Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / The oomycete Pythium insidiosum, classified in the kingdom Straminipila, is the agent of pythiosis, a chronic disease that can be hard to treat and life-threatening. The predisposing factors in mammals are unknown, but the iron overload is suspected to act directly or indirectly in the development of the infection. This aim of this study was: to evaluate the iron metabolism in rabbits with experimental pythiosis; to verify the antifungal activity and the mechanism of action in vitro of the iron chelator deferasirox against P. insidiosum isolates and to compared the treatment and the mechanism of action of the drug with immunotherapy in vivo; to verify the antifungal activity of micafungin, alone and in combination with deferasirox, in vitro and in vivo; to develop an experimental model of pythiosis using the fruit-fly Drosophila melanogaster with iron overload. The drug susceptibility tests included 17 P. insidiosum clinical isolates, and were performed according to the CLSI M38-A2 guidelines. The mechanism of action of deferasirox was evaluated by the XTT and DiBAC assays. For the in vivo tests, five P. insidiosum infected rabbits were included per group, as follows: infected treated with placebo, treated with immunotherapy, treated with deferasirox, treated with immunotherapy and deferasirox, treated with micafungin and treated with micafungin and deferasirox. Five uninfected rabbits were used as controls. Hematological and biochemical analyses were performed at days 0 25, 50 and 75 post-infection. The quantification of iron in the hepatocytes was performed after 50 days of treatment (day 75). The mechanism of action of deferasirox was evaluated by the quantification of the catabolic enzyme adenosine deaminase and by the histology of the subcutaneous lesions. The results show that P. insidiosum is poorly susceptible to deferasirox in vitro, with minimum inhibition concentrations (MICs) ranging from 12.5 to 50 μg/ml and minimum fungicidal concentrations between 50 and 100 μg/ml. No activity against P. insidiosum was observed for micafungin in vitro (MICs > 128 μg/ml) and in rabbits with pythiosis. Notwithstanding, synergism was observed in 88% of the isolates when micafungin was combined with deferasirox, and the lesions were decreased in comparison to the other groups (P = 0.06). In general, the rabbits showed microcytic hypochromic anemia with depleted iron stores, which was less prominent in the groups treated with immunotherapy or deferasirox. Despite the iron chelator has failed to thwart the infection, deferasirox showed toxicity against P. insidiosum hyphae in vitro and an immunomodulatory action was observed in the lesions, in a similar pattern to that seen in immunotherapy-treated rabbits. However, the use of deferasirox favored the dissemination of the disease to the lung by unrevealed mechanisms. D. melanogaster flies were resistant to P. insidiosum infection, independently of the iron overload. Conversely, toll-deficient D. melanogaster flies were susceptible to the infection, highlighting the importance of these receptors in pythiosis. In conclusion, rabbits with pythiosis showed iron deficiency anemia and, despite the chelating effect of deferasirox, the administration of the drug should be evaluated with care because of the dissemination of the disease observed in some of the treated animals. / O oomiceto Pythium insidiosum, classificado no Reino Straminipila, é o agente etiológico da pitiose, uma doença crônica, de difícil tratamento e que pode levar à morte. Os fatores predisponentes da doença em mamíferos não são conhecidos, mas suspeita-se que a sobrecarga de ferro exerça um papel direto ou indireto no desenvolvimento da infecção. Este estudo teve por objetivos: avaliar o metabolismo do ferro em coelhos com pitiose experimental; verificar a atividade antifúngica e o mecanismo de ação in vitro do quelante de ferro deferasirox frente a isolados de P. insidiosum e comparar o tratamento e o mecanismo de ação do fármaco com a imunoterapia in vivo; verificar a atividade antifúngica da micafungina, sozinha e em combinação com deferasirox, in vitro e in vivo; desenvolver um modelo experimental de pitiose utilizando-se a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster com sobrecarga de ferro. Os testes de susceptibilidade aos fármacos foram realizados com 17 isolados clínicos de P. insidiosum, utilizando-se o protocolo de microdiluição M38-A2 do CLSI. O mecanismo de ação in vitro do deferasirox foi avaliado através da técnica de XTT e DiBAC. Para os testes in vivo, foram utilizados cinco coelhos infectados por P. insdiosum por grupo, conforme o delineamento a seguir: infectados tratados com placebo, tratados com imunoterápico, tratados com deferasirox, tratados com imunoterápico e deferasirox, tratados com micafungina e tratados com micafungina e deferasirox. Cinco coelhos não infectados foram utilizados como controle negativo. Realizaram-se avaliações hematológicas e bioquímicas, incluindo os níveis séricos de ferro, transferrina e ferritina nos dias 0, 25, 50 e 75 pós-infecção. A quantificação do ferro depositado nos hepatócitos foi realizada após 50 dias de tratamento (dia 75). O mecanismo de ação do deferasirox in vivo foi avaliado através da mensuração da atividade da enzima catabólica adenosina deaminase e da histologia das lesões subcutâneas. Os resultados mostram que P. insidiosum demonstrou ser pouco susceptível ao deferasirox in vitro, com concentrações inibitórias mínimas (CIMs) que variaram de 12,5 a 50 μg/ml e concentrações fungicidas mínimas entre 50 e 100 μg/ml. A micafungina não apresentou atividade antifúngica contra P. insidiosum in vitro (CIMs > 128 μg/ml) e nos coelhos com pitiose. Contudo, sinergismo foi observado em 88% dos isolados quando a micafungina foi associada ao deferasirox, e as lesões dos coelhos estavam diminuídas em relação aos demais grupos (P = 0,06). No geral, os coelhos infectados apresentaram anemia microcítica hipocrômica com depleção das reservas corporais de ferro, que foi menos acentuada nos grupos tratados com imunoterápico ou quelante de ferro. Apesar do deferasirox não ter sido capaz de conter a infecção, o mesmo teve ação tóxica sobre as hifas de P. insidiosum in vitro e teve ação imunomodulatória sobre as lesões, em um padrão similar ao observado nos coelhos tratados com imunoterapia. Contudo, o uso do deferasirox favoreceu a disseminação pulmonar da doença por mecanismos não compreendidos. Moscas D. melanogaster foram resistentes à infecção por P. insidiosum, independente da sobrecarga