La medicina personalitzada i les teràpies dirigides són, avui dia, estratègies emergents en les companyies farmacèutiques. L’objectiu global, a llarg termini, és desenvolupar tractaments dirigits cap a mecanismes moleculars desregulats únicament en les cèl•lules afectades, reduint així els problemes de toxicitat d’aquests compostos. Aquest procés és llarg i costós però la introducció de les tècniques de disseny racional de fàrmacs ha permès reduir de manera considerable el temps d’identificació de molècules actives, agilitzant així les etapes inicials. Les teràpies antitumorals dirigides a promoure l’apoptosi i/o a controlar el procés de proliferació cel•lular es troben avui dia en ple desenvolupament. A més, les oportunitats d’intervenció terapèutiques en aquesta línia s’incrementen a mesura que augmenta el coneixement de les proteïnes involucrades en aquests processos. Avui dia els principals problemes dels compostos identificats radiquen però en la seva selectivitat i el gran nombre d’efectes secundaris que presenten, pel que el disseny del molècules selectives és un camp de recerca molt actiu. El present projecte es basa en la cerca de nous fàrmacs anticancerígens mitjançant la modelització molecular. D’una banda es tracta d’identificar inhibidors per a les proteïnes de la família Bcl-2 per a restablir els nivells normals d’apoptosi i, de l’altra, per a les proteïnes CDK4 i CDK6, importants reguladores del cicle cel•lular. L’objectiu plantejat a llarg termini en aquesta tesi és identificar compostos actius amb potència i selectivitat cap a aquestes proteïnes per tal de convertir-los en caps de sèrie que finalment puguin arribar a ser fàrmacs comercials. La utilització de compostos mimètics del domini BH3 per inhibir la funció dels membres antiapoptòtics de la família Bcl-2 és una de les estratègies més emprades per al control de l’apoptosi. En aquest marc, en funció de la selectivitat que presenten envers els pèptids BH3, podem trobar dues subfamílies de proteïnes antiapoptòtiques: Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w d’una banda i Mcl-1 i A-1 de l’altra. Diferents estudis suggereixen que per a produir la mort cel•lular és necessari intervenir al menys un membre de cadascuna de les subfamílies. Per tant, sota aquesta premissa, es van analitzar les interaccions establertes entre les proteïnes antiapoptòtiques i dominis BH3 tant pel cas de pèptids que s’uneixen amb igual afinitat a tota la família, com per a pèptids selectius de cadascun dels subgrups. Nombrosos estudis apunten a que la helicitat en els pèptids mimètics dels domini BH3 incrementa notablement l’afinitat d’enllaç. Sota aquesta premissa s’ha tractat de dissenyar pèptids derivats de la proteïna proapoptòtica Bak substituint alguns dels residus prescindibles per l’aminoàcid no natural Aib, inductor de conformacions helicoïdals. Actualment tots els inhibidors coneguts per a les CDKs, actuen sobre el lloc d’unió de l’ATP. Donat que existeix una gran quantitat de dades experimentals sobre aquests compostos es va decidir avaluar diferents algoritmes de docking i predicció d’afinitats experimentals amb cinc inhibidors coneguts de CDK6. Finalment, s’ha proposat també un desenvolupament metodològic que enfoca el problema del disseny de fàrmacs des d’una perspectiva més amplia: la quimiogenòmica. Amb la seqüenciació del genoma humà s’ha pres consciència de que resulta inviable avaluar el gran número de compostos químics coneguts actualment sobre totes les possibles dianes terapèutiques identificades en el genoma humà. Per aquest motiu és imprescindible desenvolupar mètodes teòrics més senzills per a la caracterització i comparació de molècules que permetin predir la seva activitat biològica. Així doncs, amb la realització d’aquesta tesi, queda patent que l’aplicació de mètodes teòrics pot contribuir de manera eficient al disseny de fàrmacs. D’aquesta manera es possible reduir el cost i temps necessari per al descobriment de compostos actius. / Nowadays, personalized medicine and directed therapies have emerged as appealing strategies for pharmaceutical companies. The long-term goal is developing new treatments to target molecular pathways altered only in affected cells, thus reducing undesired side effects and toxicity problems. This is a tedious and long process although the incorporation in its framework of rational drug design techniques has reduced the time needed to identify new active molecules. The knowledge of molecular mechanisms involved in a given pathology allows finding a point of the process that can be targeted, usually a protein, restoring the normal cell behavior. Once identified the therapeutic target it is possible to find compounds that reproduce interactions between this protein and the corresponding natural regulations by means of molecular modeling techniques. In principle, these compounds are expected to mimic the biological effect of the natural regulators. Antitumoral therapies oriented to promote apopotosis or control the cell proliferation process are gaining importance nowadays. In addition, opportunities for therapeutic intervention in this context are growing with the discovery of new proteins involved in these pathways. In fact, the drawback of compounds known at date relies on selectivity problems and, thus, the huge number of undesired side effects of these treatments. Hence, development of selective treatments is a very active research field. The goal of the present PhD project is to identify new anticancer agents using molecular modeling techniques. On the one hand, it has been tried to identify inhibitors of the Bcl-2 protein family in order to restore normal apoptosis levels in tumoral cells and, on the other hand, for the CDK4 and CDK6 proteins, key regulators of eukaryotic cell cycle. All these proteins are deregulated in many types of cancer and thus, are presented as interesting targets for the cancer treatment. The identification of compounds with potency and selectivity for these proteins that can be used as lead compounds that finally will become commercial drugs is seeked.