La congelación de espermatozoides es una técnica que supuso un importante paso para el desarrollo de la reproducción asistida. Esta es una técnica habitual y fundamental en las clínicas de reproducción que ha permitido lograr mejores resultados en las técnicas de reproducción asistida. A pesar de sus ventajas, durante la congelación, el espermatozoide sufre un gran número de alteraciones que dan lugar a la pérdida de función en el espermatozoide debido principalmente a: las bajas temperaturas a las que son sometidos, la cristalización de agua intracelular y los cambios osmóticos como consecuencia de la entrada y salida de crioprotector. Debido a los daños que se han observado, se está comenzando a desarrollar otro tipo de congelación ultrarápida llamada vitrificación, en la que los efectos que produce la entrada y salida de crioprotectores y los cambios de osmolaridad se ven disminuidos. Esta vitrificación es una técnica que consiste en el uso de crioprotectores diferentes y en un descenso de temperaturas brusco. Los primeros ensayos que se llevaron a cabo no resultaron exitosos debido a la poca tolerancia que presentan los espermatozoides a las altas tasas de crioprotector de las que se partieron. Ensayos posteriores en los que se reducía la concentración de crioprotector, se eliminaba el crioprotector permeable y la vitrificación se hacía mediante la aplicación directa de la solución espermática dentro de nitrógeno permitieron obtener mejores resultados. Es por ello que nos propusimos hacer un estudio en tres fases: una primera fase donde se realizara una valoración general de la congelación lenta y buscar un conjunto de biomarcadores útiles para la evaluación del criodaño. Posteriormente una segunda fase, en la que se realizó un estudio comparativo entre la congelación lenta y la vitrificación espermática, testando los biomarcadores elegidos en fase primera. Y, por último, en la tercera fase, un ensayo comparativo dentro de un ciclo de reproducción asistida donde la mitad del ciclo fuera fecundado con espermatozoides congelados y la otra mitad con espermatozoides vitrificados. Los resultados generales obtenidos mostraron que tras la congelación de muestras nomozoospérmicas y de baja calidad hay un conjunto de biomarcadores que dependen del estado inicial de la muestra y otros que dependen de la técnica de congelación. Que además se recomienda incluir en el estudio básico de la muestra seminal la fragmentación del ADN, el daño en el citoesqueleto y en el acrosoma, ya que son indicadores del criodaño. Que la nueva técnica de vitrificación permite criopreservar mejor las muestras seminales que la técnica de congelación lenta. Y que es seguro aplicar la técnica de vitrificación dentro de los ciclos de TRA, ya que se obtienen fecundaciones, desarrollos y niños nacidos normales. / Cátedra Human Fertility, Ivf Spain Foundation

El espermatozoide humano es uno de los tipos celulares más diferenciados, capaz de moverse con autonomía al salir del cuerpo masculino donde se produce y lograr su objetivo en el sistema reproductor femenino. Se forma a partir de un complejo y ordenado proceso de división y diferenciación celular. Para conseguir este proceso, debe reestructurar sus orgánulos internos, dividir su carga genética a la mitad, condensar su ADN para facilitar la motilidad y evitar daños irreparables, y reducir su volumen. Además, debe madurar su membrana para alcanzar el objetivo de fecundar el ovocito femenino. Desde el descubrimiento del espermatozoide, muchas publicaciones han mostrado la estructura morfológica que define a esta célula. Sin embargo, en el núcleo del espermatozoide, existe una estructura que ha suscitado mucha controversia hasta nuestros días, y que se les llama ‘vacuolas’. Estas estructuras fueron documentadas en un informe escrito por Theodor Eimer hace más de un siglo (Eimer 1874). Antiguos trabajos realizados en primates llevados a cabo por Bedford (Bedford 1967) y Zamboni (Zamboni y col. 1971) mediante microscopía electrónica reportaron que las vacuolas nucleares son estructuras específicas de la cabeza del espermatozoide humano. Estas vacuolas estaban presentes tanto en el espermatozoide maduro como en espermátidas tempranas (Holstein y Roosen-Runge, 1981; Johannisson 1987; Auger y Dadoune, 1993). Por lo que se ha sugerido que esta formación vacuolar ocurre de manera natural durante el proceso de condensación del núcleo espermático (Tanaka y col. 2012). Sin embargo, muchos años después del descubrimiento de