INTRODUÇÃO:A neuraminidase 1 (chamada a seguir por Neu1) regula o catabolismo de sialoglicoconjugados nos lisossomos. A deficiência congênita da Neu1 é a base da sialidose, doença neurossomática grave associada a deformidades osteoesqueléticas, hipotonia e fraqueza muscular. Camundongos com deficiência de Neu1 desenvolvem uma forma atípica de degeneração muscular caracterizada porproliferação anormal de fibroblastoslevando a invasão nas fibras musculares, expansão da matriz extracelular (MEC), fragmentação do citoplasma, formação vacuolar e atrofia muscular. A ocorrência de atrofia muscular indica que a deficiência da Neu1 podeestar relacionada com o controle da massa muscular, a qual é dependente do equilíbrio entre síntese e degradação proteica.Uma característica principalnaMacroautofagia (denominada a seguir por autofagia) é a principal via de degradação intracelular sendo expressamente essencial para a homeostase celular e remoção de materiais citoplasmáticos. Objetivos: Avaliarseos efeitos da deficiência da Neuraminidase 1 afetama indução de autofagia e a formação de autofagossomos e determinar os efeitos do bloqueio da função lisossomal sobre o fenótipo muscular na deficiência da Neuraminidase1.Metodologia:Camundongos Neu1+/-foram cruzados e os filhotes genotipados, onde camundongos Neu1-/-(nocaute) e Neu1+/+(normal),foram utilizados no estudon total=90, sendo 10 em padronizações, 20 para coleta de fibroblastos e 60 para procedimentos in vivo, os grupos experimentais foram divididos em privação alimentar por 2 dias que, por meio da inibição do mTOR, induz a autofagia;grupo detratamento com Colchicina por 4 dias onde irá impedir a junção autofagossomo/lisossomonão havendo a degradaçãolisossomaleadicionado nos dois últimos dias de privação alimentar e o grupo de tratamento comRapamicina por 7 dias, droga com função de inibir seletivamente o mTOR.Após os tratamentos, os animais foram eutanasiadospara coleta dos músculos gastrocnêmios e tibiais anterior. Os músculos foram analisados apósas coloraçõeshistológicas porHematoxilina & Eosina e Fosfatase Ácida; Imunofluorescência de LC3-I/II; Western Blottingdas proteínas LC3-I/II, Lamp-1 e p62/SQSTM e a análise Ultra-estrutural. Além disso, foi realizada cultura de fibroblastos, os quais foram submetidos à privação de nutrientes e ao tratamento com Rapamicina, seguidos dasmesmas metodologias de análise invivo. Resultados:As análises histológicas através de H&E e Fosfatase Ácida não revelaram alterações consistentes na musculatura esquelética de animais submetidos aos tratamentos, mostrando em animais com deficiência de Neu1 um aumento anormal do espaço endomisial, e aumento da atividade lisossomalintracitoplasmáticos. Na análise ultra-estruturalobservou-se em todos os grupos, a presença de diversas estruturas com aspecto autofágico, de diferentes tamanhos, formas e constituintes. Naanálise da expressão do LC3 através de Western Blottingmostrou importante ativação do LC3-II na privação alimentar (com e sem administração de Colchicina) tanto em animais controles quanto em animais com deficiência de Neu1 e uma importante ativação do LC3-I em Rapamicina em ambos os grupos mostrando assim que houve um aumento da via da autofagia através do bloqueio do mTOR. Já na análise de Imunofluorescência não foi possível observar diferença consistenteentre os grupos.A análise in vitrode Western Blottingmostrou que tal ativação foi similar entre fibroblastos Neu1+/+e Neu1-/-. Conclusão:Os experimentos relacionados com a ativação ou inibição da autofagia, não resultaram em diferenças consideráveis entre músculos normais e músculos com deficiência de Neu1. Desta forma, podemos concluir com estes experimentos que aparentemente a Neu1, apesar de ser uma importante enzima lisossomal, não interfere com o processo de autofagia / Introduction:Neuraminidase 1 (hereinafter Neu1) regulates the catabolism of sialoglycoconjugates in lysosomes. The congenital deficiency of Neu1 is the basis of sialidosis, a severe neurosomatic disease associated with osteo-skeletal deformities, hypotonia, and muscle weakness. Mice with Neu1deficient develop an atypical form of muscle degeneration characterized by abnormal fibroblast proliferation leading to muscle fiber invasion, extracellular matrix expansion (ECM), cytoplasm fragmentation, vacuolar formation, and muscle atrophy. The occurrence of muscle atrophy indicates that deficiencyofNeu1 may be related to the control of muscle mass, which is dependent on the balance between synthesis and protein degradation. A major feature in Macroautophagy (hereinafter referred to as autophagy) is the main pathway of intracellular degradation being expressly essential for cellular homeostasis and removal of cytoplasmic materials. Objectives:To evaluate whether the effects of neuraminidase 1 deficiency affect autophagy induction and autophagosome formation and to determine the effects of lysosomal function block on muscle phenotype in neuraminidase 1 deficiency. Methodos:Mice Neu1+/-were crossbred and the genotyped pups, where mice Neu1-/-(knockout) and Neu1+/+(normal), were used in the study ntotal = 90, 10 for standardization, 20 for fibroblast collection and 60 for in vivo procedures, experimental groups were divided into food deprivation for 2 days that, through mTOR inhibition, induces autophagy; Colchicine treatment group for 4 days whereit will prevent autophagosome/lysosome junction without lysosomal degradation and added in the last two days of food deprivation and Rapamycin treatment group for 7 days, drug with function to selectively inhibit mTOR. After the treatments, the animals were euthanized to collect the anterior gastrocnemius and tibial muscles. The muscles were analyzed after histological staining by Hematoxylin & Eosin and Acid Phosphatase; LC3-I/II immunofluorescence; Western Blottingof LC3-I/II, Lamp-1 and p62/SQSTM proteins and Ultra-structural analysis. In addition, fibroblasts were cultured and subjected to nutrient deprivation and Rapamycin treatment, followed by the same in vivo analysis methodologies. Results:Histological analyzes by H&E and Acid Phosphatase did notreveal consistent changes in skeletal muscle of animals submitted to treatments, showing in animals with Neu1 deficiency an abnormal increase in endomysial space and increased intracytoplasmic lysosomal activity.In ultrastructural analysis, it was observed in all groups, the presence of several structures with autophagic aspect, of different sizes, shapes and constituents. The analysis of LC3 expression by Western Blottingshowed important activation of LC3-II in food deprivation (with and without Colchicine administration) in both control and Neu1 deficient animals and an important activation of LC3-I in Rapamycininboth groups,thus showing an increase in the autophagy pathway through mTOR blockade. In the immunofluorescence analysis, it was not possible to observe consistent difference between the groups. In vitro Western Blottinganalysis showed that such activation was similar between Neu1+/+and Neu1-/-fibroblasts. Conclusion: Experiments related to activation or inhibition of autophagy did not result in considerable differencesbetween normal muscles and Neu1 deficient muscles. Thus, we can conclude from these experiments that apparently Neu1, despite being an important lysosomal enzyme, does not interfere with the autophagy process

