[ES] La cristalografía de rayos X es una potente técnica para la resolución de la estructura atómica de macromoléculas. La información generada, tiene gran impacto sobre diferentes campos relacionados con la investigación básica y aplicada, como son la biomedicina y diseño de fármacos, al igual que en el desarrollo de aplicaciones nanotecnológicas y biotecnológicas. Esta Tesis se centra en determinadas problemáticas actuales y en las proteínas involucradas en las mismas (TryR, eEF1A2 y CBDP35), siendo éstas sujeto de desarrollo biotecnológico en los campos de la biomedicina, farmacia y de la industria alimentaria, en el que la cristalografía de rayos X juega un papel crucial para dilucidar sus estructuras atómicas y funciones. En consideración a la biomedicina y diseño de fármacos, hemos resuelto la estructura de la Tripanotión reductasa (TryR) de Leishmania infantum en complejo con potentes inhibidores de su actividad oxidorreductasa, con potencial de desarrollo como fármacos. Así, se ha caracterizado la unión y mecanismo de acción de éstos inhibidores. TryR es una reconocida diana farmacológica para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, la Tripanosomiasis Humana Africana y la leishmaniosis, ya que desempeña un papel crucial y esencial en el metabolismo redox de los parásitos de la familia Trypanosomatidae. Además, se han analizado los parámetros de cristalización y difracción de novedosos inhibidores de la dimerización de TryR, cuyo diseño racional se basa en la unión a la interfaz de dimerización de la misma. La oncoproteína eEF1A2, involucrada en múltiples funciones celulares y sujeto de numerosas modificaciones post-traduccionales, se une al fármaco anticancerígeno plitidepsina. La cristalografía de rayos X, combinada con experimentos de espectrometría de masas, se han utilizado como herramientas para identificar nuevas modificaciones post-traduccionales y características estructurales en eEF1A2:GDP. Una modificación única, la adición de etanolamina fosfoglicerol (EPG) a aminoácidos conservados (Glu301 y Glu374 en mamíferos), se ha observado aquí por primera vez. El análisis estructural de estos hallazgos facilita la comprensión de las múltiples funciones y regulaciones de eEF1A2. La adquisición de una muestra conformacionalmente homogénea de eEF1A2:GTP, necesaria para la unión a la plitidepsina, ha sido evaluada en ensayos de cristalización del complejo terciario de eEF1A2: GTP: plitidepsina. Con respecto al dominio de unión a la pared celular de la endolisina PlyP35 codificada por el fago P35 de Listeria monocytogenes (CBDP35), hemos resuelto la estructura cristalina de CBDP35 en un complejo con ácido teicoico natural de L. monocytogenes serovar 1/2a. Esta estructura es el primer módulo de unión a la pared celular en complejo con ácidos teicoicos jamás dilucidado. El análisis estructural reveló los principales determinantes para la unión de la pared celular bacteriana, en particular, el mecanismo molecular del reconocimiento de N-acetil-d-glucosamina, una decoración de carácter glicosídico en ácidos teicoicos de serovares patógenos de L. monocytogenes. Estos hallazgos arrojan luz sobre el desarrollo biotecnológico de nuevas herramientas en la industria alimentaria y las terapias derivadas de fagos para detectar y tratar infecciones bacterianas. / [CA] La cristal·lografia de raig X és una potent tècnica per a la resolució de l'estructura atòmica de macromolècules. La informació generada té gran impacte sobre diferents camps relacionats amb la investigació bàsica i aplicada, com són la biomedicina i disseny de fàrmacs, igual que en el desenvolupament d'aplicacions nanotecnológiques i biotecnològiques. Aquesta Tesi es centra en determinades problemàtiques actuals i en les proteïnes involucrades en les mateixes (TryR, eEF1A2 i CBDP35), sent estes subjecte de desenvolupament biotecnològic en els camps de la biomedicina, farmàcia i de la indústria alimentària, en el que la cristal·lografia de raig X juga un paper crucial per a dilucidar les seues estructures atòmiques i funcions. En consideració a la biomedicina i disseny de fàrmacs, hem resolt l'estructura de la Tripanotión reductasa (TryR) de Leishmania infantum en complex amb potents inhibidors de la seua activitat oxidorreductasa, amb potencial de desenrotllament com a fàrmacs. Així, s'ha caracteritzat la unió i mecanisme d'acció d'estos inhibidors. TryR és una reconeguda diana farmacològica per al tractament de la malaltia de Chagas, la Tripanosomiasi Humana Africana i la leishmaniosi, ja que exerceix un paper crucial i essencial en el metabolisme redox dels paràsits de la família Trypanosomatidae. A més, s'han analitzat els paràmetres de cristal·lització i difracció de nous inhibidors de la dimerizació de TryR, el disseny racional dels quals es basa en la unió a la interfície de dimerización de la mateixa. L'oncoproteína eEF1A2, involucrada en múltiples funcions cel·lulars i subjecte de nombroses modificacions posttraduccionals, s'unieix al fàrmac anticancerigen plitidepsina. La cristal·lografia de raig X, combinada amb experiments d'espectrometria de masses, s'han utilitzat com a ferramentes per a identificar noves modificacions posttraduccionals i característiques estructurals en eEF1A2:GDP. Una modificació única, l'addició d'etanolamina fosfoglicerol (EPG) a aminoàcids conservats (Glu301 i Glu374 en mamífers), s'ha observat ací per primera vegada. L'anàlisi estructural d'estes troballes facilita la comprensió de les múltiples funcions i regulacions d'eEF1A2. L'adquisició d'una mostra conformacionalmente homogènia d'eEF1A2:GTP, necessària per a la unió a la plitidepsina, ha sigut avaluada en assajos de cristal·lització del complex terciari d'eEF1A2: GTP: plitidepsina. Respecte al domini d'unió a la paret cel·lular de l'endolisina PlyP35 codificada pel fago P35 de Listeria monocytogenes (CBDP35), hem resolt l'estructura cristal·lina de CBDP35 en un complex amb àcid teicoico natural de L. monocytogenes serovar 1/2a. Esta estructura és el primer mòdul d'unió a la paret cel·lular en complex amb àcids teicoicos mai dilucidat. L'anàlisi estructural va revelar els principals determinants per a la unió de la paret cel·lular bacteriana, en particular, el mecanisme molecular del reconeixement de N-acetil-d-glucosamina, una decoració de caràcter glicosídico en àcids teicoicos de serovares patògens de L. monocytogenes. Estes troballes fan llum sobre el desenrotllament biotecnològic de noves ferramentes en la indústria alimentària i les teràpies derivades de fagos per a detectar i tractar infeccions bacterianes. / [EN] X-ray crystallography is a powerful technique for atomic structure resolution of macromolecules. The information generated impacts different fields involving basic and applied research on biomedicine and drug design and the development of nanotechnology and biotechnological applications. This dissertation focuses on current problematics and the target proteins involved (TryR, eEF1A2 and CBDP35) that are in sight for biotechnological development in the biomedical, pharmaceutical and food industry fields, in which X-ray crystallography plays a crucial role in the elucidation of their atomic structures and functions. Attaining to biomedical and drug design problematics, we have solved the structure of Leishmania infantum TryR in complex with potent oxidoreductase inhibitors prone to further development as anti-trypanosomal drugs, thereby characterizing their binding and mechanism of action. This protein is a long recognized drug target for the treatment of Chagas disease, Human African Trypanosomiasis and leishmaniasis, as it plays a crucial and essential role in the redox-metabolism of the Trypanosomatidae parasites. Moreover, the crystallization and diffraction parameters of novel TryR dimerization disruptors have been assayed for inhibitors which have been rationally designed to bind the dimerization interface of TryR. The "moonlighting" oncoprotein eEF1A2 is known to be highly post-translationally modified and to bind the anticancer drug plitidepsin. X-ray crystallography, combined with mass-spectrometry experiments, have been used as tools to identify novel post-translational modifications and structural features in eEF1A2:GDP. A unique modification, namely the addition of ethanolamine phosphoglycerol (EPG) to conserved glutamic residues (Glu301 and Glu374 in mammals), has been here observed for the first time. Structural analysis of these findings facilitate the understanding of eEF1A2's multiple functions and regulations. The acquirement of a conformationally homogenous eEF1A2:GTP sample, necessary for plitidepsin binding, has