las vacuolas, sigue sin estar clara su naturaleza, origen y función. En esta tesis doctoral, hemos estudiado las vacuolas nucleares del espermatozoide humano mediante técnicas ultraestructurales e inmuno-citoquímicas. Además, hemos analizado las mismas muestras espermáticas en fresco y seleccionándolas mediante swim-up con medios capacitantes. A partir de las micrografías obtenidas con estas técnicas, hemos analizado morfológica y morfométricamente las vacuolas. Con ello demostramos que las vacuolas son, en realidad, invaginaciones de la envoltura nuclear y su contenido procede del citoplasma. Estas estructuras no varían después de seleccionar los espermatozoides mediante su motilidad con medio capacitante. En el último apartado, mostramos la utilización de una técnica ultraestructural y de análisis de imagen para recrear un diseño 3D de la cabeza del espermatozoide y de las vacuolas. En esta tomografía en 3D corroboramos los resultados demostrados. Por ello, debido a todos los datos publicados en esta tesis doctoral, proponemos cambiar la terminología de estas ‘vacuolas’ por ‘invaginaciones nucleares’. Asimismo, es necesaria una revisión en la clasificación de estas invaginaciones como parámetro negativo de calidad espermática.

Los volcanes son formaciones geológicas que resultan atractivas para los asentamientos humanos debido a la fertilidad de sus suelos y su interés turístico. Pero también son una fuente importante de contaminación natural, debido a los procesos geoquímicos que tienen lugar durante los periodos eruptivos y no eruptivos. Se estima que 44 millones de personas viven a menos de 10 km de un volcán activo y ya se ha demostrado el aumento de incidencia de patologías respiratorias en humanos que habitan estos ambientes. La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo valorar los efectos neurotóxicos en el sistema nervioso central de ratones domésticos (Mus musculus) que habitan en ambientes volcánicos activos. La acumulación de mercurio en cerebro y médula espinal de individuos expuestos, la activación de células astrocitarias y microgliales y la producción de citocinas proinflamatorias son los principales resultados de este trabajo de los que se desprende que el sistema nervioso central está afectado por la exposición crónica a estos ambientes.

Determina la caracterización fenotípica y realiza el análisis genómico de dos cepas nativas del género Shewanella con capacidad de degradar colorantes azoico. Las cepas usadas fueron Shewanella sp. LC6 y Shewanella sp. 2NE11, caracterizadas a nivel fisiológico, bioquímico y genómico. Se realizaron cinéticas de crecimiento y de decoloración con los colorantes azul directo 71, anaranjado de metilo, amarillo proción HEXL y azul brillante remazol. Los ensayos relacionados a su fisiología incluyeron la evaluación de crecimiento bajo distintos parámetros como temperatura, pH y NaCl (%); entre las pruebas bioquímicas se evaluaron la producción de catalasa, oxidasa, movilidad, indol, H2S, lisina descarboxilasa, consumo de citrato, reducción de nitratos, licuefacción de gelatina, hemólisis y consumo de carbohidratos. El análisis genómico estuvo dirigido hacia la búsqueda de genes relacionados a decoloración, resistencia a metales y consumo de carbohidratos. Los resultados obtenidos muestran que las características fisiológicas y bioquímicas relacionan a la cepa Shewanella sp. LC6 dentro de la especie Shewanella xiamenensis y a Shewanella sp. 2NE11 dentro de Shewanella algae. Se identificaron proteínas como azorreductasas, peroxidasas, oxidorreductasas y ACP fosfodiesterasas relacionadas al proceso de decoloración y una gran cantidad de genes de resistencia a metales como el mercurio, zinc, cadmio, cobre y plata. Asimismo se encontraron proteínas relacionadas al consumo de carbohidratos como N-acetylglucosamina, maltosa, L-arabinosa, DL-lactato, D-fructosa y sucrosa. La presente investigación muestra el amplio potencial que tienen estas cepas para ser utilizadas en biorremediación de colorantes textiles y metales pesados. / Tesis

