No / The current work was undertaken to assess suitability of liquid crystalline phase for engineering of lactose crystals and their utility as a carrier in dry powder inhalation formulations. Saturated lactose solution was poured in molten glyceryl monooleate which subsequently transformed into gel. The gel microstructure was analyzed by PPL microscopy and SAXS. Lactose particles recovered from gels after 48 h were analyzed for polymorphism using techniques such as FTIR, XRD, DSC and TGA. Particle size, morphology and aerosolisation properties of prepared lactose were analyzed using Anderson cascade impactor. In situ seeding followed by growth of lactose crystals took place in gels with cubic microstructure as revealed by PPL microscopy and SAXS. Elongated (size approximately 71 mum) lactose particles with smooth surface containing mixture of alpha and beta-lactose was recovered from gel, however percentage of alpha-lactose was more as compared to beta-lactose. The aerosolisation parameters such as RD, ED, %FPF and % recovery of lactose recovered from gel (LPL) were found to be comparable to Respitose(R) ML001. Thus LC phase (cubic) can be used for engineering of lactose crystals so as to obtain particles with smooth surface, high elongation ratio and further they can be used as carrier in DPI formulations.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und der Untersuchung von Struktur-Eigenschaftsbeziehungen neuartiger V-förmiger, formstabiler Mesogene zur Realisierung biaxial nematischer Mesophasen (Nb). Alle synthetisierten Verbindungen besitzen ein formtreues Oligo(phenylenethinylen)-Grundgerüst, an welches laterale Alkyloxyketten und verschiedene terminale Substituenten (z. B. -CN, O(CH2)nCOOEt, Pyridyle) angebunden wurden. Durch dieses spezielle Design erhält man ausschließlich nematische und keine höher geordneten flüssigkristallinen Phasen. Durch den Einsatz verschiedener zentraler heterozyklischer Kernbausteine konnten erfolgreich Öffnungswinkel zwischen 108.9° und 160° realisiert werden. Dabei zeigen Thiadiazolderivate stets enantiotrope Mesophasen, wobei im Hochtemperaturbereich eine uniaxiale Phase mit biaxialen Aggregaten vorliegt. Beim Abkühlen konnte bei etwa 50 °C mittels Polarisationsmikroskopie und dielektrischer Spektroskopie ein Übergang in die Nb-Phase nachgewiesen werden. Die erstmalige Beobachtung eines direkten Übergangs von der isotropen Phase in die Nb-Phase gelang durch den Einsatz von Benzo[1,2-b:4,3-b]dithiophen als Kernbaustein.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und der Untersuchung von Struktur-Eigenschaftsbeziehungen neuartiger V-förmiger, formstabiler Mesogene zur Realisierung biaxial nematischer Mesophasen (Nb). Alle synthetisierten Verbindungen besitzen ein formtreues Oligo(phenylenethinylen)-Grundgerüst, an welches laterale Alkyloxyketten und verschiedene terminale Substituenten (z. B. -CN, O(CH2)nCOOEt, Pyridyle) angebunden wurden. Durch dieses spezielle Design erhält man ausschließlich nematische und keine höher geordneten flüssigkristallinen Phasen. Durch den Einsatz verschiedener zentraler heterozyklischer Kernbausteine konnten erfolgreich Öffnungswinkel zwischen 108.9° und 160° realisiert werden. Dabei zeigen Thiadiazolderivate stets enantiotrope Mesophasen, wobei im Hochtemperaturbereich eine uniaxiale Phase mit biaxialen Aggregaten vorliegt. Beim Abkühlen konnte bei etwa 50 °C mittels Polarisationsmikroskopie und dielektrischer Spektroskopie ein Übergang in die Nb-Phase nachgewiesen werden. Die erstmalige Beobachtung eines direkten Übergangs von der isotropen Phase in die Nb-Phase gelang durch den Einsatz von Benzo[1,2-b:4,3-b]dithiophen als Kernbaustein.