L’atròfia muscular espinal (AME) és una malaltia d’origen genètic que afecta, majoritàriament a la població infantil. La malaltia cursa amb una mort de les motoneurones  i atròfia muscular. El gen implicat és el survival motor neuron (SMN) que està delecionat en un 95% dels casos. El nostre estudi està dividit en dues parts: 1- l’aprofundiment de les alteracions musculars en dos models animals murins transgènics que pateixen les formes més greus d’AME (Tipus 1-2) i 2- estudi dels possibles efectes terapèutics del liti en un d’aquests models d’AME. S’ha trobat alteracions greus en les unions neuromusculars d’animals nounats i prenatals en marcadors relacionats amb l’ancoratge de les vesícules a la membrana presinàptica, organització dels canals de calci presinàptics i altres proteïnes presinàptiques, desorganització i apoptosi de les cèl•lules musculars, apoptosi massiva del timus i alteracions generalitzades en els òrgans limfoides. L’estudi ultraestructural del múscul ens indica que hi ha una mort, per apoptosi, de les cèl•lules satèl•lit, confirmat amb la tècnica de TUNEL. L’augment de les apoptosi, però no es reflexa en un increment, per altra banda esperat, de la densitat dels macròfags. El tractament amb concentracions terapèutiques del liti no millora l’evolució de la malaltia en els ratolins que manifesten l’AME, s’observa una acumulació progressiva dels nivells de liti, provocant toxicitat en l’animal. L’efecte del liti inhibint la GSK3 no es tradueix en el increment d’expressió de SMN, tal com s’ha deduït d’alguns experiments publicats. / La atrofia muscular espinal (AME) es una enfermedad de origen genético que afecta, mayoritariamente a la población infantil. La enfermedad cursa con muerte de las motoneuronas y atrofia muscular. El gen implicado es el “survival motor neuron” (SMN) que está delecionado en un 95% de los casos. Nuestro estudio está dividido en dos partes: 1 - la caracterización de las alteraciones musculares en dos modelos animales murinos transgénicos que sufren las formas más graves de AME (Tipo 1-2) y 2 - estudio de los posibles efectos terapéuticos del litio en uno de estos modelos. Se han encontrado alteraciones pre y postnatales graves en las sinapsis neuromusculares a nivel de marcadores relacionados con el anclaje de las vesículas en la membrana presináptica, en la organización de los canales de calcio presinápticos y en otras proteínas presinápticas, Asimismo se ha hallado desorganización y apoptosis de las células musculares, apoptosis masiva del timo y alteraciones generalizadas en los órganos linfoides. El estudio ultraestructural del músculo nos revela muerte, por apoptosis, de las células satélite, confirmado con la técnica de TUNEL. El aumento de las apoptosis muscular no conlleva un incremento, por otra parte esperado, de la densidad de los macrófagos. El tratamiento con litio no mejora la evolución de la enfermedad en los ratones con AME. Se observa un incremento progresivo de los niveles de litio, provocando toxicidad en el animal. Por otra parte, el efecto del litio inhibiendo la GSK3 no se traduce en un aumento de la expresión de SMN, tal como se ha deducido de algunos experimentos publicados. / The spinal muscular atrophy (SMA) is a pediatric genetic disease. The SMA is a motor neuron disease that affects the motor neurons causing its death and muscle atrophy. The gene involved is the survival motor neuron (SMN) that is mutated in the 95% of the cases. Our study is divided into two parts: 1 – studies of the neuromuscular junction in two transgenic SMA murine models that develop the most severe forms of SMA (type 1-2) and 2 - study of the possible therapeutic effects of lithium on one of these models of SMA. We found severe alterations in the neuromuscular junctions of newborn animals and also in prenatal markers related to the vesicle docking at the presynaptic membrane, lack of organization of presynaptic calcium channels and defects in the expression of other presynaptic proteins. We found also, disruption and apoptosis of muscular cells, massive apoptosis of the thymus and widespread alterations in lymphoid organs. The ultrastructural study of muscle identifies apoptotic satellite cells that was confirmed by the TUNEL technique. The increase in apoptosis is not followed by the expected increase, in the macrophage density. Treatment with therapeutic concentrations of lithium does not improve the course of the disease in SMA mice. There was a progressive accumulation of lithium, causing toxicity in the animal. The effect of lithium inhibiting GSK3 does not determine an increased expression of SMN, as could be deduced from some published experiments.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3973.pdf: 3412425 bytes, checksum: 4be152bd7ce18a298fe811d9024f0e59 (MD5) Previous issue date: 2011-11-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / The quadriceps muscle weakness and atrophy after the anterior cruciate ligament (ACL) rupture, is present before and after its reconstruction, and are important limitations that restrict the return of subjects to activities of daily living and sports. The combination of reduced synthesis and increased levels of protein degradation results in a rapid loss of muscle protein. The rapid muscle proteolysis occurs in several animal models and in different conditions in humans, and are mainly associated to the ubiquitn proteasome system (UPS). Neuromuscular mechanisms are associated with atrophy and weakness of the quadriceps muscle after ACL rupture and reconstruction, but the molecular pathways involved in this process are unknown. The identification of these pathways may facilitate the establishment of therapeutic strategies to alleviate the muscle deficit. Thus, the objective of this thesis was to evaluate the effect of ACL transection of rats in the expression of genes of UPS (MuRF-1, Atrogina-1), as well as the expression of myostatin (involved in control of muscle mass) by the Real Time PCR (polymerase chain reaction) technique. It was evaluated the content of ubiquitinated proteins by Western blotting and the cross-sectional area of muscle fibers (CSA) of the vastus medialis (VM), rectus femoris (RF) and vastus lateralis (VL) of the quadriceps. Elevated Atrogin-1, MuRF-1 and myostatin mRNA levels were observed after ACL transection in all muscles assessed, as the reduction of CSA in VM and VL muscles. The results of this thesis contributed to the understanding of the mechanisms of quadriceps muscle atrophy after ACL transection. / A atrofia e fraqueza do quadríceps após a ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA), presentes antes e após sua reconstrução, são importantes limitações que restringem o retorno dos indivíduos às atividades da vida diária e desportivas. A rápida proteólise muscular que ocorre nos diversos modelos animais e em diferentes