Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 431346.pdf: 1084858 bytes, checksum: bfb1c0acb189347c0999c9608ad1773c (MD5) Previous issue date: 2011-03-11 / Introdu??o: O acetaminofeno (APAP) ? um potente agente analg?sico e antipir?tico, com fraco efeito anti-inflamat?rio. Apesar de sua efic?cia, a utiliza??o de doses elevadas de APAP est? associada ? severa hepatotoxicidade. Tem sido sugerido que o tratamento com inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA), como o captopril, poderia apresentar efeitos protetores na intoxica??o aguda induzida por APAP, embora n?o existam evid?ncias suficientes para comprovar este efeito. Neste contexto, o presente estudo investigou os efeitos do tratamento com um potente inibidor da ECA, o enalapril, sobre a hepatotoxicidade induzida por APAP em camundongos. M?todos: Camundongos machos e f?meos C57BL/6 (6-10 por grupo, 20-25 g) foram utilizados. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comit? de ?tica para o Uso de Animais (09/00119 PUCRS). Para o tratamento profil?tico, os animais foram pr?-tratados oralmente com enalapril (30 mg/kg), uma vez por dia, durante 4 dias antes da administra??o de APAP. No quinto dia, a hepatotoxicidade foi induzida por uma dose ?nica de APAP (400 mg/kg, i.p.). Os animais receberam duas doses adicionais de enalapril 1 h antes, e 6 h ap?s a administra??o de APAP. Os camundongos foram submetidos ? eutan?sia 24 h ap?s a inje??o de APAP. Os par?metros avaliados foram: altera??es macrosc?picas e histol?gicas dos f?gados, n?veis s?ricos de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST), atividade da catalase (CAT) e concentra??o de glutationa reduzida (GSH), migra??o de neutr?filos (MPO) e produ??o de TNFα em fatias de f?gado e, express?o de caspase-3, por imunoistoqu?mica. Os efeitos do enalapril tamb?m foram avaliados sobre estes mesmos par?metros, em um protocolo terap?utico, em que os animais receberam APAP (400 mg/kg, i.p.) e o enalapril (30mg/kg) foi administrado 3 h ap?s. Posteriormente, os camundongos receberam mais tr?s aplica??es de enalapril com intervalos de 3 h cada. A N-acetilciste?na (NAC; 50 mg/kg) foi utilizada como controle positivo, nos mesmos intervalos de tempo. Resultados: A administra??o profil?tica oral de enalapril produziu uma redu??o significativa da hepatotoxicidade induzida por APAP, de acordo com a avalia??o macrosc?pica dos f?gados (71 ? 10 %). A avalia??o histol?gica revelou que as amostras obtidas de animais controle APAP apresentaram necrose em tr?s a quatro camadas de hepat?citos, acompanhada por camadas de degenera??o centrolobular, enquanto que os animais pr?-tratados com enalapril mostraram m?nima necrose ou nenhuma mudan?a. Ademais, o pr?-tratamento com enalapril reduziu visivelmente a express?o de caspase-3, indicando interfer?ncia com apoptose de c?lulas hep?ticas. O enalapril tamb?m produziu uma inibi??o acentuada das enzimas CAT e GSH no f?gado (72 ? 11 % e 90 ? 11 %, respectivamente). Al?m disso, os animais pr?-tratados com enalapril apresentaram uma redu??o acentuada dos n?veis s?ricos AST e ALT. As inibi??es observadas foram 86 ? 14 % e, 88 ? 9 %, respectivamente. Ademais, o tratamento com enalapril tamb?m causou uma redu??o da atividade da MPO (82 ? 13 %), embora n?o tenha alterado a produ??o de TNF. Uma redu??o similar de todos os par?metros de hepatoxicidade tamb?m foi observada com o esquema terap?utico de administra??o do enalapril. De acordo com a avalia??o macrosc?pica, o enalapril reduziu significativamente a hepatoxicidade causada por APAP, de forma semelhante ao controle positivo, NAC (79 ? 12 % e 80 ? 20 %, respectivamente). Em rela??o ? avalia??o histol?gica, os resultados foram similares ao tratamento profil?tico. O p?s-tratamento com enalapril ou NAC tamb?m reduziu a express?o de caspase-3. Para a GSH hep?tica, foram observadas inibi??es de 86 ? 15 % e 92 ? 22 %, respectivamente, para os tratamentos com enalapril e NAC. No 13 entanto, para a enzima CAT, n?o houve altera??o significativa com ambos os tratamentos. O esquema terap?utico tamb?m produziu uma redu??o marcante dos n?veis s?ricos de AST (77 ? 5 % e 76 ? 7 %) e ALT (94 ? 3 % e 99 ? 