Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-25T12:18:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Marcella Miranda Sales.pdf: 5077309 bytes, checksum: a1310c8c52436e007c5891d63d4b7e5d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-25T12:18:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Marcella Miranda Sales.pdf: 5077309 bytes, checksum: a1310c8c52436e007c5891d63d4b7e5d (MD5) / CAPES;FAPESB / A osteonecrose da cabeça femoral é uma complicação óssea comum em pacientes falciformes sendo decorrente dos eventos vaso-oclusivos frequentes nesta doença. O reparo anormal na região acometida pela necrose pode ser atribuído à neovascularização limitada e possíveis alterações no número e funcionalidade das células-tronco mesenquimais e ósseas neste ambiente isquêmico. Com este trabalho se avaliou a freqüência e funcionalidade das células-tronco mesenquimais (CTMs) isoladas da fração de células mononucleares da medula óssea (CMMO) dos pacientes com doença falciforme (HbSS e HbSC). Esta população compõe a fração de células mononucleares que são injetadas de forma autóloga na cabeça do fêmur para tratamento da osteonecrose nesses indivíduos. O potencial clonogênico foi analisado por ensaio de Unidades Formadoras de Colônias-Fibroblastóides (CFU-F) na fração de células mononucleares. As CTMs isoladas e expandidas em cultivo foram caracterizadas por citometria de fluxo com os principais marcadores: CD105, CD90, CD146 e CD29. O potencial de diferenciação, a taxa de proliferação, a migração celular em câmara de Boyden, a detecção de citocinas no sobrenadante celular através do ELISA e a análise da expressão gênica , através da técnica de PCR quantitativo em tempo real, foram verificados sob condições normais e após o pré-condicionamento em hipóxia temporária por 48 horas. Os resultados demonstraram que a frequência das CFU-F na fração de células mononucleares dos pacientes portadores de anemia falciforme (n=12) está elevada na medula óssea quando comparadas à dos pacientes com osteonecrose do grupo controle (n=8) (p= 0,0409). As CTMs do grupo falciforme expandidas em cultura se apresentaram morfologicamente e imunofenotipicamente semelhantes àquelas do grupo controle. As CTMs dos pacientes falciformes se mostraram multipotentes, viáveis e proliferativas quando cultivadas em condições normais, perdendo a capacidade de diferenciação óssea após o efeito da hipóxia. Os mesmos resultados foram notados na análise da expressão gênica para marcadores ósseos de fase inicial (RUNX2, ALPL e COLLAGEN I). Concluímos que as CTMs presentes na fração de CMMO são viáveis, proliferativas e tem potencial de diferenciação multipotente em condições de normóxia, o que fundamenta o emprego da terapia celular no tratamento da osteonecrose no doente falciforme.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-25T14:16:42Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Cíntia de Vasconcellos Machado.pdf: 3205260 bytes, checksum: 8572ede4b113272c3ea3454723532c79 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-25T14:16:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Cíntia de Vasconcellos Machado.pdf: 3205260 bytes, checksum: 8572ede4b113272c3ea3454723532c79 (MD5) / Fapesb / O objetivo deste estudo foi detectar, através da imunohistoquímica, células positivas para os marcadores STRO-1 e CD90, os quais são usualmente utilizados para caracterizar célulastronco mesenquimais (MSCs), assim como para a ALDH (aldeído desidrogenase), enzima que tem sido empregada na identificação de células-tronco hematopoiéticas e também tumorais, na polpa de dentes permanentes jovens. Da mesma forma, foi avaliada a expressão dos marcadores ALDH, STRO-1 e CD44 em células-tronco da polpa de dentes decíduos (SHEDs), permanentes (DPSCs) e fibroblastos da polpa (HDPFs), através da citometria de fluxo e western blot. Para a análise imunohistoquímica, a polpa dental de nove terceiros molares e pré-molares hígidos foi coletada, fixada e processada. SHEDs, DPSCs e HDPFs foram cultivadas em meio DMEM/HEPES, suplementado com soro fetal bovino a 10%, 100U/mL de penicilina, 100μg/mL de estreptomicina e armazenadas em estufa a 37ºC e 5% de CO2. A reação imunohistoquímica mostrou células imunomarcadas com ALDH, CD90 e STRO-1 essencialmente nos espaços perivasculares e nas fibras nervosas da polpa, embora o STRO-1 tenha apresentado uma expressão menos pronunciada. Foi demonstrada uma forte marcação para a ALDH e para o STRO-1 através do western blot em SHEDs, DPSCs e HDPFs, enquanto que as células apresentaram uma fraca expressão para o CD44. Não foram observadas diferenças na intensidade das bandas entre os três tipos de células para os marcadores testados. Já na análise de citometria de fluxo, todas as células apresentaram valores percentuais altos para o CD44 e relativamente baixos para o STRO-1 e para a ALDH. Os resultados sugerem que as células-tronco pulpares residem nas proximidades dos vasos sanguíneos e das fibras nervosas deste tecido, visto que células positivas para marcadores associados às mesmas foram detectadas nestas áreas. Da mesma forma, apontam para a possibilidade de existência de mais de um nicho de MSCs na polpa dentária. Ainda, sugerem que SHEDs, DPSCs e fibroblastos podem compartilhar algumas características importantes, como a expressão de determinados marcadores

