Le glioblastome (GBM) est la tumeur primitive du cerveau la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. Le mauvais pronostic de cette pathologie peut être expliqué par la présence de cellules résistantes aux traitements à l’origine des rechutes appelées cellules souches de glioblastome (CSG). Caractérisées par une plasticité cellulaire, elles sont capables de s’adapter aux environnements défavorables à leur survie. Ainsi, malgré des traitements multimodaux agressifs, les bénéfices de la prise en charge du GBM restent très modestes ; il est donc nécessaire de mieux caractériser ces cellules afin de développer de nouvelles thérapies ciblant les CSG. Le rôle des mécanismes post-transcriptionnels de régulation de l’expression génique dans le maintien des cellules souches cancéreuses a été démontré dans différentes tumeurs. Cependant, peu de protéines de liaison à l'ARN (RBP), régulateurs clés de ces événements, ont été identifiés dans le contexte des CSG. Mon projet de thèse s’inscrit dans le cadre de l’étude de RBP régulant les propriétés d’auto-renouvèlement et de survie des CSG afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes moléculaires qui contribuent à la formation ou récurrence des GBM. Dans un premier temps, j’ai cherché à définir un protocole permettant d’enrichir la population de CSG maintenues en conditions de culture non-adhérentes qui favorisent la formation de neurosphères et le maintien d’une hiérarchie cellulaire. Confrontée à une forte hétérogénéité de signatures moléculaires, j’ai choisi de prendre cette caractéristique en compte dans un second temps en menant une étude comparative du transcriptome de 5 modèles de cellules souches de glioblastome provenant de patients différents. Cette analyse inclut également des cellules différenciées in vitro à partir des CSG ainsi que des cellules souches neurales humaines. Grâce à une approche de séquençage de leur transcriptome, mes travaux de thèse ont permis d’identifier une famille de régulateurs post-transcriptionnels enrichis dans les CSG, les protéines nELAVL. Ces résultats ont pu être confirmés par l’analyse de leur expression protéique dans des modèles in vitro et dans des coupes de tumeurs provenant de différents patients atteints de GBM. Une co-expression des protéines nELAVL avec OLIG2 ou SOX2 a été observée confirmant ainsi leur association avec l’état souche. ELAVL4 correspond au membre de la famille nELAVL le plus réprimé lors de la différenciation des CSG. Des outils de modulation de son expression ont été développé en vue d’évaluer son rôle dans les CSG par des approches de perte d’expression ou de gain de fonction / Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive primary adult brain tumor. GBM dismal prognosis can be explained by the presence of treatment resistant cells responsible for tumor relapse known as glioblastoma stem cells (GSC). Characterized by cellular plasticity, they are able to adapt to hostile environments. Thus, despite aggressive multimodal treatments, GBM curative therapies have provided only a modest benefit; it is therefore necessary to better characterize these cells in order to develop new GSC targeted therapies. The role of posttranscriptional mechanisms of gene expression regulation in the maintenance of cancer stem cells has been demonstrated in different tumors. However, few RNA-binding proteins (RBPs), key regulators of these events, have been identified in GSC. My thesis project consists in identifying RBP that are critical for self-renewal and increased survival properties of GSC. The aim of this study is to deepen our knowledge of the underlying molecular mechanisms of GBM development or recurrence. At first, I established a protocol to enrich for GSC using nonadherent culture conditions that promote the formation of neurospheres comprising a cellular hierarchy. I chose to take into account the facing problem of GSC molecular heterogeneity in a second step and carried out a comparative study of the transcriptome of 5 glioblastoma stem cell cultures from different patients. This analysis also includes in vitro differentiated cells originating from GSC as well as human neural stem cells. Using a transcriptome sequencing approach, my thesis work has led to the identification of a family of post-transcriptional regulators enriched in GSC, nELAVL proteins. These results were confirmed by protein expression analysis in in vitro neurospheres and within tumor sections from different GBM patients. Co-expression of nELAVL proteins with OLIG2 or SOX2 was observed thus confirming their association with stemness. ELAVL4 repesents the most differentially expressed member of nELAVL family upon GSC differentiation. Knock-down and gain-offunction tools targeting ELAVL4 have been developed to further assess its roles in GSC maintenance