8 %), para enalapril e NAC, respectivamente. A administra??o terap?utica de enalapril ou NAC tamb?m causou uma redu??o significativa da atividade de MPO, com percentagens de inibi??o de 96 ? 6 % e, 98 ? 9 %, respectivamente, embora n?o tenha alterado a produ??o de TNFα. Discuss?o: Os resultados do presente estudo indicam que a administra??o profil?tica de enalapril foi capaz de prevenir a hepatoxicidade causada por APAP. Al?m disto, a utiliza??o de um esquema terap?utico com este inibidor tamb?m foi capaz de prevenir a toxicidade hep?tica causada por APAP, em n?veis compar?veis aos observados com o f?rmaco de refer?ncia NAC. Assim, ? poss?vel sugerir que pacientes sob tratamento com este inibidor s?o menos suscet?veis aos efeitos do APAP.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 431822.pdf: 631602 bytes, checksum: 9d289abd63882c9ea0f089225adb5921 (MD5) Previous issue date: 2010-08-13 / Ao longo dos anos tem sido relatado o aumento dos n?veis de ferro em regi?es encef?licas de pacientes acometidos por doen?as neurodegenerativas, assim como no envelhecimento normal. Em estudos pr?vios realizados em nosso laborat?rio foi demonstrado que a sobrecarga de ferro no per?odo neonatal induz disfun??o cognitiva em ratos adultos. No presente trabalho, n?s avaliamos os efeitos do tratamento com ferro no per?odo neonatal sobre a cogni??o em ratos idosos. Tamb?m investigamos os efeitos de um tratamento subcr?nico tardio com rosuvastatina em ratos com d?ficits cognitivos induzidos por ferro e pelo envelhecimento. Ratos Wistar machos receberam ve?culo ou 10,0 mg/kg de Fe+2 por via oral do 12? ao 14? dia de vida p?s-natal. Quando os animais atingiram a idade de 23 meses, eles receberam inje??es intraperitoneais de solu??o salina ou de rosuvastatina (0,2 ou 2,0 mg/kg) por 21 dias. Vinte e quatro horas depois da ?ltima inje??o, eles foram submetidos ao treino na tarefa de reconhecimento do objeto novo. As sess?es de teste de reten??o foram realizadas 1,5 e 24 h ap?s a sess?o de treino, a fim de avaliar a mem?ria de curta dura??o e longa dura??o, respectivamente. Os resultados indicaram que os animais envelhecidos que receberam ferro no per?odo neonatal apresentaram d?ficits de mem?ria mais pronunciados do que os tratados com ve?culo, sugerindo que o ferro potencializa os preju?zos da mem?ria associada ao envelhecimento. Nos grupos da rosuvastatina os d?ficits na mem?ria de reconhecimento associados ao tratamento com ferro e ao envelhecimento melhoraram, fornecendo evid?ncias de que as estatinas podem ser consideradas para o tratamento do decl?nio cognitivo associado ao envelhecimento

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 431855.pdf: 3947634 bytes, checksum: 7beba45e84b6a9adcafc79eb9a9e0deb (MD5) Previous issue date: 2011-03-18 / As mol?culas HLA (Human Leucocyte Antigens) s?o prote?nas codificadas por genes altamente polim?rficos localizados na regi?o do MHC (Major Histocompatibility Complex) no bra?o curto do cromossomo 6 humano. Elas est?o envolvidas em processos de resposta imunol?gica, sendo respons?veis pela apresenta??o de ant?genos aos linf?citos T. O sistema HLA ? altamente informativo em estudos de gen?tica de popula??es, devido ao seu elevado polimorfismo e ao forte desequil?brio de liga??o entre loci pr?ximos. Entre diferentes popula??es podemos observar varia??o tanto na freq??ncia, como na presen?a de alelos e hapl?tipos em determinados grupos. Portanto, o conhecimento de alelos HLA ? uma ferramenta importante para os estudos da origem das popula??es. Al?m disso, sua determina??o contribui para a compreens?o de mecanismos associados ? suscetibilidade ou resist?ncia a determinadas doen?as e em processos de aloca??o de ?rg?os para transplante. A investiga??o da compatibilidade HLA entre doador e receptor ? determinante no sucesso do transplante. No Brasil a elevada taxa de miscigena??o dificulta a busca por um doador compat?vel. Informa??es sobre a diversidade desses alelos na nossa popula??o nos permitem estimar a chance de um paciente em lista encontrar um doador com uma melhor compatibilidade imunol?gica. No Brasil, existem estudos pr?vios de freq??ncia HLA, por?m, no Rio Grande do Sul, essa informa??o ? muito escassa. Nesse trabalho a distribui??o das freq??ncias al?licas, fenot?picas e