Nickel und Nickel (II) -oxid werden in großem Umfang in fortgeschrittenen elektronischen Geräten verwendet. In der Mikroelektronik-Industrie wird Nickel verwendet werden, um Nickelsilizid bilden. Die Nickelmono Silizid (NiSi) wurde als ausgezeichnetes Material für Source-Drain-Kontaktanwendungen unter 45 nm-CMOS-Technologie entwickelt. Im Vergleich zu anderen Siliziden für die Kontaktanwendungen verwendet wird NiSi wegen seines niedrigen spezifischen Widerstand, niedrigen Kontaktwiderstand, relativ niedrigen Bildungstemperatur und niedrigem Siliziumverbrauchs bevorzugt. Nickel in Nickelbasis-Akkus und ferromagnetischen Direktzugriffsspeicher (RAMs) verwendet. Nickel (II) oxid wird als Transistor-Gate-Oxid und Oxid in resistive RAM genutzt wird. Atomic Layer Deposition (ALD) ist eine spezielle Art der Chemical Vapor Deposition (CVD), das verwendet wird, um sehr glatte sowie homogene Dünnfilme mit hervorragenden Treue auch bei hohen Seitenverhältnissen abzuscheiden. Es basiert auf selbstabschließenden sequentielle Gas-Feststoff-Reaktionen, die eine präzise Steuerung der Filmdicke auf wenige Angström lassen sich auf der Basis. Zur Herstellung der heutigen 3D-elektronische Geräte, sind Technologien wie ALD erforderlich. Trotz der Vielzahl von praktischen Anwendungen von Nickel und Nickel (II) -oxid, sind einige Nickelvorstufen zur thermischen basierend ALD erhältlich. Darüber hinaus haben diese Vorstufen bei schlechten Filmeigenschaften führte und die Prozesseigenschaften wurden ebenfalls begrenzt. Daher in dieser Masterarbeit mussten die Eigenschaften verschiedener neuartiger Nickelvorstufen zu bewerten. Alle neuen Vorstufen heteroleptische (verschiedene Arten von Liganden) und Komplexe wurden vom Hersteller speziell zur thermischen basierend ALD aus reinem Nickel mit H 2 als ein Co-Reaktionsmittel gestaltet. Um die neuartige Vorläufer zu untersuchen, wurde eine neue Methode entwickelt, um kleine Mengen in einer sehr zeitsparend (bis zu 2 g) von Ausgangsstoffen zu testen. Diese Methodologie beinhaltet: TGA / DTA-Kurve analysiert der Vorstufen, thermische Stabilitätstests in dem die Vorläufer (<0,1 g) wurden bei erhöhter Temperatur in einer abgedichteten Umgebung für mehrere Stunden wurde die Abscheidung Experimenten und Film Charakterisierungen erhitzt. Die Abscheidungen wurden mit Hilfe der in situ Quarzmikrowaage überwacht, während die anwendungsbezogenen Filmeigenschaften, wie chemische Zusammensetzung, physikalische Phase, Dicke, Dichte, Härte und Schichtwiderstand wurden mit Hilfe von ex situ Messverfahren untersucht. Vor der Evaluierung neuartiger Nickelvorstufen ein Benchmark ALD-Prozess war vom Referenznickelvorläufer (Ni (AMD)) und Luft als Reaktionspartner entwickelt. Das Hauptziel der Entwicklung und Optimierung von solchen Benchmark-ALD-Prozess war es, Standard-Prozessparameter wie zweite Reaktionspartner Belichtungszeiten, Argonspülung Zeiten, gesamtprozessdruck, beginnend Abscheidungstemperatur und Gasströme zu extrahieren. Diese Standard-Prozessparameter mussten verwendet, um die Prozessentwicklung Aufgabe (das spart Vorläufer Verbrauch) zu verkürzen und die Sublimationstemperatur Optimierung für jede neuartige Vorstufe werden. Die ALD Verhalten wurde in Bezug auf die Wachstumsrate durch Variation des Nickelvorläuferbelichtungszeit, Vorläufer Temperatur und Niederschlagstemperatur überprüft. / Nickel and nickel(II) oxide are widely used in advanced electronic devices . In microelectronic industry, nickel is used to form nickel silicide. The nickel mono-silicide (NiSi) has emerged as an excellent material of choice for source-drain contact applications below 45 nm node CMOS technology. As compared to other silicides used for the contact applications, NiSi is preferred because of its low resistivity, low contact resistance, relatively low formation temperature and low silicon consumption. Nickel is used in nickel-based rechargeable batteries and ferromagnetic random access memories (RAMs). Nickel(II) oxide is utilized as transistor gate-oxide and oxide in resistive RAMs. Atomic Layer Deposition (ALD) is a special type of Chemical Vapor Deposition (CVD) technique, that is used to deposit very smooth as well as homogeneous thin films with excellent conformality even at high aspect ratios. It is based on self-terminating sequential gas-solid reactions that allow a precise control of film thickness down to few Angstroms. In order to fabricate todays 3D electronic devices, technologies like ALD are required. In spite of huge number of practical applications of nickel and nickel(II) oxide, a few nickel precursors are available for thermal based ALD. Moreover, these precursors have resulted in poor film qualities and the process properties were also limited. Therefore in this master thesis, the properties of various novel nickel precursors had to be evaluated. All novel precursors are heteroleptic (different types of ligands) complexes and were specially designed by the manufacturer for thermal based ALD of pure nickel with H 2 as a co-reactant. In order to evaluate the novel precursors, a new methodology was designed to test small amounts (down to 2 g) of precursors in a very time efficient way. This methodology includes: TGA/DTA curve analyses of the precursors, thermal stability tests in which the precursors (< 0.1 g) were heated at elevated temperatures in a sealed environment for several hours, deposition experiments, and film characterizations. The depositions were monitored with the help of in situ quartz crystal microbalance, while application related film properties like chemical composition, physical phase, thickness, density, roughness and sheet resistance were investigated with the help of ex situ measurement techniques. Prior to the evaluation of novel nickel precursors, a benchmark ALD process was developed from the reference nickel precursor (Ni(amd)) and air as a co-reactant. The main goal of developing and optimizing such benchmark ALD process was to extract standard process parameters like second-reactant exposure times, Argon purge times, total process pressure, starting deposition temperature and gas flows. These standard process parameters had to be utilized to shorten the process development task (thus saving precursor consumption) and optimize the sublimation temperature for each novel precursor. The ALD behaviour was checked in terms of growth rate by varying the nickel precursor exposure time, precursor temperature and deposition temperature.

