Made available in DSpace on 2015-11-18T13:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 stephanie_treiber_ioc_mest_2013.pdf: 6914334 bytes, checksum: 0cf19665f70fde96b94e2b12de8d587f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os poliovírus são responsáveis por causar a poliomielite, mais conhecida como paralisia infantil ou pólio, que já foi de alta incidência no Brasil e em muitos outros países, deixando centenas de indivíduos com sequelas paralíticas. Atualmente, esta doença é rara no mundo devido ao sucesso da utilização sistemática da vacina oral atenuada. Em 1988, a OMS lançou um programa para erradicar a pólio mundialmente e o desenvolvimento de antivirais contra poliovírus é considerado uma condição necessária para o sucesso deste programa. Neste trabalho, analisou-se a possível atividade antiviral de sete pseudopeptídeos derivados do ácido tartárico na replicação dos poliovírus em culturas celulares. Essas moléculas foram sintetizadas racionalmente de acordo com os alvos específicos virais (as proteases virais). A viabilidade celular foi avaliada através da incorporação do vermelho neutro pelas células vivas e posterior quantificação por espectrofotômero. A avaliação da atividade antiviral foi realizada através da observação do efeito citopático nas células infectadas por poliovírus que foram incubadas com diferentes concentrações dos compostos. Os compostos testados neste estudo apresentaram faixas de concentração não-tóxicas às células, mas não afetaram a replicação dos poliovírus, não apresentando, portanto, nenhuma atividade antiviral. De qualquer maneira, estudos sobre o potencial antiviral de moléculas candidatas é de extrema importância e devem ser estimulados, uma vez que atualmente, não existe nenhum composto antiviral contra poliovírus aprovado para uso em humanos / P oliovirus (PV) are the causative agent for causing poliomyelitis , better known as infantile paralysis or polio, a disease that has already been of high incidence in Brazil and many other countries, leaving hundreds of p eople with paralytic disabilit ies . Currently, this disease is rare in the world due to the success of systematic use of the attenuated oral vaccine. In 1988, the World Health Assembly launched a program to eradicate polio worldwide and the development of anti - poliovirus drugs is a necessary condition for the success of this program. In this study, we analyzed the possible antiviral activity of seven pseudopeptides derived from tartaric acid on the repli cation of poliovirus in cell cultures. These molecules have been synthesized according to a specific target , the viral protease s. Cell viability was assessed using neutral red incorporation by living cells and subsequent quantification by spectrophotometer . Evaluation of the antiviral activity was performed by observing the cytopathic effect in in PV - infected cells that were incubated with different concentrations of the compounds. The compounds tested in this study showed concentration ranges non - toxic to cells but did not affect the replication of poliovirus, not showing , thus, an antiviral activity. Either way, studies on p ot ential i nhibitors of PV are extremely important and should be encouraged, since currently there is no poliovirus antiviral compound approved for use in humans.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-19T15:50:58Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1496637 bytes, checksum: 5fe9118e3af447fde79634e413e36251 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T15:50:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1496637 bytes, checksum: 5fe9118e3af447fde79634e413e36251 (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / NIK1 (NSP Interacting kinase I) é um receptor cinase da família das LRRII-RLKs (leucine rich repeat II – receptor like kinase), identificado como alvo de virulência da proteína NSP (Nuclear Shuttle Protein), sendo o principal mediador de uma via de resposta imune contra esse grupo de vírus de DNA. Aufosforilação, de NIK1 em um resíduo de treonina 474 aciona a via de resposta antiviral que culmina com a repressão da expressão de proteínas ribossomais levando à redução da síntese de proteínas da célula vegetal e virais. Apesar de sua atividade antiviral, o transcriptoma de plantas nocautes de nik1 indicam um possível envolvimento de NIK1 como regulador negativo na resposta imune contra bactérias. Com a finalidade de esclarecer o envolvimento de NIK1 na imunidade inata antibacteriana, foram conduzidos ensaios de fosforilação in vitro de NIK1, utilizando os receptores, que intermedeiam PTI (Pamp-triggered immunity), BAK1 ( Brassinosteroid insensitive 1- associated kinase) e FLS2 (Flagellin sensitive – 2). Os resultados de espectrometria de massas demonstraram que BAK1 é um possível regulador da fosforilação de NIK1, uma vez que foi capaz de fosforilar um peptídeo sintético em uma treonina correspondente à posição 474 de NIK1 e de modificar a taxa de autofosforilação desse receptor em um ensaio contendo o domínio cinase intacto de NIK1. Além disso, foi demonstrado por BiFC (complementação de fluorescência bimolecular) que NIK1 e NIK1-T474D interagem tanto com BAK1 quanto com FLS2 