A membrana amniótica (MA) é considerada um biomaterial com propriedades biológicas benéficas ao processo de reparação tecidual, servindo ao tratamento de feridas e queimaduras. Recentemente, tem sido usada como substrato para a construção de substitutos cutâneos, possibilitando o cultivo de queratinócitos humanos. Contudo, por se tratar de um material biológico, com risco de transmissão de doenças infectocontagiosas, necessita ser conservado e esterilizado antes de seu uso clínico. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da radiação ionizante sobre membranas amnióticas gliceroladas, com ênfase em sua compatibilidade ao cultivo de queratinócitos humanos. Quatro MA foram conservadas em altas concentrações de glicerol (>85%), sendo metade delas enviadas para radioesterilização a 25 kGy. Constituíram-se dois grupos de estudo: MA não irradiadas (MA-ni) e MA irradiadas (MA-i). Ambos os grupos foram submetidos a protocolo padronizado de desepitelização e avaliados por microscopia óptica (Hematoxilina-eosina e Picrossirius), imunofluorescência para colágeno IV e laminina e microscopia eletrônica. Posteriormente, foram cultivados queratinócitos humanos sobre as superfícies desepitelizadas das bases de MA-ni e MA-i em situação imersa e em interface ar-líquido. Foram comparados os resultados nos instantes 14 e 21 dias de cultivo, por microscopia óptica e eletrônica. As análises microscópicas, após a denudação epitelial, demonstraram que no grupo não irradiado a continuidade da membrana basal encontrava-se preservada, enquanto no grupo irradiado não existia nenhum indício de resquício da presença da membrana basal na superfície do material. O resultado das culturas de queratinócitos mostrou que no grupo não irradiado houve crescimento de um epitélio multiestratificado e diferenciado, inclusive com a formação de estrato córneo na situação de interface ar-líquido. No grupo irradiado, o epitélio formado era composto por duas a três camadas de estratificação e discreta diferenciação celular, com semelhanças entre o cultivo imerso ou em exposição ao ar. A MA glicerolada foi compatível ao crescimento de epitélios cultivados, demonstrando potencial ao uso como um possível substituto dermoepidérmico. A irradiação a 25 kGy provocou danos estruturais às MA, levando a alterações na membrana basal e facilitando a sua perda quando exposta ao protocolo de desepitelização. Esta perda pode explicar a diferença nos resultados do cultivo de queratinócitos em MA-i em relação ao MA-ni / The amniotic membrane (AM) is a biomaterial with biological properties that are beneficial to tissue repair. It has been used as a temporary coverage to threat burns and chronic wounds. Recently, it has been served as a substrate for keratinocytes culture to construct a living skin equivalent. However, MA is a biological material, and its transplantation could cause infectious disease for receptors. So, it must be preserved and sterilized before clinical use. The aim of this study was to evaluate the radiation effects on glycerol-preserved MA, considering its compatibility to support human keratinocytes culture. Four MA were stored in high concentrations of glycerol (> 85%) and half of them were radio sterilized with a dose of 25 kGy. Then, we established two groups: non-irradiated MA (MA-ni) and irradiated MA (MA-i). Both groups was de-epithelialized by a standardized protocol and was investigated morphologically, immunohistochemical and ultraestructural. Subsequently human keratinocytes were cultivated immersed and in air-liquid interface on denuded surface of MA-i and MA-ni. The results were compared at 14 and 21 days of culture by light and electron microscopy. After epithelial denudation, analyses demonstrated the continuity of the basement membrane in MA-ni group, whereas in the irradiated group, there was no indication of the basement membranes presence on the surface of MA. The cell cultures showed that in the non-irradiated group, there was growth of a multi-layered and differentiated epithelium, with a stratum corneums formation in air-liquid interface. In the irradiated group, the epithelium had only two or three layer, little cell differentiation, with the same results immersed or air-liquid interface system. Glycerol-preserved MA was biocompatible with the growth of a cultivated epithelium, showing its potential as a skin substitute. Irradiation at 25 kGy cause structural damage to the tissue, making changes in basement membrane, that facilitates its loss when exposed to the de-epithelialized protocol. The basement membranes loss may explain the difference between the keratinocytes cultivation on MA-I and MA-ni