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento / Made available in DSpace on 2013-06-25T19:02:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 311324.pdf: 1922838 bytes, checksum: d61fe3294c5ed4d8db715894bb7fa6c8 (MD5) / As células-tronco mesenquimais (CTMs) são amplamente estudadas por apresentarem potencial de auto-renovação e multidiferenciação, além de possibilidade de isolamento a partir de diversos tecidos. A placenta humana representa uma fonte de CTMs abundante, acessível e livre de questionamentos éticos. O comportamento celular está intimamente ligado ao microambiente tridimensional que as cercam no tecido nativo. Em vista disso, biomateriais vêm sendo desenvolvidos na tentativa de mimetizar in vitro esta complexidade tecidual. O hidrogel de celulose bacteriana (HCB), em particular, tem atraído grande interesse devido a sua nanoestrutura, biocompatibilidade e propriedades mecânicas. Por outro lado, a hidroxiapatita (HAp), tem sido usada como um biomaterial promissor para engenharia de tecido ósseo, devido a sua biocompatibilidade e propriedades osteoindutoras. O plasma rico em plaquetas (PRP) mostra-se como uma interessante fonte de fatores de crescimento a ser aplicada com biomateriais. O presente trabalho teve como objetivo principal, avaliar a interação e viabilidade de células-tronco mesenquimais derivadas da placenta humana (CTMPs) em HCB e em um compósito HCB-HAp, bem como analisar a influência do PRP na viabilidade e proliferação das CTMPs. Para isto, isolamos uma população de CTMPs, com morfologia, imunofenótipos e capacidade de diferenciação características de CTMs. Os HCBs foram produzidos por bactérias Gluconacetobacter hansenii cultivadas em um meio de cultivo apropriado e sob circunstâncias estáticas. A interação célula-HCB foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal. Os resultados revelaram que as CTMPs apresentam capacidade de aderir ao HCB, porém a interação foi superficial, apresentando pequena capacidade de migração para o interior do biomaterial. Compósitos HCB-HAp foram produzidos através da síntese biomimética de HAp, por imersão dos HCB já sintetizados em soluções de cálcio e fosfato, alternadamente. Foram testados compósitos com cinco concentrações de HAp. A microestrutura e a composição química dos compósitos foram verificadas por MEV e EDS e revelaram o aumento da deposição dos cristais de HAp ao longo dos ciclos. A interação célula-compósito foi verificada por MEV e microscopia confocal, assim como no HCB, a interação foi superficial. O aumento da concentração de HAp nos compósitos prejudicou a adesão e as células tenderam a formar agregados nos compósitos com maior concentração de HAp. Dentre os compósitos, o HCB-HAp1(com apenas um ciclo de deposição de HAp) foi considerado o ideal para estudos futuros. Os efeitos do PRP foram analisados sobre a viabilidade e proliferação celular e demonstrou ter efeito dependente da concentração utilizada, sendo 2% a concentração que mostrou aumento na proliferação celular. Desta forma, concluímos que, para ambos biomateriais, melhorias relacionadas à microestrutura e porosidade devem favorecer migração das CTMPs ao interior do hidrogel e, mediante a estas melhorias, a associação do compósito HCB-HAp1 com CTMPs e PRP, deve formar um sistema de cultivo tridimensional promissor para estudos em engenharia de tecido ósseo. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are widely studied due to their self-renewal anddifferentiation potential, in addition to the possibility of isolation from several tissues.The human placenta represents an abundantsource of MSCs, readily accessible and free of ethical questions. The unique cell behavior is closely related to the specialized, three-dimensional microenvironment that immediately surrounds them in native tissue. Inthis way, biomaterials are being developed in an attempt to mimic thiscomplexity in vitro.In particular, bacterial cellulose hydrogel (BCH)has attracted great interest due toits unique nanostructure, biocompatibility and good mechanical properties. On the otherhand, the hydroxyapatite (HAp) has been used as a ubiquitous biomaterial in bone tissue engineering due to its biocompatibility and osteoinductive properties. The platelet rich plasma (PRP) appears as an interesting source of growth factors that may be used together with biomaterials. In this study we evaluated the interaction and viability of human placenta derived mesenchymal stem cells (PMSCs) cultured in BCH and BCH-HAp composite, and analyzed the influence of PRP on the viability and proliferation of PMSCs. We isolate a population of PMSCs with morphology, immunophenotypes and differentiation ability, characteristics of MSCs.The BCHs were producted by Gluconacetobacter hansenii bacteria grown in a suitable culture medium under static conditions. The cell-BCH interaction was analyzed by scanning electron microscopy (SEM) and confocal microscopy. The results revealed that the PMSCs present the ability to adhere to BCH, but the interaction was superficial, presenting low ability to migrate into the biomaterial. BCH-HAp composites were producted by the HAp biomimetic synthesis, by immersing the synthesized BCH in calcium and phosphate solutions. Composites with five concentrations of HAp were tested. The microstructure and chemical composition of the composites were observed by SEM and EDS and revealed increased deposition of HAp crystals along the cycles. The cell-composite interaction was observed by SEM and confocal microscopy and, even as in HCB, the interaction was superficial. The increase of HAp concentration impaired the cell adhesion and the cells tended to form aggregates in the composites with higher HAp concentration. Among the composites, the BCH-HAp1 (with just one HAp deposition cycle) was considered ideal for future studies. The PRP effects were analyzed on cell viability and proliferation and demonstrate to have a concentration-dependent effect. The higher increase in cell proliferation was achieved with 2% PRP. Thus, we conclude that, for both biomaterials improvements related to the microstructure and porosity would be favorable to the PMSCs migration. By these improvements, the association of the composite HCB-HAp1 with CTMPs and PRP must form a promising three-dimensional culture system for studies in bone tissue engineering.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T20:49:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 313176.pdf: 31537040 bytes, checksum: 2b55698432e1ff3ffc517949aac3d02b (MD5) / Dentre os vários fatores de crescimento que têm sido relatados na literatura para tratamento de defeitos ósseos, as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) têm atraído bastante interesse, em decorrência de sua capacidade osteoindutora. As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) também vêm se destacando na regeneração tecidual e na modulação da resposta inflamatória pelo seu efeito parácrino. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro e in vivo os efeitos da BMP-2 e de ASCs na osteogênese. Os experimentos se dividiram em 4 etapas, sendo: (1) avaliação do efeito da proteína óssea morfogenética recombinante humana do tipo 2 (rhBMP-2), da BMP-4 e da BMP-7 na diferenciação osteogênica de ASCs suplementadas com arcorbato e ?-glicerofosfato; (2) comparação do efeito do ácido retinóico (AR), da rhBMP-2 e da rhBMP-2+AR na diferenciação osteogênica de ASCs; (3) avaliação do efeito da implantação de ASCs incorporadas em arcabouços de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) na inflamação causada por rhBMP-2 no tecido muscular de cães; e (4) avaliação do efeito de ASCs incorporadas em arcabouços autógenos de plasma rico em plaquetas (PRP) na regeneração óssea na tíbia de cães. Os resultados confirmaram as caracterísitcas de células-tronco mesenquimais das ASCs, através da imunofenotipagem e da diferenciação adipogência e osteogênica. Em relação à etapa 1, as ASCs expressaram BMP-4 e BMP-7 endógenas, a suplementação do meio osteogênico com rhBMP-2 não aumentou a atividade de ALP, a expressão do mRNA da osteonectina e osteocalcina, e a deposição de cálcio. No que diz respeito à etapa 2, a rhBMP-2 promoveu maior expressão de Smad 1 e BMP-7 (dia 7), maior expressão relativa do mRNA do receptor de BMP do tipo II (BMPR-II) e do mRNA da osteocalcina (dia 21). Por sua vez, o AR exibiu as maiores atividades de ALP (dias 7, 14, 21 e 28), maior expressão relativa do mRNA do receptor de BMP do tipo II (RBMP-II) (dia 14), do mRNA da Smad 1 (dia 21) e do mRNA da osteonectina (dias 14, 21 e 28). A associação rhBMP-2+AR promoveu os maiores níveis de cálcio na matriz extra-celular (dias 12 e 32), a expressão da Smad 4 considerável (dias 21 e 28), expressão da Smad 1/ 5/ 8 fosforilada similar ao MC3T3-E1 (controle positivo) (dias 7, 14, 21 e 28), maior expressão relativa do mRNA da Smad 1, mRNA da osteocalcina e mRNA da osteonectina (dias 14, 7 e 7, respectivamente). Em relação à etapa 3, a agregação da rhBMP-2 aos arcabouços foi de aproximadamente 78, 74 e 61% para 1, 2,5 e 5 µg de rhBMP-2.mL-1, respectivamente. A liberação acumulada da rhBMP-2, em 21 dias, foi de aproximadamente 90, 64 e 64% para 1, 2,5 e 5 µg de rhBMP-2.mL-1, respectivamente. Os arcabouços de PLGA foram quase que totalmente degradados em 6 semanas de pós-operatório. As ASCs foram capazes de modular a resposta inflamatória causada por baixa dose de rhBMP-2 (2,5?g) no tecido muscular de cães, diminuindo o número de focos inflamatórios, células gigantes e aumentando a neovascularização. Os resultados da etapa 4 mostraram que PRP+ASCs apresentou menor quantidade de tecido de granulação e promoveu maior quantidade (osso primário e secundário) e maturação (osso secundário) de tecido ósseo neoformado nos defeitos ósseos, comparado com osso autógeno e PRP, isoladamente. Resumidamente, pode-se concluir que a suplementação da rhBMP-2 ao meio osteogênico não melhorou a osteogênese das ASCs; a associação de rhBMP-2+AR se mostrou mais eficiente na osteodiferenciação das ASCs, comparado com rhBMP-2 ou AR isoladamente; as ASCs reduziram o processo inflamatório e aumentaram a neovascularização nos sítios musculares que receberam baixa dose de rhBMP-2; e as ASCs associadas com PRP apresentaram menor quantidade de tecido de granulação e promoveram maior quantidade e maturação de tecido ósseo neoformado nos defeitos ósseos, comparado com osso autógeno e PRP.<br) / Abstract : Recombinant human bone morphogenetic protein type 2 (rhBMP-2) is a potent osteogenic growth factor, which has been used for treatment of bone defects in maxillofacial, oral, orthopedic, and spine surgeries. The adipose-derived stem cells (ASCs) have been draun attention in tissue regeneration and modulation of inflamatory disease because of their paracrine effect. This study evaluated the in vitro and in vivo effects of rhBMP-2 and ASCs in osteogenesis. The experiments were divided into 4 parts: (1) evaluated the effect of recombinant human bone morphogenetic protein type 2 (rhBMP-2), BMP-4, and BMP-7 in osteogenic differentiation of ASCs suplemented with arcorbate and â- glycerophosphate; (2) compared the effect of retinoic acid (RA), rhBMP-2, and rhBMP-2+AR in osteogenic differentiation of ASCs; (3) evaluated the effect of the implantation of ASCs incorporated into scaffolds of poly lactic-co-glycolic (PLGA) in canine muscular tissue; and (4) evaluated the effect of ASCs incorporated into scaffolds of platelet-rich plasm (PRP) in bone regeneration in canine tibia. The results confirmed the mesenchymal stem cells characteristics of ASCs. According to part 1, ASCs expressed endogenous BMP-4 and BMP-7. The supplementation of osteogenic medium with rhBMP-2 did not increase ALP activity, mRNA expression of osteonectin and osteocalcin, and the calcium deposition. According to the results of part 2, rhBMP-2 promoted the highest expression of Smad1 and BMP-7 (day 7), the highest relative expression of BMP receptor type II (BMPR-II) mRNA and osteocalcin mRNA (day 21). RA exhibited the highest phosphatase alkaline activity (ALP) (days 7, 14, 21 and 28), highest expression of BMPR-II mRNA (day 14), Smad 1 mRNA (day 21) and osteonectin mRNA (days 14, 21, and 28). The association rhBMP-2+RA promoted the highest levels of calcium in extracellular matrix (days 12 and 32), a considerable expression of Smad 4 (days 21 and 28), expression of phosphorylated Smad 1/ 5/ 8 similar to MC3T3-E1 (positive control) (days 7, 14, 21, and 28), the highest expression of Smad 1 mRNA, osteocalcin mRNA, and osteonectin mRNA (days 14, 7, and 7, respectivamente). According to part 3, the rhBMP-2 loading into the scaffolds was approximately 78, 74, and 61% for 1, 2.5, and 5 ìg of rhBMP-2.mL-1, respectively. Cumulative rhBMP-2 release was approximately 90, 64, and 64% for 1, 2.5, and 5 ìg of rhBMP-2.mL-1, respectively, at day 21. PLGA scaffolds were almost completely degradated at 6 weeks