de ferro. Entretanto, D. melanogaster deficientes de receptores do tipo Toll foram susceptíveis à infecção, evidenciando a importância desses receptores na pitiose. Em conclusão, coelhos com pitiose apresentaram anemia por deficiência de ferro e, apesar do efeito quelante do deferasirox, a utilização do mesmo deve ser avaliada com cuidado devido à disseminação da doença em alguns animais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trypanosoma cruzi infection causes Chagas disease (CD), a chronic inflammatory disease. The most infected individuals present no apparent morbidity, consistent with the indeterminate form of Chagas disease (IFCD). Although parasite-related factors may influence the clinical progress of disease, factors such as immune and inflammatory responses of host have a fundamental participation in the dynamic of pathology. The cellular immune response is closely associated with the presence of a tissue inflammatory infiltrate, which is composed by mononuclear cells that proliferate and produce pro- and anti-inflammatory cytokines. The inflammatory reaction triggered by T. cruzi infection is maintained by persistence of parasite in the host, and produces systemic effects, including microvascular changes. The puricergic signaling system plays an important role in the modulatiib of immune and inflammatory responses as well as vascular thrombosis by adenine nucleotides (ATP, ADP and AMP) and their derivative nucleoside adenosine. These signaling molecules are released from cells such as lymphocytes and platelets in response to damage or cell stimulation by the action of pathogens. The effects of adenine nucleotides and adenosine are promoted through the agonism of specific purinergic receptors and controlled by an enzymatic complex located on the cell surface. The aim of this study was to evaluate the influence of purinergic signaling in the regulation of microvascular dysfunction triggered by infection and in the adaptive immune response induced by the host through ectoenzymes activities involved in the metabolism of ATP in lymphocytes and platelets of patients IFCD. It was observed a decrease in both E-NTPDase and E-ADA activities, representing an adaptive consequence of host to a low antigenic stimulation during the latent phase of disease. Therefore, low concentrations of extracellular ATP would lead the induction of a Th2 response that would protect the host from an intense Th1 response, while high concentrations of extracellular adenosine would be responsible for anti-inflammatory and immunosuppressive effects. It was not observed any change in E-NTPDase expression when compared with the control group, demonstrating that its decreased activity may be a result of some tridimencional alteration of the enzyme itself. In platelets of IFCD patients, there was an increase in E-NPP and E-5 -NT activities and a decrease in E-ADA activity, which could be related to tromboregulatory effects by nucleotides degradation as well as formation and preservation of extracellular adenosine levels, in view of its vasodilator and cardioprotective roles. The decreased platelet aggregation observed in IFCD patients probably occurred due to antiaggregating action of adenosine. In conclusion, the purinergic system ectoenzymes, which are responsible for ATP metabolism, contribute in tromborregulation and modulation of host immune responses during the indeterminate form of the disease. / A infecção pelo Trypanosoma cruzi causa a doença de Chagas (DC), uma doença inflamatória crônica. A maioria dos indivíduos infectados não apresenta morbidade aparente, compatível com a forma indeterminada da doença de Chagas (FIDC). Embora fatores relacionados ao parasito possam influenciar a evolução clínica da doença, fatores como resposta imune e inflamatória do hospedeiro têm fundamental participação na dinâmica da patologia. A resposta imune celular está intimamente associada à presença de um infiltrado inflamatório tecidual, composto por células mononucleares que proliferam e produzem citocinas pró e anti-inflamatórias. A reação inflamatória desencadeada pela infecção pelo T. cruzi é mantida pela persistência do parasito no hospedeiro, e produz alterações sistêmicas, incluindo alterações microvasculares. O sistema de sinalização purinérgica desempenha um importante papel na modulação da resposta imune e inflamatória, assim como da trombose vascular, através dos nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e seu derivado nucleosídeo adenosina. Estas moléculas sinalizadoras são liberadas de células como linfócitos e plaquetas em resposta ao dano ou ao estímulo celular por ação de patógenos. Os efeitos dos nucleotídeos de adenina e da adenosina são promovidos através da ativação de receptores purinégicos específicos e controlados por um complexo enzimático localizado na superfície das células. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da sinalização purinérgica na regulação das disfunções microvasculares desencadeadas pela infecção, bem como da resposta imune adaptativa induzida pelo hospedeiro, através da determinação da atividade de ectoenzimas envolvidas no metabolismo do ATP em linfócitos e plaquetas de pacientes FIDC. Foi observada uma diminuição nas atividades da E-NTPDase e da E-ADA, representando uma conseqüência adaptativa do hospedeiro frente a uma baixa estimulação antigênica durante o período de latência da doença. Logo, baixas concentrações do ATP extracelular liberadas, levariam à indução de uma resposta Th2 que protegeria o hospedeiro de uma intensa resposta Th1, enquanto, elevadas concentrações de adenosina extracelular seriam responsáveis por efeitos anti-inflamatórios e imunossupressores. Não foi observada alteração na expressão da E-NTPDase em relação ao grupo controle, demonstrando que a diminuição da sua atividade enzimática pode ser resultado de alguma modificação na conformação tridimensional da própria enzima. Em plaquetas de pacientes FIDC, foi observado um aumento nas atividades da E-NPP e E-5 -NT e uma diminuição na atividade da E-ADA, o que poderia estar relacionado a um efeito tromborregulatório, com a formação e preservação dos níveis extracelulares de adenosina, tendo em vista seu papel vadodilatador e cardioprotetor. A agregação plaquetária diminuída observada nos pacientes FIDC, provavelmente ocorreu devido à ação anti-agregante da adenosina circulante. Dessa forma, sugere-se que as ectoenzimas do sistema purinérgico, responsáveis pelo metabolismo do ATP contribuem na tromborregulação e na modulação das respostas imunes do hospedeiro durante a forma indeterminada da doença.