condições em humanos se deve, principalmente, ao sistema ubiquitna proteassoma (UPS). Mecanismos neuromusculares são associados à atrofia e fraqueza do quadríceps após a ruptura e reconstrução do LCA, porém as vias moleculares envolvidas nesse processo são desconhecidas. A identificação dessas vias pode favorecer o estabelecimento de estratégias terapêuticas para amenizar o déficit muscular. Assim, o objetivo dessa tese foi avaliar o efeito da transecção do LCA de ratos na expressão dos genes pertencentes ao UPS (MuRF-1, a Atrogina-1), e também da Miostatina (envolvida no controle da massa muscular) pela técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real no quadriceps. Avaliou-se ainda o conteúdo de proteínas ubiquitinadas por Western Blotting e a área de secção transversa das fibras musculares (AST) dos músculos Vasto Medial (VM), Reto Femoral (RF) e Vasto Lateral (VL). Níveis elevados de Atrogina-1, MuRF-1 e Miostatina ocorreram após transecção do LCA em todos os músculos avaliados assim como a redução da AST nos músculos VM e VL. Os resultados desta tese contribuiram para a compreensão dos mecanismos de atrofia do quadríceps após a transecção do LCA.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:19:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4910.pdf: 3408018 bytes, checksum: 4034688ddb3183a38d1f9c8b45afa4e8 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / Universidade Federal de Sao Carlos / Muscle weakness is characterized as a significant cause of reduced physical capacity and functionality, this limitation is due to the decreased ability to produce voluntary contraction of the muscle groups in the affected hemisphere. It is a consequence of morphological and functional changes related to neural and muscular aspects. The aim of this study was to evaluate the neuromuscular performance, muscle volume and Growth Factor Insulin-like I (IGF-I) serum concentration (SC) and its Binding Protein, IGFBP-3, in subjects with chronic hemiparesis. For such, a cross-sectional study was designed. Fourteen subjects with chronic hemiparesis were evaluated for functionality performed by assessment tools Berg Balance Scale Test, Timed Up Go Adapted, Walk test 10 meters, Functional Reach Test, Fugl- Meyer Assessment, Barthel Index, Assessment of Quality of Life, Medical Outcomes Study- 36 Health Status Measurement. The subjects were allocated in the hemiparetic group (HG, 12 men). Healthy subjects (control group, CG) were paired for age, gender, height and body mass index with HG. Rectus femoris (RF), vastus medialis (VM), vastus intermedius (VI), vastus lateralis (VL), biceps femoris (BF) and semitendinosus / semimembranosus (SS) muscle volume was measured. The SC IGF-I and IGFBP-3 was quantified by ELISA. The peak torque (PT), work and power during concentric and eccentric contractions of knee extensors and flexors were evaluated using an isokinetic dynamometer at 60°/s, synchronously to record muscle activation RF, VM, VL, BF and semitendinosus (ST). For parametric data, the unpaired t test and ANOVA two-way followed by Tukey test were applied to identify statistical differences between groups and factors (dominance and condition; paretic limb: PL, non-paretic limb: NPL and control group CG). For nonparametric data was used the Mann Whitney U test followed by Bonferroni adjustment. The significance level of 5% was considered. The HG presented functional levels and CSs of IGF-I and IGFBP-3 reduced compared to the CG. The HG showed selective muscle atrophy of VM, VI, BF and SS, and also altered muscle activation between agonist and antagonist against the CG. There was a significant decrease in PT, work and power of the knee extensors and flexors for concentric and eccentric actions in the PL and NPL compared to the CG. In conclusion, hemiparetic group show weakness in the PL due to changes in neuromuscular performance, including decreased PT, power and work, and also due to changes in the agonist and antagonist muscle recruitment. These neural changes are accompanied by selective atrophy of quadriceps and hamstrings muscles and CSs decrease in IGF-I and IGFBP-3 serum concentrations. / A fraqueza muscular é caracterizada como uma importante causa da redução da capacidade física e funcionalidade, esta limitação ocorre devido à diminuição da capacidade de gerar contração voluntária dos grupamentos musculares no hemicorpo afetado. E consequência de alterações morfofuncionais relacionadas aos aspectos neurais e musculares. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho neuromuscular, o volume muscular e a concentração sérica (CS) do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e de sua proteína ligante, IGFBP-3, em indivíduos hemiparéticos crônicos. Para tal, um estudo transversal foi delineado. Quatorze sujeitos com hemiparesia crônica foram submetidos a avaliações de funcionalidade realizada pelas ferramentas Escala de Equilíbrio de Berg,Teste Timed Up Go (TUG) Adaptado, Teste de caminhada de 10 metros, Teste de Alcance Funcional, índice de Desempenho Motor de Fugl-Meyer, índice de atividade de vida diária de Barthel, Escala de Avaliação da Qualidade de Vida, Medical Outcomes Study-36 Health Status Measurement. Foram alocados no Grupo Hemiparético (GH; 12 homens). Sujeitos saudáveis (Grupo Controle, GC) foram pareados por idade, gênero, altura e índice de massa corpórea com o GH. Foram mensurados o volume dos músculos reto femoral (RF), vasto medial (VM), vasto intermédio (VI), vasto lateral (VL), bíceps femoral (BF) e semitendinoso/ semimembranoso (SS). A CS de IGF-I e IGFBP-3 foi quantificada pelo método de ELISA. O pico de torque (PT), trabalho e potência concêntricos e excêntricos, dos flexores e extensores do joelho, foram avaliados em dinamômetro isocinético a 60o/s, de forma sincrônica ao registro da ativação dos músculos RF, VM, VL, BF e semitendinoso (ST). Para dados paramétricos, o teste T não pareado e Anova two-way seguida de Tukey foram utilizados para identificar diferenças estatísticas entre grupos e fatores (dominância e condição; membro parético: MP, membro não parético: MNP e membro controle: MC). Para dados não paramétricos foram utilizados o teste U de Mann Whitney seguido do ajuste de Bonferroni. O nível de significância de 5% foi considerado. O GH apresentou níveis funcionais e as CSs de IGF-I e IGFBP-3 reduzidos em relação ao GC. O GH apresentou atrofia seletiva dos músculos VM, VI, BF e SS e também demonstrou a ativação muscular alterada entre agonistas e antagonistas em relação ao GC. Houve uma diminuição significativa do PT, trabalho e potência dos flexores e extensores do joelho em ações concêntricas e excêntricas no MP em relação ao MNP e ao MC. Em conclusão, indivíduos hemiparéticos apresentam fraqueza no MP decorrente de alterações no desempenho neuromuscular, incluindo diminuição do PT, potência e trabalho, e também devido a alterações no recrutamento de músculos agonistas e antagonistas do movimento. Estas modificações neurais são acompanhadas por atrofia seletiva de músculos do quadríceps e dos isquiotibiais e por menores CSs de IGF-I e IGFBP-3.