postoperative. ASCs modulated inflammatory response induced by low dose of rhBMP-2 (2.5ìg) in muscle sites, decreasing the number of inflammatory foci, giant cells, and neovascularization. The results of part 4 showed that PRP+ASCs promoted the fewest formation of granulation tissue, the highest amount of bone neoformation (primary and secondary bone), and the highest level of bone maturation in bone deffects, compared to autogenous bone and PRP, alone. In summary, supplementation of osteogenic medium with rhBMP-2 did not improve the osteogenic differentiation of ASCs; the assotiation rhBMP-2+RA was more efficient on osteodifferentiation process compared to rhBMP-2 or RA alone; ASCs modulated the inflammatory process and increased neovascularization in muscle sites with low dose of rhBMP-2; the assotiation ASCs+PRP promoted the lowest number of granulation tissue and increased the amount of bone neoformation (primary and secondary bone) and maturation in bone deffects, compared to autogenous bone and PRP, alone.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Filosofia e Ciências Humanas, Programa de Pós-Graduação em Sociologia Política, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-07-16T21:00:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318237.pdf: 481746 bytes, checksum: de433eabccb9e9dc1f0837caf6f2b095 (MD5) / A presente dissertação analisa a controvérsia sobre as pesquisas com células-tronco embrionárias a partir da teoria dos sistemas de Niklas Luhmann. O surgimento da Lei de Biossegurança, em 2003, que legalizava a utilização de embriões congelados, excedentes de processos de fertilização assistida, para pesquisas científicas, marcou o início da controvérsia, que se estendeu até o julgamento da constitucionalidade da lei, no Supremo Tribunal Federal em 2008. A polêmica em torno destas pesquisas envolveu vários setores da sociedade, principalmente dos meios científico, religioso, político e jurídico. Argumentamos que a teoria da sociedade funcionalmente diferenciada, proposta por Luhmann, é capaz de esclarecer esta série de acontecimentos envolvendo as pesquisas. A sociedade é diferenciada em um conjunto de sistemas autopoiéticos, operacionalmente fechados, cada um operando através de um código próprio. Analisando a controvérsia através da referência dos sistemas da ciência, da religião, da política, e do direito, podemos compreender as circunstâncias sociais que direcionaram a sucessão de eventos acerca das células-tronco embrionárias.<br> / Abstract : This dissertation analyzes the controversy around the research on embryonic stem cells, from the perspective of Niklas Luhmann#s social system#s theory. The #Biosafety Law#, proposed in 2003, that authorized the use of frozen embryos, from assisted reproduction clinics, for scientific research, marked the beginning of the controversy, which extended until the Supreme Court validation of the law in 2008. The debate about stem cell research involved a variety of social groups, especially from scientific, religious, political, and juridical backgrounds. We argue that the theory of a functionally differentiated society, proposed by Luhmann, is able to enlighten the sequence of events surrounding stem cell research. Society is differentiated into operationally closed, autopoietic systems, each working under its own code. Observing the controversy through the scientific, religious, political, and law systems, we#re able to understand the social influxes that steered the events around stem cell research in Brazil.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:01:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320695.pdf: 2457796 bytes, checksum: 647f86c6ebbb793a507f49003c0c1e43 (MD5) Previous issue date: 2013 / As células tronco mesenquimais (CTM) exibem ampla plasticidade e rápida expansão in vitro, podendo ser isoladas e manipuladas de modo reprodutível e com poucos problemas éticos. Dentre os diversos tipos de CTM encontram-se as CTM da derme (CTMd), as quais demonstram capacidade para agir na regeneração de tecidos lesionados. Atualmente, estudos visando o desenvolvimento de estratégias para o reparo de grandes lesões de pele vêm sendo realizados. Nesse sentido a Engenharia de Tecidos apresenta matrizes de regeneração dérmica (MRD), utilizadas na clínica cirúrgica, como a MRD Integra®. Além disto, estudos envolvendo fatores de crescimento (FC) vêm apresentando resultados satisfatórios na manutenção e diferenciação celular, neste contexto, o plasma rico em plaquetas (PRP) se mostra uma interessante fonte de FC a ser aplicada com biomateriais. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o uso do PRP sobre as CTMd humana em ambientes de cultivo bidimensional e tridimensional, associados à MRD Integra®. Para isto, as CTMd foram cultivadas sob dois modelos: (1) bidimensional: CTMd associado ao PRP sobre o plástico; (2) CTMd associado ao PRP sobre o Integra®. Em cultivo bidimensional, os resultados mostraram que o PRP promove diminuição da viabilidade e número de células. Este resultado é coerente com o estímulo do PRP na diferenciação celular, aumentando a proporção de células com o fenótipo muscular liso/miofibroblástico (positiva para a-SMA). Concomitantemente a estes resultados, observou-se que as culturas tratadas com PRP apresentaram células grandes com morfologia alongada, diferentemente das culturas controle, que apresentavam células menores com morfologia arredondada. Além disso, as CTMd tratadas com PRP apresentaram maior depósito de colágeno tipo I. Em modelo tridimensional, o PRP promoveu diminuição da viabilidade celular, assim como estimulou a diferenciação para células positivas para a-SMA. As análises de MEV demonstraram que as células cultivadas com PRP apresentam maior adesão e adquiriram características fenotípicas semelhantes ao muscular liso/miofibroblástico. Em conclusão, estes resultados demonstram que a associação da MRD Integra® com as CTMd e o PRP constituem um microambiente efetivo para o crescimento, a viabilidade, a migração, a adesão e a diferenciação das CTMd, apresentando grande potencial para a