na membrana plasmática. Ensaios de co-imunoprecipitação (Co-IP) demonstraram que flagelina promove a dissociação de NIK1 dos receptores para formar o complexo imune ativo BAK1-FLS2. Finalmente, ensaios de Co-IP com linhagens transgênicas de Arabidopsis superexpressando NIK1 e nocautes de nik1 indicaram que NIK1 interfere com a formação do complexo BAK1/FLS2 na resposta antibacteriana, já que a superexpressão de NIK1 diminui a eficiência de formação do complexo imune na presença de flagelina, enquanto que a inativação de NIK1 resulta em efeito oposto. Coletivamente, estes resultados substanciam o argumento de que NIK1 atua regulando negativamente PTI em plantas. / NIK1 (NSP Interacting kinase I), which was first identified as a virulence target of NSP (Nuclear Shuttle Protein), is a receptor-like kinase belonging to the LRRII-RLKs (leucine rich repeat II – receptor like kinase) family and the major mediator of an immune response against this group of DNA virus. NIK1 autophosphorylation at Thr 474 triggers an antiviral response which culminates with the repression of ribosomal protein gene expression leading to suppression of host and viral protein synthesis. Despite its antiviral activity, the transcriptome of nik1 knockouts implicates NIK1 as a possible negative regulator of the immune response against bacteria. To examine the NIK1 involvement in antibacterial innate immunity, in vitro phosphorylation assays were carried out on NIK1, using the PTI (Pamp-triggered immunity)-mediated receptors, BAK1 ( Brassinosteroid insensitive 1- associated kinase) and FLS2 (Flagellin sensitive – 2). The results from mass spectrometry demonstrated that BAK1 may be a regulator of NIK1 phosphorylation, as it was capable of phosphorylating a Thr residue of a synthetic peptide corresponding to the position 474 of NIK1 and modifying the autophosphorylation rate of the NIK1 Kinase domain. Furthermore, BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assays demonstrated that NIK1 and NIK1-T474D interact with BAK1 and FLS2 in the plasma membrane. Co-immunoprecipitation (Co-IP) assays showed that flagellin promoted the NIK1 dissociation from BAK1 and FLS2 to form an active BAK1-FLS2 immune complex. Finally, Co-IPs using NIK1- overexpressing transgenic lines and nik1 knockouts indicated that NIK1 interferes with BAK1-FLS2 complex formation in the antibacterial response, as NIK1 overexpression decreased the efficiency of the immune complex formation in the presence of flagellin, whereas NIK1 inactivation resulted in opposing effects. Collectively, these results substantiate the argument that NIK1 regulates negatively plant PTI.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-02-09T03:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336849.pdf: 8368799 bytes, checksum: 38db1bdc9122b89129a0fdc55484990c (MD5) Previous issue date: 2015 / A esponja marinha Petromica citrina é considerada uma espécie nativa do Brasil encontrada na região sul e sudeste. Entre os compostos isolados neste gênero estão os sulfatos de halistanol (esteroides sulfatados) que se destacam por suas atividades antiviral e antimicrobiana. O presente estudo teve por objetivo avaliar o potencial in vitro (atividade antiviral e antimicrobiana) e in vivo (modelos de indução da sepse) da fração n-butanólica (BF), da fração rica em halistanóis (TSH) e dos compostos isolados [sulfato de halistanol (HS) e sulfato de halistanol C (HS-C)]. O fracionamento bioguiado da fração BF foi realizado utilizando gel de permeação molecular (Sephadex LH-20) que, em um primeiro momento, proporcionou a obtenção da amostra bioativa TSH. Esta subfração foi submetida a novo processo cromatográfico com sílica de fase reversa, permitindo o isolamento do sulfato de halistanol (HS) e sulfato de halistanol C (HS-C), compostos estes identificados por ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massas (ESI). Os resultados gerados com os ensaios de avaliação da atividade antiherpética (HSV-1) da amostra TSH, apresentaram índice de seletividade (IS) igual a 15,33, valor este superior quando comparado às amostras HS (IS=2,46) e HS-C (IS=1,45). O potencial antimicrobiano das amostras TSH, HS e HS-C foram estabelecidos por meio das técnicas de difusão em disco, bioautografia e microdiluição, sendo constatada atividade frente a três cepas ATCC S. aureus, E. faecalis e C. albicans, além de três cepas de isolados clínicos bacterianos multirresistentes (S. aureus, MRSA e VRE), sobretudo para amostra TSH foram evidenciados valores de concentrações inibitórias mínimas promissoras frente as cepas MRSA (CIM=31,25 µg/mL) e VRE (CIM=62,5 µg/mL). Com base nos resultados de atividade antimicrobiana da amostra TSH, a mesma foi submetida a ensaios em modelos experimentais de indução de sepse (in vivo). A administração via intraperitoneal dessa amostra na dose de 12 mg/kg no modelo de pneumosepse foi capaz de retardar a morte dos animais. Contudo, no modelo de ligação e perfuração cecal (CLP) a amostra TSH não exerceu efeito na taxa de sobrevivência dos animais quando administrada na dose 33 mg/Kg.