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The phytochemical study of the crude extract hexane, methanol and fractions (acid ether, basic ether and basic acetate) from the stem bark of E. crista-galli (Fabaceae) resulted in the isolation of four compounds: The phytosterol stigmasterol (70), the triterpene lupeol (71) and the alkaloids erysotrine (1) and epierythratidine (50), usual in the genus Erythrina. The structures of the isolated metabolites were elucidated by 1H and 13C NMR uni and bidimensional, and compared with standard sample and data available in the literature. The extracts, fractions and isolated compounds were tested for their antimicrobial and antitumor front cancer cells HT29 (colorectal) activities, as well as regarding the capacity of inhibition of enzymes prolyl oligopeptidase, dipeptidil peptidase-VI and acetylcholinesterase. The crude methanolic extract, all fractions and individual compounds showed high antimicrobial activity mainly against Gram-positive and Gram-negative bacteria. The results were satisfactory in POP inhibition assays, when the crude methanolic extract and its fractions, mainly acid ether fraction, showed great inhibitor potential against this enzyme. For DPP-IV only the crude hexane extract was active. The in vitro antitumoral activity of the crude methanolic extract, basic fractions and the isolate alkaloids was investigated at different concentrations against the human colon cancer cell line HT-29 (PicoGreen dsDNA assay). The results suggest that the anti-proliferative effect of E. crista-galli extract on HT-29 cancer cells may be attributed, at least in part, to the presence of the erythrinian alkaloids 1 and 50. / O estudo fitoquímico do extrato bruto hexânico, metanólico e frações (éter ácida, éter básica e acetato básica) das cascas do caule de E. crista-galli (Fabaceae) resultou no isolamento de quatro compostos: o fitoesterol estigmasterol (70) e o triterpeno lupeol (71) além dos alcaloides erisotrina (1) e epieritratidina (50) usuais do gênero Erythrina. As estruturas dos metabólitos isolados foram elucidadas através de RMN 1H e 13C, uni e bidimensionais, além de comparação com amostra padrão quando existente e dados disponíveis na literatura. Os extratos, as frações e os compostos isolados foram testados quanto à sua atividade antimicrobiana, antitumoral frente a células cancerígenas HT29 (colorretal) e de inibição das enzimas POP, DPP-IV e AChE. Dentre as amostras testadas, o extrato bruto metanólico (EBM), suas frações (FEA, FEB e FAB) e compostos isolados apresentaram grande potencial antimicrobiano principalmente frente as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos foram satisfatórios para a enzima POP, onde o EBM e suas frações, principalmente a fração éterea ácida (FEA), demonstraram grande potencial inibidor desta enzima. Para a DPP-IV apenas o extrato bruto hexânico (EBH) mostrou-se ativo. O efeito antitumoral da planta em questão também foi investigado e os resultados obtidos indicam que o EBM, a combinação das frações FEB e FAB e o alcaloide epieritratidina (50) possuem um grande efeito antiproliferativo frente às células do colorretal (HT29) após 72 horas de exposição.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-28 / Objetivo: Avaliar, através de uma revisão sistemática da literatura, os efeitos antitumorais dos canabinóides em qualquer tipo de neoplasia, utilizando como amostra seres humanos e animais de laboratório com tumores, bem como culturas de células tumorais. Método: A pesquisa incluiu as seguintes bases eletrônicas de dados: PUBMED, EMBASE, LILACS e “The Cochrane Collaboration Controlled Trials Register”. Todos os estudos publicados que envolveram os efeitos antitumorais (mecanismos celulares e moleculares) dos canabinóides foram considerados para esta revisão. Desta forma, foram levados em conta não somente ensaios clínicos (randomizados ou não) como também estudos experimentais in vivo e in vitro. A estratégia de busca bibliográfica compreendeu todas as publicações de cada base de dados até 31 de dezembro de 2009. O exame minucioso de todas as referências bibliográficas dos artigos importantes para esta revisão (incluindo artigos de revisão) foi igualmente realizado com o objetivo de selecionar artigos que não tivessem sido capturados pela estratégia de busca eletrônica. Resultados: De 3.920 artigos inicialmente identificados, 117 preencheram os critérios de inclusão para esta revisão. Todos os estudos incluídos nesta revisão sistemática foram experimentais (in vivo e/ou in vitro), excetuando-se um estudo clinico piloto fase I/II em humanos. Em todos os estudos experimentais incluídos, os canabinóides exerceram atividade antitumoral in vitro e/ou evidência antitumoral in vivo em vários modelos de células tumorais e tumores, respectivamente. As atividades antitumorais incluíram: efeitos antiproliferativos (sequestro do ciclo celular), diminuição da viabilidade e morte celular por toxicidade, apoptose, necrose, autofagia, efeitos antiangiogênicos e antimigratórios. As evidências antitumorais incluíram: diminuição do tamanho tumoral, efeitos antiangiogênicos e antimetastáticos. Adicionalmente, a maioria dos estudos descreveu que os canabinóides apresentaram seletividade na ação antitumoral em vários modelos tumorais. Desta forma, as células normais usadas como controle não foram atingidas. O fator segurança