Engenharia de Tecidos. <br> / Abstract : Mesenchymal stem cells (MSC) exhibit broad differentiation potential and high expansion capacity in vitro. They can be isolated and manipulated in a reproducible fashion and their use raises no ethical issues. The dermis is a remarkable source of MSCs (namely dermis derived MSC or dMSC), which are able to act in the regeneration of injured tissues. Currently, several efforts to develop strategies for the repair of large skin lesions have been made. In this scenario, the Tissue Engineering area aims to develop biomaterials that can be used in surgical procedures as dermal regeneration templates (DRT), such as Integra ®. Furthermore, studies involving growth factors (GF) have shown satisfactory results in cell differentiation and maintenance. The platelet-rich plasma (PRP) comprises an interesting source of GF to be applied in association with biomaterials. This study aimed to evaluate the use of PRP on human dMSC cultured on dimensional and three-dimensional environments. Human dMSC were grown under two models: (1) two-dimensional: cells grown on plastic in association with PRP and (2) associated with PRP on the DRT Integra ®. Under the two-dimensional culture system, there was PRP promoted a decrease in cell viability and the total cell number. This result is consistent with the stimulation of PRP on cell differentiation, increasing the proportion of cells with the phenotype smooth muscle / myofibroblastic (a-SMA-positive). Concurrently to these results, cells treated with PRP showed elongated morphology with large size. Contrariwise, cells in the control condition were smaller and with rounded morphology. Moreover, dMSC treated with PRP showed greater deposition of collagen type I. In the three-dimensional model, PRP caused a decrease in cell viability, and also stimulated the differentiation of dMSC into a-SMA positive. Scanning electronic microscopy analyzes demonstrated that cells cultured with PRP acquired greater adhesion and phenotypic characteristics similar to smooth muscle / myofibroblastic. In conclusion, these results demonstrate that the association of DRT Integra® with dMSC and PRP provides an effective microenvironment that supports growth, viability, migration, adhesion and differentiation of dMSC. This shows, therefore, show great potential for fure application in Tissue Engineering.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:17:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 324077.pdf: 1927151 bytes, checksum: c745bb221b82346f72cd6b0972f8e91c (MD5) Previous issue date: 2013 / O Acidente Vascular Cerebral (AVC) isquêmico é uma das doenças que mais levam a óbito no mundo, sendo uma das doenças neurológicas que podem levar a um permanente dano neuronal. O único tratamento aprovado para o AVC agudo é a terapia trombolítica intravenosa, realizada através do ativador de plasminogênio tecidual recombinante (rtPA), que deve ser administrado ao paciente em no máximo quatro horas e meia após a lesão, restringindo o tratamento a poucos pacientes. Portanto, é necessário um novo tratamento, como a terapia com células tronco (CT). Uma fonte de CT promissora é a placenta humana, cujas CT mesenquimais tem reconhecida ação imunossupressora e capacidade de diferenciação para fenótipos neurais. No entanto, antes de partir para uma terapia celular, é necessário conhecer os mecanismos pelos quais as CT irão atuar, como secreção de fatores e influência das mesmas sobre a biologia de astrócitos e neurônios de camundongos, que foi o objetivo de nosso trabalho. Para isso, foram realizados experimentos de co-cultura e a utilização de meio condicionado (MC) de células tronco mesenquimais de placenta humana (CTMPHs) derivadas do córion. O MC das CTMPHs foi utilizado em diferentes concentrações (10%, 25%, 50% e 75%) sobre culturas de astrócitos e culturas de astrócitos e neurônios de camundongos neonatos, e a co-cultura foi realizada com CTMPHs sobre culturas de astrócitos e culturas de neurônio, também de camundongos neonatos. Após, as células foram fixadas e imunocitoquímicas para GFAP e ?-tubulina III foram efetuadas. As células foram contadas e analisadas estatisticamente através do teste ANOVA de 1 via e o pós-teste de Newman - Keuls. Também realizamos marcação para Sytox, afim de verificar a mortalidade celular, em todos os experimentos, e em um grupo de culturas de astrócitos que receberam MC de CTMPHs realizamos o ensaio de MTT para analisar a viabilidade celular. Pudemos concluir que o MC das CTMPHs e a co-cultura com as mesmas não é citotóxico para astrócitos e neurônios, pois não obtivemos marcações positivas com Sytox, assim como no ensaio com MTT, em astrócitos que receberam diferentes concentrações de MC, não houve diferença estatística entre os grupos tratados em comparação aos controles. O MC em baixas concentrações (10% e 25%) não mostrou diferenças em relação ao grupo controle, quando analisou-se a quantidade de células GFAP e ?-tubulina III positivas. Já em altas concentrações (50% e 75%), o MC diminuiu a proliferação dos astrócitos (células GFAP positivas) e aumentou a neuronal (células ?-tubulina III positivas). Em relação a co-cultura, o resultado foi o mesmo. Também notamos a presença de neurônios bipolares, maior no grupo que recebeu 75% de MC, e um aumento nos prolongamentos neuronais nos tratados com 50% e 75% de MC e na co-cultura. Juntos, estes resultados nos permitem concluir que as CTMPHs são uma alternativa eficaz para terapias celulares para o AVC ou outras doenças cerebrais.