Compara la efectividad de cuatro medios de enriquecimiento selectivos, Caldo Selenito-cistina (CS), Caldo Tetrationato (CT), Caldo Rappaport (CR) y Caldo Rappaport-Vassiliadis (CRV), así como la influencia de dos temperaturas de incubación (37oC y 43°C) para la recuperación de Salmonella de muestras de verduras irrigadas con aguas residuales de las zonas de cultivo de Callao, San Martín de Porres, San Juan de Miraflores, Cieneguilla y Mercados. Aplica la técnica recomendada por el International Commission on (ICMSF) 1983, Microbiological Specifications for Foods para evaluar la recuperación de Salmonella, analiza un total de 94 muestras de verduras, de las cuales 58 son verduras a flor de tierra (VFT), 24 son verduras bajo tierra (VBT) y 12 son verduras de tallo alto (VTA). Concluye que el caldo Rappaport (CR) es el que mejor recupera serotipos de Salmonella (17.0%) frente a Caldo Rappaport-Vassiliadis (10.63%), Caldo Tetrationato (4.25%) y Caldo Selenito-cistina (0.0%) para las muestras de verduras. Asimismo, se ha comprobado que la temperatura d e 43°c ofrece mejor recuperación de serotipos de Salmonella (30.85%} que la de 37°C (1.06%). / Trabajo de suficiencia profesional

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Identifica los genotipos circulantes del VHC en el Perú durante el periodo 2010 – 2012. Se realiza un estudio exploratorio descriptivo. Se identifican 52 muestras con serología reactiva e indeterminada a anticuerpos anti-VHC, se utiliza el kit INNOTEST® HCV Ab, y se realiza la confirmación con un inmunoblot INNO-LIATM HCV Score, ambos kits de la marca INNOGENETICS®. Sólo se procesan 44 muestras mediante varias pruebas de PCR con diferentes juegos de cebadores dirigidos a la región NS5b y Core. El secuenciamiento es realizado por el método de Sanger, se utilizan secuencias de referencia del GenBank para la limpieza, alineamiento y construcción del árbol filogenético. Las secuencias se analizan con los programas ClustalX, Sequencher v.5.4.1, BioEdit y Mega v.6. / Tesis

Diseña y desarrolla el sistema de gestión de la calidad para el laboratorio de microbiología de la empresa Yobel Supply Chain Management S.A, siguiendo los lineamientos definidos en los requisitos de la norma ISO 9001:2008 para lo cual se generó una estructura documentaria basada en documentos tales como: planes maestros, procedimientos y formatos lo que permitió la estandarización y validación de cada actividad estableciendo en la organización procesos confiables y eficientes. El diseño del estudio es descriptivo, para ello se utilizó, instrumentos de investigación tales como las listas de verificación, encuestas y seguimiento in situ, que han permitido recolectar data e información, para un diagnóstico preciso y con ello identificar fortalezas y debilidades mostrando así la brecha que se debería cubrir para lograr la certificación externa, la cual está sustentada en el cumplimiento de lineamientos de calidad que abarcan desde el inicio del proceso, con la recepción, manejo y análisis microbiológico de las muestras hasta el fin del proceso con la emisión del informe final. En base a lo mencionado, el laboratorio de microbiología de YOBEL S.C.M., ha enfocado sus procesos en la satisfacción de las necesidades de sus clientes y en la mejora continua. / Tesis

En la presente Tesis Doctoral se describen los cambios celulares que ocurren en la retina en la enfermedad de Parkinson y su posible uso como biomarcadores tempranos de la enfermedad. Los pacientes con enfermedad de Parkinson poseen acumulaciones de alfa sinucleína fosforilada en la retina similares a las que se encuentran en el cerebro de los mismos pacientes. De hecho, la cantidad de alfa-sinucleína fosforilada en la retina correlaciona con la cantidad de alfa-sinucleína fosforilada en el cerebro, con el estadio de progresión de la enfermedad y con la severidad de los síntomas motores. Además, en la retina de enfermos de párkinson se describe una degeneración de las células ganglionares melanopsínicas de la retina, lo que podría explicar las alteraciones en los ritmos circadianos y los desórdenes del sueño que aparecen en pacientes. Finalmente, también se muestra la degeneración de las células amacrinas dopaminérgicas, que se reducen en un 45%. Este fallo en el sistema dopaminérgico de la retina provoca alteraciones morfológicas en las células amacrinas AII, sus principales postsinápticas, y podría explicar algunas alteraciones visuales descritas en la enfermedad como la disminución de la sensibilidad al contraste o de la agudeza visual. En global, los resultados muestran que la retina reproduce los procesos degenerativos que ocurren en el cerebro en la enfermedad de Parkinson y, por tanto, que es un tejido idóneo para el estudio de la enfermedad. Además, el estudio de la retina aporta información sobre el estadio de la enfermedad y puede ser empleado como un biomarcador temprano que ayude al diagnóstico y seguimiento de la misma.