been has been assayed for eEF1A2:GTP:plitidepsin complex crystallization. Regarding the cell wall binding domain of Listeria monocytogenes phage-encoded endolysin PlyP35 (CBDP35), we have solved the crystal structure of CBDP35 in complex with natural Listeria serovar 1/2a teichoic acid. This structure is the first cell wall binding module in complex with teichoic acids ever elucidated. Structural analysis revealed the main determinants for bacterial cell-wall binding, in particular, the molecular mechanism of N-acetyl-d-glucosamine recognition, a glycosidic moiety in teichoic acids of pathogenic serovars of L. monocytogenes. These findings shed light upon the biotechnological development of new tools in the food industry and phage-derived therapies to detect and treat bacterial infections. / Agradecer al Ministerio de Educación, Cultura y Deporte por haberme proporcionado el contrato FPU (FPU14/03190) que me ha permitido desarrollar esta Tesis Doctoral en el Instituto de Química-Física “Rocasolano” del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IQFR-CSIC), así como la financiación otorgada para poder realizar mi estancia predoctoral en el laboratorio del Prof. Hammershmidt, en Greifswald, Alemania (EST17/00751). / Carriles Linares, AÁ. (2019). STRUCTURAL BIOMEDICINE: CHARACTERIZATION OF THE STRUCTURAL BASIS IN PROTEIN-DRUG RECOGNITION IN DIFFERENT HUMAN DISEASES [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/130844

Asiatic cholera has been called the scourge of the nineteenth century, for it caused the untimely death of millions throughout the world. During its four visits to the United States, unknown thousands of Kentuckians fell victims to the disease. In attempting to prevent the dreaded scourge, Kentuckians became more conscious of the need for cleaner cities, pure water and adequate sewage disposal. Modern waterworks facilities, sewage treatment and disposal facilities have provided the means by which the United States has conquered this scourge of the nineteenth century, for with these facilities cholera is the easiest of all communicable diseases to prevent. But, as with the eradication of any disease, constant vigilance and continued use of modern scientific knowledge are necessary to prevent its return. The disease is presently ravaging India and the Far East, and with modern jet travel it could bypass quarantine stations and enter the United States undetected. The “seeds” of the pestilence could be sown across the nation within a few hours. The only safeguard is modern sanitation facilities, for no permanent inoculation or miraculous cure has been developed. Today many rural areas of Kentucky and other states use wells and old cisterns that are, or could easily become, contaminated by human fecal matter. A fifth visit from cholera should not be necessary to correct the ignorance and complacent attitudes concerning inadequate sanitation facilities that exist in these areas of the nation. This study attempts to show the horrors of cholera’s four visits to Kentucky, and how the fear of the disease stimulated interest in public health.

Introdução: As endoftalmites infecciosas apresentam prognóstico visual reservado, sendo essencial o diagnóstico rápido assegurando tratamento imediato. O diagnóstico etiológico precoce pode ser importante para adequação do antibiótico e definir a melhor conduta. A cultura de amostra de humor vítreo para isolamento e identificação do agente etiológico apresenta como principal desvantagem o tempo necessário de alguns dias para um resultado definitivo. Desta forma, a busca por técnicas que proporcionem a identificação rápida e precisa se faz necessária. Objetivos: avaliar a análise direta do humor vítreo, inoculado em frasco de hemocultura infantil, de pacientes com endoftalmite infecciosa utilizando a espectrometria de massas (EM) por ionização e dessorção a laser assistida por matriz por tempo de voo (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI-TOF); comparar os resultados obtidos com o método convencional de cultura; analisar as características clínicas de acordo com os agentes etiológicos detectados; analisar os fatores que podem influenciar a positividade na identificação do agente etiológico. Métodos: estudo prospectivo, observacional com análise de amostras de humor vítreo, não diluído e diluído, de 96 pacientes com suspeita de endoftalmite infecciosa (critério de inclusão) diagnosticados no período entre outubro de 2015 e junho de 2017. O material foi inoculado em frasco de hemocultura e analisado pela cultura convencional e pela análise direta do humor vítreo pela EM MALDI-TOF. O tempo de identificação (turnaround time, TAT) pelos dois métodos foi comparado (teste de Wilcoxon pareado). Prognóstico visual após 3 meses do diagnóstico foi avaliado conforme o agente identificado. As variáveis avaliadas quanto à amostra foram: uso de antibiótico intravítreo prévio, amostra diluída ou não, obtida por biópsia vitrea ou por vitrectomia via pars plana e obtida do 1º ou 2º procedimento. Resultados: Dos 96 pacientes avaliados, foram excluídos dois casos por contaminação da amostra e sete casos por não preencherem os critérios de inclusão. Dentre os 87 pacientes incluídos, a cultura foi positiva em 60,9% (53 pacientes), sendo isoladas bactérias Gram-positivas em 46 casos (86,7%) e bactérias Gram-negativas em seis casos (11,3%); dois casos com cultura polimicrobiana. Não foi identificada nenhuma bactéria anaeróbia. Em três casos foram identificados Candida albicans. A mediana do TAT do agente etiológico foi 50,6 horas (variação entre 18,5 e 187,50 horas) e de 15 horas (variação entre 3,1 e 94,0 horas) pela cultura convencional e com EM MALDI-TOF, respectivamente (p < 0,001). A concordância da análise direta do frasco de hemocultura infantil com EM MALDI-TOF em relação à cultura convencional foi 81,1%, sendo 80,4% para bactérias Gram-positivas e 100% para bactérias Gram-negativas. Não houve significância na análise dos fatores que podem interferir nos resultados: uso de antibiótico ou não (positividade de 42,8% vs 64,3%, p=0,131); amostra de humor vítreo diluído ou não (TAT de 18,05 horas vs 17,03 horas, p=0,126); biópsia vítrea em relação à vitrectomia (positividade 93,1% vs 100%, p=0,531). Os agentes mais prevalentes foram Staphylococcus epidermidis (n=15; 28,3%), Streptococcus pneumoniae (n=9; 17%) e Staphylococcus aureus (n=6; 11,3%). Dentre os casos por Staphylococcus epidermidis, 60% e 86,7% apresentaram, no 3º mês pós-tratamento, acuidade visual melhor ou igual que 20/60 e 20/200, respectivamente. Nos demais casos, apenas 12,1% tiveram acuidade visual melhor ou igual a 20/200. Observou-se resistência a ciprofloxacino (93% a 100%), moxifloxacino (93% a 100%) e oxacilina (50% a 79%) pelos Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus. Conclusão: O presente estudo aplicou a análise direta pela EM MALDI-TOF em amostras de humor vítreo inoculadas em frasco de hemocultura e demonstrou uma redução mediana de 67,6% no tempo para identificação do agente etiológico em relação ao método de cultura convencional. Este método mostrou-se viável na rotina de um laboratório de microbiologia. Observou-se que os casos de endoftalmite por Staphylococcus epidermidis apresentaram melhor prognóstico visual em relação aos outros agentes. Possíveis fatores que possam interferir na positividade das análises não foram significativos / Introduction: Infectious endophthalmitis presents a limited visual prognosis; rapid diagnosis is essential to assure prompt treatment. The early etiological diagnosis may be important to guide antibiotic therapy and to adjust treatment. The main disadvantage of using culture of vitreous humor for isolation and identification of the etiological agent is the required time of a few days for definitive results. Thus, the search for techniques that provide fast and accurate identification becomes necessary. Objectives: To evaluate direct analysis of vitreous humor in pediatric blood culture bottle of patients with infectious endophthalmitis using mass spectrometry (MS) with matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI-TOF); to compare the results obtained with the conventional culture method; to analyze the clinical characteristics according to the detected etiological agents; to analyze the factors that may influence positive identification of the etiologic agent. Methods: A prospective, observational study with undiluted and diluted vitreous humor samples of 96 patients with suspected infectious endophthalmitis (inclusion criterion), diagnosed from October 2015 to June 2017. The material was inoculated in a blood