A expressão do gene Dermicidina (DCD) no câncer de mama promove aumento na proliferação e sobrevivência celular, porém os mecanismos envolvidos são desconhecidos. Através de um ensaio de microarranjos de DNA demonstramos que o DCD desempenha atividade de fator de crescimento pela modulação da via de sinalização EGF/ErbB. Estes dados foram confirmados através de silenciamento gênico, superexpressão e tratamento com a proteína recombinante. O silenciamento diminuiu a expressão de EGFR e seus ligantes, e reduziu a ativação da via de sinalização EGF/ErbB. O tratamento da linhagem celular MDA-MB-361 com DCD recombinante resultou em uma curva de proliferação em forma de sino com concomitante aumentou a expressão de EGFR e seus ligantes. A superexpressão de DCD na linhagem MCF-7 também resultou no aumento da expressão dos receptores EGFR e HER-2 e de seus ligantes, além da ativação de suas vias de sinalização. Este trabalho sugere que o DCD é capaz de modular a expressão e ativação da família EGF/ErbB resultando no aumento do crescimento e sobrevivência celular. / The expression of the gene Dermicidin (DCD) in breast cancer promotes increased in cell growth and survival, however the mechanisms involved are unknown. Using a DNA microarray assay we demonstrated that the DCD activity plays by modulating growth factor signaling phathway of EGF/ErbB. These data were confirmed by gene silencing, overexpression and treatment with the recombinant protein. The silencing decreased the expression of EGFR and its ligands, and reduced the activation of the EGF/ErbB signaling pathways. The treatment of MDA-MB-361 cell line with recombinant DCD resulted in a proliferation curve bell-shaped with a concomitant increased in the expression of the EGFR and its ligands. The overexpression of the DCD in the MCF-7 cell line also resulted in increased expression of the receptors HER-2 and EGFR and its ligands, and activation of theirs signaling pathways. This work suggests that DCD is able to modulate the expression and activation of the EGF/ErbB family resulting in increased of cellular growth and survival.

O diabetes mellitus tipo 1 (DMT1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição das células b pancreáticas, por citocinas (IFN-g, IL-1b, e TNF-a) produzidas por macrófagos e linfócitos Th1. A participação de TLRs no desenvolvimento desta doença tem sido demonstrada, porém os mecanismos envolvidos são poucos elucidados. Neste trabalho avaliamos o papel de TLR-2, TLR-4 e molécula adaptadora MyD88 no desenvolvimento do DMT1 experimental induzido por múltiplas doses de estreptozotocina. Foi observada maior severidade do DMT1 em animais TLR-2 KO, elevada glicemia e acentuada perda de peso. Um maior infiltrado celular inflamatório, aumento da expressão de bax, caspase-3 e diminuição no número de ilhotas foram observados no grupo de animais TLR-2 KO. Interessantemente, uma diminuição significante na frequência de células T reguladoras foi verificada no baço dos animais TLR-2 KO diabéticos. A deficiência do TLR-2 resultou no desenvolvimento exacerbado do DMT1, sugerindo um importante papel dos TLR-2 na modulação da resposta imune desenvolvida nesta doença. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease characterized by pancreatic beta cell destruction by activated macrophages and Th1 lymphocytes. The role of TLRs has been demonstrated in this disease, however the mechanisms involved in this process have not yet been fully explained. We evaluated the role of TLR-2, TLR-4 and MyD88 adaptor molecule in the development of experimental autoimmune diabetes induced by multiple low-doses of streptozotocin in C57Bl/6 mice. TDM1 was more severe in TLR-2 KO mice, with higher blood glucose levels and weight loss. Increased cellular infiltrate, bax and caspase-3 expression was detected in the pancreatic islets of the diabetic TLR-2 KO group suggesting a greater destruction of pancreatic cells. Interestingly, a decreased number regulatory T cells was observed in the spleen of diabetic TLR-2 KO animals. Hence, TLR-2 receptor deficiency resulted in exacerbated development of experimental autoimmune diabetes, thereby suggesting an important role for this receptor in the modulation of the immune response developed in this disease.