haplot?picas de HLA A, B e DRB1 foi determinada utilizando uma amostra de 5000 doadores volunt?rios de medula ?ssea cadastrados no REDOME (Registro Brasileiro de Doadores Volunt?rios de Medula ?ssea). Os indiv?duos estudados residem no estado do Rio Grande do Sul e foram classificados com base no grupo ?tnico (4428 caucasianos, 324 mesti?os e 248 negros). A tipagem HLA foi realizada pelo m?todo de PCR-SSO aliado ? tecnologia Luminex. Na amostra total foram identificados 21 grupos al?licos HLA-A, 33 HLA-B and 13 HLA-DRB1. Os grupos al?licos mais freq?entes para cada locus foram: A*02, B*35 e DRB1*13. Os hapl?tipos mais freq?entes foram: A*01 B*08 DRB1*03 nos caucasianos e mesti?os, e A*02 B*15 DRB1*04 nos negros. As freq??ncias al?licas foram comparadas com amostras de diferentes regi?es brasileiras. Na maioria das compara??es n?o foram encontradas diferen?as estatisticamente significativas. Foram observadas maiores diferen?as na compara??o entre os grupos da nossa amostra, mostrando a contribui??o HLA dos diferentes grupos ?tnicos. Esses dados oferecem informa??es para o conhecimento da diversidade HLA na popula??o do Rio Grande do Sul e na busca por um doador mais compat?vel para transplante

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432345.pdf: 979099 bytes, checksum: 820bba184bdc3f509975d4086e7aaeb4 (MD5) Previous issue date: 2011-03-23 / Angiostrongylus cantonensis ? um nemat?deo de roedores, seus hospedeiros definitivos. Ao infectar o ser humano, um hospedeiro n?o habitual, causa meningoencefalite eosinof?lica. A droga indicada para o tratamento ? o albendazol, por?m n?o existe, at? o presente momento, droga de efic?cia cl?nica demonstrada para o tratamento das angiostrongil?ases. Assim, a id?ia de buscar uma subst?ncia que reduza ou previna a morbidade ? uma alternativa ? abordagem usual de drogas vermicidas. Neste sentido, o presente estudo objetivou verificar o efeito de tr?s subst?ncias com potencial capacidade de inibi??o da oviposi??o em A. cantonensis. Roedores da esp?cie Rattus norvegicus foram inoculados com 100 larvas L3 de A. cantonensis e ap?s 42 dias de infec??o larvas L1 come?aram a ser eliminadas nas fezes. As subst?ncias foram administradas aos animais com 42 dias de infec??o durante 5 dias para a lovastatina (400 mg/Kg) pela via oral, 4 dias para a fenantrolina (20 mg/Kg) pela via intraperitoneal diluindo-se em carboximetilcelulose (CMC) a 1% como coadjuvante e 3 dias, de 12 em 12 horas, para a nitazoxanida (8,3 mg/Kg) pela via oral. Os resultados mostraram um decl?nio na elimina??o de larvas por R. norvegicus quando foi utilizada a nitazoxanida em rela??o aos animais infectados e n?o tratados demonstrando um potencial efeito na inibi??o da oviposi??o deste parasito. Estes resultados demonstram que esta id?ia deve ter continuidade e mais estudos devem ser realizados para aprimorar essa nova hip?tese

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432437.pdf: 10723389 bytes, checksum: d0fa4e1abb05919515c5199dcf4ecc73 (MD5) Previous issue date: 2011-06-24 / O gene inhA de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) codifica a enzima enoil redutase, InhA, uma enzima chave no ciclo de alongamento de ?cidos graxos tipo II e t?m sido validada como um alvo efetivo para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. A InhA catalisa a redu??o NADH-dependente da liga??o dupla trans entre as posi??es C2 e C3 de substratos de ?cidos graxos. Ela ? o alvo da isoniazida, uma droga de primeira linha no tratamento da tuberculose. Muta??es no gene estrutural da InhA est?o associadas com a resist?ncia ? isoniazida in vivo. Mesmo que muta??es no gene inhA sejam conhecidas por facilitar a resist?ncia ? isoniazida, InhA ainda ? uma excelente candidata a alvo para o planeamento de f?rmacos porque: (i) a grande maioria das muta??es encontradas em isolados cl?nicos de cepas resistentes ? isoniazida est?o associadas com o ativador da isoniazida (KatG catalase-peroxidase); (ii) apenas uma enoil-ACP redutase ? encontrada em M. tuberculosis, ao contr?rio de outras enzimas dos sistemas FAS-II de bact?rias; (iii) a especificidade da InhA por substratos de cadeia mais longa a distingue das enoil-ACP redutases de outros tipos. Nosso objetivo