Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Introdução: Sabendo-se que o estímulo neurogênico de origem nociceptiva é considerado o deflagrador primário do processo de cicatrização da pele, que o CGRP e SP aumentam a proliferação de fibroblastos in vitro, e diante da falta de estudos correlacionando CGRP, SP e p53 e apoptose em queloide torna-se importante investigar se os neuropeptídeos da pele podem influenciar a expressão de p53 e a apoptose no queloide. Uma possível associação entre neuropeptídeos e o gene p53 poderia representar um novo caminho para um melhor entendimento fisiopatogênico das cicatrizes patológicas fibroproliferativas e, por conseguinte, o advento de tratamentos mais específicos. Objetivo: Investigar a expressão do gene p53 e o índice apoptótico em culturas de fibroblastos de queloide, submetidos à ação dos neuropeptídeos CGRP e SP. Métodos: Foram cultivados fibroblastos de queloide em meio de cultura com adição de CGRP e SP, e controle. O índice apoptótico, e o ciclo celular foram determinados por citometria de fluxo e a marcação de proteínas-chave da apoptose por espectrofotometria. A atividade celular foi avaliada ao longo do tempo e em períodos determinados, por MTT. A morfologia celular foi avaliada por microscopia confocal. Resultados: Foi padronizado um modelo de explante baseado nas diferenças biológicas das regiões específicas do queloide. A atividade celular em fibroblastos de queloide variou ao longo do tempo, sendo diferente entre os subgrupos celulares mas similar dentro de um mesmo subgrupo, mas não foi afetada pela adição de CGRP, SP ou CGRP+SP. Fibroblastos de queloide das regiões periférica e central apresentaram maior expressão de p53 do que fibroblastos da pele adjacente ao queloide, de cicatriz normotrófica ou de pele normal, adjacente à cicatriz normotrófica. CGRP, SP e CGRP+SP provocaram uma diminuição na expressão de p53 em fibroblastos de queloide das regiões periférica e central em relação aos outros subgrupos estudados. Conclusão: CGRP, SP e CGRP+SP provocaram uma diminuição na expressão de p53 em fibroblastos de queloide. / Introduction: Given that nociceptive neurogenic stimulation is considered the primary trigger of the healing process in the skin, that CGRP and SP increase fibroblast proliferation in vitro, and given the lack of studies correlating CGRP, SP p53 and apoptosis in keloid, it becomes important to investigate whether skin neuropeptides can influence the expression of p53 and apoptosis in keloid. A possible association between neuropeptides and p53 gene could represent a new path to a better physiopathogenic understanding of pathological fibroproliferative scars and, therefore, the advent of more specific treatments. Objective: To investigate the expression of p53 gene and the apoptotic index in keloid fibroblast cultures exposed to the action of the neuropeptides CGRP and SP. Methods: Keloid fibroblasts were grown in culture medium with or without the addition of CGRP and SP. The apoptotic index and cell cycle were determined by flow cytometry and the labeling of apoptosis key proteins was done by spectrophotometry. Cell activity was evaluated over time by MTT. Cell morphology was analyzed by confocal microscopy. Results: An explant model for keloid fibroblast isolation and culture based on the biological differences of its specific regions was standardized. Cellular activity in keloid fibroblasts varied over time and was different among the fibroblasts subgroups but similar within the same subgroup, however was not affected by the addition of CGRP, SP or SP + CGRP. Keloid fibroblasts derived from peripheral and central regions had higher p53 expression than fibroblasts derived from the skin adjacent to the keloid scar, fibroblasts derived from normotrophic scar or from normal skin adjacent to the normotrophic scar. CGRP, SP and SP + CGRP caused a decrease in p53 expression in keloid fibroblasts of peripheral and central regions compared to all other subgroups studied. Conclusion: CGRP, SP and SP + CGRP caused a decrease in p53 expression in keloid fibroblasts. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientadora: Profa. Dra. Christiane Bertachini Lombello / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2015. / A engenharia de tecidos visa cultivar celulas sobre substratos tridimensionais, para implantacao no organismo, restaurando desta forma partes danificadas. Os materiais utilizados como substratos devem apresentar caracteristicas propicias ao cultivo celular. Na cultura de celulas e necessario o estabelecimento de certas condicoes, como o modo de suplementacao do meio de cultura. Sendo assim, este estudo avaliou sistemas de cultura autologo (coagulo e soro do plasma rico em plaquetas) e xenogeno (gelatina e soro fetal bovino), como substratos e suplementos para a cultura de celulas. O plasma rico em plaquetas (PRP) apos ativacao da cascata de coagulacao apresenta uma estrutura tridimensional, o coagulo. Com a retracao do coagulo, ocorre a liberacao do soro do PRP. A gelatina e uma substancia com capacidade de gelificacao. Para manutencao de sua estrutura, a gelatina foi reticulada com glutaraldeido. A caracterizacao do substrato de gelatina e a liberacao de glutaraldeido foram avaliadas por espectroscopia. Foram realizadas avaliacoes do intumescimento e da degradacao do coagulo e da gelatina por 24 horas e cinco dias, respectivamente. A analise da ultraestrutura dos substratos foi realizada por microscopia eletronica de varredura (MEV). O diametro das fibras do coagulo e a rugosidade superficial da gelatina tambem foram examinados. Para as analises biologicas foram utilizadas celulas Vero. Nas culturas com o coagulo, o meio foi suplementado com 10% do soro do PRP e as culturas com gelatina tiveram o meio suplementado com 10% de SFB. A avaliacao da citotoxicidade foi realizada atraves do teste do extrato e de contato direto das celulas com os substratos. Nas analises do comportamento celular com os substratos, as celulas foram inoculadas sobre o coagulo e a gelatina. As culturas foram mantidas a 37¿C com 5% CO2. As avaliacoes por espectroscopia da gelatina nao identificaram alteracao da estrutura primaria e a presenca do agente reticulador. Os substratos do coagulo e da gelatina exibiram intumescimentos superiores a 200% e ambos demonstraram boa estabilidade, nao apresentando uma degradacao significativa no periodo de cinco dias. A ultraestrutura do coagulo e formada por uma rede irregular de fibras de diferentes diametros, com um valor medio de 0,210}0,097 ¿Êm. A gelatina apresentou uma estrutura densa e plana, exibindo uma micro-rugosidade de 0,11}0,02 ¿Êm. As avaliacoes da citotoxicidade confirmaram que os sistemas de cultura nao foram toxicos para as celulas Vero, exibindo valores de viabilidade celular superiores a 90%. Na analise da interacao celular com os substratos foi verificado que as celulas aderiram e se espalharam sobre os materiais. As celulas presentes na gelatina exibiram maior area superficial (866,32}390,53 ¿Êm) do que as celulas aderidas no coagulo (425,53}245,21 ¿Êm), indicando maior interacao com o substrato. Portanto, os resultados sugerem que ambos os sistemas de cultura sao promissores para utilizacao em engenharia de tecido. Todavia o sistema autologo apresenta a vantagem de ser proprio do organismo. / Tissue engineering aims to grow cells on three dimensional substrates for implantation in the body, restoring damaged parts. The materials used as substrates must have favorable characteristics to the cell culture. In cell culture, it is necessary to establish certain conditions, such as supplementation of the culture medium. Thus, this study evaluated autologous culture systems (clot and serum platelet-rich plasma) and xenogeneic (gelatin and fetal bovine serum) as substrates and supplements for cell culture. The platelet-rich plasma (PRP) upon activation of the coagulation cascade has a three dimensional structure, the fibrin clot. With clot retraction, the serum PRP is released. Gelatin is a substance with gelling capacity. To maintain its structure, gelatin was crosslinked with glutaraldehyde. Characterization of the gelatin substrate and the release glutaraldehyde were assessed by spectroscopy. For the characterization of the substrates were performed assessments of swelling and degradation for 24 hours and five days, respectively. The analysis of the ultrastructure of the substrates was performed by scanning electron microscopy (SEM). The diameter of the clot fiber and the surface roughness of gelatin were also examined. For biological testing, Vero cells were used. In cultures with the clot the medium was supplemented with 10% serum from PRP and gelatin