Tacrolimus is a lactone macrolide, derived from Streptomyces tsukubaensis. It is an immunosuppressive drug that has been used in the prevention of organs transplant rejection, such as liver, kidney, heart, small intestine, pancreas and bone marron. The drug is also indicated for the treatment of atopic dermatitis, eczema, psoriasis and vitiligo. It is available as capsules, injection and ointment. Few methods have been reported for tacrolimus quantification in the dosage forms. In the present work, spectrophotometric methods were developed and validated for quantification of the drug in capsules. One method was based on the reaction with concentrated sulfuric acid (98 %), with detection at 295 nm. The other method was based in the charge transfer complex with 0.01M Iodine, with detection at 365 nm. The methods showed good linearity (r>0,99), precision (<0,2%) and accuracy (>99%). Preliminary study for in vitro drug release was also performed. Different dissolution medium (phosphate buffer pH 6.8, acetate buffer pH 5.5 and 0.1M HCl) and different stirring rotate (75 and 100 rpm) were evaluated to select the conditions for dissolution test, using basket apparatus. The percents of drug dissolved were evaluated by high performance liquid chromatographic method described in the literature. The percentage of drug dissolved was more than 85 in 60 minutes. / O tacrolimus é uma lactona macrolídea, derivada do Streptomyces tsukubaensis. É um fármaco imunossupressor usado na prevenção da rejeição de transplante de órgãos, tais como fígado, rim, coração, intestino delgado, pâncreas e medula óssea. É também indicado para tratamento de dermatite atópica, lupus eritematoso, psoríase e vitiligo. Encontra-se comercialmente disponível na forma de cápsulas, injetáveis e pomadas. Poucos métodos estão descritos na literatura para quantificação do tacrolimus nas formas disponíveis. Neste trabalho foram desenvolvidos e validados métodos espectrofotométricos para determinação quantitativa do fármaco em cápsulas. Um dos métodos utilizou reação com ácido sulfúrico concentrado (98%), com detecção em 295 nm. O outro se baseou na reação de complexo de transferência de carga com iodo 0,01M, com detecção em 365 nm. Os métodos desenvolvidos apresentaram linearidade (r>0,99), precisão (<0,2%) e exatidão (>99%) adequadas. Realizou-se, igualmente, estudo preliminar para avaliação do perfil de dissolução in vitro do fármaco. Diferentes meios de dissolução (tampão fosfato pH 6,8, tampão acetato pH 5,5 and HCl 0,1M) e diferentes velocidades de rotação (75 e 100 rpm) foram avaliados para definir as condições para o teste de dissolução, empregando o aparato cesta. As porcentagens dissolvidas do fármaco foram determinadas através de método por cromatografia líquida de alta eficiência descrito na literatura. As percentagens dissolvidas foram superiores a 85% em 60 minutos.