Submitted by Carlos Alberto Arcaro Filho (carlos_arcaro@hotmail.com) on 2018-07-13T23:08:25Z No. of bitstreams: 1 Tese Final - Carlos Alberto Arcaro Filho.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Irani Coito null (irani@fcfar.unesp.br) on 2018-07-16T13:17:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 arcarofilho_ca_dr_arafcf_int.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-16T13:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arcarofilho_ca_dr_arafcf_int.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Considerando os avanços no conhecimento acerca dos mecanismos que controlam o metabolismo de proteínas na musculatura esquelética que permitiram a busca por novas opções para o tratamento das atrofias musculares, o presente estudo teve como objetivo a compreensão do potencial antiproteolítico de inibidores de fosfodiesterase, PDE (pentoxifilina, inibidor não-seletivo de PDE; rolipram, inibidor seletivo de PDE4) em músculos esqueléticos de ratos submetidos à atrofia muscular devido à insuficiência insulínica (diabetes mellitus experimental), com ênfase na elucidação da participação de componentes da sinalização do AMP cíclico (AMPc) nesta resposta. Ratos normais e diabéticos (60 mg/kg de estreptozotocina, administração intravenosa) foram tratados com salina (NS e DS) ou com 2 mg/kg de rolipram (NROL e DROL), ou com 25 mg/kg de pentoxifilina (NPTX e DPTX) durante 3 dias, por via intraperitoneal. Após três dias de tratamento, músculos soleus e extensor digitorum longus (EDL) foram removidos, pesados, congelados e processados para diversas análises: (i) conteúdo de AMPc (ensaio imunoenzimático); (ii) atividades das proteases proteassoma, calpaínas e caspase-3 (uso de substratos específicos fluorigênicos); (iii) níveis proteicos e/ou níveis de fosforilação de componentes das vias proteolíticas, efetores intracelulares sinalizatórios e fatores de transcrição (Western blotting); (iv) determinação dos níveis séricos de insulina e citocinas pró-inflamatórias. Foram realizados experimentos ex-vivo, para verificar a ação direta dos fármacos no controle da proteólise muscular e ativação de efetores intracelulares, via incubações dos músculos na presença de rolipram ou de agonistas de EPAC (Exchange protein directly activated by cAMP) e de PKA (proteína quinase dependente de AMPc), proteínas efetoras ativadas pelo AMPc. Também foram realizados experimentos no Laboratório do Prof. Dr. Marco Sandri, no Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova, Itália, para a avaliação do papel de PDE4D no controle do processo autofágico-lisossomal em músculos esqueléticos de camundongos jejuados. Os tratamentos de animais diabéticos com rolipram (DROL) ou com pentoxifilina (DPTX) promoveram uma redução nas atividades do proteassoma e calpaínas em soleus e EDL, bem como nos níveis de componentes-chave do sistema proteolítico ubiquitina-proteassoma (MuRF-1, atrogin-1, conjugados poliubiquitinados), e aumento nos níveis de calpastatina (inibidor das calpaínas). Interesante ressaltar que o grupo DROL apresentou redução na atividade e níveis proteicos de caspase-3, em ambos os músculos, enquanto que o grupo DPTX apenas em músculos EDL. Contribuindo com a redução observada na atividade de caspase-3, houve uma redução nos níveis de Bax (proteína pró-apoptótica) e aumento nos níveis de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica) em ambos os músculos de animais DROL. Animais diabéticos tratados com salina (DS) apresentaram aumento nas atividades das três proteases, bem como nos níveis de componentes participantes destes processos proteolíticos. Animais normais e diabéticos tratados com salina (NS e DS) apresentaram níveis de AMPc basais e semelhantes entre si, tanto em soleus quanto em EDL, enquanto que os tratamentos de ratos normais e diabéticos com pentoxifilina (NPTX e DPTX) ou rolipram (NROL e DROL) promoveram aumentos de AMPc, em ambos os músculos. Um dos mecanismos que podem estar envolvidos na inibição da proteólise muscular após aumentos nas concentrações de AMPc envolve a proteína EPAC, responsável por integrar a sinalização do AMPc e a sinalização insulínica via ativação da quinase AKT. Animais diabéticos tratados com pentoxifilina ou com rolipram apresentaram aumento nos níveis proteicos de EPAC 1 e na fosforilação de AKT, quando comparados ao grupo DS. Observamos também um aumento na fosforilação inibitória de fatores de transcrição FoxO 1 e 3a em ambos os músculos de animais DROL. Podemos sugerir que parte das ações de rolipram que culminaram em ativação de AKT e inibição de FoxO na musculatura esquelética possam estar associadas aos aumentos observados nos níveis circulantes de insulina em animais DROL. Investigamos, apenas nos animais tratados com rolipram, a possibilidade de participação da proteína PKA no controle da proteólise muscular. Em animais DROL houve ativação da PKA, verificada tanto pelo aumento na fosforilação de substratos de PKA, bem como do fator de transcrição CREB, em soleus e EDL. Vale destacar que animais DS apresentaram níveis reduzidos de p-CREB e de substratos fosforilados por PKA em soleus e EDL. Animais diabéticos tratados com os inibidores de PDE apresentaram uma diminuição de citocinas pró-inflamatórias séricas (TNF-, PTX e ROL; IL-1, ROL) e aumento nos níveis de insulina sérica (ROL) em relação aos animais DS. Nos estudos ex vivo, as incubações de músculos soleus e EDL com rolipram levaram a uma redução da proteólise total, bem como aumento na fosforilação de substratos de PKA e de AKT. Músculos soleus e EDL incubados com agonistas de EPAC apresentaram aumento na fosforilação de AKT, enquanto que a incubação com agonista de PKA promoveu aumento na fosforilação dos substratos de PKA (em ambos os músculos) e aumento na fosforilação de AKT (apenas em EDL), quando comparados aos músculos incubados na ausência do fármaco. Nos estudos para compreensão do papel de PDE4D no controle do processo autofágico-lisossomal, observou-se que o silenciamento gênico da PDE4D em músculos tibialis anterior promoveu uma preservação da massa muscular e da área da fibra em animais jejuados, quando comparados ao músculo controle. Músculos flexor digitorium brevis, silenciados para PDE4D, apresentaram diminuição na expressão de proteínas-chave do processo autofágico-lisossomal, tais como LC3 e p62. Estes resultados evidenciam os mecanismos que podem estar envolvidos na ação direta de inibidores de PDE no controle do metabolismo proteico muscular esquelético, via ativação de duas vias dependentes de AMPc: (i) a via PKA/CREB, que pode participar do controle da transcrição de Bcl-2 e calpastatina, bem como na inativação direta de caspases, inibindo assim os processos proteolíticos dependentes de caspase-3 e calpaínas, (ii) a via EPAC/AKT, via fosforilação e inibição de FoxO 1 e 3A, regulando a expressão dos atrogenes (MuRF-1 e atrogin-1) e promovendo uma diminuição na atividade do sistema ubiquitina-proteassoma. Além disso, o tratamento com inibidores de PDE diminuem o processo inflamatório e aumentam os níveis circulantes de insulina, ações que podem contribuir para os efeitos antiproteolíticos. Evidências iniciais também sugerem que PDE4D participa no controle do sistema autofágico-lisossomal na musculatura esquelética. Todos estes resultados indicam que PDE participam no controle de processos proteolíticos, portanto inibidores de PDE emergem como uma opção interessante na ativação da sinalização do AMPc na musculatura