medium were supplemented with 10% FBS. Assessment of cytotoxicity was performed using the test extract and direct contact of the cells with the substrates. In cellular behavior analysis with the substrates, the cells were inoculated onto the clot and gelatin. Cultures were maintained at 37°C with 5% CO2. The evaluations of gelatin by spectroscopy have not identified change in the primary structure and the presence of the crosslinking agent. The substrates of the clot and gelatin exhibited swellings higher than 200% and both demonstrated good stability, showing no significant degradation over a five day period. The ultrastructure of the clot is formed by an irregular network of fibers of different diameters, with an average value of 0.210±0.097 ìm. The gelatin presented a dense and planar structure, showing a micro-roughness of 0.11±0.02 ìm. The evaluation of cytotoxicity confirmed that culture systems were not toxic to Vero cells, exhibiting cell viability higher than 90%. In the analysis of cell interaction with the substrates, was found that the cells adhered and spread on the materials. Cells present in the gelatin exhibited a greater surface area (866.32±390.53 ìm) than the cells adhered in the clot (425.53±245.21 ìm), indicating a greater interaction with the substrate. Therefore, the results suggest that both culture systems are promising for use in tissue engineering. However autologous system has the advantage of being the body itself.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissDF.pdf: 699670 bytes, checksum: 3b6ce911fe1da5141ad8e34545247e79 (MD5) Previous issue date: 2007-03-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / In the last two decades mammalian cell cultures have been broadly used for the industrial production of pharmaceutical, proteins, in particular the monoclonal antibodies by cultures of murine hybrid cells (hybridoma). The development of bioprocess for industrial scale of monoclonal antibodys (MAbs) depends on the determination and optimization of several physiological and metabolic parameters. In this work are shown preliminary development results of the bioprocess for production of three MAbs for blood typing through the ABO system, with is of great interest for Brazilian public health. Experiments with three lineages of murine hybridomas which were able to secret three different immunoglobulins with specificity to ABO human blood antigens were accomplished in Spinner flasks using RPMI 1640 medium and fetal bovine serum (FBS) in concentrations of 20 and 10 % vv, temperature of 37 ºC and pH 6.8 7.4 .The three hybridomas showed very different growth patterns in these culture medium The cultivation with 20 % v/v of FBS as much as the cultivation with cells adapted to 10 % v/v FBS showed the necessity of a better balance of the amino acids formulation in the culture medium in order to improve the specific maximum grow rate (µmáx) and maximum cells density (CXmáx). / Nas últimas duas décadas o cultivo de células animais tem sido amplamente utilizado para a produção industrial de proteínas de interesse farmacêutico em particular de anticorpos monoclonais, através do cultivo de células híbridas murinas (hibridomas). O desenvolvimento de bioprocessos de alta produtividade em larga escala de produção de anticorpos monoclonais (MAbs monoclonal antibodys) depende da determinação e otimização de vários parâmetros fisiológicos e metabólicos dos hibridomas. Neste trabalho são apresentados dados preliminares para o desenvolvimento de um bioprocesso de produção de três MAbs para tipagem sanguínea pelo sistema ABO, de grande interesse para a saúde pública Brasileira. Experimentos com três linhagens de hibridomas murinos capazes de secretar imunoglobulinas com especificidade a antígenos eritrocitários do sistema sanguíneo ABO humano foram realizados em frascos Spinner usando meio RPMI 1640 e soro fetal bovino (SFB) em concentrações de 20 e 10 % v/v, temperatura de 37 ºC e pH 6,8 7,4. Os três hibridomas mostraram características de crescimento celular bem diferenciadas nesse meio de cultura. Tanto os cultivos com 20 % v/v de SFB como os cultivos com células adaptadas a 10 % v/v SFB revelaram a necessidade de balanceamento de aminoácidos no meio para melhorar a velocidade específica máxima de crescimento celular (µmáx) e densidade máxima de células (CXmáx).