The atenolol is a selective β-blocker that acts specially on β-one adrenergic receptors of the heart, used in the control of high blood pressure, pectoris angine, cardiac arrhythmias and the treatment of miocardic stroke. This paper aimed to optimize the described methodologies for drugs and tablets of atenolol. It proposes to develop and validate simple and more accessible tests to evaluate atenolol tablets and raw material. It also emphasizes the ideal characteristics for drugs in the pre-formulation and development of the pharmaceutical form. Methodologies were developed and validated by HPLC and UV spectrophotometric for the quantification of atenolol in tablets. Raw material characterization techniques were also applied for the classification of atenolol in the pre-formulation. A pharmaceutical equivalence test was performed and compared to the national market reference drug. The HPLC developed method presents advantages over the official methodology to establish an analysis without the use of ionic pareator heptane sulphonate, for being faster and more simple. Both quantitative development methods were linear, specific exact, precise, robust and equivalent between themselves. For the dissolution performed with atenolol pharmaceutical form, after the dissolution efficiency analysis no meaningful difference were observed between the obtained dissolution curves through developed methods and the pharmacopeial methodology. The atenolol raw material analysis permitted its characterization, assuring an adequate use in the pharmaceutical form manufacturing. The comparative analysis between the test drug and reference drug allowed to claim that the two formulations are similar and with the some in vitro performance, i.c., they are pharmaceutical equivalent. The described methods are useful in routine quality analysis control of atenolol. The comparative analysis between the proposed methods and official methodology demonstrated that there is no statistical meaningful differences characterizing their equivalence. / O atenolol é um betabloqueador seletivo que age preferencialmente sobre os receptores adrenérgicos beta-1 do coração, utilizado no controle da hipertensão arterial, angina pectoris, arritmias cardíacas e no tratamento do infarto do miocárdio. Este trabalho tem o objetivo de otimizar as metodologias descritas para a avaliação do fármaco e comprimidos de atenolol, através do desenvolvimento e validação de métodos simples e mais acessíveis para avaliação de comprimidos e matéria prima de atenolol. Procura, também, destacar as características ideais para o fármaco na fase de pré-formulação e desenvolvimento da forma farmacêutica. Neste contexto, foram desenvolvidas e validadas metodologias por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espectrofotometria no ultravioleta para quantificação de atenolol em comprimidos. Foram também aplicadas técnicas de caracterização da matéria prima para classificação da mesma na fase de pré-formulação. O método desenvolvido por cromatografia líquida de alta eficiência apresenta vantagens sobre o método farmacopeico por estabelecer uma análise sem utilização de reagente de pareamento iônico, heptanossulfonato, por ser mais rápido e simples. Ambos os métodos quantitativos desenvolvidos apresentaram-se lineares, específicos, exatos, precisos, robustos, e equivalentes entre si. Para o estudo de dissolução realizado com as formulações farmacêuticas de atenolol, após a análise de eficiência de dissolução, não se observou variação significativa entre as curvas de dissolução obtidas através dos métodos desenvolvidos e da metodologia farmacopeica. A análise da matériaprima de atenolol permitiu sua caracterização, garantindo um emprego adequado na fabricação da forma farmacêutica. As análises comparativas entre o medicamento teste e o medicamento referência permitem afirmar que as duas formulações são semelhantes e com mesmo desempenho in vitro, isto é, são equivalentes farmacêuticos. Os métodos descritos são úteis em análise de controle de qualidade rotineira de formulações farmacêuticas de atenolol e a análise comparativa entre os métodos propostos e a metodologia oficial, demonstrou não haver diferença estatisticamente significativa, caracterizando a equivalência dos mesmos.

The Celtis iguanaea species is popularly known as esporão-de-galo and its leaves are used in folk medicine to treat body aches, rheumatism, asthma, colic, indigestion, ulcers, and as a diuretic, and roots for urinary tract infections. This study aimed to contribute to the phytochemical, antioxidant and antimicrobial study from plant roots, as well as investigated the acute and subacute toxicity of the leaves of C. Iguanaea. The leaves and roots of the plant were dried, triturated and macerated with ethanol (70%) for seven days, with renewal of the solvent. The material was filtered and concentrated in a rotary evaporator to obtain the aqueous extract (AE). Part of the AE roots was taken to complete dryness yielding the crude extract (CE) and the remainder was fractionated successively with dichloromethane (DCM), ethyl acetate (EA) and n-buthanol (BU). All EA leaves was taken to dryness to give EB. In the antioxidant and phytochemical analysis of roots, the EA fraction showed the highest amount of polyphenols (221.55 ± 0.28 mg gallic acid equivalents/g), flavonoids (28.80 ± 0.09 mg quercetin equivalents/g) and alkaloids (3.96 ± 0.32 mg/g) and the best antioxidant capacity by DPPH method (IC50 = 27.97 ± 0.35 μg/mL), TBARS (IC50 = 42.03 ± 4.55 μg/mL) and the reduction of power test (EC50 = 0.86 ± 0.13 mg/mL, but no statistical difference compared to other extracts). This fraction was also capable of removing free radicals significantly through testing of DCFH-DA and able to completely reverse the oxidative damage by protein carbonyl assay. As regards the assessment of the toxicity of the leaves, a single dose of 2000 mg/kg of crude extract administered to rats did not cause mortality or morbidity, so, the extract was classified in categoty 5 (LD50 entre 2000-5000 mg/kg) in accordance with OECD 423. The guide subacute experiment, the animals were divided into four groups: control and experimental (doses of 100, 200 and 400 mg/kg) for 28 days. There was in increase in blood sugar of the animals, indicating a possible pancreatic toxicity. Moreover, enzyme levels and histological analysis indicated that the extract does not hepatotoxic effect, even at the highest dose used. The findings contributed to reveal some phytochemicals and antioxidants characteristics of the species and show that C. iguanaea can be considered safe. / A espécie Celtis iguanaea é popularmente conhecida como esporão-de-galo, e suas folhas são utilizadas na medicina popular para o tratamento de dores no corpo, reumatismo, asma, cólicas, má digestão, úlceras e como diurético, e