esquelética, com vistas à utilização futura no tratamento de quadros de perda de massa muscular durante situações de atrofia. / Considering the advances in the knowledge of the mechanisms controlling the protein metabolism in skeletal muscles that allowed the discover of new options for the treatment of muscle atrophies, the present study aimed to understand the antiproteolytic potential of phosphodiesterase (PDE) inhibitors (pentoxifylline, a non-selective PDE inhibitor; rolipram, a selective PDE 4 inhibitor), in skeletal muscles of rats submitted to muscle atrophy due to insulin insufficiency (experimental diabetes mellitus), with emphasis on the elucidation of the participation of cyclic AMP (cAMP) signaling components. Normal and diabetic rats (60 mg/kg streptozotocin, intravenous administration) were treated intraperitoneally with saline (NS and DS) or with 2 mg/kg rolipram (NROL and DROL) or with 25 mg/kg pentoxifylline (NPTX and DPTX) for 3 days. After three days of treatments, soleus and extensor digitorum longus (EDL) muscles were removed, weighed, frozen and processed for several analyzes: (i) cAMP content; (ii) activities of proteasome, calpain and caspase-3 (use of specific fluorigenic substrates); (iii) protein levels and/or phosphorylation levels of components of proteolytic pathways, intracellular signaling effectors and transcription factors (Western blotting); (iv) determination of serum insulin and proinflammatory cytokines levels. Ex vivo experiments were performed to verify the direct action of the drugs in the control of muscle proteolysis and activation of intracellular effectors, via muscle incubations in the presence of rolipram or agonists of EPAC (Exchange protein directly activated by cAMP) and PKA (cAMP-dependent protein kinase), intracellular effectors activated by cAMP. Experiments were also carried out in the Laboratory of Prof. Dr. Marco Sandri at the Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova, Italy, for the evaluation of the role of PDE4D in controlling the autophagic-lysosomal process in skeletal muscles of starved mice. Treatments of diabetic animals with rolipram (DROL) or pentoxifylline (DPTX) promoted a reduction in the activities of proteasome and calpain in soleus and EDL, as well as reduced the levels of key components of the ubiquitin-proteasome system (MuRF-1, atrogin-1, polyubiquitinated conjugates), and increased the levels of calpastatin (calpain inhibitor). Interestingly, DROL rats showed a reduction in the activity and in the protein levels of caspase-3 in both muscles, whereas DPTX rat had reductions only in EDL muscles. Contributing to the reduction in caspase-3 activity, it was observed a reduction in the content of Bax (pro-apoptotic protein) and an increase of Bcl-2 (anti-apoptotic protein) in both muscles of DROL rats. Diabetic animals treated with saline (DS) showed an increase in the activities of the three proteases, as well as increases in the levels of components belonging to these proteolytic processes. Normal and diabetic animals treated with saline (NS and DS) had basal and similar levels of cAMP in both soleus and EDL, whereas the treatments of normal and diabetic rats with pentoxifylline (NPTX and DPTX) or with rolipram (NROL and DROL) promoted increases in cAMP in both muscles. One of the mechanisms that may be involved in the muscle proteolysis inhibition after increases in cAMP involves the EPAC protein, responsible for integrating the cAMP and the insulin signaling pathways via AKT activation. Diabetic animals treated with pentoxifylline or with rolipram showed an increase in the protein levels of EPAC 1 and in the phosphorylation of AKT, when compared with the DS group. We also observed an increase in the phosphorylation (inhibitory) of FoxO 1 and 3a in both muscles of DROL rats. It can be suggested that part of the rolipram actions causing AKT activation and FoxO inhibition in skeletal muscles may be associated with the increases in the circulating levels of insulin observed in DROL animals. It was investigated, only in animals treated with rolipram, the possible involvement of PKA in the control of muscle proteolysis. DROL rats had activation of PKA, verified both by the increase in the phosphorylation of PKA substrates, as well as in the phophorylation of the transcription factor CREB, in soleus and EDL. DS rats had decreased levels of p-CREB and of the PKA substrates, in soleus and EDL. Diabetic animals treated with PDE inhibitors showed a decrease in serum proinflammatory cytokines (TNF-, PTX and ROL; IL-1, ROL) when compared with DS. In ex vivo studies, incubations of soleus and EDL with rolipram caused a reduction of the total proteolysis as well as an increase in the phosphorylation of PKA substrates and and of AKT. Soleus and EDL muscles incubated with EPAC agonist showed increased in the AKT phosphorylation, whereas incubation with PKA agonist promoted an increase in the phosphorylation of PKA substrates (in both muscles) and and increase in the AKT phosphorylation (EDL), when compared with muscles incubated in the absence of the drugs. In studies to understand the role of PDE4D in the control of the autophagic-lysosomal process, it was observed that the PDE4D gene silencing in anterior tibialis muscles caused a preservation of the muscle mass and fiber area in fasted animals when compared with control muscle. Flexor digitorium brevis muscles, silenced for PDE4D, showed a decreased expression of key proteins of the autophagic-lysosomal process, such as LC3 and p62. These results suggested the mechanisms that may be involved in the direct action of PDE inhibitors in the control of skeletal muscle protein metabolism, through activation of two cAMP-dependent pathways: (i) the PKA/CREB pathway, which may participate in transcriptional control of Bcl-2 and calpastatin, as well as causing direct inactivation of caspases, thus inhibiting the proteolytic processes dependent on caspase-3 and calpains, (ii) the EPAC/AKT pathway, via phosphorylation and inhibition of FoxO 1 and 3a factors, regulating the expression of atrogenes (MuRF-1 and atrogin-1) and promoting a decrease in activity of ubiquitin-proteasome system. Treatments with PDE inhibitors also decreased the inflammatory process and increased the circulating linsulin levels, which may be contributing to the antiproteolytic responses. Initial evidence also suggests that PDE4D participates in the control of the autophagy-lysosomal system in skeletal muscles. All these results indicate that PDE participate in the control of proteolytic processes, therefore PDE inhibitors emerge as an interesting option to activate the cAMP signaling in the skeletal muscles, which may be used in the future in treatments muscle mass loss during atrophy situations. / FAPESP: Processo 2013/18861-2 / FAPESP: Processo 2014/12202-0 / FAPESP: Processo 2017/02348-5