<br> / Abstract : The marine sponge Petromica citrina is considered a native species found in south and southeast of Brazil. Among the compounds isolated at this genus are the halistanol sulfates (sulfated steroids), that showed antiviral and antimicrobial activities. The aim of this study was to evaluate the potential in vitro (antiviral and antimicrobial activity) and in vivo (sepsis model) of the n-butanol fraction (BF), halistanol enriched-fraction (TSH) and compounds isolated [halistanol sulfate (HS) and halistanol sulfate C (HS-C)]. Herein it was performed a chemical bioguided fractionation of BF fraction using gel permeation (Sephadex LH-20), as a first step to obtain bioactive TSH sample. This TSH fraction was then submitted to a new purification process by reversed phase chromatography yielding the halistanol sulfate (HS) and halistanol sulfate C (HS-C), that were identified by nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry (ESI). The results of anti-herpetic activity (HSV-1) were significantly more attractive to TSH sample, that showed selectivity index SI =15.33, while HS (SI=2.46) and HS-C (SI=1.45) showed weak activities. The antimicrobial potential of TSH, HS and HS-C were established by the disk diffusion, bioautography and microdilution techniques. The results showed antimicrobial activity against three ATCC strains (S. aureus, E. faecalis and C. albicans), as well as against three clinical multiresistant strains (S. aureus, MRSA and VRE). The TSH sample, presented the most promising results with minimum inhibitory concentrations values against MRSA strains (MIC=31.25 µg/ mL) and VRE (MIC=62.5 µg/mL). Finally, the TSH was assayed in two experimental models of sepsis (in vivo). The intraperitoneal administration of this sample at 12 mg/kg in Pneumosepse model was able to delay the death of animals. On the other hand, in the cecal ligation and puncture model (CLP), TSH sample at 33 mg/kg did not shown effect on the animal survival.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:22:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 214187.pdf: 538408 bytes, checksum: bb6dfd55649ed893ed0487c38357ff01 (MD5)

Introdução/Objetivo: Existem evidências indicando que a resposta virológica sustentada (RVS) ao tratamento com interferon pode estar associada com menor incidência de carcinoma hepatocelular (CHC) em pacientes com cirrose causada pelo vírus da hepatite C (VHC). O objetivo do presente estudo foi comparar a incidência de CHC em cirróticos com RVS versus sem RVS. Métodos: Foram selecionados 85 pacientes com cirrose compensada (Child A) secundária ao VHC, confirmada por biópsia, sem quaisquer outras causas de doença hepática. Todos foram submetidos a tratamento com interferon ± ribavirina por pelo menos 24 semanas. Antes do tratamento nenhum paciente apresentava evidência de CHC à ultrassonografia abdominal (US). RVS foi definida como RNA do VHC negativo (PCR qualitativo com limite de detecção de 50 UI/ml) 24 semanas após o final do tratamento. Foram incluídos apenas pacientes com seguimento semestral com US e alfa-fetoproteína e anual com PCR por mais de 12 meses após o final do tratamento. O CHC foi diagnosticado por biópsia ou achados coincidentes de lesão focal com diâmetro superior a 2cm na US e tomografia computadorizada helicoidal trifásica com sinais de hipervascularização arterial. Resultados: Dos 85 pacientes, 38 (45%) alcançaram RVS e 47 (55%) não. A média do seguimento em pacientes com RVS versus sem RVS foi de 32,1 ± 20 meses (variação: 12-84 meses) e 28,2 ± 18 meses (variação: 12-96 meses), respectivamente (P=0,51). O CHC foi diagnosticado em 1 (3%) dos 38 pacientes com RVS e 8 (17%) dos 47 pacientes sem RVS (P=0,02; Razão de chance: 0,13; Intervalo de confiança de 95%: 0,006-0,9). As características pré-tratamento foram semelhantes entre os pacientes com e sem RVS, tanto demográficas (idade e sexo) quanto clínicas (Child A, média da dose total de interferon e tempo de seguimento). Além da ocorrência de CHC, a única outra variável com diferença significativa encontrada entre os grupos com e sem RVS foi o percentual de pacientes com genótipo 1 (13% versus 35%, respectivamente; P = 0,04). Comparando-se os pacientes com e sem CHC, a única variável com diferença estatisticamente significativa encontrada foi o percentual de RVS (11% versus 49%, respectivamente; P = 0,03). Conclusões: Pacientes com cirrose pelo VHC que atingem RVS têm menor incidência de CHC quando comparados àqueles sem RVS. A única diferença entre os grupos com e sem CHC foi a ocorrência de RVS. Este achado indica que a ausência do VHC pode tanto representar fator protetor direto contra o CHC, quanto servir como marcador indireto para identificar cirróticos com menor probabilidade de desenvolver CHC. / Background/Aim: There is strong evidence that sustained virologic response (SVR) to interferon treatment has an impact on the incidence of hepatocellular carcinoma (HCC) in patients with hepatitis C virus (HVC) related cirrhosis. The aim of this study was to compare the rate of HCC among HCV cirrhotics with vs without SVR. Methods: Eighty five biopsy proven cirrhotic patients with HCV infection (PCR positive), without any other form of liver disease were included. All were treated with interferon (IFN) ± ribavirin (RBV) for at least 24 weeks. Before