as raizes para infecções urinárias. O presente trabalho objetivou contribuir para o estudo fitoquímico, antioxidante e antimicrobiano das raízes da planta, assim como avaliar a toxicidade aguda e subaguda das folhas de C. iguanaea. As folhas e raízes da planta foram secas, trituradas e maceradas com etanol (70%) por sete dias, com renovação do solvente. O material foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório a fim de obter o extrato aquoso (EA). Parte do EA das raízes foi levado a secura originando o extrato bruto (EB), e o restante foi fracionado sucessivamente com diclorometano (DCM), acetato de etila (AcOEt) e n-butanol (BuOH). Todo o EA das folhas foi levado a secura para obter EB. Na análise fitoquímica e antioxidante das raízes, a fração AcOEt apresentou a maior quantidade de polifenois (221,55 ± 0,28 mg equivalentes de ácido gálico/g), flavonoides (28,80 ± 0,09 mg equivalentes de quercetina/g) e alcaloides (3,96 ± 0,32 mg/g) e a melhor capacidade antioxidante através do método do DPPH (IC50 = 27,97 ± 0,35 μg/mL), TBARS (IC50 = 42,03 ± 4,55 μg/mL) e pelo teste de poder de redução (EC50 = 0,86 ± 0,13 mg/mL, mas sem diferença estatística em relação aos outros extratos). Esta fração também foi capaz de remover radicais livres de modo significativo, através do ensaio da DCFH-DA e capaz de reverter completamente o dano oxidativo através do ensaio da proteína carbonil. No que diz respeito a avaliação da toxicidade das folhas, uma única dose de 2000 mg/kg de extrato bruto administrada a ratos Wistar, não causou mortalidade ou morbidade, desta forma, o extrato foi classificado na categoria 5 (LD50 entre 2000-5000 mg/kg) de acordo com o Guia OECD 423. No ensaio subagudo, os animais foram divididos em quatro grupos: controle e os experimentais (doses de 100, 200 e 400 mg/kg) durante 28 dias. Observou-se um aumento na glicemia dos animais, indicando uma possível toxicidade pancreática. Por outro lado, alterações enzimáticas e a análise histológica indicaram que o extrato não possui efeito hepatotóxico, mesmo na maior dose de extrato utilizada. O resultados ajudam a elucidar algumas características fitoquímicas e antioxidantes da espécie e mostram que C. iguanaea pode ser considerado seguro.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Creatine, an endogenous guanidino compound produced on liver, kidneys, pancreas, testes and brain, has been aim of several studies over the last years. Although most studies attribute the effects of creatine to their energetic buffer role, recent findings have suggested actions non-related to energy metabolism. Researches have shown that this compound may act as a neuromodulator in the central nervous system (CNS). Among these neuromodulatory actions, was demonstrated that creatine modulates NMDA receptors in rat hippocampal slices. It is well know that stimulation of these receptors activates Na+,K+-ATPase. Moreover, little is known about the acute role of this compound on CNS. Thus, the objective of the chapter I of this paper was to investigate the effect of creatine on Na+,K+-ATPase activity and the intracellular signaling pathway involved. The results showed that creatine treatment of rat hippocampal slices increased Na+,K+-ATPase α2/3 activity in vitro. The intracerebroventricular administration of this compound also increased the enzyme activity, ex vivo. Furthermore, creatinine and phosphocreatine treatment of hippocampal slices did not alter the enzyme activity, suggesting that the creatine mechanism of action is independent of energy metabolism. Additionally, we showed the involvement of NMDA-NR2B and calcineurin. We found also the involvement of the PKA and PKC in the effect of creatine on Na+,K+-ATPase activity. In the second chapter of this study, we decide to verify the effect of acute creatine administration on PTZ-induced seizures, since this convulsant agent inhibits Na+,K+-ATPase activity without alter bioenergetic cellular state. We found that creatine treatment protected against behavioral and electroencephalographic seizures induced by PTZ. Moreover, creatine acute treatment prevented PTZ-induced inhibition of Na+,K+-ATPase activity. Based on present findings, we suggest that creatine may act through an alternative mechanism, independent of energetic metabolism, by modulation of Na+,K+-ATPase activity. / A creatina, um composto guanidínico endógeno, sintetizado pelos rins, fígado, pâncreas, testículos e cérebro, tem sido alvo de diversos estudos ao longo dos últimos anos. Apesar da grande maioria dos estudos atribuírem os efeitos da creatina ao seu papel de tamponamento de energia, recentes achados têm proposto ações não relacionadas ao metabolismo energético. Estudos têm demonstrado que este composto pode agir como neuromodulador no Sistema Nervoso Central (SNC). Dentre estas ações neuromodulatórias, demonstrou-se que a creatina pode modular os receptores do subtipo N-metil- D-aspartato (NMDA) em fatias de hipocampo de ratos. É bem descrito na literatura que a estimulação destes receptores ativa a enzima Na+,K+-ATPase. Além disso, pouco se sabe sobre o papel agudo deste composto no SNC. Desta forma, o objetivo do capítulo I deste estudo foi verificar o efeito da creatina sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase, bem como sua provável via de sinalização intracelular. Os resultados demonstraram que a incubação de fatias de hipocampo de ratos, com creatina, aumentou a atividade da enzima Na+,K+-ATPase α2/3 in vitro e, que a injeção intracerebroventrical (i.c.v) deste composto, aumentou a atividade da enzima ex vivo. Verificou-se também que o tratamento das fatias hipocampais com fosfocreatina e creatinina não alterou a atividade enzimática, sugerindo que o mecanismo de ação da creatina é independente do metabolismo energético. Além disso, foi evidenciada a participação dos receptores NMDA-NR2B, bem como a ativação da enzima calcineurina. Nós constatamos também o envolvimento das enzimas proteína quinase dependente de AMPc (PKA) e da proteína quinase C (PKC) no efeito da creatina sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase. No segundo capítulo deste estudo, decidimos verificar o efeito da administração aguda de creatina sobre as convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), uma vez que este agente quimioconvulsivante inibe a enzima Na+,K+-ATPase sem alterar o status bioenergético celular. Constatamos que a creatina protegeu contra as convulsões comportamentais e eletroencefalográficas induzidas por PTZ. Além disso, o tratamento agudo com creatina preveniu a inibição da atividade da enzima Na+,K+-ATPase induzida por PTZ. Com base nestas evidências, sugerimos que este composto guanidínico pode estar atuando através de um mecanismo alternativo, não dependente do metabolismo energético, através da modulação da atividade da enzima Na+,K+-ATPase.