Numerous initiatives to improve our understanding of cancer biology have been lunched in different laboratories that aim to describe the interactome and gene-expression profile in different tumour cell line. It is now clear that the different strategies of cell migration observed in cancer are reminiscent of the different migratory strategies observed during embryo development. These similarities suggest that developmental program that has to be kept off after embryogenesis may be induced by spontaneous genetics modifications that produce tumour cells. In this study we went inside the genetic network/profile that controls how neural crest cells eventually switch on the migration program and how they are able to arise into different lines with the propose of getting new ideas on how to prevent dissemination of tumour cells or how to treat advanced tumour that have already spread. Neural progenitors of the dorsal neural tube that acquire the expression of specific neural crest determinants, delaminate from the neural tube and follow precise migratory pathways, to terminally differentiate into the various neural crest derivatives. Here we developed a novel resource for lineage trace and isolation of neural crest cells that allowed for a genome-wide expression screen in pre-migratory and migratory neural crest progenitors. We efficiently identified previously known neural crest specific genes. Expression profiling revealed new neural crest genes belonging to a wide range of cellular functions, with high representation of genes associated to cell motion. Additionally, we identified chick genes for which the human orthologues and/or paralogues are associated to Neuroblastoma formation. In my thesis we identified new genes specifically expressed in the developing neural crest, and proposed a revised genomic signature for the normal neural crest cells. Furthermore, mutations on some of these genes are markers for Neuroblastoma tumour formation. Thus we propose this as a valid screen to identify candidates genes that contribute to the characterization of the Neuroblastoma cancer stem cells, and thus to the identification of specific targets to design new therapeutic strategies. Getting in more detail into this genetic network, Wnt canonical signalling response has to been shown to be a key event in both cancer and neural crest cell development. Traditionally Wnt canonical pathway has been involved in neural crest induction process, but here we demonstrated that it is also critical for the onset migration of the neural crest cell. In fact, high levels of Wnt canonical activity prevents neural crest cell to delaminate and only through the inhibition of this activity mediate by dapper protein, neural crest cells can undergo into their normal migration pathways. If this process has an implication in cancer is still unknown, but Dapper expression proteins have been already associated to different types of cancer.

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et létale chez l’adulte. Malgré les avancés fulgurantes dans la dernière décennie au niveau des thérapies contre le cancer, le pronostique reste inchangé. Le manque de spécificité des traitements est la cause première de la récurrence de cette tumeur. Une meilleure compréhension au niveau des mécanismes moléculaires et biologiques de cette tumeur est impérative. La découverte des cellules souches cancéreuses (CD133+) au niveau du GBM offre une nouvelle opportunité thérapeutique contre cette tumeur. Effectivement, les cellules CD133+ seraient responsables de l’établissement, le maintien et la progression du GBM. De plus, elles sont également la cause de la résistance du GBM faces aux traitements de radiothérapies. Ces cellules représentent une cible de choix dans le but d’éradiquer le GBM. L’oncogène BMI1 a été associé à plusieurs types de tumeurs et est également essentielle au maintien de différentes populations de cellules souches normales et cancéreuses. Une forte expression de BMI1 est observée au niveau du GBM et plus précisément, un enrichissement préférentiel de cette protéine est noté au niveau des cellules CD133+. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer le rôle potentiel de BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses (CSC), CD133+ du GBM. La fonction principale de BMI1 est la régulation négative du locus INK4A/ARF. Ce locus est impliqué dans l’activation de deux voies majeurs anti-tumorales : P53 et RB. Or, la perte de BMI1 induit in vitro une diminution des capacités prolifératives, une augmentation de la différentiation et de l’apoptose, ainsi qu’une augmentation de la radiosensibilité des CSC du GBM indépendamment de la présence du locus INK4A/ARF. Effectivement, deux tumeurs sur trois possèdent une délétion de ce locus, ce qui suggère que BMI1 possède d’autre(s) cible(s) transcriptionnelle(s). Parmi ces nouvelles cibles ont retrouve la protéine P21, un régulateur négatif du cycle cellulaire. De plus, la perte de BMI1 inhibe l’établissement d’une tumeur cérébrale lors d’études de xénogreffe chez la souris NOD/SCID. Également, une nouvelle fonction de BMI1 indépendante de son activité transcriptionnel a été démontrée. Effectivement, suite à l’induction d’un bris double brin (BDB) de l’ADN, BMI1 est rapidement recruté au niveau de la lésion et influence le recrutement des protéines de reconnaissance du dommage à l’ADN. La perte de BMI1 mène à un défaut au niveau de la reconnaissance et la réparation de l’ADN, alors que sa surexpression induit plutôt une augmentation de ces mécanismes et procure une radiorésistance. Ces résultats décrivent pour la première fois l’importance de BMI1 au niveau du maintien, de l’auto-renouvellement et la radiorésistance des CSC du GBM. Ainsi, ces travaux démontrent que la protéine BMI1 représente une cible thérapeutique de choix dans le but d’éradiquer le GBM, une tumeur cérébrale létale. / Glioblastoma multiform (GBM) is the most common and lethal primary brain tumor found in adults. Despite the advances made in the field of cancer therapy in the last decade, the median survival rate remains less than a year. Therefore, a better understanding of the molecular biology of GBM will reveal the mechanisms responsible for the initiation and progression of the tumor, and allow the development of new therapeutic strategies. GBM contains a minority cell population, characterized by tumor initiating cells expressing the stem cell marker, CD133. The CD133+ GBM cells are responsible for tumor initiation, maintenance, progression and resistance to chemo/radiotherapy. The CD133+ cells represent a valuable and specific therapeutic target against GBM. The Polycomb (PcG) group family of transcriptional repressors have been involved in a vast range of cancers. The PcG protein and oncogene BMI1 is the best-characterized PcG protein. The implication of BMI1 in normal and cancer stem cell survival, self-renewal and maintenance has been thoroughly investigated. BMI1 is highly expressed in GBM and more precisely; it is enriched specifically in CD133+ cell populations. The main goal of this thesis was to elucidate the potential role of BMI1 in GBM CD133 + cancer stem cell (CSC) maintenance and radioresistance. The main function of BMI1 is to repress the expression of the genes encoded by the INK4A/ARF locus, which is implicated in the activation of two major tumor suppressor pathways, P53 and RB. However, BMI1 depletion in vitro induces a reduction in proliferation potential, as well as an increase in differentiation, apoptosis, and radiosensitivity regardless of INK4A/ARF status. Indeed, two-thirds of all tumors posses a deletion of this locus, suggesting that BMI1 regulates other targets. P21, a cell cycle regulator, was identified as a new BMI1 target. Moreover, we have observed that the loss of BMI1 inhibits the establishment of a cerebral tumor in a xenograft mouse model. In addition to transcription related activity, we identified a new transcription independent function of BMI1. After the induction of a DNA double-strand-break, BMI1 is rapidly recruited to the damage site and influences the recruitment of DNA damage response proteins. Furthermore, defects in DNA damage recognition and repair are observed after BMI1 knockdown. Consistent with these results, BMI1 overexpression induces DNA damage response and increases radioresistance potential. These results emphasize for the first time the requirement of BMI1 for the maintenance, self-renewal, and radioresistance in GBM CSC, thus providing a potential target for future therapeutic strategies against GBM.

Tumors exhibit complex organization and contain a variety of cell populations. The realization that the regenerative properties of a tumor may be largely confined to a cell subpopulation (cancer stem cell) is driving a new era of anti-cancer research. Cancer stem cells from Glioblastoma Multiforme tumors express markers that are also expressed in non-cancerous neural stem cells, including nestin and Sox2. We previously showed that the transcription factor Hes3 is a marker of neural stem cells, and that its expression is inhibited by JAK activity. Here we show that Hes3 is also expressed in cultures from glioblastoma multiforme which express neural stem cell markers, can differentiate into neurons and glia, and can recapitulate the tumor of origin when transplanted into immunocompromised mice. Similar to observations in neural stem cells, JAK inhibits Hes3 expression. Hes3 RNA interference reduces the number of cultured glioblastoma cells suggesting a novel therapeutic strategy.