La fecundación es el proceso de unión entre el espermatozoide y el ovocito durante la reproducción sexual para dar lugar a un nuevo individuo. En vertebrados la fecundación puede ser interna o externa. La fecundación interna implica que el encuentro de los gametos tiene lugar dentro de la hembra y es característica de mamíferos, reptiles y aves. En la fecundación externa la unión de ambos gametos ocurre fuera del cuerpo de la hembra y se da principalmente en peces y anfibios. Los espermatozoides de mamíferos adquieren la capacidad fecundante en el tracto reproductor femenino en un proceso dinámico llamado capacitación, el cual puede requerir entre algunos minutos hasta varias horas en función de la especie. Sabemos que la capacitación espermática implica cambios moleculares como la eliminación de colesterol de membrana, la entrada de calcio o la fosforilación de proteínas implicadas en la hiperactivación. Entre las diversas modificaciones, se le ha otorgado un papel destacado al glucocáliz debido a su implicación en el proceso de fecundación en mamíferos. Los glucoconjugados que constituyen el glucocáliz espermático se reorganizan considerablemente durante la capacitación, preparándose así para interaccionar con la zona pelúcida y el oolema del ovocito. Esta reorganización de azúcares de membrana plasmática ha sido ampliamente estudiada en especies como el ratón, jabalí, cabra, toro y primates no-humanos. Sin embargo, los cambios estructurales y funcionales de los espermatozoides durante la capacitación en humanos actualmente permanecen poco definidos. Además, la elevada heterogeneidad de las muestras de semen humanas y la limitación de las técnicas convencionales para predecir la funcionalidad espermática, hace necesario profundizar en la fisiología espermática durante la capacitación. En la Fase I de este trabajo se utilizaron múltiples biomarcadores espermáticos con el fin de evaluar el impacto de diferentes tiempos de capacitación (una y cuatro horas) sobre la calidad del espermatozoide humano. Los resultados demostraron que los espermatozoides recuperados tras cuatro horas de capacitación presentaron mayor funcionalidad que aquellos que únicamente capacitaron una hora. En concreto, se observó un número significativamente mayor de células con morfología normal y tasas de fragmentación de ADN más bajas. Además, tras capacitar durante cuatro horas se observó un incremento significativo de espermatozoides con fosforilación en los residuos de tirosina de la pieza principal, así como una mayor redistribución de los azúcares presenten en la membrana plasmática. El análisis multivariante, considerando diferentes biomarcadores morfológicos y moleculares, mostró que la subpoblación de espermatozoides recuperada tras cuatro horas de capacitación fue más homogénea que la subpoblación recuperada tras una hora de capacitación. Estos hallazgos subrayan la importancia del tiempo de capacitación como variable a considerar en los métodos de selección espermática, tanto en investigación básica como en las técnicas de reproducción asistida. La finalidad de las técnicas de reproducción asistida es favorecer el embarazo en casos de infertilidad masculina, femenina o de ambos. En la mujer, una de las causas más comunes de infertilidad es la presencia de endometriosis. La endometriosis es una enfermedad crónica que consiste en el crecimiento de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina y se asocia con disfunciones ovulatorias secundarias, alteraciones en la foliculogénesis, en el líquido peritoneal y/o en el sistema inmune. El líquido peritoneal de las mujeres con esta patología contiene una elevada concentración de sustancias inflamatorias y debido a la permeabilidad de las trompas es capaz de difundir al interior y afectar a la calidad de los gametos. Dado que es una enfermedad femenina, pocos estudios han relacionado el efecto del líquido peritoneal procedente de mujeres con endometriosis sobre la calidad espermática. Entre ellos, se ha visto que el líquido peritoneal de estas pacientes deteriora parámetros espermáticos como: la motilidad, la reacción acrosómica, la fragmentación del ADN y la capacidad de unión a la zona pelúcida del ovocito. Sin embargo, la implicación del líquido peritoneal procedente de pacientes con endometriosis en la redistribución de los glucoconjugados en la membrana del espermatozoide humano no ha sido estudiada hasta el momento. En la Fase II de este trabajo se evaluó el efecto del líquido peritoneal procedente de mujeres con y sin endometriosis sobre el espermatozoide humano mediante diversos biomarcadores. Para ello, se