As células mesangiais (CM) apresentam papel essencial na fisiologia glomerular normal, e alterações em seu fenótipo levam ao desenvolvimento de glomerulopatias. A fase tardia da glomerulopatia diabética é caracterizada por fibrose e morte por apoptose das CM. Portanto, a identificação de novos elementos envolvidos nas modificações patológicas das CM facilitaria a compreensão da fisiopatologia das doenças glomerulares. A família de genes ID está implicada em processos celulares distintos, como proliferação, diferenciação e apoptose. O presente estudo tem por finalidade investigar as interações do gene ID1, com o DNA e/ou proteínas, em CM humanas. Aqui demonstramos que Id1 interage com o fator de transcrição USF2, inibindo sua atividade transcricional. Adicionalmente, demonstramos que BMP-7 e Id1 antagonizam a morte celular induzida por TGF<font face=\"Symbol\">b-1 por inibir a atividade de USF2. Nossos dados apontam para uma nova via molecular portencialmente relevante para o melhor entendimento da patogênese das doenças renais crônicas. / Mesangial cells (MC) play an essential role in normal function of the glomerulus. Phenotypic changes in MC lead to the development of glomerophaties. The late phase of diabetic glomerulopathy is characterized by fibrosis and death of MC. Thus, the identification of novel elements involved in these alterations would facilitate the comprehension of the pathophysiology of glomerular diseases. The ID (Inhibitors of DNA binding) family of genes has been implicated in diverse cellular processes, such as proliferation, differentiation, and apoptosis control. This study aims to investigate the interactions of ID1, with DNA or proteins, in human mesangial cells. We demonstrated that Id1 binds specifically to the transcription factor USF2. In addition, we show that BMP-7 and Id1 antagonize TGF<font face=\"Symbol\">b-1 induced death by inhibiting USF2 activity in human MC. In conclusion, our results point to a novel molecular path involved in the pathogenesis of glomerular diseases.

A membrana amniótica (MA) é considerada um biomaterial com propriedades biológicas benéficas ao processo de reparação tecidual, servindo ao tratamento de feridas e queimaduras. Recentemente, tem sido usada como substrato para a construção de substitutos cutâneos, possibilitando o cultivo de queratinócitos humanos. Contudo, por se tratar de um material biológico, com risco de transmissão de doenças infectocontagiosas, necessita ser conservado e esterilizado antes de seu uso clínico. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da radiação ionizante sobre membranas amnióticas gliceroladas, com ênfase em sua compatibilidade ao cultivo de queratinócitos humanos. Quatro MA foram conservadas em altas concentrações de glicerol (>85%), sendo metade delas enviadas para radioesterilização a 25 kGy. Constituíram-se dois grupos de estudo: MA não irradiadas (MA-ni) e MA irradiadas (MA-i). Ambos os grupos foram submetidos a protocolo padronizado de desepitelização e avaliados por microscopia óptica (Hematoxilina-eosina e Picrossirius), imunofluorescência para colágeno IV e laminina e microscopia eletrônica. Posteriormente, foram cultivados queratinócitos humanos sobre as superfícies desepitelizadas das bases de MA-ni e MA-i em situação imersa e em interface ar-líquido. Foram comparados os resultados nos instantes 14 e 21 dias de cultivo, por microscopia óptica e eletrônica. As análises microscópicas, após a denudação epitelial, demonstraram que no grupo não irradiado a continuidade da membrana basal encontrava-se preservada, enquanto no grupo irradiado não existia nenhum indício de resquício da presença da membrana basal na superfície do material. O resultado das culturas de queratinócitos mostrou que no grupo não irradiado houve crescimento de um epitélio multiestratificado e diferenciado, inclusive com a formação de estrato córneo na situação de interface ar-líquido. No grupo irradiado, o epitélio formado era composto por duas a três camadas de estratificação e discreta diferenciação celular, com semelhanças entre o cultivo imerso ou em exposição ao ar. A MA glicerolada foi compatível ao crescimento de epitélios cultivados, demonstrando potencial ao uso como um possível substituto dermoepidérmico. A irradiação a 25 kGy provocou danos estruturais às MA, levando a alterações na membrana basal e facilitando a sua perda quando exposta ao