Neste estudo padronizamos modelo de dor óssea induzida pela administração de células do tumor de Walker 256 em fêmur de ratos e avaliamos o efeito analgésico da crotalfina, um peptídeo com atividade analgésica. Análises radiográficas, tomográficas e cintilográficas demonstraram a presença de processos osteolíticos difusos, destruição do tecido cortical ósseo e intensa atividade osteogênica. Foi detectado aumento de partes moles adjacentes ao osso, fenômeno observado em pacientes com câncer ósseo. Análises histopatológicas mostraram a presença de células tumorais no pulmão, baço e fígado dos animais, indicando disseminação das células tumorais. Foi detectada a presença de hiperalgesia, alodinia e dor manifesta, a partir do 1º dia após a inoculação das células, persistindo por pelo menos 14 dias. Crotalfina (8 <font face=\"Symbol\">mg/kg, p.o) administrada no 14º dia, bloqueou estes fenômenos. Esse efeito antinociceptivo é de longa duração (48 h) e mediado por receptores opióides do tipo <font face=\"Symbol\">k e <font face=\"Symbol\">d. Não foi observado desenvolvimento de tolerância após o tratamento prolongado com crotalfina. / The aim of the present work was to standardize a new rat model of bone pain induced by the injection of Walker 256 carcinoma cells into the femoral cavity of rats, and to evaluate the analgesic effect of crotalphine, an analgesic peptide. Radiographic, tomographic and scintigraphic analysis showed the presence of diffuse osteolytic processes, destruction of cortical bone tissue and intense osteogenic activity. Increase of soft tissue adjacent to the bone was also detected, being this phenomenon observed in patients with bone cancer. Hystopathological analysis showed the presence of tumor cells in lungs, spleen and liver, indicating the occurrence of metastasis. Tumor cell inoculation induced the presence of hyperalgesia, allodynia and spontaneous pain. Crotalphine (8 <font face=\"Symbol\">mg/kg, p.o.), administered on day 14, blocked these phenomena. This antinociceptive effect is long-lasting effect (2 days) and mediated by peripheral <font face=\"Symbol\">k and <font face=\"Symbol\">d- opioid receptors. Prolonged treatment with crotalphine (14 days) did not cause the development of tolerance to its antinociceptive effect.

A causa mais comum da osteoporose é o declínio do hormônio sexual feminino, o estrógeno, que ocorre após a menopausa. Esse hormônio regula a produção de citocinas que influenciam a proliferação dos osteoclastos, aumentando a reabsorção óssea. Os efeitos da cafeína no metabolismo ósseo são controversos e podem estar associados ao aumento significativo de doenças periodontais, fraturas, aumento do cálcio urinário e redução da densidade mineral óssea, por exercer efeitos inibidores sobre as funções dos osteoblastos. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o efeito in vitro de diferentes concentrações de cafeína no metabolismo de células osteoblásticas da medula óssea de ratas osteoporóticas. Após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais, ratas Wistar foram divididas em dois grupos experimentais: controle (C) e submetidas à ovariectomia (OVX). Após 60 dias da cirurgia, as ratas foram sacrificadas para coleta dos fêmures e das células mesenquimais da medula óssea, que foram induzidas à diferenciação em osteoblastos com meio osteogênico com três concentrações de cafeína (1, 3 e 5 mM - grupos OVX1, OVX3 e OVX5) e cultivadas em placas de 24 poços (n = 5) para avaliação da proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP) bioquímica e in situ, detecção e quantificação de nódulos mineralizados e análise da expressão de genes relacionados à atividade osteoblástica através de PCR em tempo real. Os ensaios foram realizados em triplicata e analisados por meio do software estatístico GraphPad Prism, com nível de significância fixado em 5%. A proliferação celular foi menor nos grupos osteoporóticos com adição de cafeína, tendo a menor queda o grupo com adição de 1mM. O método bioquímico de ALP não foi significante nos períodos analisados, entretanto, aos 10 e 14 dias, a atividade aumentou quando a concentração de cafeína era maior. Já na atividade de ALP in situ, o grupo OVX1 foi o que apresentou melhor resultado nos períodos avaliados (p < 0,05), com pico aos 14 dias. A quantificação de matriz mineralizada foi maior no grupo OVX comparado ao grupo C; entre as concentrações, a maior quantificação dos nódulos de cálcio se deu no grupo com 1mM de cafeína. Os resultados obtidos no PCR mostraram que o gene para fosfatase alcalina teve maior expressão no grupo OVX, seguido do grupo OVX1 aos 7 e 10 dias; a expressão gênica de osteocalcina foi maior para o grupo OVX1 aos 10 e 14 dias e esse grupo apresentou a maior expressão em todos os períodos para os genes Runx2 e RankL. No caso do Bmp4, o grupo OVX3 foi o mais expresso aos 10 e 14 dias. Os genes osteoprotegerina e osteopontina variaram sua expressão de acordo com o período e grupo avaliado. A expressão de osterix foi similar entre os grupos aos 7 e 10 dias, enquanto a expressão de Bsp, aos 7 e 14 dias, mostrou semelhança entre os grupos controle e OVX1. Frente aos resultados obtidos, sugere-se que a concentração de 1mM de cafeína pareceu ser a menos