<br> / Abstract : The ischemic stroke is one of the most important disease that lead to death in the world, and one of neurological diseases that can lead to permanent neuronal damage. The only approved treatment for acute stroke is the intravenous thrombolytic therapy, performed using recombinant tissue plasminogen activator (rtPA), that must be administered to the patient within four hours and a half after the injury, restricting the treatment to a few patients. Therefore, a new treatment is required, like stem cell (SC) therapy. A SC promising source is human placenta, whose mesenchymal SC has recognized immunosuppressive action and capacity for differentiation to neural phenotypes. However, before going for a cell therapy, it is necessary to know the mechanisms by which SC will act, as secretion of factors and their influence on the biology of neurons and astrocytes of mice, which was the goal of our work. For this, experiments were carried out using co-culture and conditioned medium (CM) from mesenchymal stem cells from human placenta (MSCHP) derived from the chorion. The CM of MSCHP was used at different concentrations (10%, 25%, 50% and 75%) in astrocyte cultures and cultures of neurons and astrocytes from neonatal mice, and co-culture was performed with MSCHP on astrocyte cultures and cultures of neurons, also of newborn mice. Following, the cells were fixed and a immunocytochemistry for GFAP and ?-tubulina III were performed. Cells were counted and analyzed statistically by 1-way ANOVA test and post-test Newman - Keuls. We also perform marking to Sytox in order to check the cell mortality, in all experiments, and a group of astrocyte cultures that received CM from MSCHPs performed the MTT assay to analyze cell viability. We concluded that the CM of MSCHP and co-culture with them is not citotoxic to neurons and astrocytes, as we have not had positive reactions with Sytox, as well as the MTT assay in astrocytes that received different concentrations of CM, there was no statistical difference between the treated groups compared to controls. The CM at low concentrations (10% and 25%) showed no differences compared to control group, when we analyzed the number of GFAP and ?-tubulina III positive cells. Already at high concentrations (50% and 75%), CM decreased proliferation of astrocytes (GFAP positive cells) and increased neuronal cells (?-tubulina III positive cells). Regarding co-culture, the result was the same. We also noted the presence of bipolar neurons, increased in the group receiving CM 75%, and an increase in neuronal extensions treatedwith 50% and 75% CM and co-culture. Together, these results allow us to conclude that the MSCHP are an effective alternative to cellular therapies for stroke and other brain diseases.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:31:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340354.pdf: 1524038 bytes, checksum: f77f0c2ce406fc64da4df7465217fc36 (MD5) Previous issue date: 2016 / No tratamento endodôntico de dentes permanentes imaturos despolpados o preparo mecânico do canal é desaconselhado para não fragilizar ainda mais a estrutura dental. A abordagem clássica permite a desinfecção do canal radicular pelo preparo químico com soluções antimicrobianas e medicação intracanal, mas não a retomada do processo de rizogênese para a complementação do canal radicular. A neoformação de tecido pulpar, por abordagem de engenharia tecidual, tem potencial para melhor resolver essas situações clínicas. Com o uso do Modelo de Fatia Dental/Arcabouço para Engenharia de Tecido Pulpar o objetivo deste trabalho foi desenvolver polpas dentais com morfologia e função semelhantes àquelas do tecido original, em dentinas submetidas a tratamentos com diferentes materiais endodônticos. Para tanto, após o acesso endodôntico e a aplicação dos protocolos de tratamento com hipoclorito de sódio, EDTA, pasta de hidróxido de cálcio ou triantibiótica, fatias de 1 mm de espessura foram obtidas da região cervical de molares, seguido pela produção de arcabouço sintético no espaço da câmara pulpar e semeadura de células-tronco de polpa de dentes permanentes humanos (DPSC). O conjunto fatia dental/arcabouço/células foi implantado em tecido subcutâneo de camundongos. Depois de 35 dias, os implantes foram removidos e processados para análise histo-morfológica, imuno-histoquímica, e microscopia eletrônica confocal. Os resultados das análises histológicas mostraram que houve formação tecidual em todos os grupos, com destaque para o grupo tratado pela pasta Triantibiótica. Da análise em microscopia confocal conclui-se que, mesmo quando tratada por soluções irrigadoras ou pastas antimicrobianas, a dentina apresentou condições de servir como substrato para a sobrevivência e a diferenciação das DPSC em odontoblastos funcionais, com capacidade de deposição de matriz dentinária.<br> / Abstract : In the endodontic treatment of immature permanent teeth, mechanical preparation of the root canal is not recommended to do not further weaken the tooth structure. The classical approach allows the disinfection of the root canal by chemical preparation with antimicrobial solutions and intracanal dressing, but not the resumption of the root formation process for the completion of root canal. The pulp tissue neoformation by tissue engineering approach has the potential of better solving these clinical situations. Using the Tooth Slice/Scaffold Model for Dental Pulp Tissue Engineering, the aim of this study was to develop dental pulps with similar morphology and function to those of the original tissue, in dentin subjected to treatments with different materials. For this purpose, after the endodontic access and application of the treatment protocols with sodium hypochlorite, EDTA, calcium hydroxide or triple antibiotic pastes, 1 mm slices from the cervical region of third molars were obtained, followed by the production of a synthetic polymeric scaffold within the pulp chamber and seeding of dental pulp stem cells from human permanent teeth (DPSC). Tooth slice/scaffold/cells sets were implanted subcutaneously in mice. After 35 days, the implants were retrieved and processed for histo-morphological, immunohistochemical, and confocal electron microscopy analyzes. The results of histological analyzes showed that there was tissue formation in all groups, especially the group treated by triple antibiotic paste. From the confocal microscopy analysis, it was concluded that even when treated by irrigating solutions or antimicrobial pastes, dentin is able to serve as substrate for survival and differentiation of DPSC in functional odontoblasts, with dentin matrix