A estrongiloidíase é a infecção parasitária causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. O diagnóstico definitivo é realizado pela visualização de larvas, principalmente nas fezes. Porém as técnicas parasitológicas têm baixa sensibilidade. As técnicas sorológicas apresentam-se como importante alternativa diagnóstica. Pesquisas apontam para a utilização de antígenos heterólogos solúveis, principalmente de Strongyloides venezuelensis. A identificação e caracterização dos antígenos de membrana podem fornecer fonte alternativa de antígenos e assim auxiliar o desenvolvimento das técnicas imunológicas. O presente trabalho teve como objetivo a avaliação das técnicas ELISA e WB frente a diferentes frações antigênicas de larvas filarioides de S. venezuelensis. Foram utilizadas amostras de sangue e fezes de 92 indivíduos, 20 indivíduos com estrongiloidíase (grupo I), 32 indivíduos com outras parasitoses (grupo II) e 40 indivíduos negativos (grupo III) pelos métodos de Lutz, cultura em placa de ágar e Rugai. Para preparação dos antígenos foram utilizadas larvas infectantes obtidas a partir de ratos infectados experimentalmente com S. venezuelensis. Seis frações antigênicas foram preparadas: frações salinas solúveis e de membrana (PBS 0,01M pH 7,2 e SDS 1%, SS e MS; Tris-HCl 25mM pH 7,5 e CHAPS 1%, ST e MT, respectivamente) e frações alcalinas solúvel e de membrana (NaOH 0,15M e SDS 1%, SA e MA, respectivamente). Para a técnica ELISA foram utilizadas placas sensibilizadas com 10ug/mL de antígeno, soro dos indivíduos diluídos 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBSTM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBSTM. As amostras foram consideradas positivas quando o Índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em TM. Após as técnicas sorológicas foram determinadas os parâmetros de diagnóstico pela curva ROC como sensibilidade (SE), especificidade (ES), Likelihood ratio (LR) além da determinação da acurácia diagnóstica (AC) e do índice Kappa (k). A técnica ELISA destacou as frações de membrana com melhor desempenho em relação aos parêmetros diagnósticos estudados (SE 95%, ES 94,4%, AC 94,8%, LR 17,1, k 0,848). O WB revelou componentes antigênicos imunodominantes variando de 260-10kDa, mas destacam-se as frações de 40-35kDa mais frequentes em todas frações antigênicas. Pela técnica de WB, a fração ST apresentou melhor desempenho em relação aos parêmetros diagnósticos estudados (SE 100%, ES 93,1%, AC 94,5, LR 14,4,k 0,854). A utilização das frações de membrana no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana torna-se fonte acessível e eficaz em relação às frações purificadas, não necessitando de gastos complementares para sua obtenção / Strongyloidiasis is a parasitic infection caused by a nematode Strongyloides stercoralis. The definitive diagnosis is made by the larvae visualization in stool samples. However parasitological techniques have low sensitivity. Serological techniques became as suitable diagnostic alternative. Research indicates for the soluble heterologous antigen utilization, mainly Strongyloides venezuelensis. Identification and characterization of membrane antigen may constitute an alternative source of antigen and then assist the development of serological techniques. The aim of this study was evaluate ELISA and WB techniques behind different antigenic fractions of S. venezuelensis´ infective larvae. A total of 92 serum and stool samples was analyzed, 20 from individuals with strongyloidisis (group 1), 32 with other parasitic diseases (group 2) and 40 from individuals with negative coproparasitology (group 3) using Lutz, agar plate culture and Rugai methods. For the antigen preparation infective larvae of S. venezuelensis from experimental infected rats were employed. Six antigenic fractions were prepareted: saline soluble and from membrane fractions (0.01M PBS pH 7.2, and 1% SDS, SS and MS; 25mM Tris-HCl pH 7.5, 1% CHAPS, MT and ST, respectively) and alkaline soluble and membrane fractions (0.15 M NaOH and 1% SDS, SA and MA, respectively). For ELISA technique, plates were sensitized with 10 ug/mL of antigen, serum samples were diluted 1:200 in 0.05% Tween in PBS 3% milk (PBSTM) and conjugate (anti-human IgG peroxidase) in PBSTM. Positive samples were considered when ELISA index was greater than 1. To WB technique, serum samples were diluted 1:100 in Tris-HCl 5% milk (TM) and conjugate (anti-human IgG peroxidase) in the TM. After serological techniques diagnostics parameters were determined by ROC curve how sensitivity (SE), specificity (ES), Likelihood ratio (LR) and determination of diagnostic accuracy (AC) and Kappa (k) index. ELISA technique highlighted the membrane fractions with better performance compared to parameters diagnoses studied (95% SE, 94.4% ES, 94.8% AC, 17.1 LR, 0.848 k). The WB revealed immunodominant antigenic components ranging from 260-10kDa, but there are the fractions of 40-35kDa more frequent in all antigenic fractions. WB technique showed ST fraction better performance in relation to the diagnostic parameters (100% SE, 93.1% ES, 94.5% AC, 14.4 LR, 0.854 k). Membrane fractions in the immunodiagnosis of human strongyloidiasis become an accessible and effective source of antigens in relation to the purified fractions, requiring no additional expense to obtain it

Devido ao largo espectro de manifestações na leishmaniose visceral canina (LVC), o exame clínico não é capaz de confirmar o diagnóstico, já que muitos dos sinais clínicos não são exclusivos da LVC, tornando-se imprescindível o diagnóstico laboratorial para confirmação da infecção por L. (L.) infantum chagasi. A sorologia tem sido a primeira escolha para o diagnóstico da leishmaniose canina; porém, a diversidade de técnicas empregadas e de antígenos tem levado a resultados conflitantes. O emprego de formas promastigotas e amastigotas do parasito tem boa concordância no sorodiagnóstico de LVC pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), porém o teste com amastigotas mostrou-se mais sensível sem perda da especificidade. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do ELISA no sorodiagnóstico da LVC empregando antígeno total bruto de formas amastigotas provenientes de cultura axênica (ELISA-AXE) e amastigotas purificadas de tecido de animal experimental cronicamente infectado (ELISA-AMA) comparando com o desempenho do ELISA feito com antígeno total bruto de formas promastigotas (ELISA-PRO) de L. (L.) infantum chagasi. Foram avaliados 115 soros de cães parasitologicamente positivos para a pesquisa de DNA de Leishmania por PCR, domiciliados a pelo menos 2 anos em municípios com alta transmissão de leishmaniose visceral, classificados em sintomáticos (n=67) e assintomáticos (n=48) de acordo com sinais clínicos e exames laboratoriais. Como controle, foram utilizados 81 soros de cães parasitologicamente negativos oriundos do município sem transmissão comprovada de leishmaniose visceral e 13 soros de cães com outras enfermidades. Os resultados não mostraram diferença significante em sensibilidade, especificidade, valores preditivos e acurácia entre os testes ELISA-AXE, ELISA-AMA e ELISA-PRO, com forte correlação e concordância entre os três antígenos testados. O ensaio de Western Blot mostrou reatividade para proteínas de diferentes pesos moleculares, entre 14 a 178kDa dependendo da fonte de antígeno. Os resultados mostraram desempenho semelhantes nos testes de ELISA com amastigotas axênicas, amastigotas purificadas e promastigotas como fonte de antígeno para sorologia da leishmaniose canina. A ampla e diversificada reatividade no Western Blot com poucas bandas altamente especificas sugere o emprego de quimeras de antígenos de diferentes pesos moleculares oriundos tanto de formas amastigotas como de formas promastigotas do parasito no diagnóstico da LVC / Due to the wide spectrum of manifestations in canine visceral leishmaniasis (CVL), clinical exam is not able to confirm the diagnosis, since many of the signs and symptoms are not exclusive of CVL, making it imperative that the laboratory diagnosis for infection confirmation by L. (L.) infantum chagasi. Since the direct search involves invasive material collection, time-consuming and expensive; the serology has been the first choice for diagnosis of canine leishmaniasis. However, the diversity of techniques employed and antigens have led to conflicting results in both diagnostic routine and applied research. Since the use of promastigotes and amastigotes of L. (L.) infantum chagasi have good agreement on serum diagnosis of CVL by reaction of Indirect Immunofluorescence (RIFI), despite the amastigote test proved more sensitive without loss of specificity. The main objective of this study was to evaluate and compare the performance of ELISA in the CVL using crude total antigen of axenic amastigote and promastigote culture, and purified amastigote from experimental chronically infected animal tissue of L. (L.) infantum chagasi. One hundred and fifty-five sera from dogs residing on areas with high disease incidence were evaluated by PCR and diagnosed positive for Leishmania, these were used as positive control on the present study. The animals were examined clinically and in accordance with the characteristic clinical signs of visceral leishmaniasis and laboratory tests, then were classified into 2 groups: symptomatic (n=67) and asymptomatic (n=48) animals. As negative control, eighty-one sera were used from dogs parasitologically negative by PCR in real time from the municipality without proven transmission of visceral leishmaniasis. The results showed no significant difference in sensitivity, specificity, predictive values and accuracy between ELISA-AXE, ELISA-AMA and ELISA-PRO, with strong correlation and concordance between the three antigens tested. The Western Blot assay showed reactivity for proteins of different molecular weights ranging from 14 to 178kDa depending on the antigen source. The results showed similar performance in the ELISA tests with axenic amastigotes, purified amastigotes and promastigotes as source of antigen for serology of canine leishmaniasis. The broad and diverse reactivity in Western Blot with few highly specific bands suggests the use of antigen chimeras of different molecular weights derived from both amastigote and promastigote forms of the parasite in the diagnosis of LVC

A estrongiloidíase é a infecção parasitária causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. O diagnóstico definitivo é realizado pela visualização de larvas, principalmente nas fezes. Porém as técnicas parasitológicas têm baixa sensibilidade. As técnicas sorológicas apresentam-se como importante alternativa diagnóstica. Pesquisas apontam para a utilização de antígenos heterólogos solúveis, principalmente de Strongyloides venezuelensis. A identificação e caracterização dos antígenos de membrana podem fornecer fonte alternativa de antígenos e assim auxiliar o desenvolvimento das técnicas imunológicas. O presente trabalho teve como objetivo a avaliação das técnicas ELISA e WB frente a diferentes frações antigênicas de larvas filarioides de S. venezuelensis. Foram utilizadas amostras de sangue e fezes de 92 indivíduos, 20 indivíduos com estrongiloidíase (grupo I), 32 indivíduos com outras parasitoses (grupo II) e 40 indivíduos negativos (grupo III) pelos métodos de Lutz, cultura em placa de ágar e Rugai. Para preparação dos antígenos foram utilizadas larvas infectantes obtidas a partir de ratos infectados experimentalmente com S. venezuelensis. Seis frações antigênicas foram preparadas: frações salinas solúveis e de membrana (PBS 0,01M pH 7,2 e SDS 1%, SS e MS; Tris-HCl 25mM pH 7,5 e CHAPS 1%, ST e MT, respectivamente) e frações alcalinas solúvel e de membrana (NaOH 0,15M e SDS 1%, SA e MA, respectivamente). Para a técnica ELISA foram utilizadas placas sensibilizadas com 10ug/mL de antígeno, soro dos indivíduos diluídos 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBSTM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBSTM. As amostras foram consideradas positivas quando o Índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em TM. Após as técnicas sorológicas foram determinadas os parâmetros de diagnóstico pela curva ROC como sensibilidade (SE), especificidade (ES), Likelihood ratio (LR) além da determinação da acurácia diagnóstica (AC) e do índice Kappa (k). A técnica ELISA destacou as frações de membrana com melhor desempenho em relação aos parêmetros diagnósticos estudados (SE 95%, ES 94,4%, AC 94,8%, LR 17,1, k 0,848). O WB revelou componentes antigênicos imunodominantes variando de 260-10kDa, mas destacam-se as frações de 40-35kDa mais frequentes em todas frações antigênicas. Pela técnica de WB, a fração ST apresentou melhor desempenho em relação aos parêmetros