realizaron cultivos espermáticos durante 24 y 48 horas con líquido peritoneal al 20%. Los resultaron mostraron que la viabilidad espermática y la reacción acrosómica espontánea no se vieron afectadas en ninguna de las condiciones experimentales. No obstante, tras 48 horas, los espermatozoides cultivados con líquido peritoneal procedente de mujeres con endometriosis presentaron significativamente menor motilidad, menor fosforilación en los residuos de tirosinas y diferente reorganización de azúres de superficie en comparación con las células control. Estos datos aportan información sobre la fisiología de los espermatozoides humanos al interaccionar con el líquido peritoneal de mujeres con endometriosis, destacando el deterioro de la calidad espermática conforme aumenta el tiempo de exposición. Los modelos biomédicos son una fuente de gran valor en todos los campos de investigación. El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo animal con un elevado potencial en la biología del desarrollo, la genética, la inmunología, el comportamiento, la fisiología y la nutrición, debido a las numerosas ventajas que ofrece frente a otras especies. Además, presenta una elevada homología genética con la especie humana y sus costes de mantenimiento son relativamente bajos. En la fisiología reproductiva y del desarrollo, el modelo biológico del pez cebra destaca por presentar una tasa de fecundación elevada, un ciclo reproductivo corto y un desarrollo embrionario rápido. La fecundación y el desarrollo son externos, condición que facilita el estudio directo de las etapas tempranas de la ontogenia. Además, una de las características más relevantes es que tanto los embriones como las larvas tempranas son transparentes lo que permite el seguimiento visual durante el desarrollo de los distintos tejidos y órganos. Este hecho ha conllevado que la gran mayoría de los estudios realizados se hayan concentrado en diferentes aspectos de las etapas del desarrollo, siendo muy pocos los que han analizado la fisiología del espermatozoide. Se sabe que los espermatozoides de Danio rerio al igual que la gran mayoría de peces no presentan acrosoma. Además, tras la activación de la motilidad, debido al deterioro que les produce el choque hipoosmótico, tienen apenas un minuto para llegar al ovocito y fecundarlo. Por otra parte, al tratarse de un pez con fecundación externa, los espermatozoides están sometidos a una elevada competencia espermática, ya que tienen que competir con los espermatozoides de los otros machos por fecundar los ovocitos. Un estudio previo caracterizó la influencia negativa de la elevada competencia espermática en la descendencia de Danio rerio. Sin embargo, nada se sabe acerca de los cambios fisiológicos antes y tras la activación de la motilidad al someter al espermatozoide de Danio rerio a diferentes niveles de competencia. En la Fase III de este trabajo se analizó el efecto de la competencia espermática a distintos tiempos de activación (30 segundos, 1, 5 y 10 minutos) sobre diferentes biomarcadores en el espermatozoide de Danio rerio. Para ello, se partió de espermatozoides procedentes de machos expuestos a diferentes niveles de competencia espermática, alta competencia (dos machos y una hembra) y baja competencia (un macho y dos hembras). Los resultados mostraron un incremento de espermatozoides con flagelos enrollados y fragmentación de ADN a medida que incrementaba el tiempo de activación. No obstante, los espermatozoides procedentes de machos sometidos a elevada competencia, presentaron significativamente menor porcentaje de espermatozoides con flagelos enrollados tras la activación pero mayor porcentaje de células con fragmentación en el ADN antes de la activación en comparación con las células procedentes de baja competencia. Adicionalmente, mediante morfología y morfometría geométrica (aislando forma y tamaño como variables independientes) se analizaron las distintas partes del espermatozoide (cabeza, pieza intermedia y flagelo) tras 30 segundos de activación en ambos tratamientos de competencia. Los gametos procedentes de machos expuestos a elevada competencia mostraron cabezas de menor tamaño, piezas intermedias más grandes y flagelos más largos que los espermatozoides procedentes de baja competencia. Por lo tanto, los datos sugieren que la presencia de un macho rival podría tener un efecto positivo en el fenotipo del espermatozoide pero un efecto negativo sobre la integridad del ADN. Estos hallazgos proporcionan una perspectiva nueva de como el entorno social puede afectar a los parámetros espermáticos y su influencia en la biología de la reproducción.