treatment, all patients were compensated (Child A) and had no evidence of HCC on abdominal ultrasound (US). None had previous hepatic decompensation. SVR was defined as negative HCV-RNA (qualitative PCR with a limit of detection of 50 IU/ml) 24 weeks after end of treatment. Patients followed every 6 months with US and alpha-fetoprotein (AFP) for > 12 months after end of therapy were included. HCC was diagnosed by liver biopsy and/or coincident findings of focal lesion > 2 cm on US and spiral CT with arterial hypervascularization. Results: Thirty eight (45%) were SVRs and 47 (55%) were not. Mean follow-up was 32,1 ± 20 months (range:12-84 months) in SVRs vs 28,2 ± 18 months (range:12-96 months) in no-SVRs (P=0.51). HCC was diagnosed in 1 (3%) of 38 SVRs vs 8 (17%) of 47 patients without SVR (P=0.02; OR:0.13, 95% CI:0.006-0.9). All had similar pre-treatment characteristics (age, sex, liver function, Child A, total interferon dose and follow-up time). Besides HCC incidence, the only significant difference between SVRs and no-SVRs was the rate of genotype 1 (13% vs 35%, respectively, P = 0.04). Comparing patients with and without HCC, the only significant difference was found in the rate of SVR (11% vs 49%, respectively; P = 0,03). Conclusion: HCV cirrhotics with SVR have a lower incidence of HCC compared to those without SVR. The only difference between the groups with and without HCC was the rate of SVR. This finding may indicate that either absence of HCV-RNA truly protects against HCC, or acts as surrogate marker to identify cirrhotics that have a low probability of HCC development on long-term follow-up.

Orientador : Prof. Dr. Roberto Pontarolo / Coorientadora : Profª. Drª. Astrid Wiens Souza / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 04/08/2017 / Inclui referências : f. 120-140 / Resumo: A hepatite C crônica é um relevante problema de saúde pública, sendo alvo de inúmeras investigações em ensaios clínicos, especialmente em relação aos novos tratamentos medicamentosos. Contudo, a população brasileira tem sido pouco representada nos estudos. A primeira geração dos antivirais de ação direta (DAAs) para o tratamento da hepatite C crônica genótipo 1 (boceprevir e telaprevir) foi incorporada pelo sistema público de saúde do Brasil em 2012. Dada a recente inclusão dessas terapias, o Ministério da Saúde recomendou a realização de estudo observacional para avaliar resultados de segurança e efetividade do telaprevir e boceprevir no Brasil. Portanto, com este trabalho, o objetivo foi avaliar a efetividade, a segurança e a relação custo-efetividade destas terapias sob a perspectiva do sistema público de saúde brasileiro. Para tanto, foi realizado um estudo prospectivo longitudinal em cinco centros de referência em atendimento a pacientes com hepatite C do Estado do Paraná, entre 2014 e 2016. Os dados relativos à efetividade e à segurança foram coletados dos prontuários de pacientes tratados com boceprevir ou telaprevir. Os desfechos de eficácia incluíram a resposta virológica rápida (RVR) e a resposta virológica sustentada (RVS), e os resultados de segurança incluíram os eventos adversos relatados nos prontuários. Cento e vinte e um pacientes foram incluídos no estudo observacional (19 no grupo boceprevir e 102 no grupo telaprevir), dos quais 67 completaram o tratamento (oito no grupo boceprevir e 59 no grupo telaprevir). Dos 121 pacientes incluídos na análise por intenção de tratar 26,3% atingiram a RVR no grupo boceprevir e 84,3% no grupo telaprevir (p<0,001). A RVS foi atingida por 47,4% e 61,8% nos grupos boceprevir e telaprevir, respectivamente (p=0,424). Náusea foi o evento adverso mais prevalente no grupo boceprevir e prurido no grupo telaprevir. Em relação à tolerabilidade, 57,9% dos pacientes descontinuaram o tratamento com boceprevir e 42,2% com telaprevir. Para avaliar a relação custo-efetividade dos regimes com boceprevir, telaprevir e terapia dupla padrão (interferon peguilado associado à ribavirina) no tratamento da hepatite C crônica foi desenvolvido um modelo de Markov simulando a progressão da doença em pacientes infectados com o genótipo 1 do vírus. Os desfechos de longo prazo contemplaram anos de vida ganhos (AVG), anos de vida ajustados pela qualidade (QALYs) e razão custo-efetividade incremental (ICER). Para todos os desfechos analisados a terapia tripla com boceprevir foi dominada pela terapia tripla com telaprevir, que foi a mais efetiva entre os tratamentos analisados, a um custo de R$ 63.642,00. As ICERs corresponderam a R$ 120.693/RVS, R$ 47.718/AVG e R$ 33.464/QALY para a terapia tripla com telaprevir versus a terapia dupla. Dados do estudo de prevalência, realizado na cidade de Curitiba com pacientes atendidos entre 2013 e 2016 (n=452), revelaram a maior prevalência da infecção pelos genótipos 1 e 3 do vírus. Além disso, foi observada maior prevalência do estágio de fibrose F4 entre os pacientes avaliados. Comparando indiretamente os DAAs de primeira e segunda geração por meio de revisão sistemática com meta-análise em rede, verificou-se a superioridade do daclatasvir sobre as demais terapias analisadas. Palavras-chave: Agentes antivirais. Hepatite C. Hepatite C - Tratamento farmacológico. / Abstract: Chronic hepatitis C is a relevant public health issue, and has been under investigation through several clinical trials, especially regarding new therapies. However, the Brazilian population has been poorly represented in the studies. The first-generation direct-acting antiviral agents (DAAs) for chronic hepatitis C genotype 1 treatment (boceprevir and telaprevir) was approved by the public health system in Brazil in 2012. Due to the recent inclusion of these therapies, the Brazilian Ministry of Health recommended the conduction of an observational study to evaluate the safety and effectiveness of telaprevir and boceprevir in Brazil. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effectiveness, safety and cost-effectiveness of the new therapies from the perspective of the Brazilian public health system. Hence, a prospective longitudinal study was conducted in five reference centers in the State of Paraná between 2014 and 2016. Data regarding effectiveness and safety were collected from patients' medical records receiving boceprevir or telaprevir. Effectiveness outcomes included rapid virological response (RVR) and sustained virological response (SVR), and safety results included the adverse events reported on the medical records. One hundred and twenty one patients were included in the observational study (19 in the boceprevir group and 102 the in telaprevir group), of which 67 completed the treatment (eight in the boceprevir group and 59 in the telaprevir group). Of the 121 patients included in the intention-to-treat analysis, 26.3% achieved RVR in the boceprevir group and 84.3% in the telaprevir group (p <0.001). SVR was achieved by 47.4% and by 61.8% in the boceprevir and telaprevir groups, respectively (p = 0.424). Nausea was the most frequent adverse event with boceprevir and pruritus with telaprevir. Regarding tolerability, 57.9% of the patients discontinued the treatment with boceprevir and 42.2% with telaprevir. To evaluate the cost-effectiveness of regimens with boceprevir, with telaprevir and standard dual therapy (peguilated interferon with ribavirin) for chronic hepatitis C treatment, a Markov model was developed simulating the natural course of the disease in patients infected with the genotype 1 of the virus. Long-term outcomes included remaining life expectancy in life years (LYs), quality-adjusted life years (QALYs) and incremental cost-effectiveness ratio (ICER). For all evaluated outcomes the regimen with boceprevir was dominated by the regimen with telaprevir, which was the most effective among the evaluated treatments, with a cost of R$ 63.642,00. ICERs were R$ 120.693/SVR, R$ 47.718/LY and R$ 33.464/QALY for triple therapy with telaprevir versus standard dual therapy. Data from the cross-sectional study, which was conducted in Curitiba with patients attended between 2013 and 2016 (n=452), revealed a higher frequency of infection by the genotypes 1 and 3. Moreover, a higher prevalence of the F4 fibrosis stage was observed in the evaluated patients. Indirect comparison of first and second-generation DAAs through network meta-analysis exhibited the superiority of daclatasvir over the other evaluated therapies. Keywords: Antiviral agents. Hepatitis C. Hepatitis C - Pharmacological treatment.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-10-16T15:09:11Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 989533 bytes, checksum: 691738d9623dc109309055a3300f56c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T15:09:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 989533 bytes, checksum: 691738d9623dc109309055a3300f56c3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O vírus da Dengue é um arbovírus da família Flaviviridae que acomete grande parte da população mundial, possuindo quatro sorotipos (1-4), os quais ocasionam respostas imunes duradouras, mas diferentes. São vírus de RNA fita simples com polaridade positiva de aproximadamente 11Kb, codificando 10 proteínas, sendo 3 delas estruturais e 7 não estruturais. Estudos revelam que peptídeos de secreção de anfíbios possuem várias funções, dentre elas estão atividades antiviral e antimicrobiana, com isso, sequências destes peptídeos vêm sendo sintetizadas e testadas in vitro, a fim de obter compostos ativos para a fabricação de drogas de amplo espectro e de múltipla aplicabilidade. Os peptídeos de atividade antimicrobiana (PAM) são os mais estudados e eles devem apresentar uma toxicidade seletiva e rápida ação frente aos microorganismos. Por não existir nenhuma droga antiviral eficaz conta o vírus em questão, temos por objetivo avaliar a atividade antiviral de um peptídeo sintético, denominado HS-1, onde sua sequência foi obtida previamente da secreção do anfíbio anuro Hypsiboas semilineatus. Após realizar um teste de citotoxicidade, foram realizados ensaios de neutralização a fim de se investigar seu mecanismo de ação contra o vírus da dengue. Com o intuito de verificar uma possível proteção dos receptores celulares, o peptídeo foi incubado previamente com as células, em um ensaio posterior o peptídeo foi incubado previamente com o vírus, para verificar se o PAM agia sobre a partícula viral e em seguida foram realizados ensaios para verificar