na administração dos canabinóides também foi demonstrado in vivo, em ratos com tumores marcados com células tumorais. O único estudo realizado em humanos, por sua vez, demonstrou segurança na administração intratumoral do delta-9-THC em pacientes com glioblastoma multiforme recorrente. Conclusões: Os vários canabinóides testados em múltiplos modelos de tumores apresentaram efeitos antitumorais in vitro e in vivo. Estes achados indicam que os canabinóides são compostos promissores para o tratamento das neoplasias. No entanto, pesquisas em seres humanos através de ensaios clínicos randomizados, metodologicamente bem conduzidos, devem ser realizadas para a avaliação de eficácia dos mesmos antes que eles possam ser indicados para esta finalidade. Este é o caso do delta- 9-THC e do canabidiol, que já foram testados e aprovados para uso em humanos em outras condições clínicas. Outros canabinóides, no entanto, necessitam ainda de pesquisas farmacocinéticas, farmacodinâmicas e toxicológicas antes de poderem ser testados em seres humanos. / Objective: To evaluate, through a systematic review of the literature, the antitumoral effects of cannabinoids on any type of cancer, involving both human beings and animal samples, as well as cultured tumor cells. Method: Research included the following electronic databases: PUBMED, EMBASE, LILACS and "The Cochrane Collaboration Controlled Trials Register. All published studies involving the antitumoral effects (cellular and molecular mechanisms) of cannabinoids were considered for this review. Thus, not only clinical trials (randomized or not) but experimental studies (both in vivo and in vitro) were taken into account. The bibliography search strategy included all publications of each of these databases until December 31, 2009. The scrutiny of all the references from the relevant articles for this review (which included review articles) was also performed, in order to select items that could not have been captured by the chosen electronic search strategy. Results: From 3,920 initially identified articles, 117 fulfilled the inclusion criteria for this review. All the studies included in this systematic review were experimental (in vivo and/or in vitro), except for a pilot clinical trial phase I/II involving humans. In all experimental studies included, cannabinoids exerted antitumoral activity in vitro and/or antitumoral evidence in vivo in several models of tumor cells and tumors, respectively. The antitumor activity included: antiproliferative effects (cell cycle arrest), decreased viability and cell death by toxicity, apoptosis, necrosis, autophagy, as well as antiangiogenic and antimigratory effects. Antitumoral evidence included: reduction in tumor size, antiangiogenic, and antimetastatic effects. Additionally, most of the studies described that the canabinnoids exercised selective antitumoral action in several distinct tumor models. Furthermore, normal cells used as controls were not affected. The safety factor in the cannabinoids’ administration has also been demonstrated in vivo in rats with tumors which were marked with tumor cells. The sole study in humans demonstrated safety in intratumoral administration of delta-9- THC in patients with recurrent glioblastoma multiforme. Conclusions: The various cannabinoids tested in multiple tumor models showed antitumoral effects both in vitro and in vivo. These findings indicate that cannabinoids are promising compounds for the treatment of cancer. However, methodologically well conducted research on humans through clinical trials has yet to be performed in order to evaluate their effectiveness. This is the case of delta-9-THC and cannabidiol, which have been tested and approved for use in humans in other clinical conditions. In the case of other cannabinoids, however, further pharmacokinetic as well as pharmacodynamic and toxicological studies are required before their being tested in humans. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O câncer de mama é uma neoplasia altamente maligna e continua a ser a segunda principal causa de mortalidade entre as mulheres. Os efeitos antitumorais de metaloproteinases e desintegrinas de veneno de serpentes têm sido investigados em vários tipos de células tumorais. Neste estudo, foram avaliados os efeitos antitumorais e anti-angiogênicos induzidos pela Bothropoidina, uma metaloproteinase desintegrina-like isolada da peçonha de Bothrops pauloensis em células de câncer de mama humano MDA-MB-231 e células endoteliais. Após 24 horas de tratamento com 100pg/mL de Bothropoidina foi constatado um efeito citotóxico moderado de 30% em MDA-MB-231 contra 10% de citotoxicidade em MCF10A (uma linha de células da mama não tumorigênica), uma diferença significativa que sugere uma possível preferência desta proteína por alvos em células tumorais. Observou-se apoptose e apoptose tardia após tratamento com Bothropoidina (10pg/mL e 40pg/mL) em células MDA-MB-231. Além disso, esta toxina não só inibiu a adesão de células MDA-MB-231 de uma forma dose dependente, como a migração celular em aproximadamente 45%. Bothropoidina reduziu a viabilidade e adesão de células endoteliais em Matrigel e inibiu a angiogênese in vitro estimulada por bFGF em Matrigel, mostrando um número de vasos formados significativamente menor em relação ao controle. Os resultados demonstraram que Bothropoidina tem um potente efeito antitumoral e antiangiogênico in vitro, representando uma ferramenta biotecnológica para elucidar o efeito antitumoral de metaloproteinases desintegrinas-like em células cancerígenas. / Breast cancer is a highly malignant carcinoma and remains the second leading cause of mortality among women. The antitumor effects of metalloproteinases and