protocolo de desepitelização. Esta perda pode explicar a diferença nos resultados do cultivo de queratinócitos em MA-i em relação ao MA-ni / The amniotic membrane (AM) is a biomaterial with biological properties that are beneficial to tissue repair. It has been used as a temporary coverage to threat burns and chronic wounds. Recently, it has been served as a substrate for keratinocytes culture to construct a living skin equivalent. However, MA is a biological material, and its transplantation could cause infectious disease for receptors. So, it must be preserved and sterilized before clinical use. The aim of this study was to evaluate the radiation effects on glycerol-preserved MA, considering its compatibility to support human keratinocytes culture. Four MA were stored in high concentrations of glycerol (> 85%) and half of them were radio sterilized with a dose of 25 kGy. Then, we established two groups: non-irradiated MA (MA-ni) and irradiated MA (MA-i). Both groups was de-epithelialized by a standardized protocol and was investigated morphologically, immunohistochemical and ultraestructural. Subsequently human keratinocytes were cultivated immersed and in air-liquid interface on denuded surface of MA-i and MA-ni. The results were compared at 14 and 21 days of culture by light and electron microscopy. After epithelial denudation, analyses demonstrated the continuity of the basement membrane in MA-ni group, whereas in the irradiated group, there was no indication of the basement membranes presence on the surface of MA. The cell cultures showed that in the non-irradiated group, there was growth of a multi-layered and differentiated epithelium, with a stratum corneums formation in air-liquid interface. In the irradiated group, the epithelium had only two or three layer, little cell differentiation, with the same results immersed or air-liquid interface system. Glycerol-preserved MA was biocompatible with the growth of a cultivated epithelium, showing its potential as a skin substitute. Irradiation at 25 kGy cause structural damage to the tissue, making changes in basement membrane, that facilitates its loss when exposed to the de-epithelialized protocol. The basement membranes loss may explain the difference between the keratinocytes cultivation on MA-I and MA-ni

A expressão do gene Dermicidina (DCD) no câncer de mama promove aumento na proliferação e sobrevivência celular, porém os mecanismos envolvidos são desconhecidos. Através de um ensaio de microarranjos de DNA demonstramos que o DCD desempenha atividade de fator de crescimento pela modulação da via de sinalização EGF/ErbB. Estes dados foram confirmados através de silenciamento gênico, superexpressão e tratamento com a proteína recombinante. O silenciamento diminuiu a expressão de EGFR e seus ligantes, e reduziu a ativação da via de sinalização EGF/ErbB. O tratamento da linhagem celular MDA-MB-361 com DCD recombinante resultou em uma curva de proliferação em forma de sino com concomitante aumentou a expressão de EGFR e seus ligantes. A superexpressão de DCD na linhagem MCF-7 também resultou no aumento da expressão dos receptores EGFR e HER-2 e de seus ligantes, além da ativação de suas vias de sinalização. Este trabalho sugere que o DCD é capaz de modular a expressão e ativação da família EGF/ErbB resultando no aumento do crescimento e sobrevivência celular. / The expression of the gene Dermicidin (DCD) in breast cancer promotes increased in cell growth and survival, however the mechanisms involved are unknown. Using a DNA microarray assay we demonstrated that the DCD activity plays by modulating growth factor signaling phathway of EGF/ErbB. These data were confirmed by gene silencing, overexpression and treatment with the recombinant protein. The silencing decreased the expression of EGFR and its ligands, and reduced the activation of the EGF/ErbB signaling pathways. The treatment of MDA-MB-361 cell line with recombinant DCD resulted in a proliferation curve bell-shaped with a concomitant increased in the expression of the EGFR and its ligands. The overexpression of the DCD in the MCF-7 cell line also resulted in increased expression of the receptors HER-2 and EGFR and its ligands, and activation of theirs signaling pathways. This work suggests that DCD is able to modulate the expression and activation of the EGF/ErbB family resulting in increased of cellular growth and survival.