Nickel und Nickel (II) -oxid werden in großem Umfang in fortgeschrittenen elektronischen Geräten verwendet. In der Mikroelektronik-Industrie wird Nickel verwendet werden, um Nickelsilizid bilden. Die Nickelmono Silizid (NiSi) wurde als ausgezeichnetes Material für Source-Drain-Kontaktanwendungen unter 45 nm-CMOS-Technologie entwickelt. Im Vergleich zu anderen Siliziden für die Kontaktanwendungen verwendet wird NiSi wegen seines niedrigen spezifischen Widerstand, niedrigen Kontaktwiderstand, relativ niedrigen Bildungstemperatur und niedrigem Siliziumverbrauchs bevorzugt. Nickel in Nickelbasis-Akkus und ferromagnetischen Direktzugriffsspeicher (RAMs) verwendet. Nickel (II) oxid wird als Transistor-Gate-Oxid und Oxid in resistive RAM genutzt wird. Atomic Layer Deposition (ALD) ist eine spezielle Art der Chemical Vapor Deposition (CVD), das verwendet wird, um sehr glatte sowie homogene Dünnfilme mit hervorragenden Treue auch bei hohen Seitenverhältnissen abzuscheiden. Es basiert auf selbstabschließenden sequentielle Gas-Feststoff-Reaktionen, die eine präzise Steuerung der Filmdicke auf wenige Angström lassen sich auf der Basis. Zur Herstellung der heutigen 3D-elektronische Geräte, sind Technologien wie ALD erforderlich. Trotz der Vielzahl von praktischen Anwendungen von Nickel und Nickel (II) -oxid, sind einige Nickelvorstufen zur thermischen basierend ALD erhältlich. Darüber hinaus haben diese Vorstufen bei schlechten Filmeigenschaften führte und die Prozesseigenschaften wurden ebenfalls begrenzt. Daher in dieser Masterarbeit mussten die Eigenschaften verschiedener neuartiger Nickelvorstufen zu bewerten. Alle neuen Vorstufen heteroleptische (verschiedene Arten von Liganden) und Komplexe wurden vom Hersteller speziell zur thermischen basierend ALD aus reinem Nickel mit H 2 als ein Co-Reaktionsmittel gestaltet. Um die neuartige Vorläufer zu untersuchen, wurde eine neue Methode entwickelt, um kleine Mengen in einer sehr zeitsparend (bis zu 2 g) von Ausgangsstoffen zu testen. Diese Methodologie beinhaltet: TGA / DTA-Kurve analysiert der Vorstufen, thermische Stabilitätstests in dem die Vorläufer (<0,1 g) wurden bei erhöhter Temperatur in einer abgedichteten Umgebung für mehrere Stunden wurde die Abscheidung Experimenten und Film Charakterisierungen erhitzt. Die Abscheidungen wurden mit Hilfe der in situ Quarzmikrowaage überwacht, während die anwendungsbezogenen Filmeigenschaften, wie chemische Zusammensetzung, physikalische Phase, Dicke, Dichte, Härte und Schichtwiderstand wurden mit Hilfe von ex situ Messverfahren untersucht. Vor der Evaluierung neuartiger Nickelvorstufen ein Benchmark ALD-Prozess war vom Referenznickelvorläufer (Ni (AMD)) und Luft als Reaktionspartner entwickelt. Das Hauptziel der Entwicklung und Optimierung von solchen Benchmark-ALD-Prozess war es, Standard-Prozessparameter wie zweite Reaktionspartner Belichtungszeiten, Argonspülung Zeiten, gesamtprozessdruck, beginnend Abscheidungstemperatur und Gasströme zu extrahieren. Diese Standard-Prozessparameter mussten verwendet, um die Prozessentwicklung Aufgabe (das spart Vorläufer Verbrauch) zu verkürzen und die Sublimationstemperatur Optimierung für jede neuartige Vorstufe werden. Die ALD Verhalten wurde in Bezug auf die Wachstumsrate durch Variation des Nickelvorläuferbelichtungszeit, Vorläufer Temperatur und Niederschlagstemperatur überprüft.:Lists of Abbreviations and Symbols VIII Lists of Figures and Tables XIV 1 Introduction 1 I Theoretical Part 3 2 Nickel and Nickel Oxides 4 2.1 Introduction and Existence 5 2.2 Material properties of Nickel and Nickel Oxide 5 2.3 Application in electronic industry 5 3 Atomic Layer Deposition 7 3.1 History 8 3.2 Definition 8 3.3 Features of thermal-ALD 8 3.3.1 ALD growth mechanism – an ideal view 8 3.3.2 ALD growth behaviour 10 3.3.3 Growth mode 11 3.3.4 ALD temperature window 11 3.4 Benefits and limitations 12 3.5 Precursor properties for thermal-ALD 13 3.6 ALD & CVD of Nickel – A literature survey 13 4 Metrology 17 4.1 Thermal analysis of precursors 18 4.2 Film and growth characterization 21 4.2.1 Quartz Crystal Microbalance 21 4.2.2 Spectroscopic Ellipsometry 24 4.2.3 X-Ray Photoelectron Spectroscopy 28 4.2.4 Scanning Electron Microscopy 29 4.2.5 X-Ray Reflectometry and X-Ray Diffraction 29 4.2.6 Four Point Probe Technique 20 5 Rapid Thermal Processing 32 5.1 Introduction 33 5.2 Basics of RTP 33 5.3 Nickel Silicides-A literature survey 33 II Experimental Part 36 6 Methodologies 37 6.1 Experimental setup 38 6.2 ALD process 41 6.2.1 ALD process types and substrate setups 41 6.2.2 Process parameters 41 6.3 Experimental procedure 42 6.3.1 Tool preparation 42 6.3.2 Thermal analysis and ALD experiments from nickel precursors 43 6.3.3 Data acquisition and evaluation 44 6.3.4 Characterization of film properties 46 7 Results and discussion 48 7.1 Introduction 49 7.2 QCM verification with Aluminum Oxide ALD process 