OBJETIVO: Avaliar a capacidade dos parâmetros do eletrorretinograma de padrão reverso de campo total e hemianópico em diferenciar olhos com atrofia em banda do nervo óptico e, a correlação entre as amplitudes do eletrorretinograma de padrão reverso, a espessura da camada de fibras nervosas da retina e macular obtidas pela tomografia de coerência óptica e a perda de campo visual nestes pacientes. MÉTODOS: Quarenta e um olhos de 41 pacientes com perda de campo visual temporal permanente por compressão do quiasma óptico e 41 controles normais foram submetidos ao eletrorretinograma de padrão reverso de estimulação de campo total e hemianópicos (temporal e nasal), a tomografia de coerência óptica, para avaliação das medidas da espessura da camada de fibras nervosas da retina e macular e, ao exame de campo visual, pela perimetria automatizada padrão. O desvio do normal da sensibilidade dos 18º centrais do campo visual foram expressos em decibéis e unidades 1/Lambert. As comparações foram feitas pelo teste t de Student. A correlação entre os parâmetros do campo visual central, do eletrorretinograma de padrão reverso e da tomografia de coerência óptica foi avaliada pela correlação de Pearson e análise de regressão linear. RESULTADOS: Os valores das amplitudes P50, N95, and P50+N95 do eletrorretinograma de padrão reverso de campo total, e de estimulação hemianópica e os valores das medidas da espessura macular e da camada de fibras nervosas da retina obtidas pela tomografia de coerência óptica foram significativamente menores nos olhos com atrofia em banda do que nos controles (P<0,001). Uma correlação significativa foi encontrada entre a perda de sensibilidade no campo visual central e as amplitudes do eletrorretinograma de padrão reverso de estimulação de campo total e nasal, mas não para o temporal. Uma correlação significativa positiva foi observada entre os parâmetros de perda de sensibilidade no campo visual e a maioria dos parâmetros da espessura da camada de fibras nervosas da retina e macular obtidas pela tomografia de coerência óptica. Nenhuma correlação significativa foi observada entre os parâmetros do eletrorretinograma de padrão reverso e a tomografia de coerência óptica, exceto para amplitude P50+N95 do eletrorretinograma de padrão reverso de estimulação de hemicampo nasal. Uma correlação significativa foi observada entre os parâmetros de espessura macular e da camada de fibras nervosas pela tomografia de coerência óptica, exceto entre a espessura da camada de fibras nervosas no segmento de 30º, correspondente as 9 horas do relógio e os parâmetros maculares. CONCLUSÕES: Os valores das amplitudes do eletrorretinograma de padrão reverso foram eficazes em diferenciar olhos com atrofia em banda do nervo óptico de controles normais. Em pacientes com atrofia em banda do nervo óptico, as amplitudes do eletrorretinograma de padrão reverso e medidas da espessura da camada de fibras nervosas da retina e macular correlacionaram de forma significativa com a perda de campo visual, mas não houve correlação entre eles. O eletrorretinograma de padrão reverso e a tomografia de coerência óptica detectaram a perda neural e ambos são métodos diagnósticos úteis na compreensão da correlação estrutura-função em pacientes com compressão do quiasma óptico / PURPOSE: To evaluate the ability of full-field and hemifield pattern electroretinogram parameters to differentiate between healthy eyes and eyes with band atrophy of the optic nerve and also to evaluate the relationship between pattern electroretinogram amplitude, macular and retinal nerve fiber layer thickness by optical coherence tomography, and visual field loss on standard automated perimetry in eyes with BA of optic nerve. METHODS: Forty-one eyes from 41 patients with permanent temporal visual field defects from chiasmal compression and 41 healthy subjects underwent transient fullfield and hemifield (temporal or nasal) stimulation pattern electroretinogram, standard automated perimetry and time domain- optical coherence tomography macular and retinal nerve fiber layer thickness measurements. Comparisons were made using Students t-test. Deviation from normal visual field sensitivity for the central 18° was expressed in dB and 1/Lambert units. Correlations between measurements were verified by Pearsons correlations and linear regression analysis. RESULTS: Full-field P50, N95, and P50+N95 amplitude values were significantly smaller in eyes with band atrophy than in control eyes (P<0.001). Nasal and temporal hemifield pattern electroretinogram studies revealed significant differences in N95 and P50+N95 amplitudes measurements. Pattern electroretinogram and optical coherence tomography measurements were significantly lower in eyes with temporal hemianopia than in normal eyes. A significant correlation was found between visual field sensitivity loss and full-field or nasal, but not temporal, hemifield pattern electroretinogram amplitude. Likewise a significant correlation was found between visual field sensitivity loss and most optical coherence tomography parameters. No significant correlation was observed between optical coherence tomography and pattern electroretinogram parameters, except for nasal hemifield amplitude. A significant correlation was observed between several macular and retinal nerve fiber layer thickness parameters. CONCLUSIONS: Transient pattern electroretinogram amplitude measurements were efficient at differentiating eyes with band atrophy and permanent visual field defects from normal controls. In patients with chiasmal compression, pattern electroretinogram amplitude and optical coherence tomography thickness measurements were significant related to visual field loss, but not to each other. Pattern electroretinogram and optical coherence tomography quantify neuronal loss differently, but both technologies are useful in understanding structure-function relationship in patients with chiasmal compression

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5212.pdf: 1422285 bytes, checksum: 87b49935d019c76fe85fe17404e72415 (MD5) Previous issue date: 2013-03-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / Dexamethasone (Dexa) has been widely used as anti-inflammatory and anti-allergic treatment, however, its chronic use provokes peripheral insulin resistance, hypertension, weight loss and muscle atrophy. Low intensity aerobic training has been indicated for prevention and treatment of diabetes, hypertension and metabolic syndrome, however, its effects on muscle atrophy are still uncertain. Muscle atrophy may be determined by an imbalance between atrophic (FOXO3a, atrogin-1, Murf-1) and hypertrophic (AKT, mTOR) proteins, but almost nothing is known about the effects of Dexa on these proteins. Resistance training (RT) has been recommended for treatment of pathologies which involves muscle atrophy, however little is known about the effects of low intensity RT on the muscle atrophy induced by Dexa. This study investigated whether low intensity RT, performed before and concomitant with Dexa treatment could prevent and / or attenuate muscle atrophy induced by Dexa. Also, it examined the role of proteins that control muscle homeostasis in this response. Forty-eight rats were allocated into 4 groups: sedentary control (SC), sedentary and treated with Dexa (SD), trained control (TC) and trained and treated with Dexa (TD). After an adaptation period, the rats underwent to an resistance exercise protocol (ladder,60% maximal loading, 5 days / week, 70 days) or kept sedentary. During the last 10 days, the rats were treated with Dexa (0.5 mg / kg of bodyweight per day, i.p.). Fasting glycemia was measured before and after exercise training and treatment periods. Bodyweight (BW) was measured weekly before treatment and daily during drug treatment. The tibialis anterior (TA), flexor hallucis longus (FHL) and soleus muscles were removed and homogenized. Protein production of AKT, mTOR, FOXO3a, atrogin-1 and Murf-1 was analyzed in the muscles. Two-way ANOVA with Tukey post-hoc were used (p<0.05). Dexa treatment increased