com este trabalho foi de analisar em detalhe as informa??es estruturais e f?sico-qu?micas dispon?veis sobre a InhA de Mtb utilizando ferramentas de bioinform?tica. Como resultado, foi desenvolvido um modelo farmacof?rico baseado na estrutura do s?tio de liga??o ao substrato da InhA, permitindo a aplica??o de uma metodologia de triagem virtual focada em selecionar ligantes que satisfizessem essas caracter?sticas, permitindo assim, a melhor complementariedade com a prote?na alvo. Al?m disso testamos a habilidade de quatro algoritmos de docagem molecular em encontrar conforma??es semelhantes para uma mesma mol?cula, fornecendo ind?cios de que esta seja a conforma??o mais pr?xima ?quela adotada in vivo. Por fim, simula??es de din?mica molecular foram empregadas para melhor compreens?o da intera??o da enzima InhA com um inibidor j? conhecido desta enzima

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432578.pdf: 7523354 bytes, checksum: fb90e3b4e65279b64dfbdb3b93e8f365 (MD5) Previous issue date: 2011-03-25 / A tuberculose tem sido um flagelo da humanidade desde os tempos antigos. Esta doen?a tem cobrado um pre?o alto em vidas humanas, por esta raz?o muitos esfor?os tem sido feitos com o intuito de derrotar o Mycobacterium tuberculosis. A sequ?ncia gen?mica do Mycobacterium tuberculosis deu in?cio a uma nova era e foi de grande impacto para o presente conhecimento deste pat?geno como tamb?m na pesquisa de drogas anti-microbiais. Com estes avan?os foi poss?vel identificar genes e mais tarde validar vias metab?licas. O melhor entendimento das vias metab?licas presentes no Mycobacterium tuberculosis corresponde ao primeiro passo e configura uma possibilidade de identifica??o de novos alvos moleculares que possam erradicar o bacilo. Entretanto, ainda h? muito a fazer, desde a descoberta da Rifampicina, a droga de primeira linha efetivamente utilizada contra TB, nenhuma nova droga quimioter?pica foi identificada. Nos dias de hoje, a TB ? respons?vel pela morte de dois milh?es de pessoas por ano, sendo considerada uma emerg?ncia global, a qual precisa ser urgentemente erradicada. O presente projeto tem o objetivo de realizar a an?lise estrutural da enzima Citidina Deaminase (CDA; EC 3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis associada com seus substratos e produtos, aliando t?cnicas de Din?mica e Docagem molecular.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 433347.pdf: 402554 bytes, checksum: 52bf760eed71594340bcbb1efd3cb4a1 (MD5) Previous issue date: 2011-03-31 / O Herpesv?rus Humano tipo 6 (HHV-6) ? um v?rus da fam?lia Herpesviridae associado ao desenvolvimento de ros?ola infantil ou exantema s?bito, doen?a caracterizada por febre alta, rash cut?neo e ocasionalmente convuls?es febris. A preval?ncia mundial de infec??o por HHV-6 ? alta. Estima-se que cerca de 83% das crian?as at? 13 meses e mais de 95% das com idade at? 2 anos j? entraram em contato com o v?rus. Existem duas variantes do HHV-6 j? identificadas, as variantes A e B, sendo o HHV-6B o agente principal relacionado aos casos de ros?ola infantil. Epilepsia ? um termo aplicado a um grupo de patologias cr?nicas caracterizadas, principalmente, pela ocorr?ncia de crises epil?pticas. As epilepsias representam em torno de 1% dos dist?rbios neurol?gicos que afetam a popula??o mundial. As crises s?o provocadas por uma disfun??o da atividade el?trica cerebral associada a anormalidades estruturais e metab?licas causadas, em alguns casos, pela presen?a de v?rus no sistema nervoso central. Por apresentar caracter?sticas como neurotropismo e lat?ncia no sistema nervoso central, procuramos relacionar o HHV-6 com a epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM). Atrav?s de rea??o em cadeia da polimerase (PCR), pesquisamos a presen?a do v?rus em 42 amostras de hipocampo de 14 pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) submetidos a am?gdalo-hipocampectomia (AH) ou lobectomia temporal anterior (LTA) como tratamento para a epilepsia. Tr?s amostras de cada paciente foram analisadas: cabe?a, corpo e cauda do hipocampo. O DNA do HHV-6 foi detectado em 12 dos 14 pacientes (85,7%) com ELTM. Tr?s pacientes foram positivos em todas as tr?s amostras, 4 pacientes foram positivos