Submitted by Rodolfo Santos Rossi null (rodolfosrossi@gmail.com) on 2017-06-20T19:44:52Z No. of bitstreams: 1 Rossi - Dissertação Repositório UNESP.pdf: 1649974 bytes, checksum: eab3c6db952f25d7d6aa51700765d11b (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-06-21T14:07:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rossi_rs_me_bot.pdf: 1649974 bytes, checksum: eab3c6db952f25d7d6aa51700765d11b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-21T14:07:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rossi_rs_me_bot.pdf: 1649974 bytes, checksum: eab3c6db952f25d7d6aa51700765d11b (MD5) Previous issue date: 2017-04-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O objetivo deste estudo foi avaliar novas estratégias de identificação e tratamento de mastite subclínica causada por Streptococcus agalactiae. Dois estudos foram conduzidos para alcançar os objetivos propostos: 1) um ensaio clínico randomizado, para avaliar a eficácia do tratamento de S. agalactiae com cloxacilina intramamária (CLOXIMM), cefquinoma intramamária (CEFIMM) e cefquinoma intramuscular (CEFIM); e avaliar a não-inferioridade da CLOXIMM em relação a CEFIMM. E, 2) um estudo de acurácia diagnóstica, para estimar a acurácia do Somaticell, California Mastitis Test (CMT) e do exame microbiológico do leite composto (leite dos quatro quartos) na detecção de quartos e animais infectados com S. agalactiae. Os resultados indicaram que quartos tratados com CEFIM apresentaram menor taxa de cura bacteriológica (55%) do que aqueles tratados com CLOXIMM (86%) ou CEFIMM (98%). A diferença na proporção de cura bacteriológica entre CEFIMM e CLOXIMM foi de 0,121 (intervalo de confiança de 95%: 0,056 - 0,184). A CLOXIMM foi considerada não inferior a CEFIMM quando margens de não inferioridade de 0,20 e 0,25 foram utilizadas. Contudo, a determinação da não inferioridade foi inconclusiva para margens de 0,10 e 0,15. A cultura do leite composto apresentou acurácia diagnóstica satisfatória (95,7%) quando comparada a cultura individual por quarto. Para identificação dos quartos infectados com S. agalactiae, o ponto de corte considerado mais adequado foi de 205.000 células/mL para o teste Somaticell e escore 1 para o teste CMT. O teste Somaticell foi considerado mais acurado para uso em programas de erradicação, pois apresentou maior sensibilidade e menor proporção de resultados falso-negativos. Resultados deste estudo podem ser aplicados diretamente em nível de campo, para aumentar a eficiência de programas de erradicação de S. agalactiae. / The objective of the present study was to assess new strategies to identify and treat Streptococcus agalactiae subclinical mastitis. Two studies were conducted to achieve the proposed objectives: 1) a randomized clinical trial, to assess the efficacy of intramammary cloxacillin (CLOXIMM), intramammary cefquinome (CEFIMM), and intramuscular cefquinome (CEFIM), to treat S. agalactiae intramammary infections (IMI); and assess whether CLOXIMM was non-inferior to CEFIMM to treat S. agalactiae IMI. And, 2) a diagnostic accuracy study, to estimate the accuracy of the Somaticell, California Mastitis Test (CMT), and the composite milk microbiological examination of milk to detect S. agalactiae IMI. Results indicated that the bacteriological cure rate was lower for quarters treated with CEFIM (55%), as compared with CLOXIMM (86%) or CEFIMM (98%). The bacteriological cure difference between CEFIMM and CLOXIMM was 0.121 (95% confidence interval: 0.056 - 0.184). The CLOXIMM was considered non-inferior to CEFIMM when the non-inferiority margins of 0.20 and 0.25 were considered. Nevertheless, determination of non-inferiority was inconclusive for margins of 0.10 and 0.15. Microbiological examination of composite milk was of high accuracy (95.7%), as compared with microbiological examination of quarter milk samples. The thresholds of 205,000 cells/mL for the Somaticell and of score 1 for the CMT can be considered the most appropriate for diagnosing S. agalactiae IMI. The higher sensitivity and lower proportion of false-negative results are characteristics that can justify the use of the Somaticell in S. agalactiae eradication programs, as an alternative to the CMT. Results of this study can be directly applied at the farm level, to improve the efficiency of S. agalactiae eradication programs. / CNPq: 132538-2015-6

As plantas medicinais são utilizadas pelo homem desde os primórdios da humanidade. O conhecimento com relação a sua identificação e uso estabelecido pelo processo de experimentação, acertos e erros, é um patrimônio cultural dos povos. Com base nos princípios estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde, o resgate destes conhecimentos está sendo valorizado, através das etnociências. As práticas tradicionais em veterinária seguem o mesmo caminho. O novo paradigma para a produção agropecuária, trazido pela agroecologia, integra os conhecimentos tradicionais e aqueles ditos “modernos” para a moldagem de uma agricultura social, cultural, econômica e ecologicamente sustentável. Com base nesses parâmetros, este trabalho teve por objetivo avaliar plantas medicinais indicadas para uso como anti-séptico/desinfetante em situações-problema em produção animal, mais especificamente, em mastite bovina e dermatofitose, por uma comunidade agrícola. A coleta de informações referente ao uso das plantas foi