glycemia by 46%, reduced BW by 19% and food intake by 45% in sedentary animals. The RT, that was effective to increase physical capacity of the rats (+118%) prevented the increase in glycemia, but did not avoid the BW reduction. Dexa provoked TA muscle atrophy (-21%), which was determined by reduction of AKT (-29%) and increase of Murf-1 (+25%). RT attenuated the increased the Murf-1 protein production (-37%), however it did not avoid TA muscle atrophy. In the FHL, it was observed muscle atrophy (-28%) determined by reduction of AKT (-27%) and increase of Murf-1 (+55%). RT increased mTOR in TC (+36%) and TD (+72%) groups and also reduced atrogin-1 protein production in TD, which contributed to attenuate FHL muscle atrophy. Soleus muscle was not altered neither by training nor treatment. These data together suggest that low intensity RT was effective in attenuating FHL muscle atrophy due to a combination of increase in hypertrophic and decrease in atrophic protein production. / A Dexametasona (Dexa) vem sendo amplamente usada no tratamento de inflamações e alergias, porém seu uso crônico provoca resistência periférica à insulina, hipertensão arterial, perda de peso corporal e atrofia muscular. O exercício físico aeróbio contínuo, de baixa intensidade, tem sido empregado na prevenção e tratamento de diabetes, hipertensão arterial e síndrome metabólica, no entanto, seus efeitos sobre a atrofia muscular ainda são incertos. Atrofia muscular pode ser determinada por um desequilíbrio entre proteínas atróficas (FOXO3a, atrogina-1 Murf-1) e hipertróficas (AKT, mTOR), mas quase nada se sabe sobre os efeitos da Dexa sobre estas proteínas. O exercício resistido (TR) tem sido recomendado como tratamento de patologias que envolvem atrofia muscular, no entanto pouco se sabe sobre os efeitos do TR de baixa intensidade sobre a atrofia muscular induzida pela Dexa. Este estudo investigou se o TR de baixa intensidade, realizado antes e concomitante ao tratamento com Dexa, poderia prevenir e/ou atenuar a atrofia muscular. Além disso, verificou o papel das proteínas que controlam a homeostase muscular nesta resposta. Quarenta e oito ratos foram alocados em 4 grupos: sedentário controle (SC), sedentário e tratado com Dexa (SD), treinado controle (TC) e treinado e tratado com Dexa (TD). Após um período de adaptação, este ratos foram submetidos ao protocolo de treinamento resistido (escalada, 60% do carregamento máximo, 5 dias / semana, 70 dias) ou mantidos sedentários. Durante os últimos 10 dias, os animais foram tratados com Dexa (0,5 mg/kg de peso corporal por dia, i.p.). A glicemia de jejum foi medida antes e após os períodos de treinamento físico e tratamento com a Dexa. O peso corporal (PC) foi mensurado semanalmente antes do tratamento e diariamente durante o tratamento. Os músculos tibial anterior (TA), flexor longo do Halux (FHL) e sóleo foram retirados e homogeneizados. Verificou-se a produção das proteínas AKT, mTOR, FOXO3a, Atrogina-1 e Murf-1 nos músculos. Anova de 2 caminhos, com post-hoc de Tukey, foram utilizados (p<0,05). O tratamento com Dexa determinou aumento da glicemia de jejum em 46%, redução de 19% do PC e de 45% na ingestão alimentar nos sedentários. O TR, que foi efetivo em aumentar a capacidade física dos animais (+118%) preveniu o aumento da glicemia, mas não atenuou a redução de PC. A Dexa promoveu atrofia muscular no TA (-21%), que foi causada por redução da produção proteica de AKT (-29%) e aumento da Murf-1 (+25%). O TR atenuou o aumento da Murf-1 (- 37%), no entanto, não foi efetivo em atenuar a atrofia no TA. No FHL, ocorreu atrofia (-28%) determinada pela redução da AKT (-27%) e aumento da Murf-1 (+55%). O TR promoveu aumento da mTOR no TC (+36%) e no TD (+72%) bem como reduziu a produção proteica de atrogina-1 no TD, o que contribuiu para atenuar a atrofia muscular no FHL. O sóleo não foi alterado nem pela Dexa nem pelo TR. Estes dados sugerem que o TR, de baixa intensidade, foi eficaz em atenuar a atrofia muscular no FHL por uma combinação entre redução de proteínas atróficas acompanhada de aumento de proteínas hipertróficas

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3372.pdf: 2042678 bytes, checksum: 9beea5d2ce56b34888b3e4efc74386a4 (MD5) Previous issue date: 2010-09-24 / The gold standard for evaluating skin atrophy is the histological study. When compared to the technique of Fluorescence Spectroscopy (FS), histology requires the physical removal of tissue and their processing in the laboratory, while the FS conducts fast assessments in vivo. The objective of this study was to standardize a methodology for inducing skin atrophy in an experimental model, compare the collagen in normal and atrophic skin, and estimate the potential assessment of FS in skin atrophy. We used 20 adult male Wistar rats, from the UFSCar Central Animal Biotery, kept in a controlled environment. The cutaneous atrophy was induced with topical use of the glucocorticoid Clobetasol propionate 0.05%, 2 times daily for 14 days and evaluated by histological analysis and FS with laser excitation at 532nm and 408nm. We evaluated 96 skin fragments with HE and picrosirius red staining. In biopsies from the first day, the average of epidermal thickness was 44 ± 9&#956;m and, after 14 days of CB, was 16 ± 6&#956;m (p <0.0001), confirming atrophy. This result was confirmed by staining with picrosirius red, which was observed coarsed and disorganized rearrangement of the collagen fibers in the dermis after the use of corticosteroids. For the analysis of results from FS, the spectra have been nominated as "normal" or "atrophic" in correspondence to the histological study. The FS with 408nm laser analysis allowed to distinguish the "normal" and "atrophic" group with fewer spectral parameters. In the future, this technique could be used as a complementary diagnostic method in dermatology. / O padrão ouro para avaliar a atrofia de pele é o estudo histológico. Quando comparada à técnica de Espectroscopia de Fluorescência (EF), a histologia exige a remoção física de tecidos e seu processamento em laboratório; enquanto a EF realiza avaliações rápidas e in vivo. O objetivo dessa pesquisa foi padronizar uma metodologia para indução de atrofia cutânea em modelo experimental; comparar o colágeno na pele normal e atrófica; e estimar o potencial da EF na avaliação da atrofia cutânea. Foram utilizados 20 ratos machos Wistar adultos, provenientes do Biotério Central da UFSCar, mantidos em ambiente controlado. A atrofia cutânea foi induzida com o uso tópico do glicocorticóide propionato de clobetasol a 0,05% (CB), 2 vezes ao dia, por 14 dias, e avaliada por meio de estudo histológico e EF com laser de excitação em 532nm e 408nm. Foram avaliados 96 fragmentos de pele com coloração HE e Picrosirius red. Nas biópsias do primeiro dia, a média de espessura da epiderme foi de 44±9&#956;m e, após 14 dias de CB, foi de 16±6&#956;m (p<0,0001), confirmando a atrofia. Esse resultado foi corroborado pela coloração com Picrosirius red, na qual se observou, após uso de corticóide, rearranjo mais grosseiro e desorganizado das fibras colágenas da derme. Para a análise dos resultados da EF, os espectros foram nomeados como normal ou atrófico , em correspondência ao estudo histológico. A avaliação por EF com laser de 408nm permitiu distinguir os grupos normal e atrófico com menor número de parâmetros espectrais. No futuro, esta técnica poderá ser usada como método de diagnóstico complementar na área da dermatologia.

