant cell lines presented cross-resistance to Olaparib, whereas a pronounced cross-resistance was observed for SN-38 (Irinotecan metabolite) resistant cell line. Finally, Olaparib associations with Oxaliplatin or 5-Fluorouracil were shown to sensitize cells with both relative and acquired resistances. Together, these results suggest a series of new possible uses for PARP inhibitors in CRC treatment.

Objetivo: AC04 é um derivado acridínico com elevada atividade contra tumores sólidos em camundongos. O objetivo deste trabalho foi investigar a farmacocinética no plasma e a distribuição tecidual em ratos Wistar após administração i.v. bolus bem como o metabolismo in vitro e in vivo do AC04. Metodologia: AC04 foi submetido à oxidação in vitro com catalisador de Jacobsen, modelo que biomimetiza o CYP450. O produto obtido na reação foi caracterizado por 1H RMN e analisado por CLAE-EM/EM. O AC04 também foi incubado em meio microssomal de ratos para confirmar a formação do produto observado in vitro com catalisador. Para a avaliação farmacocinética, uma dose única de 1,5 mg/kg foi administrada a ratos Wistar por i.v. bolus (n = 7) e amostras de sangue foram coletadas da veia lateral da cauda até 120 h após administração. AC04 e o 1-oxo-AC04 foram separados do plasma por desproteinização com acetonitrila e analisados por método de CLAE-EM/EM previamente validado. A fração ligada a proteínas foi determinada por ultrafiltração e a distribuição tecidual foi avaliada após administração de 1,5 mg/kg i.v. bolus (n = 3 animais/tempo). Resultados: A oxidação do AC04 pelo catalisador de Jacobsen resultou na formação de um metabólito, 1-oxo-AC04, o mesmo formado pela incubação da fração microssomal e in vivo após administração da droga a roedores. O modelo aberto de dois compartimentos descreveu adequadamente o perfil de concentração plasmática do AC04, possibilitando a determinação de CL de 3,4 ± 3,4 L/h/kg, Vdss de 137,9 ± 91,4 L/kg, t1/2 de 45,5 ± 31,5 h e ASC0-∞ de 788 ± 483 ng·h/mL. A ligação a proteínas plasmáticas foi de 98,1 ± 1,6%. A penetração no pulmão, fígado e baço foi de 1077, 410 e 355 respectivamente, enquanto no cérebro foi de 0,54. O AC04 se acumula no tecido adiposo com um fator de penetração de 30. O t1/2 do 1-oxo-AC04 foi de 23,2 ± 10,4 h. Conclusões: O conjunto de resultados sugere que, apesar da pequena fração livre no plasma livre, AC04 é capaz de se acumular em diferentes tecidos, o que pode ser um componente importante para sua ação em tumores sólidos, além de ter uma meia-vida longa. A reação de oxidação de Jacobsen e o metabolismo in vitro com fração microssomal possibilitaram a identificação do mesmo metabólito obtido in vivo. / Purpose: AC04 is an acridine derivative with high activity against solid tumors in mice. The goal of this work was to investigate the plasma pharmacokinetics and tissue distribution of the drug in Wistar rats after bolus i.v. administration as well as the its in vitro and in vivo metabolism. Methodology: AC04 was submitted in vitro oxidation by Jacobsen catalyst, a biomimetic CYP450 model. The product obtained in the reaction was characterized by (1H NMR) and analyzed by LC-MS/MS. AC04 was also incubated with rats microsomal fraction to confirm the formation of the product observed in vitro with the catalyst. A single 1.5 mg/kg i.v. bolus dose of AC04 was given to Wistar rats (n = 7) and blood samples were harvested from the lateral tail vein up to 120 h after dosing. AC04 and 1-oxo-AC04 were separated from plasma by deproteinization with acetonitrile and analyzed by LC-MS/MS with a previously validated method. Protein binding fraction was performed by ultrafiltration and AC04 tissue disposition was evaluated after 1.5 mg/kg i.v. bolus (n = 3 animals/point) Results: The Jacobsen-catalyzed oxidation of AC04 resulted in the formation of one metabolite, 1-oxo-AC04. The same metabolite was observed with microsomal incubation and in vivo, after AC04 dosing to Wistar rats. A two-compartment open model adequately fitted the individuals plasma profiles of AC04 resulting in a CL of 3.4 ± 3.4 L/h/kg, a Vdss of 137.9 ± 91.4 L/kg, a t1/2 of 45.5 ± 31.5 h and a ASC0-∞ of 788 ± 483 ng·h/mL. AC04 plasma protein binding was 98.1 ± 1.6%. Lung, liver and spleen showed a penetration of 1077, 410 e 355 respectively, while brain penetration was of 0.54. The AC04 accumulates in the adipose tissue with a penetration factor of 30. The 1-oxo-AC04 metabolite showed a t1/2 of 23.2 ± 10.4 h. Conclusions: The Jacobsen oxidation reaction and the in vitro metabolism by microsomes allowed the identification of the same metabolite observed in vivo. The results suggest that despite the small free plasma fraction, AC04 is capable to accumulate in different tissues, which may contribute to its activity in solid tumor, besides its long half-life.