49 7.3 ALD process from the reference precursor 50 7.3.1 Introduction 50 7.3.2 TG analysis for Ni(amd) precursor 51 7.3.3 Thermal stability test for Ni(amd) 51 7.3.4 ALD process optimization 52 7.3.5 Film properties 54 7.4 Evaluating the novel Nickel precursors 55 7.4.1 Screening tests for precursor P1 55 7.4.2 Screening tests for precursor P2 62 7.4.3 Screening tests for precursor P3 66 7.4.4 Screening tests for precursor P4 70 7.4.5 Screening tests for precursor P5 72 7.5 Comparison of all nickel precursors used in this work 74 8 Conclusions and outlook 77 References 83 III Appendix 101 A Deposition temperature control & Ellipsometry model 102 B Gas flow plan 105 / Nickel and nickel(II) oxide are widely used in advanced electronic devices . In microelectronic industry, nickel is used to form nickel silicide. The nickel mono-silicide (NiSi) has emerged as an excellent material of choice for source-drain contact applications below 45 nm node CMOS technology. As compared to other silicides used for the contact applications, NiSi is preferred because of its low resistivity, low contact resistance, relatively low formation temperature and low silicon consumption. Nickel is used in nickel-based rechargeable batteries and ferromagnetic random access memories (RAMs). Nickel(II) oxide is utilized as transistor gate-oxide and oxide in resistive RAMs. Atomic Layer Deposition (ALD) is a special type of Chemical Vapor Deposition (CVD) technique, that is used to deposit very smooth as well as homogeneous thin films with excellent conformality even at high aspect ratios. It is based on self-terminating sequential gas-solid reactions that allow a precise control of film thickness down to few Angstroms. In order to fabricate todays 3D electronic devices, technologies like ALD are required. In spite of huge number of practical applications of nickel and nickel(II) oxide, a few nickel precursors are available for thermal based ALD. Moreover, these precursors have resulted in poor film qualities and the process properties were also limited. Therefore in this master thesis, the properties of various novel nickel precursors had to be evaluated. All novel precursors are heteroleptic (different types of ligands) complexes and were specially designed by the manufacturer for thermal based ALD of pure nickel with H 2 as a co-reactant. In order to evaluate the novel precursors, a new methodology was designed to test small amounts (down to 2 g) of precursors in a very time efficient way. This methodology includes: TGA/DTA curve analyses of the precursors, thermal stability tests in which the precursors (< 0.1 g) were heated at elevated temperatures in a sealed environment for several hours, deposition experiments, and film characterizations. The depositions were monitored with the help of in situ quartz crystal microbalance, while application related film properties like chemical composition, physical phase, thickness, density, roughness and sheet resistance were investigated with the help of ex situ measurement techniques. Prior to the evaluation of novel nickel precursors, a benchmark ALD process was developed from the reference nickel precursor (Ni(amd)) and air as a co-reactant. The main goal of developing and optimizing such benchmark ALD process was to extract standard process parameters like second-reactant exposure times, Argon purge times, total process pressure, starting deposition temperature and gas flows. These standard process parameters had to be utilized to shorten the process development task (thus saving precursor consumption) and optimize the sublimation temperature for each novel precursor. The ALD behaviour was checked in terms of growth rate by varying the nickel precursor exposure time, precursor temperature and deposition temperature.:Lists of Abbreviations and Symbols VIII Lists of Figures and Tables XIV 1 Introduction 1 I Theoretical Part 3 2 Nickel and Nickel Oxides 4 2.1 Introduction and Existence 5 2.2 Material properties of Nickel and Nickel Oxide 5 2.3 Application in electronic industry 5 3 Atomic Layer Deposition 7 3.1 History 8 3.2 Definition 8 3.3 Features of thermal-ALD 8 3.3.1 ALD growth mechanism – an ideal view 8 3.3.2 ALD growth behaviour 10 3.3.3 Growth mode 11 3.3.4 ALD temperature window 11 3.4 Benefits and limitations 12 3.5 Precursor properties for thermal-ALD 13 3.6 ALD & CVD of Nickel – A literature survey 13 4 Metrology 17 4.1 Thermal analysis of precursors 18 4.2 Film and growth characterization 21 4.2.1 Quartz Crystal Microbalance 21 4.2.2 Spectroscopic Ellipsometry 24 4.2.3 X-Ray Photoelectron Spectroscopy 28 4.2.4 Scanning Electron Microscopy 29 4.2.5 X-Ray Reflectometry and X-Ray Diffraction 29 4.2.6 Four Point Probe Technique 20 5 Rapid Thermal Processing 32 5.1 Introduction 33 5.2 Basics of RTP 33 5.3 Nickel Silicides-A literature survey 33 II Experimental Part 36 6 Methodologies 