culture bottle and analyzed by conventional culture and by direct analysis of the vitreous humor by MALDI-TOF MS. The identification time (turnaround time, TAT) of the two methods was compared (Wilcoxon paired test). Visual prognosis three months after the diagnosis was assessed according to the identified agent. The variables evaluated in the sample were: the use of previous intravitreal antibiotics, diluted or not, obtained by vitreous biopsy or pars plana vitrectomy and obtained from the 1st or 2nd procedure. Results: Of the 96 patients evaluated, two cases were excluded due to contamination of the sample, while seven cases did not meet the inclusion criteria. Among the 87 patients that were included, the culture was positive in 60.9% (53 patients); Gram-positive bacteria were isolated in 46 cases (86.7%) and Gram-negative bacteria in six cases (11.3%); in two cases there was polymicrobial culture. No anaerobic bacteria were identified. In three cases Candida albicans were identified. The median TAT of the etiological agent was 50.6 hours (ranging from 18.5 to 187.50 hours), and 15 hours (ranging from 3.1 to 94.0 hours) in the conventional culture and with MALDI-TOF MS, respectively (p < 0.001). The agreement of results from direct analysis with MALDI-TOF MS in relation to the conventional culture was 81.1%, being 80.4% for Gram-positive bacteria and 100% for Gram-negative bacteria. There was no significance in the analysis of the factors that may interfere with the results: the use of antibiotic or not (positivity of 42.8% vs 64.3%, p = 0.131); diluted or non-diluted vitreous humor sample (TAT of 18.05 hours vs 17.03 hours, p = 0.126); vitreous biopsy in relation to vitrectomy (positivity 93.1% vs 100%, p = 0.531). The most prevalent agents were Staphylococcus epidermidis (n = 15; 28.3%), Streptococcus pneumoniae (n = 9; 17%) and Staphylococcus aureus (n = 6; 11.3%). Among the cases due to Staphylococcus epidermidis, 60% and 86.7% showed visual acuity better than or equal to 20/60 and 20/200, respectively, in the 3rd month after treatment. In other cases, only 12.1% had visual acuity better than or equal to 20/200. Resistance to ciprofloxacin (93 to 100%), moxifloxacin (93 to 100%) and oxacillin (50 to 79%) by Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus was observed. Conclusion: The present study applied direct analysis by MALDI-TOF MS in vitreous humor samples inoculated in a blood culture bottle, and it showed a median reduction of 67.6% in time to identify the etiological agent in relation to the conventional culture method. This method proved to be feasible in the routine of a microbiology laboratory. It was observed that cases of endophthalmitis caused by Staphylococcus epidermidis had a better visual prognosis than other ones individually. Possible factors that could interfere in the positivity of the analyses were not significant

Estudos em nosso laboratório caracterizaram camundongos B10.A como susceptíveis e camundongos A/J como resistentes à infecção pulmonar pelo P. brasiliensis. Para investigar o papel das células PMN na paracoccidioidomicose (PCM) pulmonar, camundongos B10.A e A/J foram depletados destas células através da inoculação in vivo por via intraperitoneal (i.p.) do anticorpo monoclonal anti-células PMN e infectados pela via intratraqueal (i.t.) com um milhão de leveduras viáveis. Camundongos-controle receberam doses equivalentes de IgG normal de rato. A depleção de granulócitos diminuiu o tempo de sobrevida dos animais B10.A, mas não dos animais A/J. Quando comparados com os animais não depletados, camundongos resistentes apresentaram aumento da carga fúngica no pulmão somente no dia 7 pós-infecção. Ao contrário, camundongos susceptíveis depletados de PMN apresentaram números mais elevados de células leveduriformes no pulmão, fígado e baço nos dias 7, 15, 30 e 120 pós-infecção, com relação aos seus grupos-controle tratados com IgG. A depleção dos granulócitos, entretanto, não alterou as reações de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) desenvolvidas por ambas as linhagens de animais. Considerando a resposta imune humoral, a depleção de células PMN levou à maior produção de anticorpos específicos em animais B10.A (Ig Total, IgG1, IgA e IgG3) e em animais A/J (Ig Total, IgG2a, IgG2b e IgG3). A depleção também alterou o padrão de citocinas pulmonares. Nos animais B10.A-tratados foram encontradas concentrações mais elevadas de IL-12 aos 15 dias e de IL-4 aos 120 dias pós-infecção, em comparação aos animais controle. Níveis de IL-12 significativamente mais altos foram detectados no grupo de animais A/J-depletados aos 7 e 120 dias e o IFN-&#947; foi detectado em níveis mais elevados em todo o curso da doença. Então, a depleção de PMN induz níveis mais altos de anticorpos e um ambiente mais pró-inflamatório no local da infecção. De acordo com esses dados, pudemos verificar que os neutrófilos são células importantes na defesa do hospedeiro à infecção pelo P.brasiliensis. Entretanto, o efeito protetor desta população celular depende do patrimônio genético do hospedeiro e é mais marcante na linhagem susceptível de camundongos. Neste trabalho também investigamos o efeito da depleção in vivo de leucócitos PMN na imunidade adquirida e protetora desenvolvida pela pré-imunização de animais B10.A. Assim, os camundongos foram previamente imunizados pela via s.c., depletados ou não de células PMN e desafiados i.t. com 1 milhão de células leveduriformes. Não foram detectadas diferenças significativas na contagem de fungos viáveis do pulmão, fígado e baço, entre os grupos imunizados tratados ou não com o AcM anti-PMN. A depleção não alterou a produção de anticorpos específicos, porém aumentou significativamente a síntese de IL-3, bem como a reatividade de HTT. Portanto, nossos resultados mostraram que, diferentemente da imunidade natural, os leucócitos PMN não exercem um papel protetor na fase adquirida da resposta imune à infecção com o P.brasiliensis. / Previous studies in our laboratory defined susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice to pulmonary P.brasiliensis infection. To investigate the role of PMN cells in pulmonary PCM, resistant and susceptible mice were depleted in vivo of these cells by intraperitoneal (i.p.) injection of a granulocyte-depleting monoclonal antibody and infected intratracheally (i.t) with one million yeast cells. Control mice received equivalent doses of normal rat IgG. PMN depletion decreased survival times of B10.A, but not of A/J infected mice. When compared with the non-depleted counterparts, resistant mice presented increased fungal loads in the lung only at day 7 after infection. On the contrary, PMN-depleted susceptible mice presented higher number of yeast cells in the lung, liver and spleen at days 7, 15, 30 and 120 after infection than their IgG-treated controls. PMN cells depletion, however, did not alter the DTH reaction developed by both mouse strains. Regarding humoral immune response, PMN cells depletion caused increased production of specific antibodies in B10.A (Total Ig, IgG1, IgA and IgG3) and A/J (Total Ig, IgG2a, IgG2b and IgG3) mice. Levels of pulmonary cytokines were also altered after PMN depletion. B10.A-treated mice presented increased levels of IL-12 and IL-4 at days 15 and 120 post-infection, respective/y. In A/J-depleted mice, augmented levels of IL-12 were detected at days 7 and 120 after infection; IFN-&#947;, however, was produced in higher levels during whole course of infection. Thus, PMN depletion induces higher levels of specific antibodies and enhanced pro-inflammatory milieu at the site of infection. As a whole, our data on PMN depletion at the onset of infection showed that neutrophils are important cells in host defense to P.brasiliensis infection. However, the effect of PMN depletion depends on the genetic background of the host and has a more pronounced effect in the susceptible strain of mice. We have also assessed the effect of in vivo depletion of the leukocytes on the acquired phase of immunity developed by B10.A mice previously immunized by the subcutaneous (s.c.) route were depleted or not of PMN cells and challenged i.t. with one million yeast cells. No differences were detected in the CFU counts in the lung, liver and spleen between untreated and PMN depleted vaccinated mice. PMN depletion also did not alter the production of specific antibodies but enhanced IL-3 synthesis as well as DTH reactivity. In conclusion, our results showed that, differently from natural immunity, PMN cells do not play a protective role in the acquired phase of immune response to P.brasiliensis infection.