se o peptídeo tinha ação sobre a adsorção, internalização e replicação viral. Os resultados foram promissores, pois mostraram que o peptídeo em questão age sobre a partícula viral dos 4 sorotipos da dengue de uma forma muito eficaz, sendo que nas maiores concentrações a inibição chega a 100%, além de ter efeito sobre a inibição da adsorção, o que foi observado para os sorotipos 2 e 3. / Dengue virus is an arbovirus of Flaviviridae family, which has been the most within the world population. There are four serologic types of dengue virus (DENV 1-4), which cause long lasting, though different, immune responses. They are single positive-strand RNA viruses with of approximately 11Kb in length. This RNA is responsible for encoding 10 proteins, 3 structural and 7 non-structural. Several studies reveal that some peptides from skin of amphibians have antimicrobial and antiviral activities. Therefore, sequences of these peptides were synthesized and tested in vitro in order to obtain biologically active compounds to develop drugs with wide spectrum and multiple applicability. The antimicrobial peptides are the most studied and they must present a selective toxicity and quick action against microorganism. Effective drugs against dengue virus haven’t been developed yet. Thereat, the present study aimed to evaluate the antiviral activity against dengue virus of the synthetic peptide HS-1, which sequence was previously obtained from the skin of the anuran Hypsiboas semilineatus. In the cytotoxicity assay, and afterwards neutralization assays were performed to investigate the mechanism of action of the HS-1 peptide against Dengue virus. The first neutralization assay was carried out to determine whether the HS-1 peptide could confer protection to cell receptors against viral infection. For this, the peptide was pre-incubated with VERO cells. In the second neutralization assay the peptide was pre-incubated with Dengue virus to evaluate the ability of this peptide to act directly on viral particle. The subsequent assays were performed in order to determine whether the peptide would act over adsorption, internalization and virus replication. The results were promising; they showed that the peptide in question acts on the viral particle of the four dengue serotypes in a very effective manner. With higher concentrations of peptide, the inhibition reached 100%. In addition, it was found very promising results against inhibition adsorption to serotypes 2 and 3.

Orientador: Chung Man Chin / Coorientador: Priscila Longhin Bosquesi / Banca: Eduardo René Pérez González / Banca: Renato Farina Menegon / Resumo: A leishmaniose tegumentar possui ampla distribuição mundial, segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) e estima-se que haja o surgimento de 500 mil a um milhão de casos por ano. Segundo dados do Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde (DATASUS), no ano de 2005 registraram-se mais de 180 milhões de casos de leishmaniose tegumentar no Brasil. Apesar da existência de tratamentos disponíveis, a cura da leishmaniose é um processo complexo, em virtude das dificuldades na administração dos fármacos injetáveis, dos inúmeros efeitos adversos e da toxicidade hepática, renal e cardíaca. Dessa forma o desenvolvimento de novos fármacos mais eficazes e menos tóxicos torna-se urgente. O bioisosterismo é uma ferramenta de modificação molecular que visa à obtenção de novos análogos com a mesma atividade biológica. Assim, tem sido utilizado na pesquisa de novos fármacos, buscando a melhoria na eficácia e segurança no tratamento de diversas doenças. O nitrofural (NF), 5-nitro-2-furaldeído semicarbazona, é um fármaco utilizado como antimicrobiano de uso tópico em vários tipos de lesões de pele, que apresenta atividade descrita contra formas amastigotas de L. donovani, L. enriettii e L. major. Baseando-se nas diversas atividades do fármaco, o trabalho proposto objetivou a síntese de bioisósteros de nitrofural e avaliação dos compostos quanto à atividade leishmanicida in vitro. Foram sintetizados e caracterizados através de métodos analíticos oito compostos, sendo um inédito. Sete deles foram avaliados quanto à atividade biológica frente às formas amastigotas de L.amazonensis, através do ensaio de MTT (brometo de 3-metil[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazólio). O composto Lapdesf-MetSFS (8) apresentou atividade comparável à da pentamidina, fármaco padrão utilizado na terapêutica. / Abstract: Cutaneous leishmaniasis is a world widely distributed disease and it is estimated, by the World Health Organization (WHO), the incidence of 500,000 to one million cases per year. According to the Department of the Unified Health System (DATASUS), in 2005 it was registered more than 180 million cases of cutaneous leishmaniasis in Brazil. Although treatments for leishmaniasis are available, it is a complex process, because of difficulties in administration, once the majority of the drugs are injectable, the several numbers of adverse effects, and liver, renal and cardiac toxicity. Due to that, the development of more effective and less toxic drugs becomes urgent. The bioisosterism is a molecular modification strategy that aims to