El cáncer colorrectal (CCR), hoy en día es una de las neoplasias con mayor incidencia y mortalidad en España. Su etiología es multifactorial, influyendo tanto alteraciones genéticas/epigenéticas como factores ambientales (hábitos, tóxicos, dieta). Estudios demuestran que los programas de cribado actuales como el test inmunológico fecal (FIT), sigmoidoscopia y colonoscopia han disminuido la mortalidad del CCR. Sin embargo, el FIT presenta muchos falsos positivos y negativos, dando lugar a la realización de colonoscopias innecesarias que suponen un gran gasto para la sociedad. Por lo tanto, existe una necesidad de crear un método de detección precoz del CCR no-invasivo y preciso que maximice la correcta identificación de pacientes que tengan que hacerse una colonoscopia y minimice la realización de pruebas innecesarias. Por otro lado, los pacientes con poliposis múltiple de origen desconocido siguen siendo "huérfanos genéticos" hoy en día porque no presentan una mutación constitucional conocida. Por lo tanto la detección de biomarcadores para esta condición también es necesaria. El principal objetivo del primer estudio de la presente tesis doctoral, fue el desarrollo de un método no-invasivo para la detección del CCR mediante el análisis de compuestos orgánicos volátiles (COVs) en heces de pacientes con CCR, adenomas y controles sanos. Los COVs se extrajeron mediante un método y protocolo desarrollado por nuestro grupo de investigación (que está bajo patente) y posterior identificación mediante la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Se analizaron muestras de un total de 64 sujetos. Encontramos que 3 COVs se detectaban a distinta concentración entre los distintos grupos de estudio, siendo las diferencias más significativas entre pacientes con CCR y controles sanos. Tras estudiar el potencial de cada compuesto como posible biomarcador de enfermedad, observamos que dos de los tres COVs presentaban diferencias significativas en la abundancia entre CCR y controles, con una sensibilidad y especificidad elevada sugiriendo su potencial como biomarcadores de enfermedad. El segundo estudio de la presente tesis doctoral, se centra en la poliposis colónica múltiple de origen desconocido. El grupo de pacientes seleccionados carecen de mutaciones en genes como APC y MYH (ya que se considerarían Poliposis Adenomatosa Familiar y Poliposis asociada a MYH). En el estudio se incluyeron un total de 135 sujetos (83 enfermos y 52 controles). Se analizaron niveles séricos de citoquinas inflamatorias mediante ensayos ELISA y diversos factores ambientales (DM, hábito tabáquico, IMC, índice HOMA-IR). En este estudio, se detectó por primera vez una asociación entre interleucinas de las Th17 y la PCR con la presencia de polipósis múltiple. Este resultado no descarta la posible implicación de otros genes en la aparición de los pólipos pero el incremento de la IL-17A, IL-23 e IL-6 pertenecientes a la respuesta mediada por las células Th17, sugiere una asociación de esta vía con la aparición de múltiples pólipos colónicos. Nuestro grupo de investigación está llevando a cabo otro estudio para validar estos resultados. En resumen, ambos estudios detectan distintos biomarcadores que podrían ser útiles para diagnosticar; el CCR en el caso del primer estudio mediante el análisis de diversos COVs y la poliposis múltiple de origen desconocido en el caso del segundo estudio analizando la concentración de las tres interleucinas pertenecientes a la vía Th17.