37 6.1 Experimental setup 38 6.2 ALD process 41 6.2.1 ALD process types and substrate setups 41 6.2.2 Process parameters 41 6.3 Experimental procedure 42 6.3.1 Tool preparation 42 6.3.2 Thermal analysis and ALD experiments from nickel precursors 43 6.3.3 Data acquisition and evaluation 44 6.3.4 Characterization of film properties 46 7 Results and discussion 48 7.1 Introduction 49 7.2 QCM verification with Aluminum Oxide ALD process 49 7.3 ALD process from the reference precursor 50 7.3.1 Introduction 50 7.3.2 TG analysis for Ni(amd) precursor 51 7.3.3 Thermal stability test for Ni(amd) 51 7.3.4 ALD process optimization 52 7.3.5 Film properties 54 7.4 Evaluating the novel Nickel precursors 55 7.4.1 Screening tests for precursor P1 55 7.4.2 Screening tests for precursor P2 62 7.4.3 Screening tests for precursor P3 66 7.4.4 Screening tests for precursor P4 70 7.4.5 Screening tests for precursor P5 72 7.5 Comparison of all nickel precursors used in this work 74 8 Conclusions and outlook 77 References 83 III Appendix 101 A Deposition temperature control & Ellipsometry model 102 B Gas flow plan 105

La génération des cellules hématopoïétiques, aussi connue sous le nom d'hématopoïèse, est contrôlée par l’activité conjuguée de facteurs de transcription lignée-spécifiques permettant l’expression, en temps et lieu, de gènes spécifiques nécessaires pour le développement cellulaire. Dans le cadre de notre étude, nous avons étudié les facteurs de transcription KLF2 et KLF4 qui jouent des rôles cruciaux dans la formation des lymphocytes B et T. KLF2 et KLF4 activent la transcription de gènes spécifiques via leur interaction avec le co-activateur (CBP). Leurs interactions avec CBP requièrent le domaine de transactivation (TAD) qui est localisé dans la région N-terminal des facteurs KLF2 et KLF4. Des études préalables ont montré que des domaines TAD sont aussi présents chez la protéine suppresseur de tumeur p53 et que ces domaines sont requis pour les interactions entre la protéine p53 et le co-activateur CBP. Récemment, plusieurs structures des TADs de p53 en complexe avec les domaines TAZ2 et KIX de CBP ont permis de démontrer que ces TADs sont de nature acide et contiennent un motif ΦΧΧΦΦ crucial pour la formation des interactions. De plus, il s’avère que ces TADs sont similaires aux TADs de KLF2 et KLF4. L’étude présentée dans ce mémoire relate la caractérisation structurelle et fonctionnelle des interactions formées par les facteurs de transcription KLF2 et KLF4 avec leur partenaire d'interaction, CBP, pour activer la transcription de gènes spécifiques. Nos analyses ont été faites en utilisant différentes techniques telles que le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la résonance magnétique nucléaire (RMN) ainsi que des expériences de transactivation chez la levure. Notre étude permet une meilleure compréhension des rôles opposés mais complémentaires qu'ont les protéines KLF2 et KLF4 au cours du développement et de la différentiation des lymphocytes B et T en plus de fournir les détails mécanistiques à la base de leurs interactions. Ces informations seront potentiellement utiles pour le développement d'outils à des fins thérapeutiques dans le cadre des leucémies, notamment. / Hematopoietic development is regulated through a combinatorial interplay between lineage-specific activators and the general transcription factors that enables cell-specific patterns of gene expression. In this study, the transcription factors KLF2 and KLF4 play crucial roles in lymphocytes B and T development by activating transcription of specific genes through interactions with the co-activator (CBP). These interactions involve the transactivation domains (TAD) localized in the N-terminal region of KLF2 and KLF4 factors. Previous studies have shown that TADs are also found in the tumor suppressor protein p53 and these TADs are responsible for the interactions between the p53 protein and the coactivator CBP. Recently, several structures of p53TADs in complex with the TAZ2 and KIX domains of CBP have shown that these TADs are acidic and possess a ΦΧΧΦΦ motif crucial for the formation of the interaction. Interestingly, these TADs are similar to the ones found on KLF2 and KLF4. This thesis provides a structural and functional characterization of the interactions formed by the transcription factors KLF2 and KLF4, which have opposing roles, and competes for the same interacting partner CBP to activate transcription. The analysis is done using isothermal titration calorimetry (ITC), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and a yeast activation assay. This study brings a greater understanding on the opposing roles yet complementary of KLF2 and KLF4 proteins involved in B and T lymphocytes specific lineages selection and also provides information for potential therapeutic research regarding disease such as leukemia.