disintegrins from snake venom on various types of cancer cells have been investigated. In this study, we evaluated the antitumor and antiangiogenic effects on MDA-MB-231 human breast cancer cells and endothelial cells induced by Bothropoidin, a disintegrin-like metalloproteinase isolated from Bothrops pauloensis snake venom. At 24h after treatment at 100pg/mL, Bothropoidin exerted a moderate cytotoxic effect of 30% on MDA-MB-231 versus 10% cytotoxicity against MCF10A (a non-tumorigenic breast cell line), a significant difference that suggests a possible preference by this protein for targets in cancer cells. Early and late apoptosis of MDA-MB-231 was observed after Bothropoidin treatment (10gg/mL and 40gg/mL). Furthermore, this toxin inhibited not only the adhesion of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner but also cell migration by approximately 45%. In addition, Bothropoidin decreased endothelial cells viability and adhesion in Matrigel and inhibited in vitro angiogenesis in Matrigel stimulated by bFGF, showing significantly fewer formed vessels. The results demonstrated that Bothropoidin has potent in vitro antitumor and antiangiogenic effect and represents a biotechnological tool for elucidating the antitumor effect of disintegrins-like metalloproteinases in cancer cells. / Dissertação (Mestrado)

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Flavia de Castro Pereira UFG 2010 - part 1.pdf: 495954 bytes, checksum: 284a68ffbde993ede09791444dec1865 (MD5) Previous issue date: 2010-01-22 / Despite the resounding success of cisplatin and closely related platinum antitumor agents, the movement of other transition-metal antitumor agents toward the clinic has been exceptionally slow. Non-Platinum chemotherapeutic metallopharmaceuticals hold much promise for the future, and needs to be actively explored in a large variety of tumor types in combination therapies. The preparations of metallocomplexes with potential antitumor activity has been one of the main targets of transition metal chemistry since Rosenberg s discovery of cisplatin cisdiamminedichloridoplatinum (II), cis-[Pt(NH3)2Cl2]} cytotoxic activity in the 1960s. In 1978, cisplatin was approved as the first platinumbased drug for the oncology treatment, although several negative side-effects (nephrotoxicity, neurotoxicity, nausea, etc.) had been induced on treated patients. Nevertheless, cisplatin was followed by carboplatin {cis-diammine-1,1´ - yclobutanedicarboxylateplatinum(II), [Pt(NH3)2(cbdc)], approved in 1985} and oxaliplatin 1R,2Rdiamminocyclohexaneoxalatoplatinum(II), [Pt(dach)(ox)], approved in 1996}, which met requirements of improving antitumor activity and reducing disadvantages of cisplatin, carboplatin and oxaliplatin represent the second, and third platinum-based drug generations, respectively. Nowadays, not only platinum-bearing complexes are extensively studied with the aim to broaden a spectrum of transition metal-based complexes which could be used in the treatment of cancer. Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and photodynamic therapy. Ruthenium complexes generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their specific accumulation in cancer tissues. In vitro and in vivo studies show high anticancer activity of Ruthenium complexes and some of them are currently undergoing clinical trials. In the present work we studied the antitumor activity of the Ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis- [Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against different tumor and normal cells lineages, analising cell viabilities, cell cycle distribution, apoptosis induction mecanistics and genome DNA damage. Correlation tests were performed to determine the effects of the time of exposure and concentration of Ruthenium complex on mitotic index (MI) and mitotic aberration index on Allium cepa root cells. A comparison of MI results of cis- [Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) to those of lead nitrate reveals that the Ruthenium complex demonstrates an average mitotic inhibition eightfold higher than lead, with the frequency of cellular abnormalities almost fourfold lower and mitotic aberration threefold lower. A. cepa root cells exposed to a range of Ruthenium complex concentrations did not display significant clastogenic effects. The cis- Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate therefore exhibits a remarkable capacity to inhibit mitosis, perhaps by inhibiting DNA synthesis or blocking the cell cycle in the G2 phase. Results showed that Ruthenium(III) causes a significant reduction of proliferation of A549 cells with viabilities ranging from 55.5% to 24.6% when treated with 40 μM for 24 and 48h; and 32% to 18.2% when treated with 150 μM for 24 and 48h. The Ruthenium(III) compound induced a moderate (31.9% and 39.6% for concentrations 10 and 40 μM, respectively) to high degree (74% for concentration 32 μM) of cytotoxic activity against A549 cells (IC50= 33.72 μM). On the other hand, the normal lung fibroblast MRC-5 did not show significant reduction proliferation in the presence of Ruthenium(III) compound. Even when treated with higher concentrations of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for 48 hours, MRC-5 cells showed viabilities ranging from 85% to 78,4% for 40 μM and 150 μM, respectively. The antiproliferative and cytotoxic activity revealed that K562 cells cultured with concentrations 40 and 150 μg mL-1 of Ruthenium(III) compound showed significant reduction of proliferation after 72h of exposition, with viabilities ranging from 88.2% to 55.6% when treated with 40 μM for 24 and 72h; and 76.2% to 26.7% when treated with 150 μM for 24 and 72h. The Ruthenium(III) compound induced low [22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to 35.7% (48h) for concentrations 10 and 40 μM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53% (48h) for concentration 150 μM] of cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h, the IC50 value was 18.28 μM. Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow cytometric analysis indicated a sub-G1 arresting effect of Ruthenium compound on K562 cells, inducing a 1.7-fold, 2.2-fold and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells for 24, 48 and 72 h, respectively, when compared to control. The compound also caused a significant increase in tailed cells in any of the concentrations tested compared with negative control that can be associated cytotoxicity with direct effect on K562 cells DNA. / Apesar do sucesso da cisplatina e dos medicamentos à base de platina, o mercado de fármacos ainda é acessível para novas drogas á base de metal que oferecem uma melhor viabilidade, tais como a administração oral, o que pode ajudar a diminuir os efeitos colaterais graves e custos clínicos. Além disso, novos estudos concentram-se na investigação de novas drogas com maior eficácia, ou seja, drogas que interajam de forma diferente com o DNA, o que pode levar à superação da resistência inata ou adquirida de certos tipos de tumores. Dentre os vários complexos a base de metais desenvolvidos, os complexos de rutênio (III) representam uma nova família de promissores agentes anticâncer. No presente estudo foi investigado in vitro o efeito do composto Ditionato de cis- Tetraamino(oxalato)rutênio(III) sobre a viabilidade celular, distribuição das fases do ciclo celular, mecanismos de indução de apoptose e danos a molécula de DNA. Os resultados provenientes da análise do teste Allium cepa mostraram um efeito tempo dose-dependente. A avaliação mostrou que a concentração de rutênio teve um impacto maior do que o tempo de exposição. O efeito também se mostrou cumulativo, com uma quase completa inibição da mitose em uma concentração de rutênio de 0,1 mg mL-1 ou superior por períodos superiores a 24 h. Por outro lado, os resultados não revelaram efeitos clastogênicos significativos nas células meristemáticas expostas ao complexo de rutênio (III). A comparação entre os valores dos Índice Mitótico de células meristemáticas de cebolas tratadas com o complexo de rutênio em relação às células tratadas com nitrato de chumbo também mostrou que o complexo de rutênio induziu uma inibição mitótica média oito vezes maior do que o chumbo. Notadamente, as freqüências de anomalias e aberrações celulares mitóticas foram quase quatro vezes e três vezes menores, respectivamente. Os resultados mostram que o composto estudado causa significativa redução da proliferação das células A549 com viabilidades entre 55,5% para 24,6% quando tratados com 40 μM por 24 e 48h; e 32% para 18,2% quando tratados com 150 μM por 24 e 48h. O composto de rutênio(III) induz moderada (31,9% e 39,6% para concentrações 10 e 40 μM, respectivamente) para alta degradação (74% para a concentração 150 μM) para avaliação da atividade citotóxica das células A549 (IC50= 33,72 μM). Quanto à linhagem de fibroblasto de pulmão humano normal MRC-5, não mostrou redução significativa na proliferação celular na presença do composto. Quando tratadas com altas concentrações do Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) por 48 horas, celulas MRC-5 mostraram viabilidades altas de 85% e 78,4% para 40 μM e 150 μM, respectivamente. A atividade citotóxica e antiproliferativa revelou que a cultura de células K562 nas concentrações de 40 e 150 μg mL-1 do composto de Rutênio(III) mostrou redução significativa na proliferação 72h de exposição, com viabilidades de 88,2% para 55,6% quando tratadas com 40 μM por 24 e 72h; e 76,2% para 26,7% quando tratadas com 150 μM por 24 e 72h. O composto de Rutênio(III) induziu baixa [22,4% (24h) para 28,2% (48h) e 29,8% (24h) para 35,7% (48h) para concentrações de 10 e 40 μM, respectivamente] para moderada [44% (24h) e 53% (48h) para concentrações de 150 μM] atividade citotóxica em células K562. Após a incubação de 48 h, o valor da IC50 foi de 18,28 μM. Quando comparado o ciclo celular de células não tratadas, a análise indica que as células foram arrastadas para sub-G1 apresentando um aumento de 1,7 para 2,2 e 2.4% no número de células em sub-G1 por 24, 48 e 72 h, respectivamente, quando comparado com o grupo controle. O composto também causou um significativo aumento em danos celulares nas concentrações testadas quando comparado com o controle negativo, o que pode estar associado com efeitos citotóxicos diretamente no DNA celular.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aliny pereira.pdf: 3649782 bytes, checksum: 3c890c86afafa7051e9fcb35ec9cd8b8 (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Current inorganic drugs such cisplatin and related compounds widely used in the treatment cancer, however its application is limited by its severe toxicity and drug resistence. These limitations have prompted a search for news metal-based antitumor agents. Ruthenium (III) complexes represent a new family of promising metal-based anticancer drugs. In the present study, was investigated in vitro the effects of the compound on cell viability, cintetics cell cycle phases, mechanisms of apoptosis and DNA damage on tumors cells. Results of the viability using MTT reduction test and the trypan blue exclusion assay on K-562 cells revealed that this compound significantly reduced the viability of the K-562 tumors cells (IC50 approximately 10.74 and 73.45 μM), respectively, moreover viability assays on A549 lung tumor cells showed that cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) induced effect moderate