obtain new analogues with the same biological activity. It has been used in the research for new drugs, in order to improve the effectiveness and safety in the treatment of various diseases. The nitrofural (NF) 5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone, is a drug used as topical antimicrobial in various types of skin lesions is described which has activity against L. donovani, L. enriettii and L. major amastigote forms. Based on the various drug activities, the proposed work aimed the synthesis of bioisosters of nitrofural and evaluation of compounds for in vitro leishmanicidal activity. Were synthesized and characterized via analytical methods eight compounds, one unpublished. Seven of them were evaluated for biological activity against the amastigotesn forms of L. amazonensis by MTT assay (3-methyl bromide [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide). The Lapdesf-MetSFS (8) compound showed activity comparable to that of pentamidine, standard drug used in therapy. / Mestre

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-06-05T17:52:22Z No. of bitstreams: 1 LianaCostaPereiraDissertacao2014.pdf: 1788731 bytes, checksum: aaf1eef40e98ed7a21c08304f7dce33b (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-06-05T17:54:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LianaCostaPereiraDissertacao2014.pdf: 1788731 bytes, checksum: aaf1eef40e98ed7a21c08304f7dce33b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T17:54:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LianaCostaPereiraDissertacao2014.pdf: 1788731 bytes, checksum: aaf1eef40e98ed7a21c08304f7dce33b (MD5) Previous issue date: 2014-05-29 / Viral infections affect every living organism. Health care programs and vaccines have been developed to control and prevent those infections, but there is still the occurrence of severe diseases and with great social-economic importance, whose only alternative is the treatment with antivirals drugs. Those compounds possess different mechanisms of action and are specific for each virus. Nevertheless, with many viruses resistant strains rise, a growing interest in novel antivirals development or in the improvement of existing drugs have been observed. In the last few years, antimicrobial peptides have shown antiviral activities making them candidates for antiviral drugs. The present study aimed to evaluate the possible antiviral activities of synthetic peptides clavanin MO, LL-37, Cn-AMP1 and variants of the Pa-MAP1 against HSV-1 and the Aichivirus replication. The peptides cytotoxic effects against Vero cells were evaluated by MTT method, whereas the clavanin MO, the Pa-MAP 1.8 and Pa-MAP 18br showed more cytotoxicity, with concentrations higher than 15,4 ??M and 12 ??M, respectively. Considering the antivirals assays, it was observed that the peptide Pa-MAP 1 causes 90 % of HSV-1 replication, with a SI higher than 4.8 and a virucidal mechanism of action, but null against the Aichivirus. Futhermore LL- 37 presented 90 % of Aichivirus inhibition, with a SI of 3.4. Others peptides tested showed percentages below 41 %. Future studies are need in order to elucidate which HSV-1 structure does Pa-MAP1 interacts and futher extend to in vivo tests. In summary, this study it is the first one to describe antiviral tests for the treatment of the Aichivirus infection. / As infec????es virais acometem todos os organismos vivos. Para o controle e preven????o dessas infec????es, programas de sa??de p??blica e vacinas t??m sido desenvolvidos, mas ainda h?? a ocorr??ncia de doen??as graves e de grande impacto socioecon??mico cuja ??nica alternativa ?? o tratamento com antivirais. Estes possuem diferentes mecanismos de a????o e s??o espec??ficos para cada tipo viral. Entretanto, o surgimento de variantes resistentes de muitos tipos virais tem levado h?? um crescimento no interesse de desenvolver novos antivirais ou at?? mesmo melhorar os existentes. Nos ??ltimos anos, estudos sobre pept??deos antimicrobianos relatam a atividade antiviral desses compostos, tornando-os candidatos a medicamentos antivirais. O presente estudo teve como objetivo avaliar a poss??vel atividade antiviral dos pept??deos sint??ticos clavanina MO, LL-37, Cn-AMP1 e variantes da Pa-MAP contra o Herpes v??rus humano 1 e Aichiv??rus. O efeito citot??xico dos pept??deos em c??lulas Vero foi avaliado pelo m??todo do MTT, sendo que a clavanina MO, a Pa- MAP 1.8 e Pa-MAP 18br demonstraram maior citotoxicidade em concentra????es maiores que 15,4 ??M, e 12 ??M, respectivamente. Considerando os ensaios antivirais, observou-se que o pept??deo Pa-MAP1 apresentou 90 % de inibi????o da replica????o do HHV-1, com um IS maior que 4,8, sendo que seu mecanismo de a????o foi definido como virucida, por??m contra o Aichiv??rus o PI foi nulo. Al??m disso, LL-37 apresentou 90 % de inibi????o do Aichiv??rus com um IS de 3,4. Os outros pept??deos testados apresentaram percentuais abaixo de 41 % contra ambos os v??rus. Futuros estudos moleculares s??o necess??rios para se determinar com qual estrutura do HHV-1 a Pa-MAP1 interage e para estender os testes para modelos in vivo. Este estudo ?? o primeiro a relatar testes antivirais para o tratamento do Aichiv??rus.