The mechanochemical polycondensation between a diamine and a dialdehyde constitutes a sustainable alternative to classical solvent-based polymerization reactions. This process not only allows for a higher conversion and a shorter reaction time as compared to standard solvent-based syntheses of this conjugated polymer, but the reaction can also be adjusted by the energy introduced via the ball mill.

Le facteur de transcription IIH (TFIIH) joue un rôle crucial dans la transcription et dans la réparation de l’ADN. La sous-unité Tfb1/p62 (levure et humain) de TFIIH interagit avec de nombreux facteurs de transcription (p53, NFκB, TFIIEα) et de réparation (Rad2/XPG and Rad4/XPC) (1). La majorité des interactions avec Tfb1/p62 requiert le domaine d’homologie à la Pleckstrin (PH) localisé dans la région N-terminal de la protéine (2, 3). Ce domaine PH forme des complexes avec des domaines de transactivation acide provenant de protéines cibles impliquées dans la transcription et la réparation de l’ADN. De récentes études ont montré que Tfb1/p62 est une cible pour les protéines virales telles que la protéine VP16 du virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1, la protéine E1 du virus du papillome humain (VPH) et la protéine EBNA-2 du virus Epstein-Barr (EBV) (4, 5). Ces protéines virales interagissent avec la sous-unité Tfb1/p62 par un domaine de transactivation acide suggérant une interaction similaire à ce qui est observé chez les facteurs de transcription humains comme p53. Ce mémoire présente une caractérisation structurelle et fonctionnelle du complexe formé par la protéine virale EBNA2 et la protéine humaine Tfb1/p62. L’analyse est faite en utilisant le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et une expérience de transactivation chez la levure. Cette étude amène une plus grande compréhension des protéines impliquées dans les maladies comme le lymphome de Burkitt et le lymphome de Hodgkin qui sont souvent associées à l’infection à l’EBV (revue dans (6)) et caractérise une cible potentielle pour un antiviral. / The general transcription factor IIH (TFIIH) plays crucial roles in both transcription and DNA repair. Tfb1/p62 (yeast and human), one of the ten/eleven subunits of TFIIH, has been shown to interact with several important transcription (p53, NFκB, TFIIEα) and repair factors (Rad2/XPG and Rad4/XPC) (1). Most of the interactions with Tfb1/p62 require the Pleckstrin homology (PH) domain located at the amino-terminal end of the protein (2, 3). This PH domain in particular forms complexes with highly acidic domains from target proteins involved in both transcriptional activation and DNA repair. Recent studies has shown that the Tfb1/p62 subunit of TFIIH is also targeted by a number of viral proteins including the Herpes Simplex virus (HSV) protein VP16, the Human papillomavirus (HPV) protein HPV E1 and the Epstein-Barr virus (EBV) protein EBNA-2 (4, 5). These viral proteins interact with the Tfb1/p62 subunit via acidic domain which suggests that they are forming similar interactions as the one observed with human transcription and repair factors. This thesis provides a structural and functional characterization of the complex formed by the viral proteins EBNA2 and the human protein Tfb1/p62 subunit of TFIIH. The analysis is done using isothermal titration calorimetry (ITC), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and a yeast activation assay. This study brings a greater understanding of proteins implicated in diseases such as the Burkitt’s lymphoma directly linked to an EBV infection (review in (6)) and shows a viable target for antiviral drug.

Les interactions ARN/ARN de type kissing-loop sont des éléments de structure tertiaire qui jouent souvent des rôles clés chez les ARN, tant au niveau fonctionnel que structural. En effet, ce type d’interaction est crucial pour plusieurs processus dépendant des ARN, notamment pour l’initiation de la traduction, la reconnaissance des ARN antisens et la dimérisation de génome rétroviral. Les interactions kissing-loop sont également importantes pour le repliement des ARN, puisqu’elles permettent d’établir des contacts à longue distance entre différents ARN ou encore entre les domaines éloignés d’un même ARN. Ce type d’interaction stabilise aussi les structures complexes des ARN fonctionnels tels que les ARNt, les riborégulateurs et les ribozymes. Comme d’autres ARN fonctionnels, le ribozyme VS de Neurospora contient une interaction kissing-loop importante. Celle-ci est impliquée dans la reconnaissance du substrat et se forme entre la tige-boucle I (stem-loop I, SLI) du substrat et la tige-boucle V (stem-loop V, SLV) du domaine catalytique. Des études biochimiques ont démontré que l’interaction kissing-loop I/V, dépendante du magnésium, implique trois paires de bases Watson-Crick (W-C). De plus, cette interaction est associée à un réarrangement de la structure du substrat, le faisant passer d’une conformation inactive dite unshifted à une conformation active dite shifted. Les travaux présentés dans cette thèse consistent en une caractérisation structurale et thermodynamique de l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme VS, laquelle est formée de fragments d’ARN représentant les tige-boucles I et V dérivées