this cell lines (IC50 > 383 μM). Additionally was observed that this compound exhibits little cytotoxicity towards MRC-5 normal human fibroblast cells (IC50 > 383 μM) when compared to K562 tumor cell line (IC50 10.74 μM). Clonogenic Assay was performed on A549 cells, and observed that lower concentrations (0.38 and 3.8 μM) cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) diminished colony forming ability and highest concentrations (95 and 383 μM) no colony was observed. In cell cycle analysis on K-562 and S180 tumor cells cistetrammineruthenium( III) induced change in the distribution the cell cycle phase since that % of cells entering G1, S and G2 was decreased, correlating with increase in the proportion of cells in the sub-G1-peak (indicating apoptosis). In the analysis of damage to the DNA molecule of S180 cells using the comet assay, it was observed that the ruthenium compound induced damage to the DNA molecule to both treatments (24 and 48 h) as evidenced by an increase in damage index. In addition, cis-[RuCl2(NH3)4]Cl treatment induced apoptosis in cells K-562 as evidenced for increased DNA content in the sub-G1 peak (75.35%) and a significant increase in caspase-3, 8 and 9 activity. In tumor cells S180 the apoptosis was demonstrated for by a increase numbers of Annexin V-positive cells and fragmentation DNA. Taken together, these findings strongly demonstrate that cis-[RuCl2(NH3)4]Cl exerts antitumor activity and this activity correlates with DNA damage, process apoptotic and change cell cycle. / Atualmente drogas inorgânicas como cisplatina e compostos relacionados são amplamente utilizados no tratamento do câncer, no entanto a aplicação destas drogas é limitada devido a severa toxicidade e resistência. Estas limitações têm promovido o desenvolvimento de novos agentes antitumorais baseados em metais que sejam mais eficazes. Dentre os vários complexos a base de metais desenvolvidos, complexos de rutênio (III) representam uma nova família de promissores agentes anticâncer. No presente estudo foi investigado in vitro o efeito do composto cis-tetraaminodiclororutênio(III) sobre a viabilidade celular, cinética das fases do ciclo celular, mecanismos de indução de apoptose e danos a molécula de DNA. Os resultados de viabilidade celular utilizando os ensaios de redução do MTT e azul de tripano sobre células leucêmicas K-562 demonstrou que o composto reduziu significativamente a viabilidade celular (IC50 aproximadamente 10.74 e 73.45 μM), respectivamente, por outro lado, a viabilidade celular de células tumorais de pulmão A549 foi pouco afetada após tratamento com cis-tetraaminodiclororutênio(III) (IC50 > 383 μM). Adicionalmente, foi observado que cis-tetraaminodiclororutênio(III) exibiu uma moderada citotoxicidade sobre células normais de fibroblasto humano MRC-5 (IC50 > 383 μM) quando comparado a linhagem tumoral K-562 (10.74 e 73.45 μM) O ensaio clonogênico foi realizado em células tumorais A549, e por meio dos resultados obtidos verificou-se que em baixas concentrações do composto (0,38 e 3,8 μM) houve a diminuição na capacidade das células de formarem colônias e em concentrações elevadas 95 e 383 μM não houve a formação de nenhuma colônia. Na análise do ciclo celular de células tumorais K-562 e S-180, cistetraaminodiclororutênio( III) alterou a distribuição das fases do ciclo celular de ambas as células, visto que a porcentagem de células nas fases G1, S e G2 diminuiu, o qual correlacionou com uma aumento do número de células em sub- G1 (indicativo de apoptose). Na análise de danos a molécula de DNA de células S180 utilizando o ensaio cometa, pôde-se observar que o composto induziu danos à molécula de DNA para ambos os tratamentos (24 e 48 h) como evidenciado por um aumento do índice de dano. Além disto, o tratamento com cistetraaminodiclororutênio( III) levou a indução de apoptose nas células S180 como evidenciado pelo aumento no número de células Anexina positiva. Em células K562 a indução de apoptose após tratamento com o composto foi demonstrado pelo aumento no conteúdo de DNA em picos sub-G1 (75,35%) e um aumento na atividade de caspase 3, 8 e 9. Estes dados em conjunto demonstraram que o composto cis-tetraaminodiclororutênio(III) apresentou efeito citotóxico frente as linhagens testadas e esta atividade está correlacionada com danos à molécula de DNA, alterações nas fases do ciclo celular e indução de apoptose.

As fosfolipases A2 (PLA2s) catalisam a hidrólise de ácidos graxos na posição sn-2 das membranas fosfolipídicas e liberam, como subprodutos, ácidos graxos livres. As PLA2s do grupo IIA são encontradas em peçonhas de serpentes da família Viperidae e desempenham diversas atividades apresentando potencial miotóxico, neurotóxico, hemolítico, edematogênico, citotóxico, hipotensivo, anticoagulante, inibição/ativação da agregação plaquetária, bactericida e pró-inflamatório. Esse trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização funcional de uma PLA2 isolada da peçonha de Bothrops jararaca. Para a purificação dessa proteína, denominada BJ-PLA2-I, foram necessários três passos cromatográficos consecutivos: cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200, cromatografia de troca iônica em Source TM 15Q/50mL e cromatografia de troca iônica em MonoQ TM 5/50 GL. A BJ-PLA2-I apresentou elevado grau de pureza por SDS-PAGE e por cromatografia de fase reversa C18, em HPLC. Apresentou ainda, características ácidas, com pI em torno de 4,4 e teve a sua massa molecular determinada por dois métodos, obtendo-se valores bem próximos de 14,8 kDa (SDS-PAGE) e 14,2 kDa (MALDI-TOF). Esse fato é comum considerando que a espectrometria de massas é um método mais preciso e determina de maneira mais exata a massa molecular. O sequenciamento