deposition capacity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-12-13T03:10:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341436.pdf: 4046203 bytes, checksum: fd2def57c8033759769226c7235109fa (MD5) Previous issue date: 2016 / Lesões de espessura total na pele, como queimaduras extensas e úlceras crônicas, resultam em numerosos problemas fisiológicos, funcionais e psicológicos para os pacientes. Apesar de existirem diversos tratamentos para essas lesões, nenhum deles resulta em uma pele totalmente íntegra e funcional. Por isso, buscou-se com este trabalho um melhor método de reparo cutâneo, associando células-tronco mesenquimais dermais (dCTMs) com matrizes de celulose bacteriana (MCBs). Trabalhos têm mostrado que CTMs melhoram o reparo de tecidos lesados, por meio de sua diferenciação nos fenótipos afetados ou da liberação de fatores parácrinos. As MCBs, por sua vez, são polímeros naturais produzidos por bactérias. Essas membranas são atrativas para o reparo tecidual, por apresentarem características como biocompatibilidade, alta capacidade de retenção de água, e boa permeabilidade. Neste trabalho as MCBs produzidas foram caracterizadas fisicamente em seu estado úmido e liofilizado. As MCBs hidratadas apresentaram uma alta capacidade de retenção de água, fibras nanométricas e porosidade superficial de cerca de 30%. Quando submetidas ao processo de liofilização as MCBs não mantiveram sua conformação tridimensional, apresentando porosidade quase nula, fibras achatadas e baixa taxa de reabsorção de água, não sendo capazes de retornar ao seu estado original. Desse modo, a associação de dCTMs foi analisada apenas com as MCBs hidratadas. As dCTMs foram obtidas a partir de fragmentos de pele, de pacientes saudáveis, que se submeteram a cirurgias de lifting facial, e foram cultivadas sobre as MCBs em condições de cultivo padrão. Os experimentos demonstraram que as dCTMs permaneceram viáveis por 21 dias sobre as MCBs, análises com microscopia de varredura e confocal indicaram que as dCTMs se aderem progressivamente sobre as MCBs, são capazes de se proliferar, não migram para o interior das membranas e mantém sua morfologia típica. Nessas condições as dCTMs também mantiveram suas características imunofenotípicas de CTMs como visto por citometria de fluxo. Esses resultados mostram que as MCBs são biocompatíveis às dCTMs. Considerando estas análises, o potencial terapêutico dessa associação foi avaliado in vivo em lesões cutâneas de camundongos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: taxa de fechamento das lesões, infiltrado inflamatório, angiogênese, espessura e homogeneidade da epiderme e comprimento das cicatrizes. Os resultados revelaram que, quando comparado com o grupo controle, o grupo tratado com dCTM+MCB apresentou um aumento significativo na angiogênese e no infiltrado de neutrófilos. Além disso, o tratamento influenciou a espessura do tecido de granulação, levou a formação de uma epiderme mais fina e homogênea, e aparentemente diminuiu as cicatrizes. Em conjunto, os resultados sugerem que a associação esteja acelerando a maturação das lesões cutâneas, e favorecendo o processo de reparo cutâneo.<br> / Abstract : Full-thickness skin injuries, such as extensive burns and chronic ulcers result in numerous physiological functional and psychological problems for the patients. Even though there are various current treatments for these lesions, none of them lead to a fully reconstituted and functional skin. For this reason, this work search for a better method to improve skin repair, associating dermal mesenchymal stem cells (dMSCs) with bacterial cellulose membranes (BCMs). Studies have shown that MSCs improve tissue repair through differentiation in affected phenotypes or by releasing paracrine factors. The BCMs, in turn, are natural polymers produced by bacteria. These membranes are attractive for tissue repair by presenting biocompatibility, high capacity of water retention, and good permeability. In the present work, the produced BCMs were physically characterized in their wet and freeze-dried states. The wet BCMs showed a high capacity for water retention, nanometric fibers and a surface porosity of about 30%. When subjected to the freeze drying process, BCMs did not keep their three-dimensional conformation, presented almost no porosity, flattened fibers and low water absorption rate, not being able to return to its original state. Thus, dMSCs association was analyzed only with wet BCMs. The dMSCs were obtained from fragments of skin of healthy patients who had undergone facelift surgery. The cells were then cultured on BCMs in standard culture conditions. The experiments showed that dMSCs remained viable for 21 days on BCMs. Scanning electron and confocal microscope analyses revealed that dMSCs progressively adhered on BCMs, were able to proliferate, do not migrate to the interior of the matrices and maintained their typical morphology. In this condition, cells maintained the MSCs immunophenotypic characteristics as assessed by flow cytometry. These results show that the MCBs are biocompatible with the dMSCs. Therefore, the therapeutic potential of the dMSCs associated with BCMs was evaluated in vivo, in mice cutaneous lesions. The following parameters were evaluated: closing rate of lesions, inflammatory infiltration, neovascularization, thickness and homogeneity of the epidermis and length of scars. The results revealed that, when compared to the control group, the treated group (MSC+BCM) showed a significant increase in neovascularization and neutrophil infiltration. Besides, the treatment also influenced the thickness of granulation tissue, and allowed the formation of a thin and uniform epidermis. The lenght of scras int he treated gruoup were relatively smaller. Together, the results suggest that the MSC+BCM treatment is accelerating the maturation of skin lesions, and promoting the skin repair process.