em duas amostras e 5 em apenas uma amostra. Com rela??o ? origem das amostras, 7 foram positivas na cabe?a do hipocampo, 8 no corpo do hipocampo e 7 na cauda do hipocampo, demonstrando n?o haver um s?tio de prefer?ncia para o estabelecimento do v?rus. A positividade para HHV-6 encontrada nos pacientes deste estudo ? maior do que os dados encontrados na literatura. Uma poss?vel explica??o para esta elevada positividade poderia ser as diferen?as na concep??o do estudo, com tr?s amostras coletadas de cada paciente, o que II pode ser mais representativo do que a coleta de apenas uma amostra. Nossos resultados refor?am a hip?tese de um poss?vel papel da infec??o pelo HHV-6 na epilepsia.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437677.pdf: 769775 bytes, checksum: c4cb9d9a52d21b8a9826564fdceb6ea8 (MD5) Previous issue date: 2012-01-13 / Biopharmaceutical drugs are mainly recombinant proteins produced by biotechnological tools. Currently on the market L-asparaginase preparations, derived either from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi, have been used as a therapeutic agent on the effective treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. The interest in Erwinia carotovora L-asparaginase type II stems from its significantly lower glutaminase- and similar asparaginase-activity compared to current therapeutic preparations, this is particularly important since the glutaminase-activity has been implicated in causing serious side effects. The aim of this work is to apply a combination of technologies to develop a productive and simplified process for production of homogeneous and active recombinant L-asparaginase II from Erwinia carotovora (rErAII) in E. coli as host cells. The shake flasks and bioreactor conditions for productive rErAII expression are described, as well as a one-step ion-exchange liquid chromatography purification protocol followed by enzyme kinetics and thermodynamics through isothermal titration calorimetry (ITC). By using a robust fed-batch technique with pre-determined exponential feeding rates the bioreactor culture system yielded 30.7 gram of dry cell weight and 0.9 gram of recombinant rErAII protein in soluble form per liter of culture broth. This was achieved in cultures maintained at 30 ?C, in Terrific Broth medium under isopropil ?-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) induction and using E. coli C43 (DE3) as a host cell. The established one-step purification protocol yielded more than 5 mg of homogeneous rErAII per gram of dry cell weight, corresponding to 168 mg of rErAII protein per culture liter. The work shows that it is possible to produce an active homogeneous rErAII enzyme in the soluble cell fraction through IPTG-induced E. coli fed-batch cultivation. The rErAII proved to be a promising alternative therapy in the treatment of ALL, due to its lower glutaminase activity. When compared to well-established spectrophotometric assays, the straightforward calorimetric techniques for enzyme kinetics determination are accurate and precise either for purified enzymes or crude extracts. These data will contribute to biopharmaceutical companies interested in developing biosimilars, to healthcare policies, and quality control improvement. / Biof?rmacos s?o, na sua maioria, prote?nas recombinantes produzidas por ferramentas biotecnol?gicas. Prepara??es de L-asparaginase que atualmente est?o no mercado, derivadas de Escherichia coli ou Eravinia chrysanthemi, t?m sido utilizadas como agentes terap?uticos no tratamento efetivo de leucemia linfobl?stica aguda (ALI-) por mais de 40 anos. O interesse em L-asparaginase tipo 11 de Ertivinicr carotovora decorre da sua atividade de glutaminase reduzida e sua atividade de asparaginase similar quando comparada a prepara??es terap?uticas atualmente em uso. Isso ? particularmente importante uma vez que a atividade de glutaminase foi relacionada a s?rios efeitos colaterais. O objetivo desse trabalho ? aplicar uma combina??o de tecnologias para desenvolver um processo simplificado e produtivo para a produ??o de L-asparaginase II recombinante homog?nea e ativa de Envinia carolovora (rErAll) em c?lulas hospedeiras de E. coli. Neste trabalho s?o descritas as condi??es para a express?o produtiva de rErAll em agitador orbital e em biorreator, assim como um protocolo de purifica??o em uma ?nica etapa, por cromatografia l?quida de troca f?nica, seguida pela determina??o dos par?metros cin?ticos e termodin?micos da enzima atrav?s de calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). Usando uma t?cnica robusta de batelada alimentada, com vaz?o em perfil exponencial pr?