INTRODUÇÃO: Os hepatócitos apresentam papel potencial em iniciar e amplificar a resposta inflamatória aguda no fígado, através da liberação de citocinas pró-inflamatórias, em papel complementar ao exercido pelas células de Kupffer e endoteliais. A invasão bacteriana da célula hepática é um estímulo para que o hepatócito produza citocinas como o TNF-alfa, capaz de induzir sua própria morte por apoptose. O TNF-alfa pode ser tanto um agente citotóxico (induzindo a morte celular), quanto um agente protetor (através da ativação de NF-kB). A morte por apoptose do hepatócito libertaria as bactérias que seriam destruídas pelo sistema imunológico hepático ativado. Salmonella Typhimurium (ST) e Listeria monocytogenes (LM) são patógenos responsáveis por importantes doenças de origem alimentar. O hepatócito é o maior local de replicação bacteriana no fígado. As conseqüências da invasão bacteriana dos hepatócitos e sua repercussão na produção de TNF-alfa e na morte celular necessitam ser melhor xxix avaliadas. MÉTODOS: Nesse estudo procuramos investigar o comportamento dos hepatócitos invadidos por ST e LM sorogrupos 4a, 4b e 1/2a, analisando os seguintes parâmetros: a) morfologia = por microscopia óptica (MO) (hematoxilina e eosina) e por microscopia eletrônica (ME); b) dosagem do TNF-alfa liberado pelos hepatócitos invadidos = o TNF-alfa liberado foi detectado por técnica ELISA no sobrenadante das culturas; c) pesquisa da morte celular por apoptose = avaliada através das técnicas TUNEL e anexina (citometria de fluxo). Para todos os parâmetros foi realizada análise comparativa estatística entre os quatro tipos de bactéria. RESULTADOS: As monocamadas de hepatócitos agredidas por Listeria monocytogenes e Salmonella Typhimurium apresentam ruptura em sua distribuição, e sinais de desorganização citoplasmática e nuclear. Para as bactérias ST, LM 4a, LM 4b e LM 1/2a obtivemos os seguintes valores em seqüência: a) taxa de liberação de TNF-alfa (pg/mL): 146,9±18,38; 94,71±13,89; 94,52±15,66 e 58,16±15,49; b) capacidade de produção de TNF-alfa (pg/mL): -67,20±71,56; -46,49±54,10; -106,3±61,0 e 58,16±15,49; c) taxa de apoptose avaliada por TUNEL em unidade de área (UA): 23,86±1,614; 15,92±0,9343; 21,14±1,421 e 23,93±1,263; d) capacidades de produção de apoptose por TUNEL em UA: -50,67±12,42; 10,81±7,186; - 17,22±10,93 e -40,27±9,712; e) taxas de apoptose por anexina em UA: 12,51±2,052; 23,10±3,481; 26,61±3,414 e 18,57±2,497; f) capacidades de produção de apoptose por anexina em UA: -63,31±15,79; -126,4±26,78; - 142,0±26,26 e -97,75±19,21. CONCLUSÕES: a) ocorre liberação de TNFxxx alfa pelos hepatócitos invadidos, sendo que a Salmonella Typhimurium foi responsável pela maior taxa de liberação de TNF-alfa, e Listeria monocytogenes 4b pela maior capacidade de produção de TNF-alfa; b) ocorre morte por apoptose dos hepatócitos invadidos por bactérias, avaliada através da técnica TUNEL, sendo que Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes 1/2a foram responsáveis pelas maiores taxas e capacidades de produção de apoptose; c) ocorre morte dos hepatócitos invadidos por apoptose, avaliada através da técnica da anexina, sendo que Listeria monocytogenes 4b foi responsável pelas maiores taxas e capacidades de produção de apoptose; d) os hepatócitos cultivados invadidos pelas bactérias Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes apresentam alterações morfológicas, com ruptura da distribuição da monocamada, e sinais de desorganização citoplasmática e nuclear / INTRODUCTION: Hepatocytes can play an important role in the initiation or amplification of the hepatic acute inflammatory response, through the release of proinflammatory cytokines. The bacterial invasion of hepatocyte is a stimulus for production of TNF-alpha by these cells, and this phenomenon induces its own death by apoptosis. TNF-alpha is as a cytotoxic agent (inducing cellular death), as a protector agent (through NF-kB activation). The hepatocyte death by apoptosis may release intracellular bacteria that would be destroyed by hepatic immunological system. Salmonella Typhimurium (ST) and Listeria monocytogenes (LM) are important foodborne pathogens. The hepatocyte is the major site of bacterial replication in the liver. The consequences of hepatocytes bacterial invasion must be better evaluated. METHODS: In the present work we show the behavior of hepatocytes invaded by ST and LM serotypes 4a, 4b and 1/2a, through: a) morphology = by optic microscopy (OM) (hematoxylin-eosin staining) and electronic microscopy (EM); b) quantification of TNF-alpha released by hepatocytes = TNF-alpha released was determined by ELISA in culture supernatants; c) evaluation of apoptotic cell death by TUNEL and annexin techniques (flow cytometry). For all parameters were made a statistical comparative analysis among the four types of bacteria. RESULTS: The hepatocytes monolayers invaded by LM and ST presented ruptures in your organization, and signs of nuclear and cytoplasmic disorder. For the bacteria ST, LM 4a, LM 4b and LM 1/2a we obtained the following values respectively: a) rate of TNF-alpha released (pg/mL): 146,9±18,38; 94,71±13,89; 94,52±15,66 and 58,16±15,49; b) capacities of TNF-alpha production (pg/mL): -67,20±71,56; -46,49±54,10; -106,3±61,0 and 58,16±15,49; c) rate of apoptosis by TUNEL in unit of area (UA): 23,86±1,614; 15,92±0,9343; 21,14±1,421 and 23,93±1,263; d) capacities of apoptosis production by TUNEL in UA: -50,67±12,42; 10,81±7,186; - 17,22±10,93 and -40,27±9,712; e) rate of apoptosis by annexin in UA: 12,51±2,052; 23,10±3,481; 26,61±3,414 and 18,57±2,497; f) capacities of apoptosis production by annexin in UA: -63,31±15,79; -126,4±26,78; - 142,0±26,26 and -97,75±19,21. CONCLUSIONS: a) ST was responsible for the major rate of TNF-alpha released and LM 4b was responsible for the major capacity of TNF-alpha production; b) ST and LM 1/2a caused the major rates and capacities of apoptosis,production, evaluated by TUNEL technique; c) LM 4b was responsible for the major rates and capacities of apoptosis production, evaluated by annexin technique; d) the cultured hepatocytes invaded by bacteria ST and LM presented morphological alterations, with monolayer rupture, and signs of nuclear and cytoplasmic disorder

Infecção do Trato Urinário (ITU) é o segundo tipo de infecção bacteriana mais comum em crianças. Nesse estudo amostras de urina de 6012 pacientes pediátricos foram analisadas, a prevalência de ITU foi determinada, os uropatógenos foram identificados e o perfil antimicrobiano dos mesmos foi determinado. Os resultados mostraram que a prevalência de ITU varia de acordo com o sexo e a idade do paciente. Bactérias Gram-negativas foram responsáveis por 89 % de todos os casos de ITU e Escherichia coli foi a espécie mais prevalente. Os uropatógenos foram resistentes a ampicilina 63 %, a nitrofurantoina 37 % e ao trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. Todavia, 99 % deles foram sensíveis a cefalexina e 96 % ao cloranfenicol. Resultados obtidos com a caracterização de 90 isolados de E. coli, mostraram que todas as amostras foram positivas para os marcadores fimA e fimH, 53 % para pap, 32 % para sfa, 10 % para o marcador genético da toxina pic e 29 % foram capazes de produzir hemolisina-a. Esses isolados se distribuíram entre os grupos filogenéticos da seguinte maneira: B2 42 %, D 25 %, A 21 % e B1 11 %. Dessas amostras 19 % não foram tipáveis (ONT), 15,56 % pertenceram ao sorogrupo O2 e 12,22 % aos sorogrupos O6 e OR. A maioria dos isolados de E. coli aderiu às células epiteliais, poliestireno e PVC. / Urinary Tract Infection (UTI) is the second most common type of bacterial infection in children. In this study, 6012 urine samples from pediatric patients were analyzed, the prevalence of UTI was determined, the uropathogens were identified and their antimicrobial profile was determined. The results have shown that the prevalence of UTI varies according to the sex and age of the patient. Gram negative bacteria were responsible for 89 % of all cases of UTI and E. coli was the most prevalent species. The uropathogens were resistant to: ampicillin 63 %, nitrofurantoin 37 % and trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. However, 99 % of them were sensitive to cephalexin and 96 % to chloramphenicol. Results obtained with the characterization of 90 isolates of E. coli showed that all of them were positive for fimA and fimH, 53 % were positive for pap, 32 % were positive for sfa, 10 % were positive for the genetic marker of pic and 29 % were able to produce hemolysin-a. These isolates were distributed between the phylogenetic groups as follows: B2 42 %, D 25 %, A 21 % and B1 11 %. Nineteen percent of these samples were untypeable (ONT), 15.56 % belonged to O2 serogroup and 12,22 % belonged to the O6 and OR serogroups. Most E. coli isolates were able to adhere to epithelial cells, polystyrene and PVC.