du ribozyme VS (SLI et SLV). Cette caractérisation a été réalisée principalement par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et par titrage calorimétrique isotherme (isothermal titration calorimetry, ITC) en utilisant différents complexes SLI/SLV dans lesquels l’ARN SLV est commun à tous les complexes, alors que différentes variations de l’ARN SLI ont été utilisées, soit en conformation shiftable ou preshifted. Les données d’ITC ont permis de démontrer qu’en présence d’une concentration saturante de magnésium, l’affinité d’un substrat SLI preshifted pour SLV est extrêmement élevée, rendant cette interaction plus stable que ce qui est prédit pour un duplexe d’ARN équivalent. De plus, l’étude effectuée par ITC montre que des ARN SLI preshifted présentent une meilleure affinité pour SLV que des ARN SLI shiftable, ce qui a permis de calculer le coût énergétique associé au réarrangement de structure du substrat. En plus de confirmer la formation des trois paires de bases W-C prédites à la jonction I/V, les études de RMN ont permis d’obtenir une preuve structurale directe du réarrangement structural des substrats SLI shiftable en présence de magnésium et de l’ARN SLV. La structure RMN d’un complexe SLI/SLV de grande affinité démontre que les boucles terminales de SLI et SLV forment chacune un motif U-turn, ce qui facilite l’appariement W-C intermoléculaire. Plusieurs autres interactions ont été définies à l’interface I/V, notamment des triplets de bases, ainsi que des empilements de bases. Ces interactions contribuent d’ailleurs à la création d’une structure présentant un empilement continu, c’est-à-dire qui se propage du centre de l’interaction jusqu’aux bouts des tiges de SLI et SLV. Ces études de RMN permettent donc de mieux comprendre la stabilité exceptionnelle de l’interaction kissing-loop I/V au niveau structural et mènent à l’élaboration d’un modèle cinétique de l’activation du substrat par le ribozyme VS. En considérant l’ensemble des données d’ITC et de RMN, l’étonnante stabilité de l’interaction I/V s’explique probablement par une combinaison de facteurs, dont les motifs U-turn, la présence d’un nucléotide exclu de la boucle de SLV (U700), la liaison de cations magnésium et l’empilement de bases continu à la jonction I/V. / Kissing loops are tertiary structure elements that often play key roles in functional RNAs. Their formation is central to many RNA-mediated processes, such as translation initiation, antisense recognition and retroviral dimerization. Kissing loops are also involved in RNA folding as they form long-range interactions between different RNAs or remote domains within the same RNA and stabilize the complex architecture of functional RNA, such as tRNA, riboswitch aptamers and ribozymes. Like several other functional RNAs, the Neurospora VS ribozyme contains an important kissing-loop interaction. The substrate recognition by the VS ribozyme depends largely on the formation of a magnesium-dependent kissing-loop interaction between stem-loop V (SLV) of the catalytic domain and stem-loop I (SLI) that defines the substrate domain. It has been shown from biochemical studies that the I/V kissing-loop interaction involves three Watson-Crick base pairs and is associated with a structural rearrangement of the SLI substrate from an unshifted and inactive to a shifted and active conformation. Here, we present a thermodynamic and structural characterization of the VS ribozyme I/V kissing-loop interaction using isolated stem-loop fragments (SLI and SLV). Both isothermal titration calorimetry (ITC) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy studies were conducted with several SLI/SLV complexes using a common SLV, but either shiftable or preshifted SLI variants. From the ITC studies, we show that, under saturating amount of magnesium ions, the affinity of the preshifted SLI variants for SLV is remarkably high, the interaction being more stable than predicted for a comparable duplex. In addition, these ITC studies demonstrate that preshifted SLI variants have higher affinity for SLV than shiftable SLI variants, and these results allow us to evaluate the energetic cost of the conformational shift in SLI. From the NMR studies, we confirm formation of three Watson-Crick base pairs at the kissing-loop junction and provide direct evidence on the structural rearrangement of shiftable SLI variants in the presence of magnesium and SLV. The NMR structure of a high-affinity SLI/SLV complex demonstrates that both the SLI and SLV loops adopt U-turn structures, which facilitate intermolecular Watson-Crick base pairing. Several other interactions at the I/V interface, including base triples and base stacking help create a continuously stacked structure. These NMR studies provide a structural basis for the high stability of the kissing-loop interaction and lead us to propose a kinetic model for substrate activation by the VS ribozyme. Taken together, our ITC and NMR data suggest that the remarkable stability of the I/V interaction is likely provided by a combination of several elements, especially the presence of the U-turn motif, the presence of an extruded nucleotide in SLV (U700), the binding of magnesium ions and the extensive base stacking interactions at the junction.