diagnósticos estudados (SE 100%, ES 93,1%, AC 94,5, LR 14,4,k 0,854). A utilização das frações de membrana no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana torna-se fonte acessível e eficaz em relação às frações purificadas, não necessitando de gastos complementares para sua obtenção / Strongyloidiasis is a parasitic infection caused by a nematode Strongyloides stercoralis. The definitive diagnosis is made by the larvae visualization in stool samples. However parasitological techniques have low sensitivity. Serological techniques became as suitable diagnostic alternative. Research indicates for the soluble heterologous antigen utilization, mainly Strongyloides venezuelensis. Identification and characterization of membrane antigen may constitute an alternative source of antigen and then assist the development of serological techniques. The aim of this study was evaluate ELISA and WB techniques behind different antigenic fractions of S. venezuelensis´ infective larvae. A total of 92 serum and stool samples was analyzed, 20 from individuals with strongyloidisis (group 1), 32 with other parasitic diseases (group 2) and 40 from individuals with negative coproparasitology (group 3) using Lutz, agar plate culture and Rugai methods. For the antigen preparation infective larvae of S. venezuelensis from experimental infected rats were employed. Six antigenic fractions were prepareted: saline soluble and from membrane fractions (0.01M PBS pH 7.2, and 1% SDS, SS and MS; 25mM Tris-HCl pH 7.5, 1% CHAPS, MT and ST, respectively) and alkaline soluble and membrane fractions (0.15 M NaOH and 1% SDS, SA and MA, respectively). For ELISA technique, plates were sensitized with 10 ug/mL of antigen, serum samples were diluted 1:200 in 0.05% Tween in PBS 3% milk (PBSTM) and conjugate (anti-human IgG peroxidase) in PBSTM. Positive samples were considered when ELISA index was greater than 1. To WB technique, serum samples were diluted 1:100 in Tris-HCl 5% milk (TM) and conjugate (anti-human IgG peroxidase) in the TM. After serological techniques diagnostics parameters were determined by ROC curve how sensitivity (SE), specificity (ES), Likelihood ratio (LR) and determination of diagnostic accuracy (AC) and Kappa (k) index. ELISA technique highlighted the membrane fractions with better performance compared to parameters diagnoses studied (95% SE, 94.4% ES, 94.8% AC, 17.1 LR, 0.848 k). The WB revealed immunodominant antigenic components ranging from 260-10kDa, but there are the fractions of 40-35kDa more frequent in all antigenic fractions. WB technique showed ST fraction better performance in relation to the diagnostic parameters (100% SE, 93.1% ES, 94.5% AC, 14.4 LR, 0.854 k). Membrane fractions in the immunodiagnosis of human strongyloidiasis become an accessible and effective source of antigens in relation to the purified fractions, requiring no additional expense to obtain it

A epilepsia é a condição crônica mais prevalente dentre as doenças neurológicas graves, associada com taxas significativas de morbidade e mortalidade. Pacientes com epilepsia farmacorresistente possuem uma taxa de mortalidade 2 a 3 vezes maior que indivíduos sem epilepsia. A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a principal causa de epilepsia farmacorresistente nos adultos e também o protótipo da epilepsia cirurgicamente tratável, portanto, com maior acessibilidade para estudo de possíveis mecanismos epileptogênicos. Esclerose hipocampal (EH) é o achado neuropatológico mais comum em pacientes com ELT. Evidências, baseadas em experimentos animais e estudos em humanos, sugerem que as vias serotoninérgicas desempenham um importante papel na epileptogênese. Pacientes com ELT, causadas pela EH, apresentam maior prevalência de transtornos do humor e psicose contribuindo para uma pior qualidade de vida, com consequente impacto negativo nas respostas terapêuticas farmacológicas e cirúrgicas. Além disso, alguns estudos sugerem a existência de um mecanismo patogênico operante comum entre estas condições. Portanto, esta é um importante variável para análise. O objetivo desse estudo foi correlacionar as variáveis clínicas da epilepsia e a presença de transtornos psiquiátricos coexistentes com a concentração de serotonina (5-HT), a densidade dos receptores serotoninérgicos e a densidade do transportador serotoninérgico (5-HTT) no hipocampo dos pacientes com ELT-EH, que foram submetidos à cirurgia devido à presença de epilepsia farmacorresistente. Foram avaliadas amostras de 44 hipocampos de pacientes cirurgicamente tratados para ELT-EH. A concentração de 5-HT foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção por fluorescência. 5-HTT e os receptores serotoninérgicos 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT6 e 5-HT7 foram avaliados por Western Blot. Níveis mais baixos de concentração de 5-HT estiveram associados com a presença de crises TCG (Wilcoxon-Mann-Whitney; p = 0.019). A densidade aumentada do receptor 5-HT1A esteve associada com maior duração da epilepsia (coeficiente de correlação de Spearman: p = 0.040) e a densidade diminuída do receptor 5-HT6 esteve associado com presença de EME (Wilcoxon-Mann-Whitney: p = 0.0027). A densidade dos receptores 5-HT2A e 5-HT7 e do 5-HTT não estiveram associadas com variáveis clínicas da epilepsia. A concentração de 5-HT, a densidade dos receptores e a densidade de 5-HTT não estiveram associadas à presença dos transtornos psiquiátricos neste grupo de pacientes. Nossos achados sugerem que as vias serotoninérgicas estão associadas com mecanismos de epileptogênese. Não foi evidenciado associações entre as vias serotoninérgicas e a presença de comorbidades psiquiátricas neste grupo de pacientes com ELT-EH / Epilepsy is the most prevalent neurological condition and it is associated with significative morbidities and mortalities rates. Patients with refractory epilepsy have a 2- to 3-fold higher mortality rate than people without epilepsy. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of adult drug-resistant epilepsy. It is also the prototype of a surgically treatable epilepsy and because of that it is the most accessible for studies focused in epileptogenesis. Hippocampal sclerosis (HS) is the most common neuropathological finding in patients with TLE. Evidences from experimental, clinical and image studies suggest that the serotonergic system play an important role in epileptogenesis. Patients with TLE-HS have a higher prevalence of mood disorder and psychosis contributing for a worse quality of life with and consequent negative impact in pharmacological and surgical responses. Furthermore, studies suggest a common pathogenic mechanism operant in both conditions. Therefore, this is an important analytical variable. The objective of this study was to correlate clinical variables of epilepsy and the presence of psychiatric disease with serotonin (5-HT) concentration, serotonergic receptor density and serotonergic transporter (5-HTT) density in the hippocampus of TLE-HS patients submitted for surgery due to refractory epilepsy. It was analyzed 44 hippocampal tissue samples from surgical treated TLE-HS patients. 5-HT concentration was assessed by high pressure liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. 5-HTT and serotonergic receptors 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT6 and 5- HT7 were assessed by Western Blotting. Lower levels of 5-HT concentration were associated with the presence of generalized tonic-clonic seizures (Wilcoxon-Mann-Whitney; p = 0.019). A higher 5-HT1A receptor density was associated with longer epilepsy duration (Spearman correlation coefficient: p = 0.040). Lower 5-HT6 receptor density was associated with the presence of status epilepticus (Wilcoxon-Mann-Whitney: p = 0.0027). 5-HT2A receptor, 5- HT7 receptor and 5-HTT densities were not associated with clinical variables of epilepsy. 5-HT concentration, serotonergic receptors and transporter densities were not associated with the presence of psychiatric disease in this group of patients. Our findings suggest that the serotonergic pathways are associated with epileptogenesis mechanisms. It was not evidenced any association between serotonergic pathways and psychiatric comorbidities in this group of TLE-HS patients

A toxocaríase é considerada uma das cinco parasitoses negligenciadas pelo Centers for Disease Control and Prevention e recebe ainda pouca atenção. As metodologias diagnósticas conhecidas são bem estabelecidas, apresentando, porém, limitações caracterizadas, sobretudo, pela ocorrência de reações-cruzadas. A biologia molecular mostra grandes avanços para o diagnóstico eficaz de diversas parasitoses, mas ainda carece de estudos em amostras de fácil obtenção para o diagnóstico da toxocaríase. Para aprimorar o conhecimento sobre a importância da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase Convencional (PCR) e sua relação com técnicas diagnósticas já conhecidas, foram utilizados 42 camundongos BALB/c, machos, entre 6 a 8 semanas de vida, divididos em três grupos, inoculados com 5, 50 ou 500 ovos larvados e sangrados pelo plexo orbital aos 15, 30, 60 e 90 dias pós infecção. Ainda, do total, 24 camundongos foram sangrados aos 120 dias pós infecção. Ao final do experimento, foi realizada a recuperação de larvas e a PCR de tecido hepático, cérebro e carcaça de camundongos dos grupos infectados. As amostras de soro foram processadas pelas técnicas de ELISA, Western-blotting e PCR. O ELISA e o Western-blotting mostraram resultados reagentes em todas as datas para a maioria dos inóculos de ovos, com relação diretamente proporcional entre a detecção de anticorpos e a carga parasitária. Durante o período da infecção, a detecção de IgG foi mais intensa próxima aos 60 dias pós-infecção para a maioria dos inóculos de ovos, por ambos os métodos imunológicos. Apesar de identificar DNA de larvas e vermes adultos, a PCR não foi capaz de detectar DNA do parasito em amostras de soro em todos os grupos e datas pós-infecção. Em contrapartida, foi detectado DNA do parasito em todos os órgãos com ao menos um dos primers utilizados. Foram recuperadas larvas na maioria dos órgãos com maior porcentagem de recuperação relatada nos animais inoculados com 50 ovos larvados. O diagnóstico molecular, utilizando sangue do paciente, ainda não pode ser considerado uma ferramenta para o diagnóstico dessa infecção / Toxocariasis is considered by the Centers for Disease Control and Prevention one of the five neglected diseases and still receives little attention. The diagnostic methods are well established, presenting, however, limitations characterized mainly by the occurrence of cross-reactions. Molecular biology shows great advance for the effective diagnosis of several parasitic infections, but still lacks studies using samples that are easily obtained for the diagnosis of toxocariasis. In order to refine the knowledge about the importance of Conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) and its relation with known techniques, 42 BALB/c male mice, between 6-8 weeks of age were inoculated with 5, 50 and 500 embryonated eggs respectively and bled by the orbital plexus at 15, 30, 60 and 90 days post infection. Also, 24 of 42 animals were bled the same way at 120 days post-infection. At the end of the experiment, larval recovery and conventional PCR were performed in liver, brain and carcass of mice of the infected groups. Serum samples were processed by ELISA, Western-blotting and PCR. The ELISA and Western-blotting techniques showed positive results in all days post infection for most eggs inocula and showed a directly proportional dependence between the infective dose and the level of antibodies. During the course of the infection, IgG detection was most intense near 60 days post infection for most eggs inocula, for both diagnostic methods. Despite positive DNA identification in larvae and adult worms, PCR wasn\'t able to detect parasite DNA in serum samples in all infected groups and days post infection. In contrast, parasite DNA was detected in all organs with at least one of the primers. Larvae were recovered from most organs, and animals inoculated with 50 embryonated eggs showed the highest percentage of larval recovery. Molecular diagnosis using patient\'s blood is not the best tool for toxocariasis diagnosis so far