Este estudo teve como objetivo avaliar, in vitro, a citotoxicidade dos cimentos endodônticos Densell Endo, Pulp-Fill, Endofill, Sealer 26, Pulp Canal Sealer e GuttaFlow após 12, 24 e 72 horas de tempo de contato, utilizando-se uma linhagem de células endoteliais ECV-304. Para a avaliação da viabilidade celular, utilizou-se o teste de citotoxicidade MTT. Para cada cimento foram preparados 12 corpos de prova que foram distribuídos em seis grupos experimentais de acordo com as marcas comerciais, sendo quatro para cada tempo. Foi criado um grupo controle que não foi submetido à ação de cimento. Para avaliação do efeito dos cimentos sobre as células endoteliais, os corpos de prova foram inseridos nos poços da placa cultura, incubados a 37C em presença de 5% de CO2 e 100% de umidade. Os testes MTT foram realizados, em quadruplicata, após 12, 24 e 72 horas de contato das amostras com o tapete celular. Foi utilizada a prova Two-Way Anova com o teste Post Hoc de Bonferroni com nível de significância de 5%. Na análise de 12 horas, foi possível observar que o cimento GuttaFlow apresentou média de absorbância de 0,055, seguido do Sealer 26 (média = 0,038). Os cimentos Pulp Canal Sealer e Densell Endo apresentaram a mesma média de absorbância (0,031). O Pulp Fill e o Endofill foram os cimentos que apresentaram maior citotoxicidade (média de absorbância = 0,024 e 0,021, respectivamente). O grupo controle apresentou média de absorbância de 0,158. Em 24 horas observou-se que os cimentos GuttaFlow e Sealer 26 apresentaram as maiores médias de absorbância (0,041 e 0,037, respectivamente), seguidos pelo cimento Pulp Canal Sealer que apresentou média de absorbância de 0,035. Já os cimentos Densell Endo e Pulp Fill apresentaram médias de absorbância de 0,033 e 0,032, respectivamente. O cimento Endofill apresentou uma média de 0,026 e o grupo controle de 0,086. Quando analisados em 72 horas, o cimento Pulp Canal Sealer obteve média de absorbância de 0,049, seguido dos cimentos GuttaFlow e Pulp Fill, ambos com 0,048. Os cimentos Densell Endo, Sealer 26 e Endofill apresentaram respectivamente, médias de 0,044, 0,040 e 0,036. O grupo controle diferenciou-se significativamente de todos os grupos em todos os tempos. Quando analisadas as médias gerais de absorbância dos grupos analisados observou-se que o cimento GuttaFlow se apresentou como o cimento com menor índice de citotoxicidade, apresentando média de absorbência de 0,048. Logo após, apresentando médias de absorbância iguais (0,038) encontraram-se os cimentos Pulp Canal Sealer e Sealer 26; seguidos do Densell Endo e do Pulp Fill, com 0,036 e 0,035, respectivamente. O grupo controle apresentou média de absorbância de 0,098. Portanto, tendo como base os resultados obtidos, pôde-se concluir que o cimento Endofill foi o que apresentou maior citotoxicidade e o cimento GuttaFlow, o menos citotóxico. / This study aimed to evaluate, in vitro, cytotoxicity of root canal sealers Densell Endo, Pulp-Fill, Endofill, Sealer 26, Pulp Canal Sealer and GuttaFlow after 12, 24 and 72 hours of contact time, using a endothelial cell line ECV-304. For the assessment of cell viability, used the MTT cytotoxicity test. For any cement were prepared 12 specimens that were divided into six groups according to the trademarks, four for each time. Created a control group that was not subjected to action of cement. To assess the effects of cements on endothelial cells, the specimens were placed in culture plate wells, incubated at 37C with 5% CO2 and 100% humidity. MTT tests were performed, in quadruplicate, after 12, 24 and 72 contact hours of the samples with monolayers. Was used to test Two-Way Anova with Bonferroni Post Hoc test with significance level of 5%. In the analysis of 12 hours, was observed that the cement GuttaFlow had a mean absorbance of 0,055, followed by Sealer 26 (average = 0,038). Cements Pulp Canal Sealer and Densell Endo had the same mean absorbance (0,031). The Pulp Fill and Enfofill were the cements with higher cytotoxicity (mean absorbance = 0,024 and 0,021, respectively). The control group had a mean absorbance of 0,158. In 24 hours it was observed that the cements Sealer 26 and GuttaFlow had the highest average absorbance (0,041 and 0,037, respectively), followed by cement Pulp Canal Sealer that had a mean absorbance of 0.035. Already cements Densell Endo and Pulp Fill showed means absorbance of 0,033 and 0,032, respectively. Cement Endofill&#61650; showed an average of 0,026 and the control group, 0,086. When analyzed at 72 hours, the cement Pulp Canal Sealer had an average absorbance of 0,049, followed by cement GuttaFlow and Pulp Fill, both with 0,048. Cements Densell Endo, Sealer 26 and Endofill showed respectively, averaging 0,044, 0,040 and 0,036. The control group differed significantly from all groups at all times. When analyzing the overall means of absorbance groups analyzed showed that the cement GuttaFlow introduced himself as the cement with a lower index of cytotoxicity, with a mean of 0,048 absorbance. Soon after, with averages of equal absorbance (0,038) met cements Pulp Canal Sealer and Sealer 26; followed by Endo Densell and Pulp Fill, with 0,036 and 0,035, respectively. The control group had a mean absorbance of 0,098. Therefore, based on the results, could conclude that the cement Endofill showed the highest cytotoxicity and cement GuttaFlow, the least cytotoxic.