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase qui fait preuve d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-bisphosphate (FBP), du sorbose-1,6-bisphosphate et du psicose-1,6-bisphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Aldolase de classe I, qui donc catalyse sa réaction en formant un intermédiaire covalent obligatoire, ou base de Schiff, avec son susbtrat, la TBP aldolase de S. pyogenes partage 14 % d’identité avec l’enzyme modèle de cette famille, la FBP aldolase de muscle de mammifère. Bien que le mécanime catalytique de la FBP aldolase des mammifères ait été examiné en détails et qu’il soit approprié d’en tirer des renseignements quant à celui de la TBP aldolase, le manque singulier de stéréospécificité de cette dernière tant dans le sens du clivage que celui de la condensation n’est toujours pas éclairci. Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution des structures de l’enzyme native et mutée, en complexe avec des subtrats et des inhibiteurs compétitifs, à des résolutions comprises entre 1.8 Å et 2.5 Å. Le trempage des cristaux de TBP aldolase native et mutante dans une solution saturante de FBP ou TBP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire covalent lié à la Lys205, la lysine catalytique. La determination des profils pH de la TBP aldolase native et mutée, entreprise afin d'évaluer l’influence du pH sur la réaction de clivage du FBP et TBP et ìdentifier le(s) résidu(s) impliqué(s), en conjonction avec les données structurales apportées par la cristallographie, ont permis d’identifier sans équivoque Glu163 comme résidu responsable du clivage. En effet, le mode de liaison sensiblement différent des ligands utilisés selon la stéréochimie en leur C3 et C4 permet à Glu163, équivalent à Glu187 dans la FBP aldolase de classe I, d’abstraire le proton sur l’hydroxyle du C4 et ainsi d’amorcer le clivage du lien C3-C4. L’étude du mécanimse inverse, celui de la condensation, grâce par exemple à la structure de l’enzyme native en complexe avec ses substrats à trois carbones le DHAP et le G3P, a en outre permis d’identifier un isomérisme du substrat G3P comme possible cause de la synthèse des isomères en C4 par cette enzyme. Ce résultat, ainsi que la decouverte d’un possible isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP, identifié précedemment, permet de cerner presque complètement les particularités du mécanisme de cette enzyme et d’expliquer comment elle est capable de synthétiser les quatres stéréoisomères 3(S/R), 4(S/R). De plus, la résolution de ces structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. Enfin, la résolution de la structure du mutant Lys229→Met de la FBP aldolase de muscle en complexe avec la forme cyclique du FBP, de même que des études cristallographiques sur le mutant équivalent Lys205→Met de la TBP aldolase de S. pyogenes et des expériences de calorimétrie ont permis d’identifier deux résidus particuliers, Ala31 et Asp33 chez la FBP aldolase, comme possible cause de la discrimination de cette enzyme contre les substrats 3(R) et 4(S), et ce par encombrement stérique des substrats cycliques. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières. / Tagatose-1,6-bisphosphate aldolase from Streptococcus pyogenes is a class I aldolase that shows a lack of stereospecificity that is rare in enzymes in general, and in aldolases in particular. This aldolase catalyzes the reversible cleavage of tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), fructose-1,6-bisphosphate (FBP), sorbose-1,6-bisphosphate and psicose-1,6-bisphosphate, four stereoisomers, in dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and glyceraldehyde-3-phosphate (G3P). A class I aldolase, the aldolase TBP S. pyogenes shares 14 % identity with the model enzyme of this family, mammalian FBP aldolase. Although the catalytic mechanism of the class I FBP aldolase has been examined in detail and it is appropriate to infer information as to the class I TBP aldolase, the singular lack of specificity of the latter enzyme both in the direction of cleavage and condensation is still not elucidated. To better comprehend the characteristics of the enzymatic mechanism, a structural study of the TBP aldolase of S. pyogenes, an extremely versatile human pathogen, has been undertaken. It has allowed the resolution of high resolution structures of the native and mutated enzyme in complex with subtrates and competitive inhibitors. These same structures allowed us to gain information as to the active site of the enzyme in general and the catalytic residues in particular. TBP aldolase native and mutated soaked in a saturated solution of FBP or TBP also trapped an iminium intermediate covalenty bound to Lys205, the Schiff base-forming lysine. The determination of the pH profiles of the native and mutated enzyme, carried out to assess the influence of pH on FBP and TBP cleavage and identify the residue(s) involved, in conjunction with the structural data provided by crystallography, identified unequivocally Glu163, corresponding to Glu187 in FBP aldolase, as the residue responsible for substrate cleavage. The substantially different binding mode of the ligands, according to the stereochemistry of their C3 and C4 carbons, indeed allows Glu163 to abstract the proton in C3-OH and thus initiate C3-C4 bond cleavage. The study of the inverse mechanism, the condensation one, using for instance the crystallographic structure of native TBP aldolase in complex with DHAP and G3P, its three carbons substrates, has led us to believe that a possible isomerism of the G3P substrate was the reason for the synthesis of both C4 isomers by this enzyme. This result, as well as the discovery of a possible cis-trans isomerism around the C2-C3 bond of the Schiff base formed with DHAP, identified previously, almost completely elucidated the features of this enzyme`s mechanism. In addition, these structures have highlighted three highly mobile regions of the protein, which may be related to the role of its isozyme in the regulation of gene expression and virulence in S. pyogenes. Lastly, the resolution of the structure of the FBP aldolase mutant Lys229 → Met in complex with the cyclic form of FBP, as well as crystallographic studies of the corresponding mutant in TBP aldolase, Lys205→Met and ITC experiments, allowed the identification of two particular residues, Ala31 and Asp33 in FBP aldolase, as responsible for this enzyme discrimination against 3(R) 4(S) substrates, by steric hindrance of the cyclic substrates. X-ray crystallography, enzyme kinetics and isothermal calorimetry thus enabled advances in the elucidation of the mechanism and structural properties of this enzyme with singular characteristics.