A alergia alimentar tem se tornado um problema crescente de saúde pública em muitos países e pode ser desencadeada por qualquer alimento. Em crianças os alimentos considerados mais alergênicos são leite de vaca e ovo e em adultos há uma alta frequência de alergia a frutos do mar, sendo camarão o marisco considerado mais alergênico. Clinicamente a alergia a camarão pode se manifestar em diferentes formas como dermatite atópica, angioedema ou até mesmo anafilaxia. Com base na história clínica e avaliação de resultados de exames complementares foram selecionados 18 indivíduos alérgicos a camarão e 9 não alérgicos como grupo controle. Foram realizados testes in vitro para dosagem de IgE especifica no soro e teste cutâneo. Para reações ocorridas há mais de um ano foi realizada provocação oral para confirmação diagnóstica. O soro de todos os indivíduos do estudo foram testados em Western Blotting 1D e 2D com extrato de carne de camarão e casca separadamente da espécie Xiphopenaeus kroyeri, que possui grande importância por ser altamente consumida em nosso país além de estar entre as dez estirpes mais capturadas no mundo. Ainda assim não está presente em nenhum teste comercial disponível e não há nenhum alérgeno descrito para o mesmo. A caracterização de suas moléculas alergênicas é importante para melhor auxilio no diagnóstico e tratamento de pacientes alérgicos. As proteínas que apresentaram reatividade IgE especifica foram submetidas a espectrometria de massas para identificação. Foi possível identificar alguns homólogos de alérgenos de outras espécies de camarão como, tropomiosina, arginina quinase, proteína sarcoplasmática de ligação ao cálcio, actina, cadeia leve e pesada de miosina e hemocianina. Encontramos um possível novo alérgeno denominado como citocromo c oxidase (subunidade I) que não foi descrito anteriormente como proteína alergênica. Analisando sensibilidade e valor preditivo positivo das nossas proteínas sugerimos que algumas delas podem ser boas candidatas como futuros marcadores diagnósticos para alergia a camarão. Quando comparamos o perfil de proteínas reativas em carne e casca de camarão não observamos diferenças significativas entre elas. Essa é a primeira descrição de alergia para a espécie de camarão X. kroyeri, popularmente conhecido como camarão sete barbas, mostrando reatividade a IgE especifica em pacientes alérgicos a camarão / Food allergy has become a growing problem of public health in many countries, and can be triggered by any food. In children the most allergenic foods are cow\'s milk and egg; in adults there are high frequencies of allergy to seafood, and shrimps are considered the most allergenic seafood. Clinically, shrimp allergy can manifest itself in different forms, such as atopic dermatitis, angioedema or even anaphylaxis. Based on the clinical history and evaluation of the tests, we selected eighteen subjects that were allergic to shrimp, and nine non-allergic to shrimp as a control group. In vitro tests were performed to IgE specific dosage and cutaneous test with commercial extract. When reactions occurred more than one year before oral provocation test was performed for diagnostic confirmation. The serum of all individuals were tested in Western Blotting 1D and 2D with the shrimp meat and shell extracts separately from the species Xiphopenaeus kroyeri, which has great importance since is highly consumed in the Southeast region of our country and is among the top ten captured species in the world. Nevertheless, there are no commercial clinical tests available for it, and there is no specific allergen described, both of them would help the diagnosis and treatment of allergic patients. Proteins that showed specific IgE reactivity were submitted to mass spectrometry for identification. We identified some homologues allergens from other shrimp species such as tropomyosin, arginine kinase, calcium-binding sarcoplasmic protein, actin, myosin heavy chain and hemocyanin. We founded a possible new allergen called cytochrome c oxidase (subunit I), that was never previously described as an allergenic protein. Analyzing sensitivity and positive predictive value of our proteins we suggest that some of them may be good candidates as future diagnostic markers for shrimp allergy. When comparing the reactive proteins profile in shrimp meat and shell, we did not observe significant differences between them. This is the first description showing reactivity to specific IgE for shrimp species X. kroyeri, popularly known as shrimp seven beards, in patients allergic to shrimp

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Ricardo Aparício / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pelloso_AlexandreCesar_M.pdf: 8109350 bytes, checksum: fc162ef3c04f105331de4e0c0bb979f3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Após o sequenciamento do genoma da Xylella fastidiosa, linhagem 9a5c houve um grande aumento de informações relacionadas a este organismo. Porém grande parte das proteínas desta bactéria ainda não apresentam funções preditas. No presente estudo, objetivou-se a caracterização inicial de três proteínas deste micro-organismo, a saber: XfCysB (orf Xf0683), XfLysRL (orf Xf1448) e XfycjZ (orf Xf1480). Essas proteínas apresentam alta similaridade com membros da família de reguladores transcricionais do tipo LysR (LTTR). Os LTTR constituem a família de reguladores mais comuns em procariotos e apresentam funções diversas tais como regulação de genes envolvidos no metabolismo, divisão celular, quorum sense, virulência, resposta ao estresse oxidativo, entre outras. Dentre as proteínas em estudo, a única proteína que possui predição dentro da família LysR é a XfCysB, cujas proteínas homólogas, já caracterizadas, estão envolvidas na regulação do operon cys, o qual está envolvido na biossíntese de cisteína. Após a clonagem das proteínas, a caracterização estrutural foi feita por Cromatografia de Exclusão por Peso Molecular, em que foi possível observar o estado oligomérico da proteína; Dicroísmo Circular para verificar se a proteína apresenta estrutura secundária estruturada e SAXS (Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos) ,apenas para a proteína XfLysRL, para a determinação do envelope da proteína em solução. A caracterização funcional foi feita pela análise da expressão das proteínas durante as diferentes fases de formação do biofilme (5, 10, 15, 20 e 30 dias de crescimento) de X. fastidiosa por Western blot utilizando anticorpos específicos para cada proteína em estudo. Com os resultados obtidos pode-se estimar que a massa molecular da proteína XfLysRL é de 50 kDa quando em solução, indicando que a XfLysRL encontra-se na forma dimérica, uma vez que a massa molecular do monômero é de 23,7 kDa. Possui também a estrutura secundária estruturada, sendo estável de 4°C a 44 ° C. Foi possível verificar também que a proteína está monodispersa quando em solução, é estruturalmente globular e pôde-se produzir, com os dados obtidos, um primeiro modelo para a estrutura da proteína. Já a proteína XfCysB teve a sua massa estimada em 45,3 kDa quando em solução e de 195,1 kDa quando na presença do seu co-indutor específico, além de apresentar uma estrutura secundária estruturada. Em relação à proteína XfycjZ pôde-se observar que esta quando em solução possui uma massa molecular estimada em 174,8 kDa demonstrando que sua forma oligomérica é de tetrâmero. Os estudos funcionais indicam que as três proteínas são expressas durante a formação do biofilme de X. fastidiosa, ou seja, estão presentes nos 6 tempos analisados. Deste modo, o estudo detalhado das presentes proteínas torna-se importante devido a sua presença na formação do biofilme de X. fastidiosa, um dos mecanismos de patogenicidade da bactéria. Outro fator importante é a utilização dos resultados da caracterização estrutural na elucidação do papel desempenhado pelas proteínas, visto que a estrutura protéica está diretamente envolvida com sua função / Abstract: After sequencing the genome of Xylella fastidiosa, strain 9a5c, there was a large increase in information related to this organism, but most of the proteins produced by these bacteria do not have predicted functions. In this study, the objective was the initial characterization of three proteins of this organism, namely XfCysB (orf Xf0683) XfLysRL (orf Xf1448) and XfycjZ (orf Xf1480). These proteins show high similarity to members of the family of LysR-type transcriptional regulators (LTTR). The LTTR family of regulators is the most common in prokaryotes and has diverse functions such as regulation of genes involved in metabolism, cell division, quorum sense, virulence, oxidative stress response, among others. Among the proteins under study, the only protein that has more specific prediction of classification within the family is the LysR XfCysB, which already characterized homologous proteins are involved in the regulation of cys operon, which is involved in the biosynthesis of cysteine. After cloning the protein, structural characterization was performed using the techniques of Exclusion Chromatography for Molecular Weight that shows the oligomeric state of the protein; circular dichroism to determine if protein has folded and stable secondary structure and SAXS (X-Ray Scattering at Small Angle) for the determination of protein structure in solution. Functional characterization was performed by analyzing the expression of proteins during different stages of biofilm formation (5, 10, 15, 20 and 30 days of growth) of X. fastidiosa by producing antibodies specific for each protein under study and performance of Western blot using total protein extract of the antibody produced against biofilm. With results obtained it was possible to estimate that the molecular weight of protein was 50 kDa XfLysRL in solution, indicating that the XfLysRL is in dimeric form, since the molecular weight of the monomer is 23.7 kDa. It also has a stable secondary structure folded and supporting a rise in temperature to 44° C. It was also verified that the protein is monodisperse in solution, is structurally globular and could be produced, with the data obtained, a first model for the structure of the protein. The protein XfCysB had its mass estimated at 45.3 kDa in solution and 195.1 kDa in the presence of its coinducer specific, besides presents a folded secondary structure. Regarding the protein XfycjZ was observed that when this solution has a molecular mass of 174.8 kDa demonstrating that it's oligomeric form is a tetramer. Functional studies indicate that the three proteins were expressed during the biofilm formation of X. fastidiosa, follows that they are present in 6 times analyzed. Thus, the detailed study of these proteins is important because their presence in biofilm formation of X. fastidiosa, one of the mechanisms of pathogenicity of the bacteria. Another important factor is the use of results in the structural elucidation of the role of proteins because the protein structure is directly involved in its function / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A alergia alimentar tem se tornado um problema crescente de saúde pública em muitos países e pode ser desencadeada por qualquer alimento. Em crianças os alimentos considerados mais alergênicos são leite de vaca e ovo e em adultos há uma alta frequência de alergia a frutos do mar, sendo camarão o marisco considerado mais alergênico. Clinicamente a alergia a camarão pode se manifestar em diferentes formas como dermatite atópica, angioedema ou até mesmo anafilaxia. Com base na história clínica e avaliação de resultados de exames complementares foram selecionados 18 indivíduos alérgicos a camarão e 9 não alérgicos como grupo controle. Foram realizados testes in vitro para dosagem de IgE especifica no soro e teste cutâneo. Para reações ocorridas há mais de um ano foi realizada provocação oral para confirmação diagnóstica. O soro de todos os indivíduos do estudo foram testados em Western Blotting 1D e 2D com extrato de carne de camarão e casca separadamente da espécie Xiphopenaeus kroyeri, que possui grande importância por ser altamente consumida em nosso país além de estar entre as dez estirpes mais capturadas no mundo. Ainda assim não está presente em nenhum teste comercial disponível e não há nenhum alérgeno descrito para o mesmo. A caracterização de suas moléculas alergênicas é importante para melhor auxilio no diagnóstico e tratamento de pacientes alérgicos. As proteínas que apresentaram reatividade IgE especifica foram submetidas a espectrometria de massas para identificação. Foi possível identificar alguns homólogos de alérgenos de outras espécies de camarão como, tropomiosina, arginina quinase, proteína sarcoplasmática de ligação ao cálcio, actina, cadeia leve e pesada de miosina e hemocianina. Encontramos um possível novo alérgeno denominado como citocromo c oxidase (subunidade I) que não foi descrito anteriormente como proteína alergênica. Analisando sensibilidade e valor preditivo positivo das nossas proteínas sugerimos que algumas delas podem ser boas candidatas como futuros marcadores diagnósticos para alergia a camarão. Quando comparamos o perfil de proteínas reativas em carne e casca de camarão não observamos diferenças significativas entre elas. Essa é a primeira descrição de alergia para a espécie de camarão X. kroyeri, popularmente conhecido como camarão sete barbas, mostrando reatividade a IgE especifica em pacientes alérgicos a camarão / Food allergy has become a growing problem of public health in many countries, and can be triggered by any food. In children the most allergenic foods are cow\'s milk and egg; in adults there are high frequencies of allergy to seafood, and shrimps are considered the most allergenic seafood. Clinically, shrimp allergy can manifest itself in different forms, such as atopic dermatitis, angioedema or even anaphylaxis. Based on the clinical history and evaluation of the tests, we selected eighteen subjects that were allergic to shrimp, and nine non-allergic to shrimp as a control group. In vitro tests were performed to IgE specific dosage and cutaneous test with commercial extract. When reactions occurred more than one year before oral provocation test was performed for diagnostic confirmation. The serum of all individuals were tested in Western Blotting 1D and 2D with the shrimp meat and shell extracts separately from the species Xiphopenaeus kroyeri, which has great importance since is highly consumed in the Southeast region of our country and is among the top ten captured species in the world. Nevertheless, there are no commercial clinical tests available for it, and there is no specific allergen described, both of them would help the diagnosis and treatment of allergic patients. Proteins that showed specific IgE reactivity were submitted to mass spectrometry for identification. We identified some homologues allergens from other shrimp species such as tropomyosin, arginine kinase, calcium-binding sarcoplasmic protein, actin, myosin heavy chain and hemocyanin. We founded a possible new allergen called cytochrome c oxidase (subunit I), that was never previously described as an allergenic protein. Analyzing sensitivity and positive predictive value of our proteins we suggest that some of them may be good candidates as future diagnostic markers for shrimp allergy. When comparing the reactive proteins profile in shrimp meat and shell, we did not observe significant differences between them. This is the first description showing reactivity to specific IgE for shrimp species X. kroyeri, popularly known as shrimp seven beards, in patients allergic to shrimp

A epilepsia é a condição crônica mais prevalente dentre as doenças neurológicas graves, associada com taxas significativas de morbidade e mortalidade. Pacientes com epilepsia farmacorresistente possuem uma taxa de mortalidade 2 a 3 vezes maior que indivíduos sem epilepsia. A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a principal causa de epilepsia farmacorresistente nos adultos e também o protótipo da epilepsia cirurgicamente tratável, portanto, com maior acessibilidade para estudo de possíveis mecanismos epileptogênicos. Esclerose hipocampal (EH) é o achado neuropatológico mais comum em pacientes com ELT. Evidências, baseadas em experimentos animais e estudos em humanos, sugerem que as vias serotoninérgicas desempenham um importante papel na epileptogênese. Pacientes com ELT, causadas pela EH, apresentam maior prevalência de transtornos do humor e psicose contribuindo para uma pior qualidade de vida, com consequente impacto negativo nas respostas terapêuticas farmacológicas e cirúrgicas. Além disso, alguns estudos sugerem a existência de um mecanismo patogênico operante comum entre estas condições. Portanto, esta é um importante variável para análise. O objetivo desse estudo foi correlacionar as variáveis clínicas da epilepsia e a presença de transtornos psiquiátricos coexistentes com a concentração de serotonina (5-HT), a densidade dos receptores serotoninérgicos e a densidade do transportador serotoninérgico (5-HTT) no hipocampo dos pacientes com ELT-EH, que foram submetidos à cirurgia devido à presença de epilepsia farmacorresistente. Foram avaliadas amostras de 44 hipocampos de pacientes cirurgicamente tratados para ELT-EH. A concentração de 5-HT foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção por fluorescência. 5-HTT e os receptores serotoninérgicos 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT6 e 5-HT7 foram avaliados por Western Blot. Níveis mais baixos de concentração de 5-HT estiveram associados com a presença de crises TCG (Wilcoxon-Mann-Whitney; p = 0.019). A densidade aumentada do receptor 5-HT1A esteve associada com maior duração da epilepsia (coeficiente de correlação de Spearman: p = 0.040) e a densidade diminuída do receptor 5-HT6 esteve associado com presença de EME (Wilcoxon-Mann-Whitney: p = 0.0027). A densidade dos receptores 5-HT2A e 5-HT7 e do 5-HTT não estiveram associadas com variáveis clínicas da epilepsia. A concentração de 5-HT, a densidade dos receptores e a densidade de 5-HTT não estiveram associadas à presença dos transtornos psiquiátricos neste grupo de pacientes. Nossos achados sugerem que as vias serotoninérgicas estão associadas com mecanismos de epileptogênese. Não foi evidenciado associações entre as vias serotoninérgicas e a presença de comorbidades psiquiátricas neste grupo de pacientes com ELT-EH / Epilepsy is the most prevalent neurological condition and it is associated with significative morbidities and mortalities rates. Patients with refractory epilepsy have a 2- to 3-fold higher mortality rate than people without epilepsy. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of adult drug-resistant epilepsy. It is also the prototype of a surgically treatable epilepsy and because of that it is the most accessible for studies focused in epileptogenesis. Hippocampal sclerosis (HS) is the most common neuropathological finding in patients with TLE. Evidences from experimental, clinical and image studies suggest that the serotonergic system play an important role in epileptogenesis. Patients with TLE-HS have a higher prevalence of mood disorder and psychosis contributing for a worse quality of life with and consequent negative impact in pharmacological and surgical responses. Furthermore, studies suggest a common pathogenic mechanism operant in both conditions. Therefore, this is an important analytical variable. The objective of this study was to correlate clinical variables of epilepsy and the presence of psychiatric disease with serotonin (5-HT) concentration, serotonergic receptor density and serotonergic transporter (5-HTT) density in the hippocampus of TLE-HS patients submitted for surgery due to refractory epilepsy. It was analyzed 44 hippocampal tissue samples from surgical treated TLE-HS patients. 