prejudicial ao metabolismo das células osteoblásticas neste modelo experimental de osteoporose. / The most common cause of osteoporosis is the decrease of estrogen after menopause. This hormone regulates the production of cytokines that influence osteoclast proliferation, increasing bone resorption. The effects of caffeine in bone metabolism are controversial and may be associated to periodontal disease, bone fractures, increase of urinary calcium levels and reduction of mineral bone density due to inhibition of osteoblast activities. Thus, the goal of this investigation was to evaluate the in vitro effect of different caffeine concentrations in the metabolism of bone marrow osteoblastic cells from osteoporotic rats (OVX). After Ethical Committee approval, wistar female rats were divided in two experimental groups: control (C) and submitted to ovariectomy (OVX). After 60 days of surgery, femurs were removed to isolate bone marrow mesenchymal cells, which were induced to osteoblastic differentiation in osteogenic medium along with three different concentrations of caffeine (1, 3 and 5 mM - OVX1, OVX3 e OVX5 respectively) and posteriorly seeded in 24-well plates (n = 5) to evaluate cell proliferation, alkaline phosphatase activity and its in situ detection, detection and quantification of mineralized nodules as well as assess quantitative expression of genes associated to osteoblastic activity by means of real time PCR. All the experiments were performed in triplicate and analyzed by means of the statistical software GraphPad Prism for p<0.05. Cell proliferation was diminished in the all osteoporotic groups that received caffeine, with group OVX1 being the less affected. Biochemical assay of ALP activity did not show differences among the groups in the periods analyzed; nevertheless there was a tendency to a higher activity proportional to the higher concentration of caffeine. The in situ detection of ALP showed better results in group OVX1 after 14 days of culture. Mineralized matrix quantification was higher in OVX groups when compared to control group; among the concentrations, the higher quantification of calcium nodules was in group OVX1. The results obtained with PCR showed that the gene for ALP had its highest expression in OVX group, followed by OVX1 at 7 and 10 days; expression of osteocalcin was higher in OVX1 after 10 and 14 days and this same group presented higher expression in all periods for genes Runx2 e Rankl. Analysis of Bmp4 gene showed that it was expressed in group OVX3 after 10 and 14 days. The genes that code for osteoprotegerin and osteopontin had different expression values in accordance to the period and group evaluated. The expression of osterix was similar between the groups after 7 and 10 days, whereas the expression of Bsp was similar between control and OVX1 groups after 7 and 14 days. The results suggest that the concentration of 1mM of caffeine is the most beneficial to the metabolism of osteoblastic cells in a model of osteoporosis.

BMPs ocupam papel central na diferenciação e crescimento celulares. A sinalização intracelular das BMPs depende de substratos conhecidos como BR-SMADs (SMAD1/5/8). Em ilhotas pancreáticas de ratas grávidas, onde ocorre aumento da massa endócrina e da síntese e secreção de insulina, houve aumento da expressão do receptor BMPR1A. Em camundongos knockout para BMPR1A houve diminuição da expressão de genes-chave na exocitose de grânulos de insulina. Tais eventos estão associados à redução da atividade das BR-SMADs. O objetivo deste trabalho foi avaliar, em células <font face=\"Symbol\">b INS1E, o perfil de expressão gênica em larga escala após silenciamento das BR-SMADs. As expressões relativas de Munc18a, Munc18b e Snap23 foram reduzidas quando do silenciamento das BR-SMADs (n=3, p<0,05 vs CTL). O silenciamento de SMAD1 (n=3, p<0,05 vs CTL) ou SMAD5 (n=3, p<0,05 vs CTL) acarretaram redução do mRNA de Sintaxina 4. Conclui-se que as BR-SMADs estão envolvidas na regulação da secreção de insulina modulando proteínas envolvidas na fusão de vesículas contendo grânulos de insulina à membrana plasmática de células INS1E. / BMPs play a determinant role in cell differentiation and growth. BMP intracellular signaling involves the substrates know as BR-SMADs (SMAD1/5/8). BMPR1A receptor expression was upregulated in pancreatic islets from pregnant rats, in wich endocrine mass and insulin secretion are increased. Mice with attenuated BMPR1A signaling in <font face=\"Symbol\">b cells showed decreased expression of key genes involved in insulin exocytosis. These events are associated with reduction of BR-SMADs activity. The aim of this work was to perform a screening to evaluate changes in expression profiles after knockdown of BR-SMADs in INS1E <font face=\"Symbol\">b cells. Relative expressions of Munc18a, Munc18b and Snap23 were diminished after knockdown of the BRSMADs (n=3, p<0,05 vs CTL). Only SMAD1 (n=3, p<0,05 vs CTL) and SMAD5 (n=3, p<0,05 vs CTL) silencing caused reduction of sintaxin 4 expression. These data point to the involvement of BR-SMADs in the regulation of insulin secretion by modulating the expression of proteins responsible by fusion of insulin-containing granules to the membrane of INS1E cells.