Recombinant proteins expressed in cell culture have been shown to be relevant in the biopharmaceutical production focusing human heaths. Insulin, interferon and vaccine against B hepatitis are products obtained from recombinant expression system. Importantly, the precipitation is a widely used technique for separating proteins from a mixture due to its simplicity, and the process is incremented by the use of salts. This study initially dealt with the validation of the salt precipitation method by using the purified BSA and trypsin, and then, to investigate the precipitation process of recAVLOEc protein synthesized by cells of E. coli BL21 (DE3) pLysS used as expression system for the AVLO. This protein has shown antiviral activity and it found in the hemolymph of Lonoimia obliqua caterpillar. The precipitation was conducted by the use of conventional salts (ammonium sulfate and sodium sulfate) and the volatile salt ammonium carbamate. The proteins of the bacterial expression system were evaluated for their antiviral potential virus-infected cell cultures. Bacterial cells were resuspended in phosphate buffer and lysade by ultrasound. In the experimental procedure, the saturated salt solution (ammonium sulfate, sodium sulfate or ammonium carbamate) was added dropwise to the protein solution. This mixture was kept at constant temperature of 5°C for 24 h. The supernatant phase was separated from the precipitate phase by centrifugation. The protein precipitate obtained from bacterial lysate was then added to cultures of L929 and Vero cells to evaluate the cytotoxic effect; and cultures of these cells were subsequently infected with virus (EMC and measles). The results showed better efficiency of sodium sulfate on the precipitation of BSA compared to ammonium sulfate, while for trypsin, the ammonium carbamate showed more effective. Toxic effect on the culture of L929 cells was observed for the precipitate obtained by the use of ammonium sulfate and sodium sulfate. However, as expected, the precipitated protein obtained by the use of volatile ammonium carbamate salt showed a lower cytotoxic effect. Tests in L929 cultures infected with EMC, were performed; however, protein samples obtained by conventional and volatile salts used as a precipitating agent did not show antiviral action. In Vero cell cultures, the precipitated protein from cell lysate by sodium sulfate showed antiviral action for measles. / Proteínas recombinantes, expressas em culturas celulares, têm se mostrado importantes na produção de fármacos de interesse para a saúde humana. Insulina, interferons e a vacina contra a hepatite B são exemplos de produtos obtidos a partir de sistemas recombinantes de expressão. A precipitação é uma técnica amplamente empregada para separação de proteínas a partir de uma mistura devido à sua simplicidade, sendo tal fato potencializado pelo uso de sais. Este estudo, inicialmente, abordou a validação do método de precipitação salina das proteínas puras BSA e tripsina e em adição a investigação do processo de precipitação da proteína recAVLOEc, sintetizada por células de E. coli BL21 (DE3) pLysS utilizadas como sistema de expressão. Tal proteína é originalmente encontrada na hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua. A precipitação foi conduzida por meio do uso de sais convencionais (sulfato de amônio e de sódio) e do sal volátil carbamato de amônio. As células bacterianas foram ressuspendidas em tampão fosfato e submetidas à lise mecânica. No procedimento experimental estabelecido, o contato de um concentrado proteico com uma solução salina saturada (sulfato de amônio, sulfato de sódio ou carbamato de amônio) foi mantido por 24 horas a 5°C. O sobrenadante foi isolado do precipitado por meio de centrifugação e estas frações tiveram sua concentração proteica determinada através do método de Bradford. O precipitado proteico obtido do lisado bacteriano foi então administrado em culturas de células L929 e Vero para a avaliação do efeito citotóxico e posteriormente para a verificação da ação antiviral para o EMC e o sarampo. Os resultados demonstraram maior eficiência do sulfato de sódio na precipitação da BSA quando comparado ao sulfato de amônio. Enquanto que para a tripsina o carbamato de amônio foi mais efetivo. Um efeito tóxico em culturas de L929 foi observado para os precipitados obtidos pelo uso de sulfato de amônio e de sódio. Entretanto, como esperado, o precipitado proteico obtido pelo uso do sal volátil carbamato de amônio apresentou menor efeito citotóxico. Os testes em culturas de L929 infectadas com o vírus EMC foram efetuados e as amostras de proteínas precipitadas com os sais convencionais e o sal volátil não resultaram em ação antiviral. Em culturas de células Vero, o uso do sulfato de sódio como agente de precipitação das proteínas contidas no lisado bacteriano resultou em ação antiviral para o sarampo. / Mestre em Engenharia Química