-determinado, o sistema de cultivo em biorreator rendeu 30,7 gramas de c?lulas secas e 0,9 gramas de prote?na rErAll na fra??o sol?vel por litro de meio de cultivo. Os resultados foram atingidos em cultivos mantidos a 30?C, em meio de cultura Terrific Broth sob indu??o de isopropil 0-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e utilizando E. coli C43 (DE3) como c?lula hospedeira. O protocolo de purifica??o de uma ?nica etapa rendeu aproximadamente 5 mg de rErAll homog?nea por grama de c?lula seca, correspondendo a 168 mg de prote?na rErAll por litro de meio de cultura. O trabalho demonstra que ? poss?vel produzir na fra??o celular sol?vel a enzima rErAII ativa e homog?nea, por meio de cultivos de E. coli em batelada alimentada sob a indu??o de IPTG. A rErAll mostrou ser uma terapia alternativa promissora para o tratamento de ALL devido a sua atividade de glutaminase reduzida. Quando comparada a ensaios espectrofotorn?tricos bem estabelecidos, as t?cnicas calorim?tricas diretas para determina??o de cin?tica enzim?tica s?o exatas e precisas, tanto para enzimas purificadas quanto para extratos brutos. Esses dados poder?o contribuir para ind?strias farmac?uticas interessadas em desenvolver biosimilares. para pol?ticas de sa?de e para o melhoramento do controle de qualidade de enzimas terap?uticas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437675.pdf: 3014292 bytes, checksum: 10c5c967edfd4e61677f7867c8186a73 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, which currently infects one-third of the world s population. Despite the availability of the Bacille Calmette-Gu?rin vaccine and effective short-course chemotherapy, the increasing global burden of TB has been linked to the co-infection with HIV, the emergence of multi, extensively and now totally drug-resistant strains. Furthermore, the capacity of M. tuberculosis to remain viable within infected hosts in a long-term asymptomatic infection is an additional problem for the control of TB. Nucleotides biosynthesis pathways provide promising molecular targets for the development of new vaccines and therapeutic strategies to control the global incidence of TB. Uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) catalyzes the conversion of uracil and 5'-phosphoribosyl-a- 1'-pyrophosphate (PRPP) to uridine 5'-monophosphate (UMP) and pyrophosphate (PPi). UPRT plays an important role in the pyrimidine salvage pathway since its product (UMP) is a common precursor of all pyrimidine nucleotides. This work presents cloning, recombinant expression in Escherichia coli, and purification of the upp-encoded M. tuberculosis UPRT (MtUPRT). Mass spectrometry analysis and N-terminal amino acid sequencing confirmed the identity of homogeneous MtUPRT. The molecular mass of the native MtUPRT was shown to follow a monomer-tetramer association model by analytical ultracentrifugation. This enzyme did not show a pronounced regulation by GTP as this nucleotide did not affect enzyme kinetic parameters, and its binding was not detected by isothermal titration calorimetry (ITC). Initial velocity and ITC studies suggested that catalysis proceeds through a sequential ordered mechanism, in which PRPP binds first, followed by uracil binding, and PPi is the first product to be released, followed by UMP. ITC also showed that PRPP and UMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles indicated that groups with pK values of 5.7 and 8.1 are important for catalytic activity and a group with a pK value of 9.45 is involved in PRPP binding. Pre-steady-state kinetic data suggested that product release is not the rate-limiting step of the reaction catalyzed by MtUPRT. Kinetic fluorescence studies demonstrated two forms of enzyme in solution of which only one can bind to PRPP. Knockout of the upp gene showed that this gene is not essential for M. tuberculosis H37Rv in the employed experimental conditions and the absence of upp gene did not affect the mycobacterium growth. UPRT is expressed in both high and low oxygen conditions of M. tuberculosis H37Ra growth. MtUPRT is inhibited by an active metabolite of isoxyl, which does not seem to inhibit RNA polymerase, adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Minimum inhibitory concentration of isoxyl for M. tuberculosis mutant for upp gene, complemented and wild type strains was 12.8 μg/mL, meaning that the absence of the upp gene did not affect M. tuberculosis sensitivity to isoxyl. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the nucleotide biosynthesis pathway in M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to decrease the global incidence of this pathogen. / A tuberculose (TB) ? uma doen?a infecciosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, o qual atualmente infecta um ter?o da popula??o mundial. Apesar da disponibilidade da vacina Bacille Calmette-Gu?rin e da eficaz quimioterapia de curta dura??o, o aumento na incid?ncia global da TB est? relacionado ? co-infec??o com o HIV e ao surgimento de cepas multi, extensivamente e agora totalmente resistente a drogas. Al?m disto, a capacidade do M. tuberculosis de permanecer vi?vel dentro do hospedeiro infectado por longo per?odo em uma infec??o assintom?tica ? um problema adicional para o controle da TB. As rotas de bioss?ntese de nucleot?deos fornecem alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de novas vacinas e estrat?gias terap?uticas para controlar a incid?ncia global de TB no mundo. A uracil fosforribosil transferase (UPRT) catalisa a convers?o de uracil e 5 - fosforribosil-a-1 -pirofosfato (PRPP) a uridina 5 -monofosfato (UMP) e pirofosfato (PPi). A UPRT tem um papel importante na rota de salvamento das pirimidinas j? que seu produto (UMP) ? o precursor comum de todos os nucleot?deos pirim?dicos. Este trabalho apresenta a clonagem, express?o recombinante em E. coli, e a purifica??o da UPRT de M. tuberculosis codificada pelo gene upp (MtUPRT). Adicionalmente, foram realizadas an?lises de espectrometria de massas e sequenciamento N-terminal que confirmaram a identidade da MtUPRT homog?nea. A massa molecular da MtUPRT nativa seguiu um modelo de associa??o mon?mero-tetr?mero por ultracentrifuga??o anal?tica. Esta enzima n?o mostrou uma regula??o pronunciada por GTP j? que este nucleot?deo n?o afetou os par?metros cin?ticos da enzima, e a sua liga??o n?o foi detectada por calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). A velocidade inicial e os estudos de ITC sugeriram que a cat?lise procede atrav?s de um mecanismo ordenado sequencial, no qual o PRPP liga primeiramente, seguido pela liga??o de uracil, e PPi ? o primeiro produto a ser liberado, seguido pelo UMP. ITC tamb?m mostrou que a liga??o de PRPP e UMP s?o processos termodinamicamente favor?veis. O perfil de pH indicou que grupamentos com os valores de pK pr?ximos de 5,7 e 8,1 s?o importantes para a atividade catal?tica e um grupamento com valor de pK pr?ximo a 9,45 est? envolvido na liga??o do PRPP. Dados de cin?tica no estado pr?-estacion?rio sugeriram que a libera??o de produto n?o ? a etapa limitante da rea??o catalisada pela MtUPRT. Estudos de fluoresc?ncia demonstraram a exist?ncia de duas formas da enzima em solu??o, das quais apenas uma pode ligar ao PRPP. O nocaute do gene upp demonstrou que este gene n?o ? essencial para o M. tuberculosis H37Rv nas condi??es empregadas no experimento e a aus?ncia do gene upp n?o afetou o crescimento micobacteriano. A UPRT mostrou ser expressa tanto em altas como em baixas concentra??es de oxig?nio. A MtUPRT foi inibida por um metab?lito ativo do isoxyl, que n?o parece inibir as enzimas RNA polimerase, adenina fosforribosil transferase e hipoxantinaguanina fosforribosil transferase. A concentra??o inibit?ria m?nima de isoxyl para as cepas de M. tuberculosis mutante para o gene upp, complementada e tipo selvagem foi de 12,8 μg/mL, o que significa que a aus?ncia do gene upp n?o afetou a sensibilidade do M. tuberculosis ao isoxyl. Assim, estes dados podem ser ?teis para um melhor entendimento sobre a via de bioss?ntese de nucleot?deos em M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estrat?gias terap?uticas e preventivas eficientes para diminuir a incid?ncia global deste pat?geno.