The α₂-adrenergic receptor agonists are widely used in equine practice, especially in antalgic therapy, because they promote profound sedation and moderate visceral analgesia. The opioids are used in horses with some restriction due to the excitatory effects in this specie. The objective of this study was to evaluate the sedative effect, hemodynamic, pulmonary and digestory changes due to the neuroleptoanalgesic association of buprenorphine and different doses of xylazine. Six adults horses of both gender, weighting an average of 400 Kg. The animals were control of themselves, being divided into four groups, control group (CG) saline NaCl 0,9% solution administrated IV, and three other groups with buprenorphine 10 μg/kg associated to three different doses of xylazine, 0,25 mg/kg (BX25), 0,50 mg/kg (BX50) and 0,75 mg/kg (BX75) IV. Sedative effects, gastrointestinal motility, FC, f, SAP, MAP, DAP, blood gas tension analysis and core temperature were evaluated 30 min before, immediately before the administration of any treatment for basal values and after 5, 15 and every 15 min until 120 min post-treatment. Gastrointestinal motility was evaluated by the same period and for 12 hours, every 2 hours. Blood samples were collected at 0, 30 and 60 min. Parametric variables were analyzed with ANOVA, followed by Dunnett test for intra group and Tukey test between groups. For the non-parametric variable (intestinal motility) Wilcoxon test was used. Differences was considered significant when P<0.05. Intense sedative effect was observed in the three groups with the neuroleptoanalgesic association lasting 45 min in BX75 with profound ataxia. Intestinal motility decreased with 5 minutes after administration and remained decreased for 8 hours. Hemodynamic parameters started to increased after 30 min and no changes were observed in respiratory frequency and blood gas samples analysis, only HCO3- showed increase. Synergistic effect was observed, maintaining hemodynamic stability, with minimal pulmonary effects. The hypomotility observed must be considered when the association is used in horses with gastrointestinal disorders. / Os agonistas α₂-adrenérgicos são amplamente empregados na clínica equina, destacando-se na terapia antálgica pela intensa sedação e por produzirem moderada analgesia visceral. Os opióides, apesar de serem utilizados na terapia antálgica de equinos, parecem ainda ter seu uso relativamente restrito, principalmente pela excitação observada quando da utilização destes. O estudo teve como objetivo investigar o efeito sedativo e as alterações hemodinâmicas, pulmonares e digestória decorrentes da utilização da associação neuroleptoanalgésica entre a buprenorfina e diferentes doses de xilazina. Utilizou-se 6 equinos de ambos os sexos, com média de peso de 400kg. Os animais foram divididos em quatro grupos autocontrole, sendo grupo controle, administração de solução fisiológica 0,9% IV, e outros três grupos, com a associação de buprenorfina 10 μg/kg associada a diferentes doses de xilazina, 0,25 mg/kg (BX25), 0,5 mg/kg (BX50) e 0,75 mg/kg (BX75) IV. Avaliouse a atividade sedativa, motilidade intestinal, FC, f, PAS, PAM, PAD, parâmetros hemogasométricos e temperatura corpórea aos 30 min antes, imediatamente antes da administração de qualquer substância para determinação dos valores basais e aos 5min, 15 min, e a cada 15 min até 120 min após o tratamento. A motilidade intestinal foi avaliada pelo mesmo período nos mesmos tempos e a cada duas horas até 12 horas após a administração. Os parâmetros hemogasométricos foram avaliados aos 0, 30 e 60 min. Para as variáveis paramétricas utilizou-se análise de variância para amostras pareadas, com posterior teste de Dunnett. Para comparações entre os grupos, realizou-se análise de variância, seguido de teste de Tukey. Para a variável não-paramétrica, motilidade intestinal, utilizou-se teste de Wilcoxon para amostras pareadas. As diferenças foram consideradas significantes quando P<0,05. Foi observado efeito sedativo significante nos três grupos com a associação neuroleptoanalgésica, perdurando por até 45 min no BX75 com severa ataxia. Observou-se hipomotilidade 5 minutos após a administração perdurando por 480 min. Os parâmetros hemodinâmicos elevaram-se após os 45 min, não sendo observadas alterações na frequência respiratória e nos parâmetros hemogasométricos, ocorrendo aumento somente no HCO3-. Conclui-se que houve efeito sinérgico entre os dois fármacos, mantendo estabilidade hemodinâmica, com mínimas alterações pulmonares. A hipomotilidade promovida pela associação deve ser considerada quando usada em equinos com distúrbios gastrintestinais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Malassezia pachydermatis is opportunistic yeast that primarily affects animals, being associated with dermatomycoses and ear diseases in dogs and cats. This is important yeast in veterinary medicine and therefore the knowledge of its susceptibility profile against various antifungal agents, is necessary to obtain success in treating and preventing relapses of infection. The aim of this study was to compare the susceptibility between pathogenic and commensal M. pachydermatis strains against ketoconazole, miconazole, clotrimazole, itraconazole, fluconazole, voriconazole, amphotericin B and nystatin. All isolates were tested by the broth microdilution method using the CLSI M27-A3 (2008). The strains isolated from infectious processes (G1) showed higher MICs than commensals strains (G2). The azoles ketoconazole, itraconazole and voriconazole showed excellent effectiveness against M. pachydermatis isolates. Differences in susceptibility to amphotericin B, nystatin, miconazole, clotrimazole and fluconazole were observed between G1 and G2 groups. It can be explained by the variation in the lipid content of the capsule surrounding