realizada junto a COOPAVA, Cooperativa de Agricultores Assentados da reforma agrária, localizada no Município de Piratini, RS, utilizando método participativo, na moldagem de um planejamento de produção de leite em transição agroecológica. As plantas selecionadas foram Baccharis trimera, Bidens pilosa, Eucalyptus sp., Polygonum hydropiper e Tagetes minuta. Utilizaram-se extratos hidroalcoólicos (EHA) e decoctos (DEC) das plantas selecionadas – soluções desinfetantes - para avaliar: atividade antibacteriana frente a microrganismos causadores de mastite, utilizando o método da microdiluição serial em placas para estabelecer atividade inibidora e inativadora dos extratos; concentração inibitória mínima para dermatófitos de interesse em saúde animal e humana; e a cinética de inativação de microrganismos relacionados a mastite bovina pelas soluções desinfetantes. Essas soluções desinfetantes foram confrontadas com 25 amostras bacterianas, sendo nove Staphylococcus coagulase positiva, sete Staphylococcus coagulase negativa, oito Streptococcus spp. e uma Pseudomonas aeruginosa. Todos os extratos avaliados apresentaram ação antibacteriana. O EHA de Eucalyptus foi o que apresentou maior atividade inibidora bacteriana no conjunto do experimento. Quanto à inativação, o EHA de Eucalyptus, o EHA B. trimera e o DEC T. minuta apresentaram os melhores resultados, inclusive atuando frente a P. aeruginosa, embora em concentração mais alta do que frente às outras bactérias (p<0,05). Obteve-se atividade antifúngica de todos os EHA frente a todos os isolados avaliados, variando a CIM de 5,5% para EHA de T. minuta a 19,5% para EHA de B. trimera. Os decoctos de B. trimera e P. hydropiper foram os únicos ativos contra esses fungos. Os três EHA testados quanto a tempo de inativação tiveram bom desempenho frente a bactérias Gram positivas, com eficácia semelhante ao controle clorexidina a 0,18% (p>0,05) frente a S. agalactiae, com e sem a presença de matéria orgânica e, com exceção do EHA de B. trimera, frente a S. aureus sem matéria orgânica. Os decoctos tiveram desempenho inferior, apresentando bom desempenho somente frente a S. agalactiae. O desinfetante controle foi o mais eficaz quando confrontado com P. aeruginosa. Todas as soluções desinfetantes foram sensíveis à matéria orgânica. Pode-se concluir que as plantas medicinais com indicativo anti-séptico/desinfetante podem ser úteis em sistemas de produção agroecológicos, em situações-problema relacionadas aos agentes testados. / Since these ancient times, the succeeding civilization all over the world had used medicinal plants, in human and animal healthcare. The knowledge about it has evolutioned through trial and error methods and it’s the cultural patrimony of the peoples. In consonance to the WHO strategies, the identification and valorization this knowledge is on, by the ethno sciences. Agroecology is the new paradigm that it focuses on a systemic vision to integrate of the traditional and non-traditional practices. Two can complement one another to achieve a cultural, economic, ecologic and social sustainable livestock health care delivery system. This purpose of the present study was to evaluable “in vitro” activity of medicinal plants used to disinfectant/antiseptic in practice livestock to bovine mastitis and dermatophytes disease. The informants were familiar agriculturist on the agrarian reform seatment, on Piratini city, RS, as previous report, using participatory approaches. The five medicinal plants were selectioned: Baccharis trimera, Bidens pilosa, Eucalyptus sp., Polygonum hydropiper and Tagetes minuta. Antibacterial activity (bacteriostatic or bactericidal) of the hidroalchoolic (EHA) or decoction (DEC) extracts were determined through the serial dilution method in the multiple tube system in the microplate against 25 contagious bovine mastitis bacterial – nine Staphylococcus coagulase positive, seven Staphylococcus coagulase negative, eight Streptococcus spp and a P. aeruginosa. Minimal Inhibitory Concentration for six samples of dermatophytes was determined by dilution methods in the microplates. To test antibacterial kinetic, EHA and DEC of B. trimera, Eucalyptus and T. minuta were confronted to S. aureus, S. agalactiae and P. aeruginosa in different times and with or without organic load, included chlorhexidine 0.18% by control. All extracts were antibacterial. EHA from leaves of Eucalyptus sp. was the most bacteriostatic effective, and the same extract plus EHA B. trimera and DEC T. minuta were the best bactericidal. P. aeruginosa was more resistant that Gram positive bacterial (p<0.05). All EHA inhibited all dermatophytes valued. MIC was between 5.5% to EHA T. minuta and 19.5% to EHA B. trimera. DEC B. trimera and P. hydropiper were effective. In the kinetics experiment, the three EHA exhibited a good activity against Gram positive organisms. It were as strong to control, in presence or absence to organic load against S. agalactiae, and excluded EHA B. trimera, against S. aureus without organic load. The DECs were fewer effective. It was acted against S. agalactiae only. Chlorexidine was the best against P. aeruginosa. All disinfection solutions were sensible to organic load. The conclusion were that medicinal plants used ethnoknowledge system can to improved livestock health in the agroecologic systems, related to the studied transmitted agents.

A resistência bacteriana é responsável perante o fracasso no tratamento de infecções com agentes quimioterápicos. São necessárias novas alternativas para controlar estes micro-organismos. Entre essas alternativas estão plantas utilizadas tradicionalmente na medicina popular. O presente trabalho avaliou a eficiência dos extratos etanólicos e acetonicos de folhas de Cecropia pachystachya e Curatella americana com atividade antibacteriana in vitro em cepas de Staphylococcus aureus isolado de caso de mastite bovina. Os extratos de C. pachystachya e C. americana apresentam MIC de 2,5 mg.mL-1. O composto isolado de C. pachystachya denominado EEB2 apresentou actividade bactericida para uma concentração de 1,25 mg.mL-1. Estes resultados demonstram que os extratos de C. pachystachya e C. americana contém compostos anti-bacterianos. / Bacterial drug resistance is responsible for the failure of the treatment of infection using chemotherapeutic agents. Thus, new approaches are necessary for the control of these microorganisms. Included among these alternatives are several plants that are traditionally used in folk medicine. Therefore, the aim of this study was to evaluate the antibacterial activity of the ethanolic and acetone extracts of leaves of Cecropia pachystachya and Curatela americana in vitro against S. aureus bacteria isolates from cases of bovine mastitis. The extracts from C. pachystachya and Curatela americana had a MIC of 2.5 mg.mL-1. The compound isolated from C. pachystachya called EEB2 showed bactericidal activity at a concentration of 1.25 mg.mL-1. These results demonstrate that the extracts of C. pachystachya and C. americana contains antibacterial compounds.

Staphylococcus spp. é uma das principais causas da mastite bovina, onde o uso de antimicrobianos tem sido comprometido por mecanismos de resistência bacteriana e geração de resíduos que alteram a qualidade e segurança alimentar do leite e derivados. Foi avaliada a atividade in vitro da nisina (NS), do brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA) e do complexo NS/DDA contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. A CBM50 da nisina e DDA foi 50 e 4&#956;g/mL, respectivamente, enquanto que a CBM50 do complexo NS/DDA foi 3/2&#956;g/mL, com efeito parcialmente sinérgico. O estudo de time-kill revelou redução de 3 log10 UFC/mL após uma hora de interação entre NS/DDA e a bactéria. A microscopia de fluorescência confirmou uma perda da viabilidade após 6 horas de interação. A interação NS/DDA resultou na formação de nanopartículas (148,5 nm) catiônicas (+8,84 mV) cuja interação com a superfície bacteriana negativa (-27,32 mV) resultou em ação bactericida. NS/DDA pode ser uma alternativa promissora contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. / Staphylococcus spp. is a major cause of bovine mastitis, where the use of antimicrobials has been compromised by bacterial resistance mechanisms and waste generation that change the food quality and safety of milk and dairy products. The in vitro activity antibacterial was evaluated of the nisin (NS), of the dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA) and of the NS/DDA complex against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis. The CBM50 of nisin and DDA were 50 and 4&#956;g/ml, respectively, while the CBM50 NS/DDA complex was 3/2mg/mL, with partially synergistic effect. The time-kill study showed reduction of 3log10 CFU/mL after an hour of interaction between NS/DDA and bacteria. Fluorescence microscopy confirmed a loss of viability after 6h of interaction. NS/DDA interaction resulted in formation of nanoparticles (148.5 nm) cationic (+8.84 mV) which interact with negative bacterial surface (-27.32 mV) resulted in bactericidal activity. NS/DDA may be a promising alternative against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis.

Os objetivos do presente estudo foram: a) avaliar a frequência de isolamentos de patógenos causadores de mastite em rebanhos leiteiros comerciais; b) determinar a susceptibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. isolados de casos de mastite subclínica c) avaliar o perfil de multirresistência de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. d) Detectar o gene mecA em Staphylococcus spp. resistentes a oxacilina/meticilina; e) avaliar a associação entre as práticas de manejo e tratamento de mastite e a susceptibilidade antimicrobiana de Staphylococcus aureus isolados de rebanhos leiteiros. Foram selecionados para o presente estudo 13 rebanhos leiteiros a partir de um total de 60 rebanhos vinculados a um laticínio da região de Pirassununga/SP. Questionários previamente formulados foram respondidos pelos responsáveis do rebanho para avaliar a associação entre as práticas de manejo e tratamento de mastite e a susceptibilidade antimicrobiana de S. aureus. Após a seleção dos rebanhos e aplicação dos questionários, 1069 amostras de leite compostas foram coletadas durante 24 meses, em quatro períodos para realização de cultura e identificação dos patógenos, testes de susceptibilidade antimicrobiana e detecção do gene mecA. Os testes de susceptibilidade foram realizados em todos os isolados de Staphylococcus spp. e em 50% de Streptococcus spp. selecionados aleatoriamente. Os antimicrobianos testados foram: ampicilina 10 mg; clindamicina 2 &micro;g, penicilina 1 mg; ceftiofour 30 &micro;g; gentamicina 10 mg; sulfatrimetropin 25 &micro;g, enrofloxacina 5 &micro;g; sulfonamida 300 &micro;g, tetraciclina 30 &micro;g; oxacilina 1 mg; cefalotina 30 &micro;g e eritromicina 5 &micro;g. Todos os isolados de Staphylococcus spp. que apresentaram resistência a oxacilina/meticilina foram avaliados quanto à presença do gene mecA. Entre os isolados, Staphylococcus coagulase negativa foi o mais prevalente (28,6%), seguido por S. aureus (27,8%) e Corynebacterium spp. (10,9%). A susceptibilidade antimicrobiana dos isolados de S. aureus foi de 95,23% (eritromicina), 93,33% (cefalotina) e 65,71% (ampicilina). A susceptibilidade antimicrobiana dos isolados de Staphylococcus coagulase negativa (SCN) foi de 93,33% (cefalotina), 89,91% (eritromicina) e 62,03% (ceftiofur). Entre os isolados de Staphylococcus coagulase positiva (SCP), a susceptibilidade antimicrobiana foi de 93,33% (eritromicina), 91,11% (clindamicina e sulfonamida). A susceptibilidade antimicrobiana dos isolados de Streptococcus agalactiae foi de 38,46% (ampicilina) e 50% (sulfatrimetropin) e os isolados de S. dysgalactiae apresentaram susceptibilidade à tetraciclina de 19,44% e a clindamicina de 47,22%. A multirresistência foi maior entre os isolados de SCN (20,3%) e S.aureus (15,7%). Não foi detectado o gene mecA em nenhum dos isolados de Staphylococcus spp. Houve associação entre as variáveis para os seguintes antimicrobianos: a) tratamento de mastite clínica: ampicilina (P = 0,0055), ceftiofur (P = 0,0481), sulfatrimetropin (P= 0,0293), sulfonamida (P = 0,0043) e tetraciclina (P = 0,0058); e envio de amostras para cultura e antibiograma: ampicilina (P=0,0032), tetraciclina (P=<0,0001). Os principais fatores de risco para susceptibilidade antimicrobiana de S. aureus foram o não envio de amostras para cultura e antibiograma para tetraciclina (OR=6.012), penicilina (OR=4.687), eritromicina (OR=3.059) e ampicilina (OR=2.571), tratamento de mastite clínica para ampicilina (OR=2.178), ceftiofur (OR=1.956), gentamicina (OR=1.668), oxacilina (OR= 1.132) e penicilina (OR= 1.261) e tratamento de vaca seca para enrofloxacina (OR=2.111) e tetraciclina (OR=2.075). Os microrganismos mais frequentemente isolados foram Staphylococcus coagulase negativa e S. aureus. Os testes de susceptibilidade realizados para as espécies de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. apresentaram alta susceptibilidade para a maioria dos antimicrobianos testados. Com exceção de Streptococcus agalactiae para ampicilina e sulfatrimetropin e os isolados de S. dysgalactiae para tetraciclina e clindamicina. A maioria dos Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. não apresentaram perfil de multirresistência. Nenhum dos isolados de Staphylococcus spp. fenotipicamente resistentes a oxacilina/meticilina apresentaram o gene mecA. O maior fator de risco associado à susceptibilidade de S. aureus foi em relação à tetraciclina, penicilina, eritromicina e ampicilina para o não envio de amostras para cultura e antibiograma. Dois fatores de risco importantes identificados foram relacionados à ampicilina, ceftiofur, gentamicina, oxacilina e penicilina para o tratamento de mastite clínica e à enrofloxacina e tetraciclina para o tratamento de vaca seca. / The aims of this study were: a) to evaluate the frequency of mastitis pathogens in commercial dairy herds, b) to determine the antimicrobial susceptibility of Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. isolated from subclinical mastitis c) to evaluate the profile of multidrug resistance of Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. d) to detect the mecA gene in Staphylococcus spp. resistant to oxacillin / methicillin, e) to evaluate the association between management practices and treatment of mastitis, and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolates from dairy herds. Thirteen dairy herds were selected from a total of 60 dairy farms in the region of Pirassununga / SP. Questionnaires formulated previously were answered by dairy farmers to evaluate the association between mastitis treatment practices and antimicrobial susceptibility. A total of 1,069 composite samples of milk from all herds were collected for culture and identification of pathogens, susceptibility testing and mecA gene detection, over 24 months in four periods. The susceptibility tests were performed in all isolates of Staphylococcus spp. and in 50% of Streptococcus spp. randomly selected. The antimicrobials tested were ampicillin 10mg; 2&micro;g clindamycin, penicillin 1mg; ceftiofour 30&micro;g; gentamicin 10mg; sulfatrimetropin 25&micro;g, 5&micro;g enrofloxacin; 300&micro;g sulfonamide, tetracycline 30&micro;g; oxacillin 1mg; 30&micro;g cephalothin and erythromycin 5&micro;g. All Staphylococcus spp. that were resistant to oxacillin/methicillin in the susceptibility tests were investigated for the presence of mecA gene. Among the isolated bacteria, CNS was the most prevalent (28.6%), followed by S. aureus (27.8%) and Corynebacterium spp. (10.9%). The antimicrobial susceptibility of isolates of S. aureus was 95.23% (erythromycin), 93.33% (cephalothin) and 65.71% (ampicillin). The antimicrobial susceptibility of isolates of coagulase-negative Staphylococcus (CNS) was 93.33% (cephalothin), 89.91% (erythromycin) and 62.03% (ceftiofur). Among strains of coagulase positive Staphylococcus (CPS), the antimicrobial susceptibility was 93.33% (erythromycin), 91.11% (clindamycin and sulfonamide). The antimicrobial susceptibility of the strains of Streptococcus agalactiae was 38.46% (ampicillin) and 50% (sulfatrimetropin) and isolates of S. dysgalactiae were susceptible to tetracycline and clindamycin (19.44% to 47.22%). The multidrug resistance was higher among isolates of CNS (20.3%) and Staphylococcus aureus (15.7%). The mecA gene was not detected in any of Staphylococcus spp isolates. There was an association between variables for the following antimicrobials: a) treatment of clinical mastitis: ampicillin (P = 0.0055), ceftiofur (P = 0.0481), sulfatrimetropin (P = 0.0293), sulfonamide (P = 0.0043) and tetracycline (P = 0.0058); and sending samples for culture and antibiogram: ampicillin (P = 0.0032), tetracycline (P = <0.0001). Major risk factors for antimicrobial susceptibility of S. aureus were not submitting samples for culture and antibiogram for tetracycline (OR = 6.012), penicillin (OR = 4.687), erythromycin (OR = 3.059) and ampicillin (OR = 2.571), treatment of clinical mastitis: ampicillin (OR = 2.178), ceftiofur (OR = 1.956), gentamicin (OR = 1.668), oxacillin (OR = 1.132) and penicillin (OR = 1.261); and dry cow therapy: enrofloxacin (OR = 2.111) and tetracycline (OR = 2.075). The most frequent organisms isolated were coagulase negative Staphylococcus and S. aureus. The susceptibility tests performed for the species of Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. showed high susceptibility to most antimicrobials tested. With the exception of Streptococcus agalactiae to ampicillin and sulfatrimetropin and isolates of S. dysgalactiae to tetracycline and clindamycin. Most Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. did not show multidrug resistance profile. None of Staphylococcus spp. phenotypically resistant to oxacillin / methicillin showed the mecA gene. The major risk factor associated with susceptibility of S. aureus to tetracycline, penicillin, erythromycin and ampicillin was not sending samples for culture and sensitivity. Two important risk factors have been identified related to ampicillin, ceftiofur, gentamicin, penicillin and oxacillin for treatment of clinical mastitis and enrofloxacin and tetracycline for the treatment of dry cow dry cow therapy.

Le biofilm bactérien est une communauté de bactéries qui s’agrègent en un amas structuré recouvert d’une matrice polymérique et adhèrent sur une surface biotique ou abiotique. Ce mode de vie permet à ces bactéries de survivre dans un environnement hostile et cela entre autres grâce à une plus grande résistance aux antibiotiques que les bactéries sous forme libre ou planctonique. Les bactéries ayant la capacité de former des biofilms constituent donc un grave problème de santé tout aussi bien pour l’homme que pour l’animal comme par exemple dans le cas de la mammite bovine (MB). La MB est une inflammation de la glande mammaire de la vache induisant des dommages des tissus du pis et de ce fait, une réduction de la production de lait ainsi qu’une altération du bien-être de l’animal. Il est donc important de développer de nouvelles stratégies prophylactiques et thérapeutiques contre la MB. Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire avaient mis en évidence la capacité de certaines souches de staphylocoques à coagulase négative (SCN) produisant peu ou pas de biofilm à inhiber la formation de biofilm par d’autres bactéries responsables de MB. Notre hypothèse était donc que certaines souches faibles productrices de biofilm produisaient une ou plusieurs molécule(s) capable(s) d’inhiber de façon significative la formation de biofilm par d’autres SCN mais également par Staphylococcus aureus et possiblement d’autres agents pathogènes de la MB. Le but de ce projet fut donc de caractériser des molécules antibiofilm produites par des souches de SCN. Pour cela, 30 souches de staphylocoques (cinq espèces de SCN et S. aureus) fortes productrices de biofilm et 10 souches de SCN (Staphylococcus chromogenes et Staphylococcus simulans) faibles productrices de biofilm ont été utilisées. Nos résultats ont montré que certaines souches de SCN présentant un phénotype de faible production de biofilm réduisaient significativement la formation de biofilm chez plusieurs espèces de staphylocoques dont S. aureus. De plus, quatre souches de SCN (S. chromogenes C et E et S. simulans F et H) ont été capables d'inhiber de façon significative (p < 0,05) la formation de biofilm de 80% des souches testées. Cette activité