A medicina regenerativa é um campo fascinante e tem chamado a atenção, nos últimos anos, pelo crescente esforço multidisciplinar em busca de metodologias adequadas para a reposição de tecidos danificados no corpo humano. Entre as técnicas utilizadas para desenvolver matrizes para o uso em engenharia tecidual está o electrospinning. Essa técnica que permite a produção de nanofibras através do uso de forças electrostáticas e tem sido empregado para a produção de matrizes fibrosas. As células-tronco mesenquimais (CTM) são células-tronco adultas com alta plasticidade e por isto alvo de muitos estudos terapêuticos. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos sendo que cada um tratou de um objetivo, como segue: (1) cultivar e diferenciar células-tronco mesenquimais em matrizes de nanofibras de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) produzidas através da técnica de electrospinning e investigar o envolvimento de receptores integrina- 1 no processo de adesão em matrizes de PLGA; (2) avaliar a viabilidade celular de células-tronco mesenquimais ou células mononucleares (CMNs) misturadas a uma solução de poli(álcool vinílico) (PVA) e submetidas a produção de fibras por electrospinning. No capítulo I, as CTM foram isoladas de camundongos da linhagem C57BL/6, cultivadas e submetidas a diferenciação condrogênica em matrizes de nanofibras de PLGA produzidas por electrospinning. Análises realizadas 24 horas após a semeadura demonstraram que as CTM eram responsívas e apresentavam morfologia semelhante a de fibroblastos com a presença de fibras de estresse de actina. O bloqueio dos receptores integrina- 1 reduziu (em cerca de 20%) a adesão celular e as observações demonstraram a perda das fibras de estresse de actina. Estes resultados demonstraram a habilidade das nanofibras de PLGA em ativar respostas celulares mediadas por adesão via integrina. No capítulo II foi avaliada a viabilidade de CTM e CMNs após terem sido processadas pelo electrospinning. As CTM foram extraídas da parede de cordão umbilical e as CMNs do sangue de cordão umbilical. Ambas as células foram misturadas a uma solução de PVA 10% e esta suspensão foi utilizada para produzir fibras pelo processo de electrospinning durante 30 minutos utilizando-se uma voltagem de 21 kV. Após o procedimento a viabilidade celular foi mensurada através de contagem celular com exclusão de células mortas por coloração com Trypan Blue. As CTM tiveram a viabilidade reduzida para 19.6%, e as CMNs para 8.38%. Os dados coletados sugerem a necessidade de mais estudos na busca de estratégias de proteção celular durante o electrospinning, uma vez que a elevada perda da viabilidade celular pode estar relacionada à alta viscosidade da solução polimérica, levando a redução do acesso ao meio nutritivo, associada aos efeitos do estresse mecânico e elétrico inerentes do procedimento. Os resultados gerais destes capítulos (1) demonstraram a habilidade das matrizes de nanofibras de PLGA em ativar respostas celulares via receptores integrinas- 1; (2) sugerem que a incorporação de células em matrizes fibrosas durante a produção de fibras através da técnica de electrospinning é um procedimento viável e pode ser utilizado como estratégia para a melhor distribuição celular na matriz formada. Juntamente, estes dados contribuem para o entendimento do comportamento das CTM em matrizes biodegradáveis e biocompatíveis produzidas por electrospinning, as quais podem ser utilizadas como material carreador em tratamentos clínicos envolvendo transplante celular. / Regenerative medicine is an amazing field that has called attention, in the last years, due to the multidisciplinary efforts to find suitable methodologies to regenerate damage tissues. Electrospinning is an important technique used to produce nanofibers and is employed to develop fibrous scaffolds. Mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells with high plasticity and, for this reason, are widely studied in therapeutic approaches. The present study is composed by two chapters, with different aims, as follow: (1) culture MSC on poly(D, Llactide- co-glycolide) (PLGA) nanofiber scaffolds and induce them to condrogenic differentiation and, analyze the influence of the integrin- 1 receptor in the adhesion of MSC on PLGA scaffolds; (2) analyze the viability of MSC and mononuclear cells (MNCs) mixed to a PVA solution after electrospinning. In the Chapter I, MSCs were isolated from C57BL/6 mice, cultured on PLGA scaffold produced by electrospinning technique and differentiated into chondrogenic lineage. After seeding, MSCs were responsive and become flattened with fibroblast-like morphology demonstrated by the presence of actin stress fibers. Integrin- 1 receptor blockage reduced (about 20%) cell adhesion with loss of actin stress fibers, demonstrating the ability of PLGA nanofiber to trigger integrin receptor-mediated cell adhesion. In the Chapter II, the viability of MSC and MNC after electrospinning were analyzed. MSC were extracted from the wall of the umbilical cord, and MNC from the umbilical cord blood. Cells were resuspended in a solution of poly(vinil alcohol) (PVA) 10% and subjected to electrospinning during 30 minutes under a voltage of 21kV. Cell viability was assessed before and after the procedure by exclusion of dead cells by Trypan Blue staining. After electrospinning the MSC viability reduced to 19.6%, and the MNCs viability to 8.38%. These data suggest the need for more investigations looking for strategies to protect cell from the damages caused by electrospinning, as the loss of viability can be related to the high viscosity of the polymeric solution which reduced the access to nutrients associated to the electric and mechanical stress during electrospinning. The results of both chapters (1) demonstrated the ability of PLGA nanofiber to trigger integrin receptor-mediated cell adhesion; (2) suggested that the cellular incorporation into fibrous scaffolds produced by electrospinning is a viable process and can be used to improve the cellular distribution into scaffolds. The present data contribute to the understanding of MSCs´ behavior on these biodegradable and biocompatible scaffolds that can be used as carriers in treatments involving cell transplantation.