the organism and the concentration of intracellular antioxidant enzymes. M. pachydermatis is important yeast in veterinary medicine and therefore the knowledge of its susceptibility profile against various antifungal agents, is necessary to obtain success in treating and preventing relapses of infection. / Malassezia pachydermatis é uma levedura oportunista que acomete principalmente animais, estando associada a dermatomicoses e otopatias em cães e gatos. Por se tratar de um fungo de grande importância na medicina veterinária, o conhecimento do seu perfil de suscetibilidade frente a diversos antifúngicos se faz necessário para obtermos sucesso no tratamento e na prevenção de recidivas da malasseziose. Este estudo teve como objetivo principal comparar o perfil de suscetibilidade de isolados de M. pachydermatis, patógenos e comensais, frente aos antimicóticos cetoconazol, miconazol, clotrimazol, itraconazol, fluconazol, voriconazol, nistatina e anfotericina B utilizando a técnica de microdiluição em caldo RPMI 1640 tamponado, proposta pelo protocolo M27-A3 do CLSI (2008). Através da avaliação das CIMs, constatou-se menor sensibilidade dos isolados oriundos de processos infecciosos (G1) a todos os antifúngicos testados. As melhores respostas foram observadas frente aos azólicos cetoconazol, itraconazol e voriconazol, sendo o itraconazol considerado o mais eficiente, visto que a maioria dos isolados testados se mostraram sensíveis às menores concentrações deste antifúngico. Ao comparar o perfil de suscetibilidade dos dois grupos, foi observada diferença significativa entre eles frente aos antifúngicos miconazol, clotrimazol, fluconazol, anfotericina B e nistatina, fato que poderia ser explicado pela variação do conteúdo lipídico da cápsula que envolve o microrganismo e da concentração de enzimas antioxidantes intracelulares.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The efficacy of immersion anaesthesia with tricaine methanesulfonate or propofol on silver catfish Rhamdia quelen was assessed through induction and recovery times and observation of mortality. Two types of comparisons were conducted: one contrasting grey silver catfish of three size ranges and another comparing two strains of the species, albino and grey. For tricaine methanesulfonate, there was no uniform relationship between the induction and recovery times and the size of the grey silver catfish. The grey animals were more sensitive to the anaesthetic than the albinos were, and recovery was also faster in the grey fish group. Induction of propofol anaesthesia had a direct relationship with size, with the small animals reaching anaesthesia stage earlier. No uniform pattern was observed for recovery among the three different sizes. Propofol promoted faster anaesthesia in the grey animals than in the albinos, but no direct relationship was observed for recovery between the strains. No mortality was detected throughout the experiment. This study reports a novel, efficient and practical use of propofol as an immersion anaesthetic for fish and notes the first time that silver catfish have been anesthetised with such an agent. The best outcomes with propofol were registered in the size range comparison, indicating that 12 mg.L-1 is the most efficient concentration to anesthetise the small fish and that 10 mg.L-1 is a more appropriate concentration for anaesthesia of the medium and large animals. With regard to tricaine methanesulfonate, 300 mg.L-1 promoted satisfactory results for anaesthesia of the large fish in the size range comparison and the albino in the strain comparison. The grey fish responded better to 100 mg.L-1 of the anaesthetic in the latter evaluation. These findings show that it is essential to consider size and strain when anesthetising silver catfish with tricaine methanesulfonate or propofol bath solution. / A eficácia da anestesia em banho de imersão com metanosulfonato de tricaína ou propofol em jundiá Rhamdia quelen foi avaliada através de tempos de indução e recuperação anestésica e observação de mortalidade. Foram realizados dois tipos de comparações: um contrastando jundiás cinzas de três tamanhos e outro comparando duas variedades da espécie, albina e cinza. Para metanosulfonato de tricaína, não houve relação uniforme entre tempos de indução e recuperação e tamanho dos jundiás. Os peixes cinzas foram mais sensíveis ao anestésico do que os albinos e a recuperação também ocorreu mais rapidamente nos animais cinzas. Indução anestésica com propofol apresentou relação direta com o tamanho dos peixes, sendo os pequenos os primeiros a atingirem o estágio de anestesia. Não foi observado padrão uniforme entre os diferentes tamanhos de peixe na recuperação. Propofol induziu anestesia mais rapidamente nos peixes cinzas do que nos albinos, mas não foi observada relação direta entre as duas variedades na recuperação. Não houve mortalidade ao longo do experimento. Este estudo descreve um uso novo, eficiente e prático de propofol como anestésico para banho de imersão em peixes, bem como o primeiro relato de anestesia de jundiá com este agente. Os melhores resultados com propofol foram registrados na comparação entre jundiás cinzas de diferentes tamanhos, indicando 12 mg.L-1 como a concentração mais eficaz para anestesia dos peixes pequenos e 10 mg.L-1 como a mais eficiente para os peixes médios e grandes. Com relação ao metanosulfonato de tricaína, 300 mg.L-1 promoveu resultados satisfatórios para anestesia dos peixes grandes na comparação entre tamanhos e para anestesia dos albinos na comparação entre variedades. Nesta última, os jundiás cinzas responderam melhor a concentração de 100 mg.L-1. Estes resultados demonstram ser essencial considerar tamanho e variação genética quando opta-se por anestesiar jundiás em banho de imersão com metanosulfonato de tricaína ou propofol.