N-terminal da BJ-PLA2-I resultou em 60 resíduos de aminoácidos. O alinhamento múltiplo com outras fosfolipases A2 de serpentes do mesmo gênero mostrou similaridade entre elas, mostrando identidade de 100% com a BJ-PLA2, fosfolipase A2 Asp-49, também isolada da Bothrops jararaca. Esse dado levanta a hipótese de que a BJ-PLA2-I purificada neste trabalho e a BJ-PLA2 se tratam da mesma proteína, entretanto essa hipótese só poderá ser confirmada quando a sequência completa da BJ-PLA2-I for obtida. Outros dados encontrados neste trabalho reforçam essa hipótese, isso porque, avaliando a atividade fosfolipásica, o efeito sobre as plaquetas e o pI, tanto a BJ-PLA2-I quanto a BJ-PLA2 apresentaram características semelhantes. A BJ-PLA2-I, sendo uma Asp-49, mostrou alta atividade catalítica e efeito inibidor da agregação plaquetária induzida por ADP (20,5 ?g/mL inibiu 50 % da agregação plaquetária). Ela também foi capaz de induzir a migração leucocitária após a administração de diferentes concentrações (5, 10 e 20 ?g/mL) da BJ-PLA2-I. Esse dado também foi encontrado no ensaio em que a concentração de 10 ?g/mL foi fixada e variou-se o tempo de 2, 4 e 24 horas, observando-se principalmente a migração de neutrófilos. Além disso, verificou-se a liberação das citocinas IL-6 e IL-1?, de proteínas totais e de prostaglandina E2 na reação inflamatória induzida pela BJ-PLA2-I. No entanto, não foi observado a produção de TNF-?, IL-10 e leucotrieno B4. A BJ-PLA2-I caracterizou-se como uma PLA2 pró-inflamatória, produzindo inflamação local aguda. A BJ-PLA2-I foi avaliada quanto ao seu potencial antitumoral em três linhagens celulares distintas (PBMC, HL-60 e HepG2). Observou-se que a enzima em questão possui baixo potencial antitumoral para a linhagem HL-60, reduzindo o número de células tumorais em apenas cerca de 20% nas concentrações testadas. Verificou-se pequena alteração na viabilidade celular das células de PMBC, nas maiores concentrações testadas (160 e 80 ?g/mL) e, na linhagem HepG2 não foi encontrada nenhuma alteração. Concluindo, as informações adquiridas neste trabalho são de suma importância para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas atividades biológicas desempenhadas pelas PLA2s. Além disso, a BJ-PLA2-I pode servir como modelo molecular para a formulação de fármacos mais eficazes a serem utilizados no tratamento de várias doenças. / Phospholipases A2 (PLA2s) catalyze the hydrolysis of fatty acids in the sn-2 position of membrane phospholipids, releasing free fatty acids as by-products. PLA2s of group IIA are found in snake venoms of the Viperidae family and perform various activities, including myotoxic, neurotoxic, hemolytic, edematogenic, cytotoxic, hypotensive, anticoagulant, inhibition/activation of platelet aggregation, bactericidal and proinflammatory effects. This work aimed at the isolation and functional characterization of a PLA2 isolated from Bothrops jararaca venom. For the purification of this protein, called BJ-PLA2-I, three consecutive chromatographic steps were used (size exclusion chromatography on Sephacryl S-200, ion exchange chromatography on Source 15Q/50 mL, ion exchange chromatography on MonoQ 5/50 GL). Confirmation of the purity of BJ-PLA2-I was evaluated by SDS-PAGE and reverse phase HPLC using a C18 column. BJ-PLA2-I has acidic characteristics, with pI around 4.4, and its molecular mass was determined by two methods, obtaining values close to 14.8 kDa (SDS-PAGE) and 14.2 kDa (MALDI-TOF). The N-terminal sequencing of BJ-PLA2-I resulted in 60 amino acid residues. Multiple alignment with other phospholipases A2 of snakes of the same genus showed high similarity between them, showing 100% identity with BJ-PLA2, an Asp-49 phospholipase A2 previously isolated from Bothrops jararaca venom. This finding raises the possibility that the PLA2 purified in this work is the same protein previously described (BJ-PLA2), however, this assumption can only be confirmed when the complete sequence of BJ-PLA2-I is obtained. Other data obtained in this study support this hypothesis, considering that the phospholipase activity, the effect on platelets and pI of both BJ-PLA2-I and BJ-PLA2 showed to be similar. BJ-PLA2-I, being an Asp-49 PLA2, showed high catalytic activity and inhibitory effect on the platelet aggregation induced by ADP (20.5 ?g/mL inhibited 50% of the platelet aggregation). It was also able to induce leukocyte migration after the administration of different concentrations (5, 10 and 20 ?g/mL) of BJ-PLA2-I. This fact was also found when the concentration of 10 ?g/mL was fixed and response times were varied (2, 4 and 24 hours), observing especially neutrophil migration. Furthermore, there was a release of IL-6 and IL-1?, total proteins and prostaglandin E2 in the inflammatory reaction induced by BJ-PLA2-I, however, the production of TNF-?, IL-10 and leukotriene B4 was not observed. BJ-PLA2-I was characterized as a proinflammatory PLA2 producing acute local inflammation. BJ-PLA2-I was evaluated for its antitumor potential on three different cell lines (PBMC, HL-60 and HepG2). It was observed that this enzyme showed a low antitumor potential on HL-60 tumor cell line, reducing the number of tumor cells in only about 20% at the concentrations tested. There was little change in cell viability of PBMC cells in the higher concentrations tested (80 and 160 ?g/mL), but no change was found on HepG2 tumor cell line. In conclusion, the information obtained in this work are of utmost importance for better understanding the mechanisms involved in the biological activities induced by PLA2s. Furthermore, BJ-PLA2-I may serve as a molecular model for the formulation of more effective drugs to be used in the treatment of various diseases.