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T22:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brito_VaniaNieto_D.pdf: 17655224 bytes, checksum: 75de87a92111468f9002287b57e1c7fe (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O timo e o local de maturacao dos linfocitos T que coordenam a resposta imune apos o reconhecimento de antigenos; apesar disso, torna-se alvo em diversas infeccoes. O P. brasiliensis, causador da paracoccidioidomicose, e capaz de invadir o timo e induzir atrofia deste orgao em animais experimentais. Neste estudo, foi analisada a influencia da virulencia fungica (cepas Pb18 e Pb265), da linhagem murina (A/J e B10.A) e de citocinas pro-inflamatorias (TNF e IFN-g) nesse fenomeno. As leveduras da cepa virulenta Pb18 persistiram no timo por um periodo maior e induziram alteracoes histopatologicas mais intensas, embora o isolado Pb265, de baixa virulencia, tambem tenha causado atrofia. O padrao de atrofia, caracterizado por perda de peso do orgao, aumento na taxa de apoptose e perda de delimitacao corticomedular foi semelhante nas duas linhagens, contudo os camundongos B10.A apresentaram tambem alteracoes quantitativas nas subpopulacoes de timocitos e linfocitos T esplenicos. A infeccao fungica também provocou a depressao da resposta proliferativa frente a ConA de timocitos e esplenocitos de camundongos B10.A por um periodo mais prolongado do que de animais da linhagem A/J. Em ambas as linhagens, a infeccao provocou aumento na porcentagem de linfocitos T esplenicos de fenotipo CD4+CD8+. Houve reducao no numero de celulas timicas positivas para TNF e IFN-g apos infeccao com o P. brasiliensis. Utilizando-se camundongos deficientes para o receptor p55 de TNF ou para a producao de IFN-g, verificou-se que o TNF medeia o aumento na apoptose de timocitos pos-infeccao enquanto a perda de peso e da delimitação corticomedular sao desencadeadas pelo IFN-g. Nossos resultados indicam que a atrofia timica observada na paracoccidioidomicose experimental envolve a interacao de fatores relacionados ao fungo e ao hospedeiro, que podem influenciar o curso da doenca / Abstract: Thymus is the site of T cells maturation that orchestrates specific immune response following antigen recognition. In spite of this, it can be a target during many infectious diseases. Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis, is able to invade the thymus inducing atrophy in experimental models. In this study, it was analyzed the influence of fungal virulence (Pb18 and Pb265 isolates), murine strain (A/J e B10.A) and proinflammatory cytokines (TNF e IFN-g) in this phenomenon. Yeasts from virulent strain Pb18 persisted for a larger period in the thymus and induced stronger histopathological alterations, although poorly virulent Pb265 also has induced thymic atrophy. The pattern of atrophy that embodied organ weight decreases, increases in the apoptotic levels and the loss of corticomedullary delimitation was similar in both strains. However, B10. A strain also presented quantitative changes in the thymic and splenic T cell subpopulations. This strain showed a decreased proliferative response of thymocytes and splenocytes to Concanavalin A for a larger period than A/J strain, as well. Both strains had augmentation in the percentage of splenic CD4+CD8+ T cells. There was reduction in the amount of cells positive to TNF and IFN-g in the thymus after infection with P. brasiliensis. By using mice deficient to production of IFN-g or to p55 receptor of TNF it was seen that the TNF mediates the increase of apoptosis that takes place in the thymus after the infection, whereas organ weight decreases and loss of corticomedullary delimitation are performed by IFN-g. Our results suggest that thymic atrophy observed during experimental paracoccidioidomycosis involves interaction of fungal and host related factors and, most probably, influences the course of disease / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Maeli Dal Pai Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:12:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_RodrigoWagnerAlves_M.pdf: 2186081 bytes, checksum: 2a1578159471f249151f3b90ca0b76fb (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O treinamento físico pode promover adaptações benéficas ao músculo esquelético. Entretanto, o treinamento de alta intensidade associado com um tempo insuficiente de recuperação, similar às condições de sobretreinamento, pode ocasionar efeitos prejudiciais. Os fatores reguladores miogênicos (MRFs) e o fator de crescimento IGF-1 são importantes reguladores da massa muscular no treinamento físico. Neste contexto, testamos a hipótese que o treinamento de alta intensidade com curto tempo de recuperação, poderia influenciar a morfologia, as isoformas da cadeia pesada de miosina (MHC), e a expressão dos MRFs MyoD e Miogenina e do IGF-1, no músculo esquelético de ratos. Ratos Wistar machos (200-250g) foram divididos em 4 grupos: treinado 8 semanas (T8), controle 8 semanas (C8), treinado 12 semanas (T12) e controle 12 semanas (C12). Os grupos T8 e T12 realizaram um programa de treinamento resistido de alta intensidade (5 dias/semana), envolvendo sessões de saltos em uma cuba contendo água. Ao término de cada período, os animais foram sacrificados e o músculo plantar retirado e submetido às análises morfológica e histoquímica, análises das MHCs e expressão gênica da MyoD, Miogenina e IGF-1. Do início ao final do experimento todos os grupos aumentaram o peso corporal, no entanto, o grupo T12 foi estatisticamente menor em relação ao C12. Com relação à área de secção transversal, observou-se uma redução das fibras IIC e IIAD no grupo T8 e IIA e IID no grupo T12 em relação aos seus controles. O grupo treinado por 12 semanas apresentou um aumento da frequência das fibras IIBD e redução nas frequências das fibras I, IIA e IID, em relação ao grupo controle; esses dados ainda foram corroborados pela redução das isoformas MHCI e MHCIIa e aumento da MHCIIb. A MHCIId não mostrou diferença significativa. A expressão gênica do grupo T12 apontou uma diminuição da MyoD e um aumento do IGF-1 comparado com o grupo C12; já, a expressão da Miogenina foi semelhante entre os grupos. Estes dados mostram que o modelo utilizado, semelhante às condições do sobretreinamento, promoveu a atrofia muscular e a transição das fibras musculares para uma atividade contrátil mais rápida. Estes fatos podem estar associados a uma menor atividade das células satélites. Em adição, o aumento da expressão do IGF-1, decorrente do treinamento, pode ter ocorrido na tentativa de prevenir o processo atrófico. / Abstract: Physical training can promote beneficial changes in skeletal muscle. However, the high-intensity resistance training associated with insufficient recovery time may cause harmful effects. Myogenic regulatory factors (MRFs) and the growth factor IGF-1 are important mediators of muscle mass during physical training. In this context, we tested the hypothesis that high-intensity resistance training with short recovery time, similar to overtraining conditions, could influence the morphology, the myosin heavy chain (MHC) isoforms and the expression of MRFs MyoD and myogenin, and IGF-1 in skeletal muscle of rats. Male Wistar rats (200-250 g) were divided into 4 groups: trained 8 weeks (T8), control 8 weeks (C8), trained 12 weeks (T12) and control 12 weeks (C12). T8 and T12 groups were subjected to a high-intesnsity resistance training program (5 days/week), involving jumps sessions into water, carrying progressive overload equivalent to percentage of body weight. At the end of each period the animals were sacrificed and the plantaris muscles were removed and submited to morphological and histochemical analysis, myosin heavy chain (MHC) analysis and the gene expression of MyoD, Myogenin and IGF-1. From beginning to end of the experiment all groups increased body weight, however, in T12 body weight was lower compared to the C12. Regarding the cross-sectional area, there was a significant reduction of the IIC fibers and IIAD in T8 group and IIA and IID in T12 compared to their controls. The group trained by 12 weeks showed an increase in the IIBD, accompanied by a reduction in the I, IIA and IID muscle fibers frequency, compared to control group; these data have been corroborated by the reduction of MHCI and MHCIIa isoforms and increased of MHCIIb isoform. The MHCIId showed no significant differences. The gene expression of the T12 group showed a decrease in MyoD and an increase in IGF-1 compared with the C12 group; already, the expression of Myogenin was similar between groups. These data show that the model used, similar to the conditions of overtraining, promoted muscular atrophy and muscle fiber transition to a faster contractile activity. These facts may be associated with a lower activity of satellite cells. In addition, increased expression of IGF-1, due to training, may have occurred in an attempt to prevent the atrophic process. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural