Este trabajo se enmarca en el área de dispositivos semiconductores, siendo su propósito concreto el realizar una aportación original a los estudios teóricos relativos al transporte de portadores en las regiones de silicio con perfiles de concentración de impurezas no uniformes. Con esta finalidad se ha partido de la utilización de un método semi-analítico original de resolución de las ecuaciones del semiconductor en una zona casi-neutra, llamado solución iterativa, que permite obtener con gran rapidez el valor exacto de la corriente y/o el perfil de minoritarios, tanto en condiciones de oscuridad como de iluminación, requiriendo el concurso de recursos informáticos muy modestos. Este método de solución ha sido validado mediante la comparación de sus resultados tanto con resultados procedentes de simulaciones exactas como con medidas experimentales. La disponibilidad de la solución iterativa permite identificar qué parámetros y factores físicos son los dominantes en el comportamiento eléctrico de la región de emisor. Los resultados obtenidos indican que la dosis (cantidad de impurezas existente en el emisor) y la velocidad de recombinación en la superficie son los parámetros de mayor influencia sobre la corriente de emisor en oscuridad. Asimismo el estudio realizado muestra que es posible hacer una interpretación física sencilla de esta corriente en base a sus componentes de recombinación superficial y volumétrica. De este estudio además se deriva que es posible extraer condiciones de minimización de la corriente, resultado de gran interés cara al diseño óptimo de emisores para dispositivos avanzados. A continuación el trabajo utiliza el principio de superposición para obtener soluciones analíticas aproximadas de la corriente de emisor, tanto para condiciones de oscuridad como de iluminación. Estas nuevas soluciones mestran un buen compromiso entre margen de validez y complejidad formal (igual o superior al de otras soluciones comparables propuestas en la literatura), y una estructura fácil de relacionar con interpretaciones físicas. El último objetivo del trabajo consiste en la aplicación de lo obtenido a la optimización del emisor en una célula solar de silicio monocristalino. Un análisis de las prestaciones fotovoltaicas de la célula revela que existe siempre un rango de dosis que conduce a resultados fotovoltaicos óptimos, y que estos resultados óptimos son poco dependientes de la anchura del emisor, lo cual supone una cierta libertad a la hora de escoger qué perfil de dopado es el más conveniente. Finalmente se propone y evalúa a nivel teórico la utilización de contactos de polisilicio en el emisor. Los resultados obtenidos muestran una reducción de la corriente de oscuridad y con ella una mejora directa de las prestaciones fotovoltaicas, en concreto de la tensión de circuito abierto y del rendimiento. Estas perspectivas vienen confirmándose a nivel práctico por otros trabajos recientes y/o actualmente en curso. / This work is framed in the semiconductor devices area, being its main purpose making an original contribution to the theoretical studies on transport of carriers in silicon regions with nonuniform profiles of impurity concentration.To this effect, an original semi-analytical method of resolution of the equations of the semiconductor in an quasi-neutral zone, called iterative solution, is introduced and used. Such solution allows very quickly to obtain the exact value of the current and the minority carrier profile, both under illumination or dark conditions, requiring the aid of very reduced computation resources and time. This method of solution has been validated by comparison with results coming from exact numerical simulations and with results extracted from experimental measurements. The availability of the iterative solution allows to easily identify what physical parameters and factors are the dominant ones in the electrical behavior of the emitter region. The obtained results indicate that the dose -that is, the total amount of impurities in the emitter- and the recombination speed at the surface are the parameters of greater influence on the emitter current under dark conditions. The study also shows that it is possible to make a rather simple physical interpretation of the current behavior on the basis of its components of superficial and volumetric recombination. Moreover, it is concluded that it is possible to extract conditions for current minimización, being this a result of great interest to the optimal design of emitters for advanced devices. Next the work uses the superposition principle to obtain approximate analytical solutions of the emitter current, as much for dark conditions as for illumination. These new solutions exhibit a good commitment between validity margin and formal complexity (equal or superior to the one of other comparable solutions proposed in the literature), and a formal structure which is easy to relate to physical interpretations. The last objective of the work consists of the application of the obtained tools to the optimization of the emitter region in solar monocrystalline silicon cells. An analysis of the cell reveals that a dose rank always exists that leads to optimal photovoltaic results, and that these optimal results are little dependent on the emitter width, thus introducing some degree of freedom at the time of choosing what doping profile is most optimal. Finally the use of polysilicon contacts in the emitter is evaluated at the theoretical level. Here the obtained results show that a significant reduction of the dark current can be obtained, with a direct improvement of the cell performance, in concrete of the open circuit voltage and of the conversion efficiency. These perspectives are in good agreement with practical results from other recent and currently underway works.

No description available.

Els carcinomes usualment presenten inestabilitat cromosòmica (CIN), mostrant tant anomalies estructurals com numèriques. La CIN es genera a l'inici del desenvolupament del càncer i representaria un pas important en l'inici i/o progressió tumoral. Un model per estudiar la CIN deguda a disfunció telomèrica són les cèl·lules epitelials mamaries humanes (HMECs). Quan les HMECs es cultiven in vitro proliferen fins assolir un plateau, anomenat fase de selecció. La inactivació espontània del gen que codifica la proteïna p16INK4a, permet a les cèl·lules seguir proliferant amb una longitud telomèrica per sota de la normal. Els cromosomes amb telòmers disfuncionals poden ser reparats de forma il·legítima conduint a l'aparició de cromosomes dicèntrics els quals són susceptibles d'entrar en cicles de fusió-pont-trencament (BFB) tot generant CIN estructural (S-CIN). En aquesta tesi es descriuen els mecanismes bàsics de generació CIN deguda a disfunció telomèrica. Primerament, es determinà que l'entrada de cromosomes dicèntrics en cicles BFB genera una CIN massiva que es visualitza amb la presència de morfologies nuclears anòmales (ANM). L'anàlisi de HMECs binucleades demostrà la presència de tres tipus d'ANM: ponts cromatínics, protuberàncies nuclears i micronuclis, els quals incrementaven a mesura que incrementava la disfunció telomèrica. És més, es demostrà que aquestes ANM són originades pels cromosomes amb disfunció telomèrica alhora que s'evidencià un origen comú per als tres tipus d'ANM gràcies a l'estudi de la resolució de ponts anafàsics mitjançant microscòpia a temps real. A més, la utilització de la tècnica de FISH aplicant sondes pancentromèriques i centromèriques específiques per a cromosomes amb escurçament telomèric i cromosomes de longitud telomèrica normal va permetre establir que la disfunció telomèrica a més de generar S¬CIN també pot originar inestabilitat cromosòmica numèrica (W-CIN). Això succeeix quan els ponts anafàsics deguts a disfunció telomèrica segreguen erròniamet durant la mitosi. La capacitat d'un pont anafàsic de no trencar-se durant la divisió cel·lular podria estar condicionada per les forces mecàniques que oposa la cromatina que forma el pont juntament amb la capacitat que tenen els microtúbuls a no perdre la seva unió amb els cinetocors del pont. L'estudi dels ancoratges dels microtúbuls als cinetocors demostrà que els cinetocors dels ponts anafàsics no perden la seva connexió amb els microtúbuls que els uneixen, i poden romandre íntegres més enllà de la sortida de la mitosi. És més, la resistència que oposa la cromatina que intervé en el pont causa un retard en la seva migració fent que se situïn propers a l'equador de la cèl·lula, mentre que altres cromosomes segreguen normalment. Tot plegat, afavoriria la segregació errònia dels ponts anafàsics tot generant aneuploïdies. Per últim, mitjançant citometria de flux es confirmà la presència de HMECs poliploides, l'aparició de les quals està lligada a la interferència dels ponts anafàsics, generats per disfunció telomèrica, amb la consecució de la citocinesi induint la regressió del solc de divisió generant cèl·lules tetraploides. I no només això, sinó que aquestes cèl·lules 4N presentaven nivells més elevats d'inestabilitat cromosòmica, tant estructural com numèrica, que les diploides isogèniques. Tot plegat, ha permès dibuixar una connexió entre la disfunció telomèrica i l'aparició de tetraploïdies, dos esdeveniments que per separat s'havien relacionat amb la carcinogènesi, però que no havien estat vinculats encara. A l'inici del desenvolupament tumoral la disfunció telomèrica seria responsable de l'aparició de S i W-CIN alhora que també originaria cèl·lules tetraploides. Aquestes cèl·lules tetraploides altament inestables es dividirien de forma asimètrica generant cèl·lules filles aneuploides amb CIN. La posterior reactivació de la telomerasa minimitzaria la CIN deguda a disfunció telomèrica mentre que altres fonts de CIN perdurarien permetent la progressió tumoral. / Epithelial tumours frequently exhibit chromosomal instability (CIN), and show both reorganized chromosomes and aneuploidies. CIN emerges early during carcinogenesis and is an important event in the promotion of tumour development. A valid model for studying telomere-dependent CIN is the human mammary epithelial cell system (HMECs). When these cells are cultured in vitro they proliferate actively until they reach a first plateau phase called selection. Spontaneous inactivation of the gene that codifies for p16INK4a allows cultures to be extended and the generation of CIN due to telomere dysfunction. Chromosomes with dysfunctional telomeres can fuse illegitimately and originate dicentric chromosomes, which may enter into breakage-fusion¬bridge cycles (BFB cycles) that give rise to structural CIN (S-CIN). Our work describes the different mechanisms through which telomere dysfunction can originate CIN in human cells. We first determined that when dicentric chromosomes enter into BFB cycles, CIN can be visualized by the presence of abnormal nuclear morphologies (ANM). The study of binucleated HMECs showed that there are three main types of ANM, nucleoplasmatic bridges (NPB), nuclear blebs (B) and micronuclei (MN), which increase throughout the cell culture in parallel with increasing telomere dysfunction. Furthermore, using in situ hybridization with fluorescent probes we determined that chromosomes with dysfunctional telomeres were involved in the formation of the different ANM. Real time microscopy revealed that B and MN originated through the breakage of anaphase bridges derived from the fusion of two unprotected chromosomes. Next we wanted to determine if telomere dysfunction was also responsible for the generation of numerical chromosome aberrations in addition to the structural ones. Pancentromeric and centromere specific FISH probes for chromosomes with telomere dysfunction and also with normal telomere length were applied to HMECs. Our results showed that telomere dysfunction not only generates structural CIN (S-CIN) but also whole chromosome instability (W-CIN) due to the missegregation of anaphase bridges during mitosis. The capacity of an anaphase bridge to remain unbroken during mitosis could be related to: 1) the mechanical forces of the intervening chromatin in the bridge that oppose the pulling of kinetochore microtubules at anaphase, and 2) the integrity of the attachment between the kinetochores and the microtubules in the bridged chromatin. The analysis of microtubule-kinetochore attachments showed that chromosome bridges rarely lose their connection with microtubules. In addition, the resistance given by the intervening chromatin in the bridge causes a delay in their migration so that they lag closer to the cell equator, whereas the kinetochores from normal chromosomes are situated close to the poles. Overall, these results imply that bridges that remain near the cell equator could ultimately be missegregated, which would cause aneuploidy. Finally, using flow cytometry approaches it was confirmed that a polyploid HMEC population emerged in the later phases of the culture. These polyploid cells appeared to be related to the presence of anaphase bridges due to telomere dysfunction. Unbroken anaphase bridges trapped below the cleavage furrow ultimately caused cytokinesis regression, which originated binucleated tetraploid cells. Importantly, these polyploid cells were significantly more unstable than the isogenic diploids. In summary, our results showed a connection between telomere dysfunction and the appearance of polyploidy: two events that have been related separately to carcinogenesis in humans. Early in the tumourigenic process telomere dysfunction would originate S and W-CIN as well as polyploid cells. This unstable tetraploid lineage of cells would divide with asymmetric divisions originating a highly aneuploid progeny with CIN. After telomerase activation, CIN, due to telomere dysfunction, would be minimized while other remaining sources of CIN would persist and be responsible for tumour progression.

La insuficiència cardíaca congestiva és una epidèmia creixent a nivell mundial. Les causes principals de la insuficiència cardíaca estan relacionades amb el dany irreversible que resulta d'un infart de miocardi. El cor humà té una capacitat de regeneració limitada, i la pèrdua de múscul, juntament amb la contracció i la fibrosi de la cicatriu miocàrdica, posen en joc un conjunt d'esdeveniments anomenats remodelat ventricular, que finalment tendeixen cap a una insuficiència cardíaca congestiva. En l'actualitat no hi ha cap tractament o procediment clínic, amb excepció del trasplantament cardíac, que substitueixi la cicatriu de l'infart per teixit contràctil funcional. Recentment, la identificació de diferents tipus de cèl·lules mare capaces de contribuir a la regeneració dels teixits ha generat un notable interès en la possibilitat que la teràpia cel·lular pugui ser utilitzada per reparar el miocardi danyat (cardiomioplàstia cel·lular). No obstant això, es desconeix encara quin és el tipus cel·lular ideal per a la cardiomioplàstia cel·lular.Tradicionalment, es pensava que les cèl·lules mare pròpies d'un teixit adult només podien diferenciar-se cap a cèl·lules del teixit d'origen. Recentment, però, un conjunt d'estudis han demostrat que les cèl·lules mare adultes poden diferenciar-se cap a llinatges diferents als del seu teixit d'origen exhibint una plasticitat que ha estat anomenada transdiferenciació. Les cèl·lules mare mesenquimals són unes cèl·lules no hematopoètiques que típicament s'han aïllat del moll d'os però que més endavant s'ha demostrat que resideixen virtualment en tots els teixits. La seva accessibilitat, capacitat proliferativa, potencial de diferenciació i perfil immunològic fan que les cèl·lules mare mesenquimals adultes siguin un candidat principal per l'aplicació en teràpia regenerativa.En aquesta tesi hem aïllat i estudiat tres tipus de cèl·lules mare d'origen mesenquimal de tres teixits diferents, el moll d'os, el teixit adipós subcutani i el teixit adipós epicàrdic. Tots ells s'han caracteritzat in vitro i se n'ha estudiat la velocitat de creixement, la seva expressió de marcadors de superfície i la seva capacitat pluripotencial vers els llinatges adipogènic i osteogènic. La recerca en aquesta tesi però, s'ha centrat en el seu potencial per a la regeneració cardiovascular. Per aquest motiu es va estudiar el potencial cardiomiogènic mitjançant l'anàlisi de l'expressió basal de marcadors característicament cardíacs i la seva capacitat de diferenciació cap a cardiòcits. Dels resultats obtinguts en aquesta primera fase in vitro vam concloure que les cèl·lules progenitores derivades de greix epicàrdic (epiATPC), unes cèl·lules no descrites fins ara, eren el candidat cel·lular ideal per a l'estudi del seu potencial de regeneració del miocardi infartat in vivo. Per aquest motiu, es va estudiar l'efecte de les epiATPC trasplantades en dos models animals d'infart de miocardi en els quals es va observar una notable millora del miocardi infartat a nivell histològic i de funció. En conclusió, les epiATPC són una font cel·lular alternativa per a la cardiomioplàstia cel·lular, com ho demostra la seva capacitat de diferenciació cap a cardiòcit i cèl·lula endotelial, així com la millora de la funció cardíaca observada en els dos models d'infart agut de miocardi estudiats en aquest treball. / Congestive heart failure is a growing epidemic worldwide. The main causes of heart failure are related to the irreversible damage that results from a heart attack. The human heart has a limited capacity for regeneration, and loss of muscle, along with contraction and fibrosis of the myocardial scar, put into play a series of events known as ventricular remodelling, which ultimately tend to congestive heart failure.At present there is no treatment or clinical procedure, with the exception of heart transplant, to replace the scar tissue for a viable tissue with contractile function. Recently, the identification of different types of stem cells capable of contributing to the regeneration of tissues has generated a significant interest in the possibility that cell therapy can be used to repair the damaged myocardium (cellular cardiomyoplasty). However, it is not known yet which cell type is ideal for the cellular cardiomyoplasty.Traditionally, it was thought that stem cells of an adult tissue could only differentiate itself into cells types of the tissue of origin. Recently, however, a number of studies have shown that adult stem cells can differentiate itself into different lineages of their tissue of origin displaying a plasticity that has been called transdifferentiation. Adult mesenchymal stem cells are a non-haematopoietic cells that typically have been isolated from the bone marrow but was later shown to reside in virtually all tissues. Its accessibility, proliferative capacity, potential for differentiation and immunological profile makes adult mesenchymal stem cells a primary candidate for the application in regenerative therapy.In this thesis we isolated and studied three types of stem cells of mesenchymal origin from three different tissues, bone marrow, subcutaneous fat and epicardic adipose tissue. All of them have been characterized in vitro and has studied the rate of growth, their expression of surface markers and their capacity towards the adipogenic and osteogenic lineages. Research in this thesis however, has focused on the potential for cardiovascular regeneration. That is why we studied the cardiomyogenic potential by analyzing the expression of basal characteristically cardiac markers and their ability to differentiate into cardiomyocytes. Based on the results obtained in this first phase in vitro we conclude that epicardial fat progenitor cells (epiATPC), a stem cell type not reported until now, were the ideal cell type for the study of their potential to regenerate myocardial infarction in vivo. For this reason, we studied the effect of epiATPC transplanted in two animal models of myocardial infarction in which there was a remarkable improvement of the infracted myocardium at histological and functional levels.In conclusion, epiATPC are an alternative cell source to cellular cardiomyoplasty, as demonstrated by their ability to differentiate into cardiomyocytes and endothelial cells, as well as the improvement of cardiac function observed in the two models of acute myocardial infarction studied in this work.

En aquest treball s'ha abordat el problema de l'optimització dels cultius de cèl·lules animals, més específicament dels hibridomes, des de l'estudi de l'aplicació de diferents estratègies de cultiu, com les operacions en discontinu, discontinu alimentat, i continu amb perfusió. Aquestes estratègies de cultiu s'han realitzat en un bioreactor de tanc agitat amb l'ajut d'eines de monitoratge i control que genèricament s'han utilitzat per obtenir informació i poder actuar, en els casos que ha estat necessari, sobre l'entorn cel·lular. En l'estratègia en discontinu s'han validat les mesures de concentració cel·lular i d'activitat cel·lular, utilitzades per obtenir informació en línia de l'estat del cultiu, i s'ha optimitzat l'operació mitjançant la fortificació del medi de cultiu. Tot i que aquest és el sistema d'operació més estès des del punt de vista industrial, bàsicament per la seva simplicitat, es demostra que és clarament subòptim, ja que les cèl·lules es troben sotmeses sempre a un ambient canviant en què les condicions de cultiu són poc favorables. Mitjançant l'operació en discontinu alimentat s'ha intentat donar solució als problemes de l'operació en discontinu, tot canviant el metabolisme cel·lular fixant els substrats majoritaris a baixos nivells de concentració, i així poder reduir la producció de subproductes inhibitoris i, per tant, augmentar la concentració cel·lular i perllongar la vida del cultiu. Per a tal propòsit, s'ha fet necessari l'ús de diferents esquemes de control de nutrients amb l'ajut de les mesures implementades en línia i del disseny d'una solució concentrada d'addició. En concret, les estratègies desenvolupades graviten sobre dues mesures en línia, la de la concentració cel·lular i la del consum d'oxigen, indicativa de l'activitat cel·lular. De totes formes, encara que els subproductes es redueixen i la concentració cel·lular augmenta, no ho fa en prou quantia respecte al cultiu amb medi fortificat i, per tant, la productivitat augmenta molt lleument. Per eliminar els problemes tant de l'operació en discontinu com de l'operació en discontinu alimentat, les cèl·lules són retingudes a l'interior del reactor mitjançant un mòdul de microfiltració extern i són cultivades amb una aportació constant de medi, de manera que es garanteix una presència dels diferents nutrients essencials a unes concentracions adequades per a les cèl·lules i s'aconsegueix eliminar els diferents subproductes cel·lulars que podrien esdevenir tòxics, aconseguint així unes condicions el més semblants possibles a les que tindria la cèl·lula in vivo. A partir dels resultats obtinguts s'ha pogut constatar que aquesta estratègia de cultiu permet obtenir elevades concentracions cel·lulars durant períodes de temps superiors als de les altres dues estratègies estudiades, incrementant-se també tant la productivitat com la concentració final d'anticòs monoclonal. / In this thesis the problem of the mammalian cells culture optimisation, more specifically of hybridomas, has been undertaken from the study of application of different cultivation strategies, as the operations in batch, fed-batch, and continuous perfusion. These cultivation strategies have been carried out in a well agitated bioreactor with the aid of monitoring and control tools that they have been utilised to obtain information and to be able to act upon the cellular environment, in the cases that has been necessary. In batch strategy it has been validated the measurements of cellular concentration and cellular activity, utilised to obtain on-line information of the culture state, and the operation has been optimised fortifying the growth medium. Although this is the most extended operation system from industrial point of view, basically by their simplicity, is shown that is clearly sub-optimised, since the cells have been always submitted to a changing environment where culture conditions are unfavourable. Fed-bath strategy has tried to give solution to batch operation problems, changing the cellular metabolism setting the major substrates to low concentration levels, and thus to be able to reduce the production of inhibitors by-products and, therefore, to increase cellular concentration and to extend cell culture life. For this purpose, it is done necessary the use of different nutrients scheme control with the aid of the implemented on-line measurements and the design of concentrated addition solutions. In concrete, the strategies developed gravitate upon two on-line measurements: cellular concentration and oxygen consumption rate, indicative of cellular activity. Nevertheless, although by-products production are reduced and cellular concentration is increased, does not do it in sufficient amount regarding the cell culture made with fortified growth medium and, therefore, the productivity is increased very lightly. To eliminate the problems of batch and fed-batch strategies, the mammalian cells are retained inside of bioreactor by means of an external microfiltration module (hollow fiber) and they are cultivated with a constant medium contribution. By means this strategy the presence of different essential nutrients is guaranteed to adequate concentrations for the cells and is obtained to eliminate the different cellular by-products that would be able toxic, being reached thus similar conditions that would have the cells in vivo. The obtained results has been able to confirm that this cultivation strategy permits to obtain high cell concentrations during long time periods over the other two strategies studied, being increased also so much the productivity as the final monoclonal antibody concentration.

El hierro es un elemento imprescindible para los seres vivos. En la naturalezase encuentra fundamentalmente en forma de Fe(lll) formando parte de sales ehidróxidos de muy baja solubilidad, lo que lo hace biológicamente inaccesible para losseres vivos mediante mecanismos simples de asimilación. En su forma reducida, elFe(ll) es mucho más soluble, pero también muy inestable, pasando immediatamentea Fe(lll) en presencia de oxígeno. Por otro lado, el hierro puede resultar tóxico para lacélula a concentraciones superiores a las requeridas por ésta, hecho éste que haforzado en la célula el desarrollo de mecanismos de incorporación del hierroaltamente regulados. El primer paso en la asimilación del hierro por S. cerevisiaeimplica la reducción del Fe(lll) extracitoplasmático a Fe(ll), estado en el cual el hierroes captado y transportado al citoplasma celular. En S. cerevisiae se han descrito dossistemas para la entrada de hierro en la célula. El sistema de baja afinidad, pococaracterizado hasta el momento, funciona cuando el hierro extracelular es abundante,siendo FET4 el gen que codifica para el transportador del hierro en estascondiciones, el único elemento genético de este sistema que ha sido caracterizado.Cuando el hierro es deficiente en el medio entra en funcionamiento el sistema de altaafinidad, en el que intervienen dos ferro-reductasas de membrana, productos de losgenes FRE1 y FRE2, que reducen el Fe(lll) extracitoplasmático a Fe(ll), el cual escaptado por una oxidasa de membrana, producto del gen F£T3, que se encarga depasarlo de nuevo a Fe(lll) y transportarlo al citoplasma. Resultados nuestros y deotros autores demuestran que la expresión de estos tres genes depende del productodel gen RCS1 (también denominado AFT1). RCS1 es un gen de S. cerevisiae quehabía sido parcialmente secuenciado con anterioridad; mutantes con una delecciónparcial en el mismo tenían un tamaño celular superior al de la cepa salvaje. En estetrabajo se ha completado la secuencia del gen RCS1 y se han construido mutantesnulos, esto es, portadores de una delección total del gen. Las células carentes deRCS1 no crecen en fuentes de carbono respirables como el etanol/glicerol, lo cualhizo pensar ¡nicialmente que RCS1 tuviese un papel en la desrepresión por glucosa.El análisis de la expresión de genes como ADH2 e ICL1, sometidos a represión porglucosa y necesarios para el crecimiento en este medio, ha revelado que dichaexpresión no está afectada en el muíante. La identidad de RCS1 con el gen AFT1implicado en la asimilación de hierro por otros autores nos llevó a intentar relacionarla incapacidad de los mutantes RCS1 para crecer sobre fuentes de carbonorespirables con su deficiente asimilación de hierro. Así, se ha comprobado que laausencia de crecimiento del muíante en etanol/glicerol como únicas fuentes decarbono puede suprimirse adicionando hierro en exceso al medio. Por otro lado, elcrecimiento en etanol/glicerol no requiere la inducción del sistema de alta afinidad,hecho que permite sugerir un papel adicional para RCS1 al anteriormente descrito,bien como responsable de mantener unos niveles de actividad ferro-reductasa y deentrada de hierro suficientes para el crecimiento en dicho medio, bien comoresponsable de la inducción de nuevos elementos implicados en la entrada de hierroque serían necesarios en esas condiciones, o bien porque sea necesario para unfuncionamiento eficiente del sistema de baja afinidad. La sobreexpresión de RCS1produce una detención homogénea del crecimiento celular en la fase G1 del ciclocelular, efecto no suprimible ni por privación ni por adición de hierro. El uso de lagenética de dominancia para contrarrestar este efecto podrá dar luz acerca de otrosgenes con interacción funcional con RCS1. En este trabajo se demuestra que Rcs1es o forma parte de un factor transcripcional activo sobre el promotor de FRE1. Así, laproteína Rcs1 unida al dominio de unión a DNA de la proteína Gal4 es capaz detransactivar dos sistemas reporteros (GAL1-HIS3 y GAL1-lacZ). En relación con ello,mediante estudios de retardamiento en gel, se ha podido comprobar que Rcs1 esnecesaria, en condiciones deficitarias de hierro, para la estabilidad del complejo quereconoce la zona del promotor de FRE1 responsable de su regulación por hierro. Laobtención de anticuerpos anti-Rcsl para su immunodetección ha permitido hacer unseguimiento de la proteína en diferentes condiciones. Así, se ha podido comprobarque dicha proteína está sujeta a una modificación postraduccional por fosforilación,que se produce en situaciones de detención del crecimiento celular. Estudios concepas portadoras de mutaciones en diferentes elementos de la vía Ras han permitidodescartar una implicación de la proteína quinasa A dependiente de cAMP en lafosforilación de Rcsl Asimismo, se ha visto que ósta es también independiente delas proteína quinasas producto de los genes YAK1 (que codifica para una quinasaantagónica de la proteína quinasa A) o SNF1 (quinasa necesaria para la desrepresiónpor glucosa). La fosforilación de Rcs1 parece corresponderse con una inactivación dela proteína y podría constituir un mecanismo para adaptar la entrada de hierro alestado metabólico de la célula.

CD40 (TNFRSF5) és una glicoproteïna de membrana que pertany a la família de receptors del factor de necrosi tumoral (TNF-R). La interacció amb el seu lligand fisiològic (CD40L o CD154) regula una àmplia varietat de funcions biològiques, des de l'activació del sistema immune, tant humoral com cel·lular, a diferents aspectes de la resposta inflamatòria. Els principals objectius d'aquesta tesi han estat 1) l'estudi a nivell molecular del paper de CD40 en l'activació de les cèl·lules endotelials, i 2) les conseqüències del bloqueig d'aquesta via de senyalització en la resposta immunoinflamatòria. S'ha obtingut un siRNA potent i específic capaç de reduir l'expressió del receptor CD40 humà en un 85%, tant a nivell de mRNA com a nivell de proteïna. Aquest siRNA expressat en forma de shRNA en un vector lentiviral permet assolir un silenciament gènic eficient i estable de CD40 al llarg del temps. S'ha validat l'activitat antiinflamatòria d'aquest siRNA analitzant les conseqüències funcionals del silenciament d'aquest receptor en cèl·lules endotelials. Aquest siRNA bloqueja l'activació endotelial via CD40L impedint la inducció de l'expressió de les molècules d'adhesió ICAM-1, VCAM-1 i E-selectina, i inhibint l'adhesió leucocitària en aquestes cèl·lules en un 87%. S'ha utilitzat el potencial antiinflamatori del siRNA dirigit contra CD40 humà per estudiar el paper d'aquest receptor en cèl·lules endotelials en inflamació. Utilitzant microarrays, s'ha realitzat una anàlisi comparativa del perfil global d'expressió gènica en cèl·lules endotelials humanes en les quals s'inactiva específicament aquesta via de senyalització mitjançant RNAi, en el context de la interacció cèl·lula endotelial i limfòcit T activat (CD40L+), com a primer pas en l'inici de la resposta immunoinflamatòria. Aquest estudi d'expressió gènica ha permès identificar nous gens i noves vies de senyalització implicades en la inducció de la resposta inflamatòria desencadenada per l'activació de CD40 en endoteli.Per altra banda, es volia avaluar l'eficàcia del silenciament gènic de CD40 per a la inducció de tolerància immunològica en un model experimental d'al·lotrasplantament renal. Amb aquesta finalitat s'ha obtingut un siRNA anti-CD40 de rata amb una potent eficiència silenciadora i s'ha optimitzat la transferència d'aquest siRNA en el ronyó a trasplantar mitjançant electroporació in vivo de l'òrgan. L'objectiu d'aquest estudi era silenciar temporalment l'expressió d'aquest receptor en les cèl·lules renals i bloquejar la interacció CD40-CD40L essencial per a la inducció de procés inflamatori que dóna lloc al rebuig del ronyó trasplantat. Resultats preliminars mostren que la teràpia gènica local amb siRNA redueix la resposta inflamatòria posttrasplantament. El siRNA anti-CD40 causa una reducció significativa de l'expressió del mRNA de CD40, disminuint l'aparició de rebuig agut humoral i allargant el temps mig de supervivència dels animals trasplantats amb els ronyons tractats amb siRNA en comparació amb els animals control. / CD40 (TNFRSF5) belongs to the tumor necrosis factor receptor family (TNF-R). Its interaction with its physiological ligand (CD40L or CD154) regulates a wide variety of biological functions, from the activation of the immune system, to different aspects of the inflammatory response.The main goals of this work have been 1) the molecular study of the role of CD40 in the activation of the endothelial cells, and 2) the consequences of blocking this signaling in the immunoinflammatory response. We have obtained a powerful and specific siRNA able to reduce human CD40 expression by 85%. The anti-inflammatory activity of this siRNA has been validated by analyzing the functional consequences of CD40 silencing in endothelial cells activated via CD40L. This siRNA blocks the induction of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin expression, and inhibits leukocyte adhesion in these cells by 87%.We have used the anti-inflammatory potential of this siRNA directed against human CD40 to carry out a global gene expression profiling analysis in order to study the role of CD40 in endothelial cells during inflammation. Using microarrays, we have performed a comparative transcriptome analysis in human endothelial cells, in the context of the endotelial cell interaction with activated T lymphocyte (CD40L+), as the first step of the immunoinflammatory response. This study has allowed us to identify new genes and signaling pathways involved in the induction of the inflammatory response by CD40 activation in endothelium.On the other hand, we have obtained an siRNA against rat CD40 with a powerful silencing activity and we have optimized its transfer to the kidney through in vivo electroporation. The purpose of this study was to determine the CD40 gene silencing effectiveness in inducing immunological tolerance in an experimental model of renal allotransplantation. Preliminary results show that local gene therapy with siRNA reduces the inflammatory response post-transplantation. The anti-CD40 siRNA treatment causes a significant reduction of the incidence of acute humoral rejection and increases the survival half life of animals transplanted with kidneys treated with siRNA compared to control animals.

S'estudia la histologia normal de la paret corporal d'Hirudo medicinalis i els canvis morfogenètics que es donen durant el procés de cicatrització de ferides per incisió, cauterització i nitrat de plata.El procés de curació de ferides a Hirudo medicinalis consta d'una fase de formació d'un tap cel·lular, el pseudoblastema, d'un procés de reepitelització i de la formació d'un teixit cicatricial, com en els altres hirudinis estudiats (Myers, 1935; LeGore i Sparks, 1971; Cornec, 1984). Hem observat també el fenomen de la contracció de la ferida que permet l'acostament dels marges de la ferida.Formació i evolució del pseudoblastemaEl pseudoblastema, a diferència d'altres espècies estudiades, està format per un sol tipus cel·lular: les cèl·lules vasocentrals, provinents del teixit vasofibrós, una especialització del teixit connectiu. Aquestes cèl·lules estan capacitades per realitzar les diferents funcions que en espècies rincobdèl·lides realitzen diferents tipus cel·lulars. En concret: taponament de la ferida a través de la formació del pseudoblastema, fagocitosi dels teixits necrosats i regeneració, almenys d'una part, de la matriu connectiva cicatricial. També són responsables de la contracció de la ferida.Les cèl·lules vasocentrals en el seu estadi de repòs es troben en el teixit vasofibrós formant agrupacions coherents, però sense mostrar unions intercel·lulars especialitzades visibles en ME. La coherència del grup queda assegurada per les interdigitacions entre les cèl·lules vasocentrals i probablement per unions tipus adherens o especialitzades. Les unions amb la matriu són de tipus adherens. Aquestes cèl·lules vasocentrals presenten feixos de filaments d'actina força conspicus.En produir-se una ferida les cèl·lules vasocentrals s'activen, desconnecten les unions intercel·lulars i amb la matriu i migren cap a la zona afectada, on s'acumulen. El pseudoblastema actua com un tap cel·lular que funciona de forma eficient per tancar la ferida en un plaç de temps relativament curt. El pseudoblastema forma un teixit coherent amb unions intercel·lulars tipus adherens, caracteritzades per material electrodens en la cara intracitoplasmàtica, feixos de filaments d'actina que hi convergeixen i espais intercel·lulars petits, de 17-20 mm, atravessats per petites fibril·les.Un cop finalitzat el procés de reepitelització, es produeix una contracció de la ferida. Es produeix per la retracció del pseudoblastema cap a l'interior de l'animal. El pseudoblastema disminueix la seva amplària i arrossega els teixits contigus provocant un tancament. La força motriu que provoca la retracció i l'arrossegament dels teixits vindria donada per la presència dels filaments d'actina a les cèl·lules del pseudoblastema, els quals durant aquesta fase es tornen mes conspicus. La presència d'unions intercel·lulars especialitzades característiques de la fase de contracció, està relacionada amb la transmissió de la força de tensió. Aquestes unions connecten els feixos de filaments d'actina de les cèl·lules amb la matriu o d'una cèl·lula a altre a través d'espais intercel·lulars força amples en els que s'observa material electrodens.ReepitelitzacióL'epitelització s'inicia quan el pseudoblastema està consolidat i segueix el mateix patró que la reepitelització de ferides en epitelis monoestratificats de vertebrats (Stem i DePalma, 1983, és a dir, per migració de tota la capa per sobre del substrat, segons l'anomenat model de lliscament.Les glàndules unicel·lulars mucoses del tegument degeneren abans de produir-se la migració epitelial i posteriorment, un cop consolidat l'epiteli a sobre de la ferida, es diferencien a partir de les cèl·lules epitelials.Durant l'epitelització es produeixen canvis importants en el citosquelet i les unions basals de les cèl·lules epitelials. En canvi, el complex d'unió lateral es manté durant tot el procés. En iniciar-se la migració els tonofilaments es desconnecten dels hemidesmosomes cuticulars i dèrmics i es reagrupen al voltant del nucli, a la vegada que els hemidesmosomes dèrmics es desconnecten de la làmina basal. Un cop acabada la migració, les cèl·lules epitelials estableixen unions basals amb les cèl·lules del pseudoblastema. Aquestes unions no són hemidesmosomes sinó que presenten el mateix aspecte que les unions intercel·lulars del pseudoblastema. Els hemidesmosomes no es tornen a formar fins que les cèl·lules epitelials han restablert la membrana basal.La regeneració de la membrana basal no s'inicia fins que no s'ha començat a regenerar matriu connectiva a la zona cicatricial.Regeneració de la cicatriuAl mateix temps que es dona el fenomen de contracció, s'observa regeneració de la matriu connectiva entre les cèl·lules del pseudoblastema. Aquestes cèl·lules són responsables almenys del recobriment fibrós que presenten en aquest estadi, durant el qual mostren sàculs del reticle endoplasmàtic rugós molt dilatats, característics de cèl·lules que secreten constituents de la matriu. A més, s'observa infiltració de matriu connectiva i processos citoplasmàtics dels fibròcits en els marges del pseudoblastema.En la matriu del teixit connectiu normal s'observen fibres que estan constituïdes per un còrtex de fibril·les col·làgenes organitzades al voltant dels processos citoplasmàtics dels fibròcits. Les fibres del teixit connectiu peridigestiu, d'uns 1,2-1,9 mm de diàmetre, presenten el còrtex prim, amb les fibril·les organitzades paral·lelament a l'eix de la fibra. En canvi, les fibres de la dermis i teixit connectiu intramuscular, d'uns 2,5-7,1 mm de diàmetre, tenen el còrtex gruixut, amb fibril·les que s'organitzen paral·lelament en la zona proximal a la medul·la i de forma desorganitzada en la part més distal.Als 8 mesos la cicatriu encara és detectable. La matriu cicatricial presenta fibres connectives del tipus prim i força material fibril·lar desorganitzat disposat laxament. S'observa colonització per part de fibròcits, cromatòfors, petites fibres musculars i nervis. / This thesis in a study of the morphogenetic events that occurs during wound healing of Hirudo medicinalis and of the normal histology of the body wall.The wound healing process of Hirudo medicinalis involves the formation of a cellular plug, the reepithelialization and the regeneration of a scar tissue, as in the others hirudineans previously studied (Myers, 1935; LeGore and Sparks, 1971; Cornec 1964). We also report the wound contraction process that allows the wound clousure.After a wound is inflicted cells of the connective tissue migrate to form a cellular plug, the pseudoblastema. The pseudoblastema of Hirudo medicinalis formed only by one type of cell: the vasocentral cells. In the resting state those cells are associated with vasofibrous cells forming the vasofibrous tissue.Once the pseudoblastema has been formed, then reepithelialization begins. The epithelium of the wound edges advances as a unified sheet like the monolayered epithelia of Vertebrata (Stenn and DePalma, 1988). Unicellular mucous glands of the integument degenerate until epithelial migration. Later, once the epithelium has been consolidated over the wound, some epithelial cells differentiate into mucous glands.After the wound has been reepithelializated, wound contraction occurs by the retraction of the pseudoblastema.In the later stages, infiltration of fibrocite citoplasmic projections can be observed. The pseudoblastema disintegrates and an extracellular matrix remains in its place. This matrix is colonized by fibrocites, capillary vessels, nerves and little muscular fibers. The body wall muscular fibers sectioned or splitted don't regenerate. The extracellular matrix of the scar zone can be distinguished from the normal one for long periods (8 months at least).An important fact of the work is the role of the vasocentral cells. Those cells are responsible for the formation of the pseudoblastema and for the phagocitosis of the remnants of injures tissue. They are also responsible for the wound contraction, presenting acting filaments alinied with the stress direction and specialized intercellular junctions that transmit tension force. Finally, they contribute to the scar matrix regeneration by the synthesis of a fibrous cell coat.

En aquesta Tesi, un nou biomaterial de disseny composat per seqüències peptídiques repetitives i amfifíliques, que per autoensamblatge forma xarxes de nanofibres (i hidrogels), AcN-RADARADARADARADA-CONH2, s´ha utilitzat com a anàleg de la matriu extracel·lular per al manteniment, proliferació i diferenciació cel·lular. Aquest pèptid s'ha funcionalititzat amb motius biològicament actius procedents de proteïnes de la matriu extracel·lular incloent laminina-1 i colàgen IV. El scaffold peptídic autoensamblant RAD16-I i els seus derivats biològicament actius s´han caracteritzat i provat utilitzant diferents sistemes cel·lulars com pot ser les cèl·lules d'aorta humanes (HAEC), hepatocits madurs i la línea progenitora de fetge (Lig-8). La proteòlisi d'aquest pèptid s'ha avaluat utilitzant tripsina com a enzim proteolític, i els fragments resultants s'han analitzat per MALDI-TOF i AFM. Així mateix, la segona generació de biomaterials basats en el RAD16-I s'ha provat tant amb HAEC com amb hepatocits madurs. Amb aquests sistemes hem demostrat que el desenvolupament d'una matriu biomiètica reforça, a la vegada que manté, les funcions específiques de cada teixit. En particular, els resultats obtinguts en diferenciació, proliferació i manteniment de la funció cel·lular utilitzant pèptids sintètics autoensamblants són comparables amb els resultats que s'obtenen utilitzant matrius biològiques (Colàgen I i Matrigel). Això indica que els nostres anàlegs de la matriu extracel·lular poden substituir als materials naturals, i suggereix l'ús d'aquests materials intel·ligents amb capacitat instructiva en aplicacions terapèutiques. Així mateix s'ha provat que l'ús d'aquests pèptids auto-ensamblants és eficient en la construcció d'un nínxol de cèl·lules mare. Hem sigut capaços de controlar la cinètica cel·lular (de simètrica a assimètrica) induint diferenciació funcional, a la vegada que es mantenia una petita proporció de cèl·lules no diferenciades. Aquests resultats indiquen clarament que hem sigue capaços d'obtenir un nínxol on cèl·lules primitives (Lig-8) es diferencien adquirint funcions d'hepatocits madurs. Hem desenvolupat una plataforma de biomaterials que es podrien utilitzar per la funcionalització amb innumerables biomolècules amb capacitat d'induir processos biològics com la diferenciació, proliferació i funció metabòlica. Aquests biomaterials, preveiem que tindran un gran impacte a l'àrea terapèutica i biología regenerativa. / En esta Tesis, un nuevo biomaterial de diseño compuesto por secuencias peptídicas repetitivas y amfifílicas que por autoensamblaje forma redes de nanofibras (e hidrogeles), AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I), se ha utilizado como análogo de la matriz extracelular para el mantenimiento, proliferación y diferenciación celular. Este péptido se ha funcionalizado con motivos biológicamente activos procedentes de proteínas de la matriz extracelular incluyendo laminina-1 y colágeno IV. El scaffold peptídico autoensamblante RAD16-I y sus derivados biológicamente activos se han caracterizado y probado utilizando diferentes sistemas celulares como puede ser células endoteliales de aorta humanas (HAEC), hepatocitos maduros y la línea progenitora de hígado Lig-8. La proteólisis de este péptido se ha evaluado utilizando tripsina como enzima proteolítico, y los fragmentos resultantes se han analizado por MALDI-TOF y AFM. Asimismo, la segunda generación de biomateriales basados en el RAD16-I se ha probado tanto con HAEC como hepatocitos maduros. Con estos sistemas hemos demostrado que el desarrollo de una matriz biomimética refuerza a la vez que mantiene las funciones específicas de cada tejido. En particular, los resultados obtenidos en diferenciación, proliferación y mantenimiento de la función celular utilizando los péptidos sintéticos auto-ensamblantes son comparables con los resultados que se obtienen usando matrices biológicas (Colágeno I y Matrigel). Esto indica que nuestros análogos de la matriz extracelular pueden reemplazar a los materiales naturales, y sugiere el uso de estos materiales inteligentes con capacidad instructiva en aplicaciones terapéuticas. Asimismo, se ha probado que el uso de estos péptidos auto-ensamblantes es eficiente en la construcción de un nicho de células madre. Hemos sido capaces de controlar la cinética celular (de simétrica a asimétrica) induciendo diferenciación funcional, a la vez que se mantenía una pequeña proporción de células no diferenciadas. Estos resultados indican claramente que hemos sido capaces de obtener un nicho donde células primitivas (Lig-8) se diferencian adquiriendo funciones de hepatocitos maduros. Hemos desarrollado una plataforma de biomateriales que se podrían utilizar para la funcionalización con innumerables biomoléculas con capacidad de inducir procesos biológicos como la diferenciación, proliferación y función metabólica. Estos biomateriales preveemos que tendrán un gran impacto en el área terapéutica y biología regenerativa. / In this Thesis, a new designed biomaterial made out of short repetitive amphiphilic peptide sequence AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I) that self-assembles forming nanofiber networks (hydrogel scaffold) has been used as synthetic extracellular matrix analog for cell maintenance, proliferation and differentiation. This peptide has been functionalized with biological active motifs from extracellular matrix proteins including laminin-1 and collagen IV. The prototypic self-assembling peptide scaffold RAD16-I and its biologically active derivatives have been characterized and tested using several cellular systems such as human aortic endothelial cells (HAEC), mature hepatocytes and a putative liver progenitor cell line, Lig-8. The proteolysis of the peptide RAD16-I has been evaluated using trypsin as a proteolytic enzyme and the resulting fragments have been analyzed by MALDI-TOF and AFM. Moreover the second generation of RAD16-I-based biomaterials have been tested using HAEC and mature hepatocytes. With these systems we have shown that the development of a biomimetic matrix enhances as well as maintain tissue-specific functions. In particular, the results obtained in cell differentiation, proliferation and maintenance of cell function using the synthetic self-assembling peptide matrices, are comparable with the results obtained using natural biological matrices counterparts (Collagen-I and Matrigel). This indicates that our extracellular matrix analogs can replace the use of naturally-derived materials and suggests the use of these smart biomaterials with instructive capacity for cells in therapeutics. Moreover, the use of the self-assembling peptide RAD16-I in the recreation of a stem-cell niche proved to be highly efficient. We were able to control stem-cell kinetics (from symmetric to assymetric) inducing functional differentiation while maintaining a small proportion of undifferentiated cells. This striking results clearly indicate that we were able to obtain a stem-cell niche where primitive cells (Lig-8) undergo differentiation acquiring mature hepatic functions. We have developed a biomaterial platform that can be used for functionalization with innumerable biomolecules, with capacity to induce biological processes like differentiation, control of proliferation, metabolic function, etc. These biomaterials will have a strong impact in therapeutics and regenerative biology.