antibiofilm a été également visualisée par microscopie confocale ainsi que dans des conditions dynamiques en utilisant un système de microfluidique. En parallèle, il a été démontré que les souches de SCN présentant un phénotype de faible production de biofilm n'inhibaient pas significativement la croissance des souches ayant un phénotype de forte production de biofilm. Par conséquent, l’activité antibiofilm observée ne semblait pas être due à une activité bactéricide. De plus, nos résultats ont montré que les surnageants de ces quatre souches présentaient également une activité antibiofilm et qu’ils possédaient un spectre d’activité étendu suggérant ainsi que les souches excrétaient une molécule antibiofilm dans son environnement extérieur. La caractérisation de ces surnageants a permis de mettre en évidence que l’activité inhibitrice était notamment conservée dans la fraction des surnageants < 3kDa et qu’une des molécules responsables de cette activité était hydrophile, thermorésistante et sensible à l’action de la RNase A. Enfin, nous avons pu observer que ces surnageants avaient la capacité de réduire voir même de prévenir la colonisation de la glande mammaire par une souche de S. aureus résistante à la méthicilline dans un modèle murin de mammite. Ces surnageants semblent être une alternative prometteuse dans le contrôle de la MB pour prévenir et/ou traiter cette infection que ce soit seul ou en association avec un traitement antibiotique. / Bacterial biofilms are structured communities of bacteria cells enclosed in a selfproduced polymeric matrix which is adherent to a biotic or abiotic surface. This lifestyle allows these bacteria to survive in hostile environments. For example, bacteria having the ability to form biofilms are significantly less susceptible to antibiotics than bacteria in planktonic form. Bacteria within biofilms pose a serious risk to human and animal health such as during bovine mastitis (BM). BM is an inflammation of the mammary gland of dairy cows which causes udder damages and reduces milk production. Therefore, it is important to develop new prophylactic and therapeutic strategies to control and treat BM. Preliminary results have demonstrated the ability of some coagulase-negative staphylococci (CNS) producing a weak biofilm to inhibit biofilm formation by other bacteria associated with BM. Our hypothesis is that some of CNS isolates having the ability to form a weak biofilm produce one or more molecule(s) able to significantly inhibit biofilm formation by other CNS, Staphylococcus aureus or other BM pathogens. The purpose of this project was to characterize antibiofilm molecules produced by CNS isolates. A total of 30 staphylococcal isolates (five species of CNS and S. aureus) with a strong biofilm phenotype and 10 CNS (Staphylococcus chromogenes and Staphylococcus simulans) isolates with a weak biofilm phenotype were used. Our results indicated that some CNS isolates with a weak biofilm phenotype significantly reduced biofilm formation of several staphylococcal species including S. aureus. Importantly, four isolates of CNS (S. chromogenes C and E and S. simulans F and H) were able to significantly inhibit biofilm formation (p < 0.05) of 80% of staphylococcal isolates tested. This activity was confirmed using confocal microscopy but also in dynamic conditions using a microfluidic system. Additionally, CNS with a weak biofilm phenotype did not significantly inhibit the growth of isolates with a strong biofilm phenotype. Therefore, the biofilm inhibition does not seem to be due to a bactericidal activity. The results also showed that the culture supernatants from these four bacteria still have an antibiofilm activity and own a broad spectrum of activity suggesting that the strains release an antibiofilm molecule into the external environment. The characterization of these supernatants indicated that the inhibitory activity was conserved in the < 3kDa fraction of the supernatants. Furthermore, one of the molecules responsible for the antibiofilm activity appears hydrophilic, heat-resistant and sensitive to the action of the RNase A. Finally, we observed that culture supernatants of these bacteria had the ability to reduce or even prevent colonization of the mammary gland by a strain of methicillin-resistant S. aureus in a murine model of mastitis. These supernatants appear to be a promising alternative alone or in combination with antibiotics in the control of BM.

Resumo: Entre agosto de 2005 e dezembro de 2006, foram obtidas 245 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras de leite de vacas com mastite, de óstios papilares da glândula mamária e de insufladores da ordenhadeira, procedentes de um rebanho bovino produtor de leite tipo B. Com a finalidade de monitorar as estirpes de S. aureus envolvidas em casos de mastite bovina por meio da verificação da relação epidemiológica existente entre as estirpes isoladas, especialmente com vistas aos sítios de localização e vias de transmissão, as estirpes foram submetidas à Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE), à amplificação das seqüências codificadoras (sea, seb, sec, sed e tst), por intermédio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), e suas sensibilidades in vitro a 12 antimicrobianos foram determinadas. Os resultados obtidos revelaram 51 diferentes perfis, sendo que a resistência à penicilina foi a predominante entre as 179 (73,1%) estirpes de S. aureus, quando considerada de forma particular (54,8%) ou em conjunto (29,4%). As 66 (26,9%) estirpes restantes foram sensíveis aos 12 antimicrobianos testados e a vancomicina foi o único princípio ativo que se mostrou eficiente a 100% das estirpes testadas. A PFGE revelou 39 pulsotipos distintos, dos quais 25 (64,1%) encontraram-se distribuídos nas 137 (55,9%) estirpes obtidas do leite. Dentre estas, 92 (67,1%) estirpes apresentaram resistência a um ou mais antimicrobianos e foram agrupadas em 22 (88,0%) pulsotipos distintos. Foi observado, também, por meio da PFGE, que nenhum pulsotipo foi isolado por mais de três colheitas consecutivas e que somente o pulsotipo 29 foi identificado em 5 (31,2%) colheitas...