Estudos em nosso laboratório caracterizaram camundongos B10.A como susceptíveis e camundongos A/J como resistentes à infecção pulmonar pelo P. brasiliensis. Para investigar o papel das células PMN na paracoccidioidomicose (PCM) pulmonar, camundongos B10.A e A/J foram depletados destas células através da inoculação in vivo por via intraperitoneal (i.p.) do anticorpo monoclonal anti-células PMN e infectados pela via intratraqueal (i.t.) com um milhão de leveduras viáveis. Camundongos-controle receberam doses equivalentes de IgG normal de rato. A depleção de granulócitos diminuiu o tempo de sobrevida dos animais B10.A, mas não dos animais A/J. Quando comparados com os animais não depletados, camundongos resistentes apresentaram aumento da carga fúngica no pulmão somente no dia 7 pós-infecção. Ao contrário, camundongos susceptíveis depletados de PMN apresentaram números mais elevados de células leveduriformes no pulmão, fígado e baço nos dias 7, 15, 30 e 120 pós-infecção, com relação aos seus grupos-controle tratados com IgG. A depleção dos granulócitos, entretanto, não alterou as reações de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) desenvolvidas por ambas as linhagens de animais. Considerando a resposta imune humoral, a depleção de células PMN levou à maior produção de anticorpos específicos em animais B10.A (Ig Total, IgG1, IgA e IgG3) e em animais A/J (Ig Total, IgG2a, IgG2b e IgG3). A depleção também alterou o padrão de citocinas pulmonares. Nos animais B10.A-tratados foram encontradas concentrações mais elevadas de IL-12 aos 15 dias e de IL-4 aos 120 dias pós-infecção, em comparação aos animais controle. Níveis de IL-12 significativamente mais altos foram detectados no grupo de animais A/J-depletados aos 7 e 120 dias e o IFN-&#947; foi detectado em níveis mais elevados em todo o curso da doença. Então, a depleção de PMN induz níveis mais altos de anticorpos e um ambiente mais pró-inflamatório no local da infecção. De acordo com esses dados, pudemos verificar que os neutrófilos são células importantes na defesa do hospedeiro à infecção pelo P.brasiliensis. Entretanto, o efeito protetor desta população celular depende do patrimônio genético do hospedeiro e é mais marcante na linhagem susceptível de camundongos. Neste trabalho também investigamos o efeito da depleção in vivo de leucócitos PMN na imunidade adquirida e protetora desenvolvida pela pré-imunização de animais B10.A. Assim, os camundongos foram previamente imunizados pela via s.c., depletados ou não de células PMN e desafiados i.t. com 1 milhão de células leveduriformes. Não foram detectadas diferenças significativas na contagem de fungos viáveis do pulmão, fígado e baço, entre os grupos imunizados tratados ou não com o AcM anti-PMN. A depleção não alterou a produção de anticorpos específicos, porém aumentou significativamente a síntese de IL-3, bem como a reatividade de HTT. Portanto, nossos resultados mostraram que, diferentemente da imunidade natural, os leucócitos PMN não exercem um papel protetor na fase adquirida da resposta imune à infecção com o P.brasiliensis. / Previous studies in our laboratory defined susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice to pulmonary P.brasiliensis infection. To investigate the role of PMN cells in pulmonary PCM, resistant and susceptible mice were depleted in vivo of these cells by intraperitoneal (i.p.) injection of a granulocyte-depleting monoclonal antibody and infected intratracheally (i.t) with one million yeast cells. Control mice received equivalent doses of normal rat IgG. PMN depletion decreased survival times of B10.A, but not of A/J infected mice. When compared with the non-depleted counterparts, resistant mice presented increased fungal loads in the lung only at day 7 after infection. On the contrary, PMN-depleted susceptible mice presented higher number of yeast cells in the lung, liver and spleen at days 7, 15, 30 and 120 after infection than their IgG-treated controls. PMN cells depletion, however, did not alter the DTH reaction developed by both mouse strains. Regarding humoral immune response, PMN cells depletion caused increased production of specific antibodies in B10.A (Total Ig, IgG1, IgA and IgG3) and A/J (Total Ig, IgG2a, IgG2b and IgG3) mice. Levels of pulmonary cytokines were also altered after PMN depletion. B10.A-treated mice presented increased levels of IL-12 and IL-4 at days 15 and 120 post-infection, respective/y. In A/J-depleted mice, augmented levels of IL-12 were detected at days 7 and 120 after infection; IFN-&#947;, however, was produced in higher levels during whole course of infection. Thus, PMN depletion induces higher levels of specific antibodies and enhanced pro-inflammatory milieu at the site of infection. As a whole, our data on PMN depletion at the onset of infection showed that neutrophils are important cells in host defense to P.brasiliensis infection. However, the effect of PMN depletion depends on the genetic background of the host and has a more pronounced effect in the susceptible strain of mice. We have also assessed the effect of in vivo depletion of the leukocytes on the acquired phase of immunity developed by B10.A mice previously immunized by the subcutaneous (s.c.) route were depleted or not of PMN cells and challenged i.t. with one million yeast cells. No differences were detected in the CFU counts in the lung, liver and spleen between untreated and PMN depleted vaccinated mice. PMN depletion also did not alter the production of specific antibodies but enhanced IL-3 synthesis as well as DTH reactivity. In conclusion, our results showed that, differently from natural immunity, PMN cells do not play a protective role in the acquired phase of immune response to P.brasiliensis infection.