O desenvolvimento da imunoterapia do câncer baseada em células dendríticas (DCs) é alvo de vários estudos. Para tumores sólidos, a abordagem baseada no uso de DCs alogenêicas fundidas com células tumorais tem se mostrado relativamente eficaz. Por outro lado, esta estratégia necessita uma massa tumoral considerável de cada paciente para a geração das células híbridas. Para contornar este problema o uso de DCs transfectadas com mRNA tumoral, o qual pode ser amplificado in vitro a partir de uma pequena amostra inicial do tumor, tem sido investigado. Para isto, uma transfecção eficiente e tradução correta do mRNA tumoral nas DCs são etapas críticas. Sabendo-se que as DCs de pacientes com câncer possuem atividade aloestimuladora defeituosa, DCs derivadas de doadores saudáveis poderiam ser uma alternativa para induzir uma resposta imune mais eficiente. Assim, este trabalho pretendeu aprimorar a metodologia de transfecção de DCs alogenêicas, derivadas de monócitos de doadores saudáveis, com mRNA de antígenos tumorais (survivina e RPSA) super-expressos na leucemia linfóide crônica (LLC) e avaliar sua capacidade em estimular a resposta linfocitária. Ao mesmo tempo, foram estabelecidas as metodologias para amplificação e síntese do RNA destes antígenos tumorais específicos, assim como do RNA mensageiro total, contidos nas células tumorais de pacientes com LLC. Os resultados mostraram ser possível a amplificação do mRNA total extraído das células leucêmicas com manutenção da expressão dos antígenos tumorais. Ainda, várias condições de transfecção com mRNA da survivina, transcrito in vitro, foram testadas, encontrando-se na lipofecção, a melhor maneira de transfectar as DCs. A lipofecção mostrou-se com baixa toxicidade quando comparada à técnica de eletroporação. Observou-se uma eficiência em torno de 40% de células transfectadas num intervalo de tempo entre 12 e 48 horas. Estas células foram usadas como estimuladoras em ensaios de proliferação usando-se linfócitos T alogenêicos como células respondedoras. As células transfectadas com mRNA da survivina foram capazes de estimular resposta linfoproliferativa com maior produção de IFN-gama, avaliado por ELISA. Além disso, a transfecção não alterou o padrão de expressão dos marcadores de superfície característicos das DCs. Estes dados mostram que a transfecção das DCs com mRNA pode afetar a resposta imune induzida por estas APCs. Nossos resultados suportam o uso de DCs transfectadas com mRNA para produção de vacinas anti-tumorais e mostram a survivina como um potente antígeno indutor da resposta linfocitária. / The development of dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy has been the target of many studies. For solid tumors, a promising approach based in allogeneic DCs fused to tumor cells has been relatively effective. On the other hand, this approach needs large tumor samples to generate enough DC-tumor cell hybrids. To overcome this problem, tumor mRNA-transfected DCs can be used, since mRNA can be amplified in vitro and allow unlimited vaccine production. For this, efficient transfection and optimal translation of tumor mRNA in DCs are critical. Moreover, DC derived from cancer patients has defective alostimulatory activity. In this case, DC derived from healthy donors may be an alternative to induce immune response more efficiently. Here, we established the methodology of allogeneic DC transfection with mRNA for tumor antigens (survivin and RPSA) overexpressed in chronic lymphocytic leukemia (CLL), and evaluated their ability for T cell stimulation. At the same time, we established mRNA amplification and mRNA in vitro transcription methodology for specific tumor antigens and total messenger RNA, present in CLL tumor cells. Our results showed it to be possible to amplify total mRNA derived from leukemic cells maintaining tumor antigen expression. Moreover, several transfection conditions using survivin mRNA obtained from in vitro transcript reactions were evaluated, defining lipofection as the better way to transfect DC. We obtained nearly 40% of transfected DCs between 12 and 48 hours. Transfected DCs were used as stimulator cells in proliferation assays using allogeneic T cells as responder cells. Survivin mRNA transfected DCs were able to stimulate T cell proliferation with increased IFN-gama production, measured by ELISA. Furthermore, the transfection did not change the pattern of surface molecules expression characteristic of DC. These data show that mRNA DC transfection can affect immune responses induced by these APCs. These findings support the use of tumor mRNA transfected DCs for anti-cancer vaccine production and show survivin as a potent antigen to induce T cell responses.