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two hundred and forty five Staphylococcus aureus strains were isolated between August of 2005 and December of 2006 from samples collected from a type-B milk-producing herd. Samples encompassed milk collected directly from mastitic cows, papillas osteuns of mammary glands, and milking machine cups. Samples were subjected to Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) to monitor for the strains of S. aureus and to determine epidemiologic relationships between the isolated strains, taking into account the different precedence of strains. PFGE was used to monitor the presence of specific coding sequences (i.e., sea, seb, sec, sed, and tst) in the milk samples using polymerase chain reaction (PCR) amplification. Moreover, sensitivity of strains to 12 different antibiotics was determined in vitro. Results revealed the presence of 51 different PFGE profiles of S. aureus in the samples, and highlighted 179 (73.1%) penicillin resistant strains. Nonetheless, the 66 (26.9%) other strains were sensitive to all 12 antibiotics tested, and vancomycin was the only antibiotic effective against all tested strains. PFGE also revealed 39 distinct peaks with 25 of them (64.1%) being present in 137 (55.9%) strains obtained from milk. Of these strains, 92 (67.1%) were resistant to one or more antibiotics, and were further grouped in 22 (88.0%) distinct peaks. Additionally, PFGE revealed the presence of no distinct peaks in samples from three consecutive collection times, and that peak 29 was the only one identified in 5 collection times (31.2%). Importantly, PGFE also indicated that in the periods A and H, which corresponded to 12.5% of the total time points, the isolated strains from one collection day (samples from all 3 sources) all had the peaks 2 and 12, respectively...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Antonio Nader Filho / Coorientador: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Carlos Augusto Fernande de Oliveira / Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago / Banca: Paulo Francisco Domingues / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Doutor

A mastite bovina apresenta alta prevalência nos rebanhos leiteiros e a antibioticoterapia é o procedimento mais utilizado no tratamento da mesma. O Staphylococcus aureus, agente etiológico mais frequentemente isolado em casos de mastite, tem demonstrado em diversos estudos aumento crescente no padrão de resistência aos antimicrobianos. O desenvolvimento de bactérias resistentes e a presença de resíduos de antimicrobianos no leite estimulam o desenvolvimento de novos tratamentos que solucionem estes problemas. O muco dos moluscos Achatina fulica é composto por uma glicoproteína, denominada achacin, com atividade antimicrobiana sobre bactérias Gram positivas. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do muco de A. fulica sobre S. aureus, bem como determinar e avaliar a concentração inibitória mínima (CIM) do muco de A. fulica purificado sobre S. aureus ATCC 25923 e isolados de S. aureus provenientes de infecções intramamárias bovina. O muco foi purificado mediante cromatografia líquida de alta eficiência e a fração com atividade antimicrobiana foi submetida à quantificação protéica e microdiluição em caldo. A CIM do muco purificado determinada para a cepa ATCC 25923 correspondeu a 50 &micro;g/mL e para os isolados de S. aureus, variou entre 12,5 e 100 &micro;g/mL. Sendo que destes, dois isolados (6,7 %) apresentaram CIM de 12,5 &micro;g/mL, três (10 %) CIM de 25&micro;g/mL, vinte e três (76,6 %) CIM de 50 &micro;g/mL e dois (6,7 %) apresentaram CIM de 100 &micro;g/mL. A CIM50 para os isolados correspondeu a 50 &micro;g/mL e a CIM90 a 100 &micro;g/mL. No presente estudo observou-se que o muco purificado apresentou atividade antimicrobiana com ação bactericida. Estes resultados proporcionam perspectivas para a compreensão e otimização de protocolos microbiológicos deste potencial biofármaco com a finalidade de empregá-lo futuramente na terapêutica veterinária para o controle de infecções intramamárias causadas por S. aureus. / The bovine mastitis is highly prevalent in dairy herds and antibiotic therapy is the procedure most commonly used to treat it. Staphylococcus aureus is the most frequently isolated etiologic agent in cases of mastitis and it has been shown in several studies the pattern of increasing antimicrobial resistance. Due to the development of resistant bacterias and the presence of antimicrobial residues in the milk the development of new treatments to solve those problems are required. The mucus of the molluscs Achatina fulica contains a glycoprotein called achacin that presents antimicrobial activity against Gram positive bacteria. The aim of this study was the evaluation of the in vitro antimicrobial activity of the A. fulica mucus of on S. aureus, as well the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of A. fulica mucus purified on S. aureus ATCC 25923 and isolates of S. aureus from bovine intramammary infections. The mucus was purified by high performance liquid chromatography. The protein content in portion presenting the was quantified and microdiluted. The MIC determined for the purified mucus strain ATCC 25923 was 50 &micro;g/mL and for the isolates of S. aureus ranged between 12,5 and 100 &micro;g/mL. Among these samples, two isolates (6,7 %) showed MIC of 12,5 &micro;g/mL, three (10 %) of MIC 25 &micro;g/mL, twenty-three (76,6 %) MIC of 50 &micro;g/mL and two (6,7 %) had an MIC of 100 &micro;g/mL. The MIC50 for isolates was 50 &micro;g/mL and MIC90 to100 &micro;g/mL. It was found that the purified mucus showed bactericidal activity. The results showed in the present work improved the understanding and optimization of the biopharmaceutical microbiological potential that could be applied in new protocols in future veterinary therapy for the control of intramammary infections caused by S. aureus.