<p>Uvod: Antimikrobna rezistencija bakterija predstavlja globalni problem. Najvažniji faktor za njen nastanak je neadekvatna primena antibiotika, koja podrazumeva: Upotrebu antibiotika bez odgovarajuće dijagnoze, neadekvatan izbor leka, dužinu<br />primene i doziranje. Zbog specifičnosti populacije vitalno ugroženih bolesnika u jedinicama intenzivne terapije (JIT) i bolničkih infekcija uzrokovanih multirezistentnim bakterijama, primena antibiotika je na ovim odeljenjima učestala. Pokazana je povezanost između razvoja antimikrobne rezistencije i veličine potro&scaron;nje antibiotika u JIT. Cilj: Analiza primene antibiotika prema indikacijama na Klinici za anesteziju i intenzivnu terapiju, KC Vojvodine, zatim analiza stanja antimikrobne rezistencije<br />najče&scaron;ćih uzročnika bolničkih infekcija i analiza korelacije između navedenih uzročnika bolničkih infekcija i empirijski primenjivane antibiotske terapije na Klinici za anesteziju i intenzivnu terapiju. Materijal i metode: Prospektivna, opservaciona studija, sprovedena u jednogodi&scaron;njem period, u JIT, Klinike za anesteziju i intenzivnu terapiju, uključila je 856 ispitanika, oba pola, starijih od 18 godina kod kojih je tokom hospitalizacije u JIT bio primenjen antibiotik. Ispitanici su, radi prikupljanja podataka, bili podeljeni u dve grupe u zavisnosti od toga da li su imali bolničku infekciju ili ne. Adekvatnost primene antibiotika je analizirana prema indikacijama (hirur&scaron;ka profilaksa, bolničke infekcije, vanbolničke infekcije i drugo), a u odnosu na izbor antibiotika, dužinu primene, režim doziranja, veličinu pojedinačne doze i način promene terapije (prema preporukama farmakoterapijskog vodiča The Sanford guide to antimicrobial therapy i antimikrobnoj osetljivosti bakterijskih uzročnika bolničkih infekcija u JIT. Za izračunavanje potro&scaron;nje antibiotika u JIT kori&scaron;ćena je ATC/DDD metodologija. Podaci o antimikrobnoj osetljivosti dobijeni su iz rezultata mikrobiolo&scaron;ke obrade uzorkovanog materijala. Statistička analiza je izvr&scaron;ena pomoću statističkog paketa IBM SPSS 21 Statistics. Podaci su predstavljeni tabelarno i grafički, obrađeni su standardnim statističkim testovima, a statistička značajnost određivanja je bila na nivou p&lt; 0,05. Ispitivanje povezanosti između potro&scaron;nje anibiotika i antimikrobne rezistencije urađeno je primenom Pirsonovog koeficijenta korelacije. Rezultati: Izbor antibiotika kod bolesnika u JIT nije bio adekvatan u 52,19% preskripcija. Izbor empirijski indikovanih antibiotika za lečenje bolničkih infekcija nije bio u skladu antimikrobnom osetljivo&scaron;ću izolovanog uzročnika u 78,44% preskripcija. Izbor antibiotika za hirur&scaron;ku profilaksu nije bio adekvatan u 55,6% preskripcija. Antimikrobna rezistencija Acinetobacter spp.na karbapeneme, fluorohinolone i cefalosporine bila je preko 90%, na aminoglikozide preko 70%. Klebsiella pneumoniae bila je rezistentna na fluorohinolone i cefalosporine 80%, dok je na grupu karbapenema bila 18%. Pseudomonas aeruginosa je bio rezistentan na karbapeneme i aminoglikozide preko 50%, na antipseudomonasne cefalosporine preko 40%. Na kolistin nije zabeležena rezistencija ni jedne izolovane bakterijske vrste. Značajna pozitivna korelacija zabeležena je između potro&scaron;nje empirijski indikovanog meropenema i rezistencije Acinetobacter spp. Zaključak: U vise od 50% slučajeva primena antibiotika u JIT nije bila u skladu sa stanjem antimikrobne rezistencije bakterijskih uzročnika bolničkih infekcija i savremenim farmakoterapijskim protokolima. Antimikrobna rezistencija Acinetobacter spp, Klebsiellae pneumoniae и Pseudomonas aeruginosae je iznosila preko 20% na antibiotike preporučene savremenim farmakoterapijskim smernicama, osim u slučaju rezistencije Klebsiellaе pneumoniae na grupu karbapenema. Između pojave rezistencije Acinetobacter spp. i potro&scaron;nje empirijski indikovanog meropenema utvrđena je statistički značajna pozitivna povezanost, dok za druge dve navedene bakterijske vrste ova povezanost nije bila statistički značajna. Na osnovu podataka o najče&scaron;ćim bakterijskim uzročnicima i njihovoj antimikrobnoj osetljivosti za empirijsku<br />terapiju pneumonija mogao bi biti preporučen jedino kolistin, dok bi za lečenje urinarnih infekcija mogao biti preporučen imipenem ili meropenem. Potrebno je promeniti farmakoterapijski pristup u primeni antibiotika u JIT.</p> / <p>Uvod: Antimikrobna rezistencija bakterija predstavlja globalni problem. Najvažniji faktor za njen nastanak je neadekvatna primena antibiotika, koja podrazumeva: Upotrebu antibiotika bez odgovarajuće dijagnoze, neadekvatan izbor leka, dužinu<br />primene i doziranje. Zbog specifičnosti populacije vitalno ugroženih bolesnika u jedinicama intenzivne terapije (JIT) i bolničkih infekcija uzrokovanih multirezistentnim bakterijama, primena antibiotika je na ovim odeljenjima učestala. Pokazana je povezanost između razvoja antimikrobne rezistencije i veličine potro&scaron;nje antibiotika u JIT. Cilj: Analiza primene antibiotika prema indikacijama na Klinici za anesteziju i intenzivnu terapiju, KC Vojvodine, zatim analiza stanja antimikrobne rezistencije<br />najče&scaron;ćih uzročnika bolničkih infekcija i analiza korelacije između navedenih uzročnika bolničkih infekcija i empirijski primenjivane antibiotske terapije na Klinici za anesteziju i intenzivnu terapiju. Materijal i metode: Prospektivna, opservaciona studija, sprovedena u jednogodi&scaron;njem period, u JIT, Klinike za anesteziju i intenzivnu terapiju, uključila je 856 ispitanika, oba pola, starijih od 18 godina kod kojih je tokom hospitalizacije u JIT bio primenjen antibiotik. Ispitanici su, radi prikupljanja podataka, bili podeljeni u dve grupe u zavisnosti od toga da li su imali bolničku infekciju ili ne. Adekvatnost primene antibiotika je analizirana prema indikacijama (hirur&scaron;ka profilaksa, bolničke infekcije, vanbolničke infekcije i drugo), a u odnosu na izbor antibiotika, dužinu primene, režim doziranja, veličinu pojedinačne doze i način promene terapije (prema preporukama farmakoterapijskog vodiča The Sanford guide to antimicrobial therapy i antimikrobnoj osetljivosti bakterijskih uzročnika bolničkih infekcija u JIT. Za izračunavanje potro&scaron;nje antibiotika u JIT kori&scaron;ćena je ATC/DDD metodologija. Podaci o antimikrobnoj osetljivosti dobijeni su iz rezultata mikrobiolo&scaron;ke obrade uzorkovanog materijala. Statistička analiza je izvr&scaron;ena pomoću statističkog paketa IBM SPSS 21 Statistics. Podaci su predstavljeni tabelarno i grafički, obrađeni su standardnim statističkim testovima, a statistička značajnost određivanja je bila na nivou p&lt; 0,05. Ispitivanje povezanosti između potro&scaron;nje anibiotika i antimikrobne rezistencije urađeno je primenom Pirsonovog koeficijenta korelacije. Rezultati: Izbor antibiotika kod bolesnika u JIT nije bio adekvatan u 52,19% preskripcija. Izbor empirijski indikovanih antibiotika za lečenje bolničkih infekcija nije bio u skladu antimikrobnom osetljivo&scaron;ću izolovanog uzročnika u 78,44% preskripcija. Izbor antibiotika za hirur&scaron;ku profilaksu nije bio adekvatan u 55,6% preskripcija. Antimikrobna rezistencija Acinetobacter spp.na karbapeneme, fluorohinolone i cefalosporine bila je preko 90%, na aminoglikozide preko 70%. Klebsiella pneumoniae bila je rezistentna na fluorohinolone i cefalosporine 80%, dok je na grupu karbapenema bila 18%. Pseudomonas aeruginosa je bio rezistentan na karbapeneme i aminoglikozide preko 50%, na antipseudomonasne cefalosporine preko 40%. Na kolistin nije zabeležena rezistencija ni jedne izolovane bakterijske vrste. Značajna pozitivna korelacija zabeležena je između potro&scaron;nje empirijski indikovanog meropenema i rezistencije Acinetobacter spp. Zaključak: U vise od 50% slučajeva primena antibiotika u JIT nije bila u skladu sa stanjem antimikrobne rezistencije bakterijskih uzročnika bolničkih infekcija i savremenim farmakoterapijskim protokolima. Antimikrobna rezistencija Acinetobacter spp, Klebsiellae pneumoniae i Pseudomonas aeruginosae je iznosila preko 20% na antibiotike preporučene savremenim farmakoterapijskim smernicama, osim u slučaju rezistencije Klebsiellae pneumoniae na grupu karbapenema. Između pojave rezistencije Acinetobacter spp. i potro&scaron;nje empirijski indikovanog meropenema utvrđena je statistički značajna pozitivna povezanost, dok za druge dve navedene bakterijske vrste ova povezanost nije bila statistički značajna. Na osnovu podataka o najče&scaron;ćim bakterijskim uzročnicima i njihovoj antimikrobnoj osetljivosti za empirijsku<br />terapiju pneumonija mogao bi biti preporučen jedino kolistin, dok bi za lečenje urinarnih infekcija mogao biti preporučen imipenem ili meropenem. Potrebno je promeniti farmakoterapijski pristup u primeni antibiotika u JIT.