Os tumores de cabeça e pescoço ocupam o sexto lugar no ranking de incidência mundial, e estão localizados na região da face, fossas nasais, seios paranasais, boca, faringe, laringe entre outros tecidos moles do pescoço. O tabagismo, o etilismo, a radiação solar e o vírus HPV, são fatores de risco associados a esse tipo de tumors. A terapia combinada de drogas antineoplásicas tem sido utilizada para amenizar os efeitos colaterais e potencializar o tratamento antitumoral. A combinação de paclitaxel e cisplatina tem se mostrado eficaz em tumores sólidos, como o HNSCC. A morte celular induzida pelo paclitaxel é mediada pela ruptura da dinâmica dos microtúbulos normais, já a cisplatina induz ligações cruzadas de DNA estes tratamentos induzem a célula à morte por apoptose. A apoptose é um processo de morte dividido, didaticamente, em via intrínseca (via mitocondrial) e via extrínseca (via receptor de morte). Entender por qual via essas células tumorais são induzidas a morte é fundamental para tentar evitar a resistência dessas células ao tratamento. Nosso objetivo é entender se células tumorais de HNSCC são resistentes ou sensíveis ao tratamento com paclitaxel e cisplatina sozinhos ou em associação. Para isso, realizamos o tratamento da linhagem celular FaDu por um período de 48 horas com as drogas e verificamos sua resistência a indução de morte por esses tratamentos. Os resultados mostraram que o tratamento com paclitaxel não potencializa a morte desta célula, sendo a linhagem FaDu mais sensível ao tratamento com cisplatina e a associação apresenta o mesmo perfil de quando tratada com cisplatina. A morte desta linhagem é dependente de caspases e possui uma preferência pela via extrínseca da apoptose que, consequentemente, induz a morte também pela via intrínseca. A modulação desta morte se dá pelo balanço das proteínas pró- e anti-apoptóticas da família BCL-2 que são responsáveis pela regulação da apoptose, o tratamento com cisplatina induz a expressão da proteína pró-apoptótica BAK e a diminuição das proteínas anti-apoptóticas BCL-2 e BCL-XL. Com os resultados obtidos, concluímos que a associação de paclitaxel e cisplatina não potencializa a morte da linhagem celular FaDu. Contudo, a cisplatina apresentou-se efetiva na indução de morte por apoptose através do aumento da expressão da proteína BAK e a diminuição da expressão das proteínas BCL-2 e BCL-XL. / Head and neck squamous cell carcinoma is the sixth most common cancer in the world, and are located in the region of the face, nasal fossas, sinuses, mouth, pharynx, larynx and other soft tissues of the neck. Tobacco smoke, etilism, solar radiation and HPV are risk factors associated with this type of tumors. Combination therapy of anticancer drugs has been used to alleviate the side effects and potentiate the antitumor treatment. The combination of paclitaxel and cisplatin has been shown to be effective in solid tumors such as HNSCC. The paclitaxel-induced cell death is mediated by disruption of the normal microtubule dynamics, and the cisplatin induced DNA cross-links, these treatments induce cell death by apoptosis. Apoptosis is a death process divided in, intrinsic pathway (mitochondrial pathway) and extrinsic pathway (death receptor pathway). Understand by what pathway those tumor cells which are induced death is important to try and avoid the resistance of these cells to treatment. Our aims understand if HNSCC tumor cells are resistant or sensitive to treatment with paclitaxel and cisplatin alone or in combination. We carried out the treatment of cell line FADU a period of 48 hours with the drug and we verify their resistance to death induction by these treatments. The results showed that treatment with paclitaxel did not potentiate the cell death, in the other hand, FADU cell line appeared to be more sensitive to cisplatin treatment, and the association has the same profile when treated with cisplatin. The death of this line is dependent on caspases and has a preference for the extrinsic pathway of apoptosis, consequently, also induces the death by the intrinsic pathway. The modulation of death is caused by the balance of pro-and anti-apoptotic proteins of BCL-2 family proteins that are responsible for regulation of apoptosis, treatment with cisplatin induces the expression of pro-apoptotic protein BAK and the decrease of anti-apoptotic proteins BCL -2 and BCL-XL. With these results, we conclude that the combination of paclitaxel and cisplatin did not potentiate the cell death of the cell line Fadu. However, cisplatin showed to be effective in induction of death by apoptosis through increased expression of BAK protein and decreased expression of BCL-2 and BCL-XL.