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437812.pdf: 154195 bytes, checksum: 6d937534253a5ebf131f023920cdd572 (MD5) Previous issue date: 2011-11-11 / Background: Age related reductions in contextual memory can impair daily functioning of older adults and have an important impact on their quality of life. Thus, the understanding of the neurobiological correlates of this memory decline is important to the establishment of effective cognitive interventions in healthy older adults. Objective: The current study was aimed to investigate the effects of aging and prefrontal cortex (PFC) function on contextual memory performance under different encoding conditions in a naturalistic experimental paradigm. Methods: Young (n=34, aged 20 - 35 years) and older adult men (n=31; aged 54 - 87 years) matched for education completed a recognition memory task for context (location of objects depicted in different rooms of a house) with or without an incidental binding cue at encoding. In addition, Wisconsin Card Sorting Test (WCST) was carried out to assess PFC function. Results: Results for contextual memory performance showed significant main effects of aging and encoding condition. Older adults performed significantly poorer than young controls in the encoding condition without incidental binding cue. The introduction of the incidental binding cue at encoding significantly improved the context recognition scores in young and older adults. A significant association between WCST scores and the performance for contextual memory were found only in the task without binding cue and just for the older adult men. Conclusion: The main findings indicate that the age related deficits on contextual memory are associated to age related impairments of PFC function, as indicated by the WCST. However, contextual memory of older adults improved with cognitive support at encoding and became independent of the scores on WCST, suggesting that incidental associative binding instructions at encoding can mitigate PFC deficits. / Introdu??o: Redu??es na mem?ria contextual relacionadas ? idade podem prejudicar o funcionamento di?rio dos idosos e t?m um impacto importante na sua qualidade de vida. Assim, a compreens?o dos correlatos neurobiol?gicos deste decl?nio da mem?ria ? importante para o estabelecimento de interven??es cognitivas eficazes em idosos saud?veis. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos do envelhecimento e da fun??o do c?rtex pr?-frontal (CPF) sobre o desempenho da mem?ria contextual em condi??es diferentes de codifica??o em um paradigma experimental naturalista. M?todos: Jovens (n = 34; 26,02 ? 0,64) e idosos (n = 31; 69,09 ? 1,26) do sexo masculino pareados por n?vel educacional. Os volunt?rios foram submetidos a uma tarefa de mem?ria de reconhecimento de contexto (localiza??o de objetos representados em diferentes salas de uma casa) com ou sem uma estrat?gia de codifica??o associativa. Al?m disso, o Teste Wisconsin de Classifica??o de Cartas (WCST) foi realizado para avaliar a integridade funcional do CPF. Resultados: Os resultados para o desempenho da mem?ria contextual mostrou efeitos significativos do envelhecimento e da estrat?gia de codifica??o. Os idosos tiveram um desempenho significativamente pior do que controles jovens na condi??o de codifica??o sem estrat?gia de codifica??o. A introdu??o da estrat?gia de codifica??o melhorou significativamente as pontua??es do reconhecimento do contexto nos jovens e idosos. A associa??o significativa entre as pontua??es WCST e o desempenho da mem?ria contextual foram encontrados apenas nos idosos sem estrat?gia de codifica??o. Conclus?o: As principais conclus?es indicam que os d?ficits na mem?ria contextual e dist?rbios da fun??o do CPF est?o relacionados com a idade, como indicado pelo WCST. No entanto, a mem?ria contextual dos idosos melhorou, com o a introdu??o da estrat?gia de codifica??o associativa e tornou-se independente da pontua??o no WCST, sugerindo a estrat?gia de codifica??o associativa pode atenuar os d?ficits do CPF.