Cancer related fatigue (CRF) is a common phenomenon in patients undergoing chemotherapy and radiotherapy representing a negative impact on functional status and quality of life. Some plants present tonic and antifatiguing properties, as guaraná (Paullinia cupana) and a previous study described positive effect on CRF of breast cancer patients submitted to chemotherapy. Despite the positive results indicating that guaraná improve CRF, this fruit present bioactive molecule as caffeine and catechin which can to influence the effect of antitumor drugs. Therefore, the aim of this study was to evaluate if guaraná changes the viability and antiproliferative effect of seven chemotherapic agents currently used in the breast cancer treatment using as in vitro experimental model MCF-7 breast cancer cell line. The cells were exposed at 1, 5 and 10 μg/mL guaraná concentrations with and without chemotherapics. The main results showed an antiproliferative effect of guaraná at 5 10 μg/mL. The guaraná influence on chemotherapic effects was drug-dependent. The guaraná effect on MCF-7 cells viability was heterogeneous and drug dependent. Different of the results found after 24 hours exposition, the guaraná plus all chemotherapic drugs showed a strong antiproliferative effect ( > 40% of cell inhibition) on MCF-7 cells after 72 hours of exposition of 10 uM gemcitabine, vinorelbine and methotrexate, 2 uM 5-fluoracil, 50 uM paclitaxel, 200 nM doxorubicin, and 5mM cyclophosphamide. Because chemotherapic drugs were affected by guaraná addition most improve the antiproliferative activity, the therapeutic use of guaraná against CRF seems did not affect negatively the chemotherapy. However, in vitro protocols present methodological limitations that need to be considered and complementary in vitro and in vivo investigations need to be performed to evaluate whether chemotherapic plus guaraná administration is safe to breast cancer patients. / A fadiga relacionada ao câncer (CRF) é um fenômeno comum em pacientes submetidos à quimioterapia e à radioterapia representando um impacto negativo sobre o estado funcional e a qualidade de vida. Algumas plantas apresentam propriedades tônicas e antifatigantes, como guaraná (Paullinia cupana) e um estudo anterior descreveu efeito positivo sobre a CRF de pacientes com câncer de mama, submetidas à quimioterapia. Apesar dos resultados positivos, indicando que o guaraná melhora o CRF, este fruto apresenta molécula bioactiva como cafeína e catequina, que podem influenciar no efeito de fármacos antitumorais. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar se o guaraná muda a viabilidade e o efeito antiproliferativo de sete agentes quimioterápicos atualmente utilizados no tratamento do câncer de mama, utilizando como modelo experimental in vitro a linhagem de células de câncer de mama MCF-7. As células foram expostas a concentrações de guaraná de 1, 5 e 10 μg/mL, com e sem quimioterápicos. Os principais resultados demonstraram um efeito antiproliferativo do guaraná em 5 10 μg/mL. A influência do guaraná sobre os efeitos quimioterápicos era dependente de fármacos. O efeito do guaraná na viabilidade de células MCF-7 foi heterogêneo e dependente de drogas. Diferente dos resultados obtidos após 24 horas de exposição, o guaraná mais todos os fármacos quimioterápicos mostraram um forte efeito antiproliferativo (> 40% de inibição de células) em células MCF-7, depois de 72 horas de exposição de 10 uM de gemcitabina, vinorelbina e metotrexato, 2 uM 5-fluoracil, 50 uM de paclitaxel, 200 nM de doxorubicina, e 5 mM de ciclofosfamida. Devido ao fato das drogas quimioterápicas serem afetadas pela adição de guaraná melhorando a atividade antiproliferativa, o uso terapêutico de guaraná contra CRF parece não afetar negativamente a quimioterapia. No entanto, protocolos in vitro apresentam limitações metodológicas que precisam ser consideradas e precisam ser realizadas investigações complementares in vitro e in vivo para avaliar se a administração de quimioterápico com guaraná é segura para pacientes com câncer de mama.