CSCs, caracterizadas pela alta atividade da ALDH1 e expressão (ou não) de marcadores de células-tronco embrionárias OCT-4, NANOG, SOX2, KLF4, LIN2, estão presentes em tumores de mama HER2+. Mamosferas são estruturas celulares esferóides in vitro enriquecidas em CSCs. Neste trabalho, buscou-se um melhor entendimento do papel dos miRNAs -221, -222 e -4728-3p na biologia das CSCs. Foi observado alto percentual de células ALDH1+ (citometria) em mamosferas das linhagens MCF-7, SKBR3 e BT-474; alta expressão (qRT-PCR) de miR-221 e -222 em mamosferas da linhagem MCF-7 e de tumores de pacientes, além de alta expressão de HER2 em mamosferas das linhagens MCF-7 e SKBR3. A MFE de células MCF-7 mostrou-se aumentada após a indução (com lentivetores) da superexpressão dos miRNAs -221 e -222. A resistência ao quimioterápico paclitaxel estava aumentada em mamosferas que superexpressavam o miRNA-222. A superexpressão de miR-4728-3p, localizado em um intron de HER2, levou a um aumento das subpopulações ALDH1+ em duas linhagens celulares reforçando seu envolvimento com a biologia de CSCs. / CSCs, characterized by high activity of ALDH1 and high (or not) expression of embryonic stem cell markers OCT-4, NANOG, SOX2, KLF4, LIN28 are present in tumors with HER2 amplification. Mammospheres are spheroid cell structures in vitro enriched by CSCs. In this study, we aim to contribute to the better understanding the role of miRNAs -221, 222, 4728-3p in the the biology of CSCs. We observed high percentage of ALDH+ cells (cytometry) in mammospheres of MCF-7, SKBR3 and BT-474 cell lines; high expression (qRT-PCR) of miR-221 and -222 in mammospheres of MCF-7 cell line and cells derived from patients, moreover HER2 is upregulated in mammospheres from MCF-7 and SKBR3 cell lines. MFE is higher in MCF-7 cell line after induction (with lentivectors) of miR-221 and -222 expression. The resistance to paclitaxel was increased in mammopheres that were overexpressing miRNA-222. Overexpression of miR-4728-3p, located in an intron of HER2 gene, induced the increment of ALDH1+ subpopulations in two cell lines, reinforcing its role in the biology of CSCs.

O splicing do pré- RNAm é o processo pelo qual os introns são removidos e os exons são unidos para produzir um RNAm maduro. Esse processo é catalisado por um complexo denominado spliceossomo. RNF113A é uma proteína detectada em complexos pré- e pós-catalíticos. Neste trabalho analisamos a participação de RNF113A no spliceossomo de mamíferos e suas interações com outros componentes do spliceosomo. Nossos resultados mostraram que a super- expressão de RNF113A em células HEK293T aumentam o nível dos snRNAs U1, U2, U5 e U6 e de PRPF19. A imunoprecipitação de RNF113A revelou maior concentração de PRPF19, hBRR2 e SF3b2. Além disso, observamos maior quantidade dos snRNAs U5 e U6 associados à RNF113A. As frações de imunoprecipitação foram analisadas por espectrometria de massas e mostraram interação de RNF113A com proteínas que participam na transcrição, ubiquitinação, maturação do pré-RNAm e splicing. Estes resultados indicam que a associação de RNF113A ao spliceossomo ocorre a partir de suas interações com os snRNAs U5 e U6 e com proteínas relacionadas, como a hBRR2. / Splicing of pre-mRNA is the process by which introns are removed and exons are joined together to produce a mature mRNA competent for translation. It is catalyzed by the complex called spliceosome. RNF113A is a protein detected in pre- and post-catalytic complexes. In this work we analyzed RNF113A participation on spliceosome and its interactions with other spliceosome components. Our results showed that overexpression of RNF113A in HEK293T led to increased levels of U1, U2, U5, U6 snRNAs and PRPF19. RNF113A also associates to PRPF19, hBRR2 and SF3b2, as observed by immunoprecipitation followed by RT-qPCR and western blot. Consistently, U5 and U6 snRNAs were observed in association with RNF113A. Immunoprecipitation fractions were also analyzed by mass spectrometry and results showed interaction of RNF113A with proteins that participate in processes such as transcription, ubiquitination, pre-mRNA maturation and splicing. These results suggest RNF113A associates to spliceosome by interacting with U5 and U6 snRNAs and with related proteins, for example hBRR2.