O uso da LDE como veículo para quimioterápicos tem mostrado ser uma boa estratégia para aumentar a eficácia terapêutica dos mesmos. Nesse estudo, a LDE foi empregada como veículo para um derivado lipofílico do metotrexato (MTX), o di-dodecil metotrexato, que foi obtido com rendimento elevado através de reação de esterificação do MTX. O aumento na lipofilicidade do derivado possibilitou incorporação na LDE com rendimento e estabilidade elevados. O IC50 de LDE-di-dodecil MTX foi cerca de 100 vezes menor em relação ao MTX comercial, sua captação celular mais elevada nas linhagens leucêmicas estudadas e sua toxicidade animal reduzida, mostrando que a LDE é um veículo promissor para este fármaco. / The use of LDE as vehicle to drugs is a great strategy to improve the therapeutic index and reduce the side effects. In this study LDE was used as vehicle to di-dodecyl methotrexate, a lipophilic derivative of MTX, obtained through an esterification reaction with a high yield. The increased lipophilicity of the derivative allowed a high association to LDE and good stability. The IC50 of LDE-di-dodecyl MTX was lower than that of the MTX and the uptake was higher in leukemic cells. The MTX toxicity in mice was reduced after association to LDE, showing that LDE is a promising vehicle to this drug.

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La voie de signalisation mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) joue un rôle central dans la croissance cellulaire, le métabolisme, et l'homéostasie des lymphocytes T (LT). Lors de la transplantation d'organes, l'administration de rapamycine, un inhibiteur de mTOR (mTORi), bloque l'activation des LT et promeut la polarisation des lymphocytes T CD4 régulateur (Treg). En cancérologie, des mTORi sont utilisés pour leur action inhibitrice sur la prolifération et l'angiogenèse tumorales. Cependant l'immunosuppression via l'induction de Treg nécessaire à la prévention du rejet de greffe pourrait être délétère pour la réponse anti-tumorale. Notre hypothèse est que l'efficacité clinique des mTORi serait également dépendante de la modulation de l'immunité adaptative T induite par ces traitements chez les patients atteints de cancer.Au cours de cette thèse, nous avons abordé cette question immunologique dans une cohorte prospective de patients atteints de cancer rénal métastatique (mRCC) traités par évérolimus. L'analyse du taux de Treg et de la réponse spontanée T CD4 Thl anti-tumorale (anti-télomérase TERT) par Elispot-IFN-y a été effectuée au moment de l'inclusion des patients et tous les deux mois après le début du traitement. Nous avons observé chez la majorité des patients une augmentation du taux de Treg après traitement par évérolimus. Ces Treg expriment Hélios, suggérant un phénotype Treg naturel. La fréquence et la qualité de la réponse Thl anti-TERT sont également augmentées suite au traitement. Nous avons montré que conjointement ces deux paramètres immunologiques corrèlent avec l'efficacité clinique du traitement. Les patients présentant précocement une diminution des Treg associée à une augmentation des Thl anti-TERT ont une meilleure survie par rapport aux patients dont les paramètres immunitaires ne variaient pas, ou variaient dans une même direction (13,2 mois vs 8 et 4 mois). De plus, au moment de la progression la plupart des patients perdaient leur réponse Thl anti-TERT, et cet effet était associé à une augmentation des Treg. Les Treg traités par mTORi in vitro inhibent plus fortement la prolifération de LT allogéniques, par un mécanisme contact dépendant. Par l'utilisation d'anticorps monoclonaux déplétant les LT chez la souris et par l'utilisation de souris DEREG, nous avons montré que la présence de Treg in vivo altère l'efficacité anti-tumorale des mTORi, par un mécanisme impliquant l'inhibition des réponses T CD8 anti-tumorales. En conséquence, l'efficacité des mTORi a pu être augmentée par sa combinaison avec des agents bloquant les Treg. En addition, l'administration de temsirolimus améliore l'efficacité anti-tumorale d'un vaccin thérapeutique, en favorisant la différenciation des LT CD8 anti-tumoraux centraux mémoires (CD62L+CD127+) et précurseurs mémoires (CD127+KLRGl'°) induits par la vaccination.En conclusion, ces études ont montré pour la première fois le rôle de l'immunité T anti-tumorale sur l'efficacité clinique des mTORi et soulignent ainsi l'intérêt potentiel de combiner les mTORi avec des immunothérapies anti-tumorales / The mammalian Target of Rapamycin (mTOR) pathway plays a central role in the regulation of cell growth andmetabolism, and is involved in oncogenesis. Everolimus and temsirolimus are two mTOR inhibitors (mTORi) approvedfor renal and breast carcinoma treatments. However, accumulating evidence highlights a central role for mTOR pathwayin T cell immunity. We showed that 21 out of 23 metastatic renal cell carcinoma patients under everolimus treatmenthad an increase of Tregs atter everolimus treatment. Paradoxically, strong antitumor Th 1 responses were detected andthen greatly decreased at the time of disease progression when high expansion of Tregs occurred. Furthermore, weidentified three immune groups based on the early modulation of both Treg and anti-tumor Thl cells and found thatpatients with {low Tregs plus high anti-tumor Thl cells} showed the best survival. In vitro, mTORi-exposed Tregs highlysuppressed T cell proliferation and Thl-associated cytokines production. We showed in vivo that T cells depletiondifferentially modulated the antitumor efficacy of mTORi. Although anti-mTOR effect was loss in B16-OVA-bearingmice lacking CD8 T cells, CD4 T depletion increased mTORi efficacy. The studies conducted in mice demonstratedthat the presence of Tregs in vivo altered the responses to mTORi via a mechanism involving the inhibition of antitumorCD8 T cell responses. Finally the efficacy of mTORi was improved by combination with Tregs depleting agents andvaccines. Altogether, our results describe for the first time a dual impact of host adaptive antitumor T cell immunity onthe clinical effectiveness of mTQRi and prompt their association with immunotherapies.