</p> / <p>Introduction: Antimicrobial resistance is a global health problem.The most important factor in the development of antimicrobial resistance is inadequate use of antibiotics, which means: inadequate diagnosis of bacterial infection, inadequate antibiotic choice, dosage and duration of therapy. Specificities of critically ill patients and nosocomial infections caused by multidrug-resistant pathogens are important reasons for large antibiotic consumption in ICU settings. Many studies have confirmed a positive correlation between antibiotic use and antimicrobial resistance. Aims: The aims of this study were: to analyze the use of antibiotics at the ICU of the Clinic for anesthesia and intensive care at the Clinical Centre of Vojvodina, according to indications for antibiotic treatment; to analyze the pattern of antimicrobial resistance ofthe most common bacteria causing hospital acquired infections in our participants and to analyze the correlation between the consumption of empirically indicated antibiotics and antimicrobial resistance pattern. Methodology: Prospective observational study was conducted during a one-year period at the Clinic for anesthesia and intensive care, Clinical Centre of Vojvodina. The study included 856 participatns, aged over 18 years and of both genders. The participants were divided into two cohorts, depending on whether they showed symptoms of hospital-acquired infection or not. Adequacy of antibiotic use was analyzed with regard to indication for antibiotic treatment (surgical prophylaxis, treatment of hospital acquired infection, outpatient infection or other) and with regard to antibiotic choice, dosage and duration of treatment. An adequate antibiotic choice was compared to the resistance pattern of positive bacterial isolates as outlined by The Sanford guide to antimicrobial therapy). To calculate the consumption of antibiotics in ICU we used ATC/DDD methodology. Data on antibacterial sensitivity was obtained from the results of microbiological analysis of sample materials. IBM SPSS version 21 was used for statistical analysis, standard statistical tests were applied. The results were presented in tables and graphs. Statistically significant correlation was set at the value of p˂0.05. Pearson correlation coefficient was used to measure the strength between variables. Results: Antibiotic choice was inadequate in 52,19% of all antibiotic prescriptions for all indications. Antibiotic choice in surgical prophylaxis was inadequate in 55,59% of prescriptions for this indication. Inadequate choice of empirically indicated antibiotics (for treatment of hospital-acquired infections) according to antimicrobial resistance pattern occurred in 78,44% of all prescription for this indication. The three the most important bacterial causative agents of hospital acquired infections in ICU were: Acinetobacter spp, Klebsiella pneumonia and Pseudomonas aeruginosa. The resistance of Acinetobacter spp. to antibiotic groups was as follows: to carbapenems, fluoroquinolones and cephalosporins over 90% and to aminoglycosides over 70%. The antimicrobial resistance of Klebsiella pneumoniae was: to fluoroquinolones and cephalosporins over 80% and to carbapenems up to 20%. The resistance pattern of Pseudomonas aeruginosa was as follows: to carbapenems and aminoglykozides over 50%, and to antipseudomonal cephalosporins over 40%. Statistically significant correlation was found between the consumption of empirically prescribed meropenem and antimicrobial resistance of Acinetobacter spp. Conclusion:In more than 50% of antibiotic prescriptions at ICU, regardless of indication, the choice of prescribed antibiotics was inadequate. Antimicrobial resistance pattern of Acinetobacter spp, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa to antibiotics recomennded by contemporary guidelines for antimicrobial therapy was over 20%, except in the case of the resistance of Klebsiellae peneumoniae to carbapenems. Statistically significant correlation was found between the consumption of empirically prescribed meropenem and antimicrobial resistance of Acinetobacter spp. No statistically significant correlation was observed in the other two bacterial strains. Initial, empiric therapy for nosocomial pneumonia in our ICU, should be colistin, and for urinary tract infection imipenem or meropenem. It is important to change antibiotic prescribing praxis in ICU.</p>

INTRODUÇÃO: Lesão renal aguda (LRA) é uma complicação comum da cirrose frequentemente desencadeada por infecções bacterianas. A mortalidade de pacientes com cirrose e LRA varia de 10 a 100% a depender do estádio da cirrose, etiologia e progressão da LRA e tratamento recebido. Pacientes com LRA que progride possuem mortalidade intra-hospitalar consideravelmente maior do que aqueles que não progridem. Os critérios diagnósticos da LRA baseiam-se na creatinina sérica. Porém, esse biomarcador tem acurácia diagnóstica limitada, já que demora até 48 horas para se alterar e não distingue a etiologia da LRA. Essa última limitação é particularmente importante em pacientes com suspeita de síndrome hepatorrenal (SHR), já que o seu tratamento envolve o uso de medicações de alto custo (albumina e terlipressina) e eficácia limitada. O NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin) é um biomarcador de necrose dos túbulos renais e sua dosagem tem sido proposta como marcador diagnóstico mais acurado da LRA na cirrose, pois se altera mais precocemente e seus níveis urinários variam conforme a etiologia e gravidade da LRA. OBJETIVOS: Os objetivos primários do trabalho foram avaliar a acurácia do NGAL urinário para predizer: a) desenvolvimento ou progressão da LRA em pacientes com cirrose e infecção bacteriana; b) resposta ao tratamento combinado com albumina e terlipressina em pacientes com diagnóstico estabelecido de SHR. Os objetivos secundários foram: a) acurácia de marcadores de disfunção hemodinâmica em cirrose (atividade plasmática de renina e noradrenalina sérica) na predição do desenvolvimento ou progressão da LRA em pacientes com cirrose e infecção bacteriana; b) acurácia de marcadores de função hepática, parâmetros hemodinâmicos, marcadores inflamatórios e testes laboratoriais de lesão renal tradicionalmente utilizados na prática clínica na predição do desenvolvimento ou progressão da LRA em pacientes com cirrose e infecção bacteriana; c) acurácia de marcadores de disfunção hemodinâmica em cirrose (atividade plasmática de renina e noradrenalina sérica) na predição de resposta ao tratamento combinado com albumina e terlipressina em pacientes com diagnóstico estabelecido de SHR; d) acurácia de marcadores de função hepática, parâmetros hemodinâmicos, marcadores inflamatórios e testes laboratoriais de lesão renal tradicionalmente utilizados na prática clínica na predição de resposta ao tratamento combinado com albumina e terlipressina em pacientes com diagnóstico estabelecido de SHR; e) comparar o conceito tradicional de LRA em cirrose com a nova classificação ICA-AKI para predizer mortalidade intra-hospitalar, em 30 e 90 dias em pacientes com cirrose e infecção bacteriana; f) acurácia do NGAL para predizer mortalidade intra-hospitalar em pacientes com cirrose e infecção bacteriana. PACIENTES E MÉTODOS: Critérios de inclusão: a) cirrose; b) ascite e/ou hidrotórax hepático; c) idade maior que 18 anos; d) concordância em participar no estudo; e) LRA e/ou infecção bacteriana. Critérios de exclusão: a) comorbidades graves; b) choque; c) nefropatia intrínseca; d) uso de drogas nefrotóxicas; e) diálise prévia; f) transplante hepático. Foram coletadas amostras de urina para dosagem de NGAL e sangue para dosagem de atividade plasmática de renina e noradrenalina sérica no momento da inclusão do paciente no estudo. Os pacientes com SHR receberam o tratamento padrão atual com albumina e terlipressina. RESULTADOS: Foram incluídos 199 pacientes: 179 com infecção bacteriana para avaliação de desenvolvimento ou progressão da LRA e 58 com SHR para avaliação da resposta ao tratamento (38 pacientes foram avaliados nas duas partes do estudo). O NGAL urinário apresentou associação com a progressão da LRA (AUC: 0,67; p=0,002), mas não com o seu desenvolvimento (p=0,973). Outras variáveis associadas à progressão da LRA foram INR (p=0,033), MELD (p=0,012), FEUr (p=0,026) e relação proteinúria/creatinina urinária (p=0,023). Houve associação entre NGAL urinário e a resposta ao tratamento combinado com albumina e terlipressina em pacientes com SHR (AUC: 