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Alziro Vasconcelos Carneiro.pdf: 455403 bytes, checksum: 96b519d909bc30f30ddc42546978acfb (MD5) Previous issue date: 2006-07-31 / There are several pathogens causing bovine mastitis, but only Streptococcus agalactiae is feasible to be eradicated from a herd. Two herd data ( A and B ) were used to evaluate the economic and technical viability of the eradication of this pathogen, based on this pathogen attack program. It was used a 24 month period data from production; somatic cells count (SCC), clinical mastitis and expenditures. A cost-benefit analysis was carried out through mathematical models. It was identified 16 infected cows with S. agalactiae in herd A , and in herd B , there were 42, from which 31 associated with Staphylococcus aureus. The therapy effectiveness in eliminating S. agalactiae was about 100% in both herds. However, 18 cows kept the infection of S. aureus after the therapy (42% of effectiveness). The number of cases and cows with mastitis decrease was about 18% and 21%, respectively. For herd B it was found a SCC growing tendency on infected group and on total milk, 12 months before the therapy (980x10P 3 P and 968x10P 3 P cells/ml averages, respectively) and stabilization after treatment (577x10P 3 P cells/ml and 563x10P 3 P cells/ml averages, respectively). Treatment cost was about R$ 175.95 per cow considering the following higher cost items: laboratory exams (39%); milk discard (31%); veterinary medicaments and labor for additional operations (20%); and veterinary fees (10%). Payment due to quality and to the decrease in clinical mastitis cases represented about 55% e 34% of total benefit. However, it was not found significant milk production increase for treatment program (p>0.05), in treated group, nor in herd B . It was estimated about 11.67; 6.45 and 2.61 monetary unit return for each unit invested. Prophylactic procedures were important to eradicate and maintain the herd free from S. agalactiae, they have also contributed for lower incidence of clinical mastitis, decreasing SCC and discard/precocious mortality, so its adoption is recommended. Considering Brazilian requirements relative to somatic cells and milk total bacterial as well as S. agalactiae role in increasing these parameters, it is suggested an eradication program of this pathogen, which may help farmers to maintain production under standard requirements, as well as the consumers reducing risk and Government income loss due to taxes collection. / Entre os v?rios pat?genos causadores de mastite, o ?nico que pode ser erradicado do rebanho ? Streptococcus agalactiae. Dados de dois rebanhos, 'A' e 'B', foram utilizados para avaliar a viabilidade t?cnica e econ?mica de um programa de erradica??o deste pat?geno. Foram utilizados dados de produ??o, contagem de c?lulas som?ticas (CCS), mastite cl?nica e financeiros, de 24 meses. An?lise custo/benef?cio foi realizada com aux?lio de modelos matem?ticos. Identificaram-se 16 vacas infectadas com S. agalactiae no rebanho 'A' e 42 no rebanho 'B', sendo que destas ?ltimas, 31 apresentaram infec??o associada com Staphylococcus aureus. A efic?cia da terapia de ataque foi de 100% nos dois rebanhos. Entretanto, 18 vacas no rebanho B mantiveram a infec??o por S. aureus ap?s a terapia (42% de efic?cia). No rebanho 'B', a redu??o do n?mero de casos e de vacas com mastite cl?nica foi de 18 e 21%, respectivamente. A CCS apresentou tend?ncia crescente no grupo infectado e no leite total, nos 12 meses antecedentes ? terapia, com as m?dias de 980x103 e 968x103 c?l/ml, respectivamente. Ap?s o tratamento, as m?dias estabilizaram-se em 541x103 e 563x103 c?l/ml, respectivamente. O custo do tratamento foi de R$ 175,95 por vaca/tratada, sendo 39% deste com exames laboratoriais, 31% descarte de leite, 20% medicamentos e m?o-de-obra devido a opera??es adicionais e 10% honor?rios do m?dico veterin?rio. O pagamento por qualidade e a redu??o dos custos com a mastite cl?nica representaram 55% e 34% do benef?cio. Aumento significativo n?o foi observado (p>0,05) na produ??o m?dia de leite dos grupos tratados e do rebanho 'B'. Estimaram-se retornos de 11,67, 6,45 e 2,63 unidades monet?rias para cada unidade investida no programa de erradica??o de S. agalactiae. As medidas terap?uticas e profil?ticas foram eficazes para erradicar e manter o rebanho livre de S. agalactiae, al?m de contribu?rem para reduzir a CCS do leite, a incid?ncia de mastite cl?nica, o descarte/mortalidade precoce e proporcionou ganhos em programa de pagamento por qualidade, sendo sua ado??o recomend?vel. Considerando as exig?ncias brasileiras com rela??o ao limite de c?lulas som?ticas e de bact?rias totais no leite e o papel de S. agalactiae no aumento desses par?metros, o programa de erradica??o deste pat?geno pode significar a perman?ncia do produtor na atividade formal, al?m de reduzir risco para os consumidores e perdas de receitas do Governo com recolhimento de impostos.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.