No presente trabalho, desenvolvemos uma estratégia vacinal baseada em vacinas de DNA que codificam proteínas do HPV-16, o tipo viral de maior relevância epidemiológica, fusionadas à glicoproteína D (gD) do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). A vacina que contêm o gene da E7 de HPV-16 fusionada à gD de HSV-1 (pgDE7), administrada em regime vacinal de quatro doses, foi capaz de gerar significativa ativação de células T CD8+ E7-específicas e apresentar 40% de efeito protetor anti-tumoral terapêutico em camundongos desafiados com células transformadas que expressam as proteínas E6 e E7 do HPV-16 (células TC-1). A partir das evidências geradas, desenvolvemos um novo vetor vacinal que codifica as proteínas E7, E6 e E5 do HPV-16 (pgD-E7E6E5). Em ensaios em modelo murino, apenas uma dose da vacina foi capaz de gerar ativação de células T CD8+ específicas e 70% dos camundongos previamente desafiados com células TC-1 e inoculados com 3 doses da vacina mantiveram-se livres de tumores. Como tentativa de potencializar o efeito protetor terapêutico encontrado, adotamos duas medidas: a co-administração de plasmídeos que codificam citocinas e a otimização de códons da sequência gênica que codifica a proteína quimérica. A combinação das vacinas pgDE7 ou pgD-E7E6E5 com plasmídeos que carregam os genes das citocinas IL-2, IL-12 ou GM-CSF foi capaz de aumentar a proteção terapêutica para 100% em regime vacinal de dose única. A adequação da sequência antigênica ao sistema de expressão humano, aumentou em cerca de 5 vezes o potencial terapêutico do vetor vacinal pgDE7. Em conjunto, os dados apresentados nesta tese demonstram a evolução do desenvolvimento de uma estratégia vacinal contra tumores induzidos por HPV-16 e encorajam seu potencial para uso em futuros ensaios clínicos. / The development of immunotherapeutic strategies against human papillomavirus (HPV) is a priority for the control of HPV-induced lesions and cervical cancer. In this study, we developed DNA vaccines encoding HPV-16 proteins fused to glycoprotein D (gD) of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) as an approach to control HPV-16 induced tumors. The vaccine encoding HPV-16 E7 fused to HSV-1 gD (pgDE7), when administered in a four doses vaccine regimen, was able to generate significant activation of E7-specific CD8+ T cells and showed 40% of therapeutic anti-tumor effect in mice previously challenged with tumor cells expressing HPV-16 E6 and E7 proteins (TC-1 cells). Following these evidences, we developed a new vaccine vector encoding HPV-16 E7, E6, E5 proteins fused to HSV-1 gD (pgD-E7E6E5). Only one vaccine dose generated antigen-specific CD8+ T cell responses and three doses conferred 70% protection to mice previously challenged with TC-1 cells. As an attempt to enhance the observed therapeutic anti-tumor effects, we tested two approaches: co-administration of cytokine-expressing plasmids and codon optimization of the gene encoding the chimeric protein. The combination of the vaccines pgDE7 or pgD-E7E6E5 with plasmids encoding the cytokines IL-2, IL-12 or GM-CSF increased the therapeutic protection to 100% of the vaccinated animals following a single dose. The gene sequence adaptation increased by a factor of 5 the therapeutic potential of the pgDE7 vaccine. In summary, the data presented in this thesis demonstrated the development of a vaccine strategy against HPV-16 induced tumors and reinforces its potential use in future clinical trials.