0,70; p=0,007). Outras variáveis associadas à resposta ao tratamento da SHR foram INR (p=0,028), MELD (p=0,004) e relação proteinúria/creatinina urinária (p=0,003). Combinando o MELD com o NGAL urinário foi possível identificar subgrupos de pacientes com taxas de resposta ao tratamento com albumina e terlipressina distintas (9,1% x 48,1% x 80,0%, p < 0,001). Tanto o conceito tradicional de LRA na cirrose quanto a classificação ICA-AKI foram capazes de predizer mortalidade intra-hospitalar, em 30 e 90 dias (p < 0,05). O NGAL urinário também foi capaz de predizer mortalidade intra-hospitalar (AUC: 0,71; p < 0,001). CONCLUSÕES: a) NGAL urinário aumentado foi associado à progressão da LRA em pacientes com cirrose e infecção bacteriana; b) atividade plasmática de renina e noradrenalina sérica não se correlacionaram ao desenvolvimento ou progressão da LRA em pacientes com cirrose e infecção bacteriana; c) NGAL urinário foi preditor de resposta ao tratamento combinado com albumina e terlipressina em pacientes com SHR; d) atividade plasmática de renina e noradrenalina sérica não se correlacionaram à resposta ao tratamento combinado com albumina e terlipressina em pacientes com SHR; e) tanto o conceito tradicional de LRA em cirrose quanto a classificação ICA-AKI mostraram-se adequados para predizer mortalidade intra-hospitalar, em 30 e 90 dias em pacientes com cirrose e infecção bacteriana; f) NGAL urinário aumentado foi associado à maior mortalidade intra-hospitalar em pacientes com cirrose e infecção bacteriana / INTRODUCTION: Acute kidney injury (AKI) is a frequent complication of cirrhosis, and is often triggered by bacterial infection. The mortality of patients with cirrhosis and AKI varies from 10 to 100%, depending on the stage of cirrhosis, etiology and progression of AKI, and treatment. Patients with AKI that progresses have a higher in-hospital mortality than those with AKI that does not progress. AKI diagnostic criteria are based on serum creatinine. However, this biomarker has limited diagnostic accuracy, taking up to 48 hours to rise, and does not distinguish the etiology of AKI. This latter limitation is particularly important in patients with suspected hepatorenal syndrome (HRS), because treatment involves high cost medication (albumin and terlipressin) with limited efficacy. NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin) is a biomarker of renal tubular necrosis which has been proposed as a more accurate AKI biomarker in cirrhosis because it rises earlier than creatinine and its urinary levels vary according to the etiology of AKI. OBJECTIVES: The primary endpoints were the establishment of the accuracy of urinary NGAL to predict: a) development or progression of AKI in patients with cirrhosis and bacterial infection; b) response to treatment with albumin and terlipressin in patients with diagnosed HRS. The secondary endpoints were: a) accuracy of biomarkers of hemodynamic dysfunction in cirrhosis (renin plasma activity and serum noradrenaline) to predict AKI development or progression in patients with cirrhosis and bacterial infection; b) accuracy of biomarkers of hepatic function, hemodynamics, inflammation and kidney injury routinely used in clinical practice to predict AKI development or progression in patients with cirrhosis and bacterial infection; c) accuracy of biomarkers of hemodynamic dysfunction in cirrhosis (renin plasma activity and serum noradrenaline) to predict response to treatment with albumin and terlipressin in patients with diagnosis of HRS; d) accuracy of biomarkers of hepatic function, hemodynamics, inflammation and kidney injury routinely used in clinical practice to predict response to treatment with albumin and terlipressin in patients with diagnosis of HRS; e) compare the traditional definition of AKI in cirrhosis with the new classification ICA-AKI to predict in-hospital, 30-day and 90-day mortality in patients with cirrhosis and bacterial infection. f) accuracy of urinary NGAL in predicting in-hospital mortality in patients with cirrhosis and bacterial infection. PATIENTS AND METHODS: Inclusion criteria: a) diagnosis of cirrhosis; b) presence of ascites and/or hepatic hydrothorax; c) age over 18 years old; d) consent to participate in the study; e) AKI and/or bacterial infection. Exclusion criteria: a) severe systemic comorbidities; b) shock; c) intrinsic nephropathy; d) nephrotoxic drug use; e) previous dialysis; f) liver transplantation recipient. Urine and blood samples were collected for urinary NGAL and renin plasma activity and serum noradrenaline measurement at the inclusion. Patients with HRS received standard treatment with albumin and terlipressin. RESULTS: 199 patients were included: 179 with bacterial infection for the analysis of AKI development or progression and 58 with HRS for the analysis of response to treatment (38 patients were analyzed in both parts of the study). Urinary NGAL was associated with AKI progression (AUC: 0.67, p=0.002), but not with AKI development (p=0.973). Other variables associated with AKI progression were INR (p=0.003), MELD (p=0.012), FEUr (p=0.026) and proteinuria/urinary creatinine ratio (p=0.023). There was also an association of urinary NGAL with response to HRS treatment with albumin and terlipressin (AUC: 0.70, p=0.007). Other variables associated with response to HRS treatment were INR (p=0.028), MELD (p=0.004) and proteinuria/urinary creatinine ratio (p=0.003). Combining MELD and urinary NGAL we could identify subgroups of patients with distinct response rates to treatment with albumin and terlipressin (9.1% x 48.1% x 80.0%, p < 0.001). Both the traditional definition of AKI in cirrhosis and the classification ICA-AKI predicted in-hospital, 30-day and 90-day mortality (p < 0.05). Urinary NGAL was also associated with in-hospital mortality (AUC: 0.71, p < 0.001). CONCLUSIONS: a) High urinary levels of NGAL were associated with AKI progression in patients with cirrhosis and bacterial infection; b) renin plasma activity and serum noradrenaline were not associated with AKI development or progression in patients with cirrhosis and bacterial infection; c) urinary NGAL was associated with response to combined treatment with albumin and terlipressin in patients with HRS; d) renin plasma activity and serum noradrenaline were not associated with response to combined treatment with albumin and terlipressin in patients with HRS; e) both traditional definition ok AKI in cirrhosis and ICA-AKI classification were able to predict in-hospital, 30-day and 90-day mortality in patients with cirrhosis and bacterial infection; f) high urinary levels of NGAL were associated with in-hospital mortality in patients with cirrhosis and bacterial infection

Chlamydia trachomatis is the most prevalent agent of bacterial sexually transmitted infections in the world. However, a profuse number of cases are unreported, as the infection is often asymptomatic. Sequelae such as pelvic inflammatory disease, an increased risk of cervical cancer, premature birth, and perinatal infections in pregnant women can occur. Inflammation occurs in the body in response to infection or injury. Although inflammation can lead to some unwanted secondary effects, such as pain, it serves to return the body to homeostasis by restoring injured tissues and eliminating pathogens. One recently identified connection between the central nervous system and the immune system that regulates inflammation is the cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP). In the CAP, pathogen-associated molecular patterns stimulate the vagus nerve to activate the pathway, which ultimately results in acetylcholine (ACh) release, which down regulates inflammation. We hypothesized that genital chlamydial infection would increase the expression of choline acetyltransferase (ChAT), the enzyme that synthesizes ACh, in the female murine genital tract, therefore down regulating inflammation and promoting chlamydial infection. Transgenic female mice carrying a ChAT-promoter driven GFP reporter gene were vaginally infected with C. muridarum. Mice were sacrificed on days 3, 9, 15, and 21 post infection; cervical, uterine horn, and ovarian tissues were removed and embedded in paraffin. Small sections of each tissue were cut and mounted onto slides. The tissue sections were then stained for the expression of ChAT using immunohistochemical techniques. Finally, tissue sections were viewed under a microscope for positive staining and the data was analyzed. The results indicated that there is a significant increase in the number of cells that express ChAT in genital tract of chlamydia-infected mice versus non-infected mice.