5-HT concentration was assessed by high pressure liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. 5-HTT and serotonergic receptors 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT6 and 5- HT7 were assessed by Western Blotting. Lower levels of 5-HT concentration were associated with the presence of generalized tonic-clonic seizures (Wilcoxon-Mann-Whitney; p = 0.019). A higher 5-HT1A receptor density was associated with longer epilepsy duration (Spearman correlation coefficient: p = 0.040). Lower 5-HT6 receptor density was associated with the presence of status epilepticus (Wilcoxon-Mann-Whitney: p = 0.0027). 5-HT2A receptor, 5- HT7 receptor and 5-HTT densities were not associated with clinical variables of epilepsy. 5-HT concentration, serotonergic receptors and transporter densities were not associated with the presence of psychiatric disease in this group of patients. Our findings suggest that the serotonergic pathways are associated with epileptogenesis mechanisms. It was not evidenced any association between serotonergic pathways and psychiatric comorbidities in this group of TLE-HS patients

Devido ao largo espectro de manifestações na leishmaniose visceral canina (LVC), o exame clínico não é capaz de confirmar o diagnóstico, já que muitos dos sinais clínicos não são exclusivos da LVC, tornando-se imprescindível o diagnóstico laboratorial para confirmação da infecção por L. (L.) infantum chagasi. A sorologia tem sido a primeira escolha para o diagnóstico da leishmaniose canina; porém, a diversidade de técnicas empregadas e de antígenos tem levado a resultados conflitantes. O emprego de formas promastigotas e amastigotas do parasito tem boa concordância no sorodiagnóstico de LVC pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), porém o teste com amastigotas mostrou-se mais sensível sem perda da especificidade. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do ELISA no sorodiagnóstico da LVC empregando antígeno total bruto de formas amastigotas provenientes de cultura axênica (ELISA-AXE) e amastigotas purificadas de tecido de animal experimental cronicamente infectado (ELISA-AMA) comparando com o desempenho do ELISA feito com antígeno total bruto de formas promastigotas (ELISA-PRO) de L. (L.) infantum chagasi. Foram avaliados 115 soros de cães parasitologicamente positivos para a pesquisa de DNA de Leishmania por PCR, domiciliados a pelo menos 2 anos em municípios com alta transmissão de leishmaniose visceral, classificados em sintomáticos (n=67) e assintomáticos (n=48) de acordo com sinais clínicos e exames laboratoriais. Como controle, foram utilizados 81 soros de cães parasitologicamente negativos oriundos do município sem transmissão comprovada de leishmaniose visceral e 13 soros de cães com outras enfermidades. Os resultados não mostraram diferença significante em sensibilidade, especificidade, valores preditivos e acurácia entre os testes ELISA-AXE, ELISA-AMA e ELISA-PRO, com forte correlação e concordância entre os três antígenos testados. O ensaio de Western Blot mostrou reatividade para proteínas de diferentes pesos moleculares, entre 14 a 178kDa dependendo da fonte de antígeno. Os resultados mostraram desempenho semelhantes nos testes de ELISA com amastigotas axênicas, amastigotas purificadas e promastigotas como fonte de antígeno para sorologia da leishmaniose canina. A ampla e diversificada reatividade no Western Blot com poucas bandas altamente especificas sugere o emprego de quimeras de antígenos de diferentes pesos moleculares oriundos tanto de formas amastigotas como de formas promastigotas do parasito no diagnóstico da LVC / Due to the wide spectrum of manifestations in canine visceral leishmaniasis (CVL), clinical exam is not able to confirm the diagnosis, since many of the signs and symptoms are not exclusive of CVL, making it imperative that the laboratory diagnosis for infection confirmation by L. (L.) infantum chagasi. Since the direct search involves invasive material collection, time-consuming and expensive; the serology has been the first choice for diagnosis of canine leishmaniasis. However, the diversity of techniques employed and antigens have led to conflicting results in both diagnostic routine and applied research. Since the use of promastigotes and amastigotes of L. (L.) infantum chagasi have good agreement on serum diagnosis of CVL by reaction of Indirect Immunofluorescence (RIFI), despite the amastigote test proved more sensitive without loss of specificity. The main objective of this study was to evaluate and compare the performance of ELISA in the CVL using crude total antigen of axenic amastigote and promastigote culture, and purified amastigote from experimental chronically infected animal tissue of L. (L.) infantum chagasi. One hundred and fifty-five sera from dogs residing on areas with high disease incidence were evaluated by PCR and diagnosed positive for Leishmania, these were used as positive control on the present study. The animals were examined clinically and in accordance with the characteristic clinical signs of visceral leishmaniasis and laboratory tests, then were classified into 2 groups: symptomatic (n=67) and asymptomatic (n=48) animals. As negative control, eighty-one sera were used from dogs parasitologically negative by PCR in real time from the municipality without proven transmission of visceral leishmaniasis. The results showed no significant difference in sensitivity, specificity, predictive values and accuracy between ELISA-AXE, ELISA-AMA and ELISA-PRO, with strong correlation and concordance between the three antigens tested. The Western Blot assay showed reactivity for proteins of different molecular weights ranging from 14 to 178kDa depending on the antigen source. The results showed similar performance in the ELISA tests with axenic amastigotes, purified amastigotes and promastigotes as source of antigen for serology of canine leishmaniasis. The broad and diverse reactivity in Western Blot with few highly specific bands suggests the use of antigen chimeras of different molecular weights derived from both amastigote and promastigote forms of the parasite in the diagnosis of LVC