As células dendríticas (DCs) são as mais eficazes células apresentadoras de antígenos. Mesmo com a possibilidade da geração de DCs in vitro, que permitiu a criação de protocolos de vacinação antitumoral, mecanismos de tolerância periférica, mediados por células T reguladoras, impedem uma resposta imune antitumoral eficaz. O presente estudo visou avaliar, in vitro, a geração de linfócitos T reguladores por células dendríticas derivadas de pacientes portadoras de câncer de mama. Para tanto, DCs foram diferenciadas a partir de monócitos do sangue periférico de pacientes com câncer, por sete dias, na presença de GM-CSF e IL-4 (DCs imaturas - iDCs), e ativadas, por adição de TNF-<font face=\"Symbol\">a no dia cinco de cultura (DCs maduras - mDCs). As DCs foram caracterizadas, por citometria de fluxo, quanto à: expressão de CD1a, CD11c, CD14, CD80, CD86, CD83, CD123, PD-L1, HLA-ABC e HLA-DR; produção de IL-10 e TGF-beta1, por ELISA; e ainda em ensaio funcional, que se deu pela co-cultura das DCs com linfócitos T (CD3+, CD3+CD25neg ou CD4+CD25neg), isolados por microsferas imunomagnéticas. Após co-cultura, a expressão de CD25, a proliferação (diluição de CFSE), a produção de citocinas (IFN-<font face=\"Symbol\">g, IL-10, TGF-beta1) e a geração de células Tregs foram analisadas. As células foram caracterizadas como Tregs por seu fenótipo (CD4+CD25+CD127lowCTLA-4+Foxp3+) e sua capacidade supressora sobre linfócitos alogeneicos. iDCs de pacientes apresentaram aumento da expressão de CD86 (com duas subpopulações: CD86High e CD86Low) e CD123 além de produção elevada de IL-10 e TGF-beta1 bioativo. Co-culturas com DCs de pacientes apresentaram níveis altos de TGF-beta1 bioativo (298,08 pg/ml x ctrl: 57,63 pg/ml) e induziram um alta freqüência de Tregs (iDCs: 57% ± 4,1; mDCs: 48% ± 5,0 x ctrl: 2,5% ± 0,7) a partir de precursores CD25negFoxp3neg, que foram capazes de suprimir a proliferação de linfócitos alogeneicos. O bloqueio de TGF-beta nas co-culturas reduziu parcialmente a freqüência de Treg geradas por DCs de pacientes. Esses achados são condizentes com a alta freqüência de Tregs no sangue periférico dessas mesmas pacientes (19,5% ± 2,3 x 8% ± 2,3) e com a presença de células com fenótipo de DCs no sangue, apresentando marcação semelhante a iDCs geradas in vitro. Por outro lado, iDCs provenientes de doadoras saudáveis induziram estimulação linfocitária mais intensa (35,7% ± 7,9 x 11,8 ± 5,9% CD25+), intensa proliferação de linfócitos CD4+ (82,7% x 29,4%) e CD8+ (73,8% x 21%) e alta produção de IFN-<font face=\"Symbol\">g (109,85 pg/ml x 7,86 pg/ml) nas co-culturas. Estes dados indicam que DCs derivadas de monócitos de pacientes com câncer de mama apresentam um viés imunossupressor que não é estritamente dependente do seu status de maturação ou de TGF-beta. Esses achados além de contribuir para a compreensão das interações entre o sistema imune e as neoplasias, devem ser considerados no delineamento de protocolos imunoterapêuticos baseados em DCs. / Dendritic cells (DCs) are the most effective professional antigen-presenting cells. Even considering the possibility of generating DCs in vitro, which allowed the design of antitumor vaccination protocols, mechanisms of peripheral tolerance mediated by regulatory T cells prevent an effective antitumor immune response. The aim of our study was evaluate, in vitro, the induction of regulatory T cells by dendritic cells derived from breast cancer patients.DCs were differentiated from breast cancer patients blood monocytes, for seven days, in the presence of GM-CSF and IL-4 (immature DCs- iDCs) and activated by TNF-<font face=\"Symbol\">a on day five of culture (mature DCs- mDCs). DCs were characterized by flow cytometry to CD1a, CD11c, CD14, CD80, CD86, CD83, CD123, PD-L1, HLA-ABC and HLA-DR expression; the cytokine secretion to IL-10 and bioactive TGF-beta1, by ELISA; and in functional assay by co-culturing DCs with T lymphocytes (CD3+, CD3+CD25neg or CD4+CD25neg) isolated by microbeads. Cell activation (CD25 expression), proliferation (CFSE dilution), cytokine production (IFN-gamma, IL-10 and TGF-beta1) and de novo regulatory T cells (Tregs) generation, were analyzed in these co-cultures after 5 or 6 days. Tregs were characterized by their phenotype (CD4+CD25+CD127LowCTLA-4+Foxp3+) and suppressive capability on allogeneic T cell proliferation. Patients iDCs showed a higher expression of CD86 (two subpopulation: CD86High and CD86Low) and CD123 beyond the elevated production of IL-10 and bioactive TGF-beta1. Co-cultures using patients DCs presented high levels of bioactive TGF-beta1 (298.08 pg/ml x ctrl: 57.63 pg/ml) and induced elevated frequency of Tregs (iDCs: 57% ± 4.1; mDCs: 48% ± 5.0 x ctrl: 2.5% ± 0.7) from CD25neg Foxp3neg precursors, which were able to suppress the allogeneic lymphocyte proliferation. The TGF-beta blocking partially reduced the frequency of induced Tregs by patients DCs. These findings are consistent with the higher frequency of Tregs on peripheral blood of those patients (19.5% ± 2.3 x ctrl 8% ± 2.3) and the presence of DCs also on the blood, showing similar markings with iDCs generated in vitro. Contrastingly, iDCs from healthy donors were better stimulator cells, leading to a higher CD25+ cell frequency (ctrl 35.7% ± 7.9 x 11.8 ± 5.9% CD25+), more intense proliferation of CD4+ (82.7% x 29.4%) and CD8+ (73.8% x 21%) cells and higher production of IFN-gamma (109.85 pg/ml x 7.86 pg/ml) on co-cultures. These data indicate that DCs derived from breast cancer patients show an immunosuppressive bias that is not strictly dependent on DCs maturation status or TGF-beta. Finally, these observations call to caution in the use of patients monocytes for the generation of DC-based vaccines and also contribute to the comprehension of the interactions between the immune system and cancer.

No câncer de mama, o metabolismo tumoral, ação dos moduladores de estrógenos são fatores que podem influenciar as células dendríticas (DCs). Neste trabalho avaliou o fenótipo de DCs em amostras tumorais, a diferenciação de DCs a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) das pacientes e comparou com voluntárias saudáveis. Os resultados mostraram que há alteração na capacidade de geração, no fenótipo, na capacidade aloestimuladora, maior produção de interleucina 10 e expressão de HSP27 nas DCs de pacientes, comparadas com as DCs de voluntárias saudáveis que produzem mais Interferon-gama. A via p38MAPK parece ser importante na diferenciação de PBMCs em DCs, entretanto, estímulos estressantes podem ativar esta via e induzir a síntese de HSP27 inibindo este processo. O tratamento com tamoxifeno parece modular a expressão de algumas moléculas de membrana. Desta forma, os resultados sugerem que as DCs diferenciadas de pacientes com câncer de mama apresentam alterações fenotípicas e funcionais causadas pelo microambiente tumoral. / In breast cancer, the tumor metabolism, the action of estrogens antagonists can influence dendritic cells (DC) generation. The aim of this work was to evaluate the frequency of DCs in tumor tissue and the differentiation of DCs derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and compared the phenotypic and functionally of these cells from healthy individuals and breast cancer patients. The results showed that patients PBMCs were unable to generate phenotypicaly, functionally mature DCs and presented larger production of interleukin 10 and higher expression of HSP27 when compared with healthy volunteers\' DCs, presented higher production of Interferon-gamma. The p38 MAPK signaling pathway seems to be important in PBMCs differentiation into DCs, and its activation by stress can induce the synthesis of HSP27, that inhibits DC generation. The tamoxifen treatment caused modulation of membrane DC markers expression. Therefore, these results show that patients\' DCs present phenotypic and functional alterations which can be caused by tumor microenvironment.