Las células tumorales presentan alteraciones metabólicas. Una de las diferencias con las células no transformadas es que los tumores usan más glucosa incluso en condiciones de normoxia, lo que se utiliza actualmente para visualizar tumores mediante la técnica de PET. Ultimamente se están desarrollando terapias basadas en estas particularidades metabólicas de las células tumorales, que las hacen más sensibles a inhibición del metabolismo glicolítico. Aquí estudiamos la muerte producida por la falta de glucosa en sarcomas y otros tipos tumorales. La privación de glucosa induce apoptosis o necrosis dependiendo de la línea celular. Mostramos cómo la privación de glucosa induce actividad caspasa en células deficientes de Bax/Bak, mientras que en las líneas de rabdomiosarcoma induce necrosis. Además la caspasa-8 está implicada en la muerte por ausencia de glucosa en estas células deficientes en Bax/Bak y también en células humanas HeLa. Investigamos el uso de 2-deoxiglucosa como inductor de muerte celular frente a líneas de rabdomiosarcoma alveolar y embrional. La 2-deoxiglucosa promueve muerte celular en líneas de rabdomiosarcoma alveolar. También induce diferenciación acompañada por una bajada de PAX3/FOXO1a, una proteína surgida de la translocación cromosómica en las células de rabdomiosarcoma alveolar y crítica en el desarrollo oncogénico de las mismas. Caracterizamos la muerte celular apoptótica inducida por 2-deoxiglucosa en líneas de sarcoma, in vitro. Estudiamos las moléculas de las rutas de apoptosis que determinan la sensibilidad de estas células a la 2-deoxiglucosa, con especial interés en las proteínas de la familia del oncogén Bcl-2. La muerte celular inducida por el tratamiento está asociada a la activación de Bax y Bak. Observamos que la sobre-expresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 como Bcl-xL y de Mcl-1 previene la apoptosis, indicando que la muerte sucede a través de la ruta mitocondrial. Enseñamos que la bajada de Mcl-1 y la subida de Noxa son críticos en la muerte por 2-DG. Además, la 2-DG promueve estrés reticular acompañado de la inducción de ATF4 y chaperonas. Al bajar los niveles de ATF4, protegemos a las células de la muerte inducida por 2-DG y prevenimos la pérdida de Mcl-1. Incubamos células en presencia de manosa, que revierte el estrés inducido por la 2-DG y previnimos la muerte sin subir los niveles de ATP. Así, el estrés energético causado por la 2-DG no es la principal causa de muerte celular. También la 2-DG promueve la fosforilación de eIF2α, un inductor de ATF4, y la inactivación de mTOR. Nuestros resultados sugieren que el uso de inhibidores glicolíticos como la 2-DG pueden ser efectivos en el tratamiento de los rabdomiosarcoma alveolares y que Noxa podría ser un marcador pronóstico de la eficiencia de estas drogas. Por otro lado, caracterizamos las respuestas a la falta de glucosa y 2-DG, en particular la respuesta autofágica que puede determinar que las células mueran o no en respuesta a la falta de nutrientes. Observamos que las células están sensibilizadas al tratamiento con 2-DG tras el uso de cloroquina. Sin embargo, la presencia de cloroquina no afecta a la privación de glucosa. Intentamos clarificar si la falta de glucosa está induciendo macroautofagia. El flujo de LC3 por western blot nos indica que no hay más macroautofagia ni en células DKO ni en las Rh4 en ausencia de glucosa. Por microscopía confocal y analizando células HeLa y Rh4, tampoco vemos mayores acúmulos de GFP-LC3 tras la retirada de glucosa comparando con tratamientos clásicos de inducción de autofagía como la retirada de aminoácidos o con rapamicina. Estos datos sugieren que la combinación de 2-DG con inhibidores de la autofagia podría ser útil en el tratamiento contra rabdomiosarcomas y que la falta de glucosa no induce autofagia. / Characterization of cell death induced by inhibition of glucose metabolism Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft-tissue tumor of childhood characterized by high malignancy, local invasiveness and a marked predisposition to metastasize. Recently, a number of therapies targeting tumor cell metabolism are being developed, since oncogenic changes make tumors more sensitive to inhibition of glycolytic metabolism. We observed that the glycolytic inhibitor 2-deoxyglucose (2-DG) can efficiently promote cell death in p53-deficient alveolar rhabdomyosarcoma (the rhabdomyosarcoma subtype with poorer prognosis), but not in embryonal rhabdomyosarcoma. Differential expression of HIF-1 could not explain the different sensitivity of tumor subtypes. 2-deoxyglucose induced nuclear chromatin condensation, cleavage of caspase substrates and DNA degradation which was inhibited by caspase inhibitors. Cell death triggered by 2-DG was associated with its ability to activate Bax and Bak and was prevented by overexpression of the anti-apoptotic Bcl-2 homologs Bcl-xL and Mcl-1. Conversely, siRNA against Bcl-xL or Mcl-1 accelerated death. 2-DG promoted downregulation of the anti-apoptotic protein Mcl-1 and accumulation of two BH3-only proteins, Noxa and Bim. siRNA against these proteins indicated that Noxa mediates 2-DG-induced cell death. Addition of different carbon/energy sources indicated that apoptosis is not associated with loss of ATP but rather with endoplasmic reticulum stress and the eIF2-alpha-ATF4 pathway. 2-DG promoted Mcl-1 loss, probably due to general inhibition of translation, since both eIF2-alpha phosphorylation and inactivation of the mTOR pathway were observed. All these events (ER stress, energetic stress and inhibition of the mTOR pathway) are known to induce autophagy. Indeed, 2-DG induces autophagy, and inhibition of autophagy at different levels sensitizes cells to 2-DG. Together, our findings suggest that glycolysis inhibitors such as 2-DG may be effective in treating alveolar rhabdomyosarcoma.