Τα αστροκυττώματα αποτελούν το συχνότερο τύπο πρωτοπαθών όγκων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και παραδοσιακά θεωρούνται ότι σχετίζονται με ιδιαίτερα δυσμενή πρόγνωση. Η Συστημική προσέγγιση της καρκινογένεσης, εστιάζοντας στην αποκρυπτογράφηση του τρόπου λειτουργίας και δυναμικής αλληλεπίδρασης πολύπλοκων παθοβιολογικών δικτύων, προσφέρει σήμερα καινούριες ερευνητικές προοπτικές και πιθανές εναλλακτικές, περισσότερο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές. Οι οιστρογονικοί υποδοχείς και οι συν – ρυθμιστές της μεταγραφής συνιστούν κομβικά σημεία “συνομιλίας” (cross – talk) πολύπλοκων μοριακών οδών του κυττάρου, διαμεσολαβώντας πλήθος κυτταρικών λειτουργιών φυσιολογικά αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις, ανάμεσα στις οποίες και ο καρκίνος. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2 θεωρούνται μόρια κλειδιά του ρυθμιστικού μεταγραφικού κυκλώματος που χαρακτηρίζει το stemness. Η αποσαφήνιση της συμπεριφοράς του συγκεκριμένου αυτού δικτύου στα διάφορα νεοπλάσματα και ρόλος του σε σχέση με την απόκτηση ιδιότητας καρκινικού stem κυττάρου, θεωρείται καθοριστικής σημασίας στην προσπάθεια ερμηνείας του φαινομένου του καρκίνου ως πολύπλοκο προσαρμόσιμο σύστημα, που θα αναδείξει εναλλακτικούς θεραπευτικούς στόχους και θα επιτρέψει περισσότερο αποτελεσματικές σε σχέση με τις υπάρχουσες παρεμβάσεις. Σκοπός. Υπό το πρίσμα της Συστημικής προσέγγισης της κατανόησης της κακοήθους ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, η παρούσα μελέτη διερεύνησε τα επίπεδα έκφρασης του Οιστρογονικού υποδοχέα β (ERβ), και των συν – ρυθμιστών AIB1, TIF2 and PELP1, όπως και την έκφραση των παραγόντων EZH2 και SOX2 σε αστροκυττώματα grade II ως IV και τη συσχέτιση μεταξύ του προφίλ έκφρασης των συγκεκριμένων παραγόντων, με κλινικοπαθολογικά δεδομένα. Υλικό και μέθοδος. Η έκφραση των πρωτεϊνών ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 και SOX2 εκτιμήθηκε σε 86 περιπτώσεις αστροκυτταρικών όγκων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Είκοσι grade II αστροκυττώματα, 22 grade III αναπλαστικά αστροκυττώματα και 46 grade IV πλειόμορφα γλοιοβλαστώματα (GBM) συμπεριλήφθησαν στη συγκεκριμένη μελέτη. Η μέθοδος με χρήση συστήματος ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, CA, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των ERβ (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) και SOX2 (R&D Systems, Inc.) χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση. Αντιπροσωπευτικές περιοχές επιλέχθηκαν κατόπιν σάρωσης του πλακιδίου σε οπτικό πεδίο μικρής μεγέθυνσης (Χ100), ενώ η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Σημαντική μείωση των επιπέδων του ERβ παρατηρήθηκε παράλληλα με την αύξηση του grade. Επιπλέον, η υψηλή ERβ έκφραση αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος θετικός προγνωστικός παράγοντας της συνολικής επιβίωσης κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση. Η έκφραση των AIB1, TIF2 και PELP1, δε συσχετίσθηκε με αυτή του ERβ, και ακολούθησε αντιστρόφως ανοδική τάση, παράλληλα με την αύξηση του grade. Η στατιστική ανάλυση περαιτέρω, ανέδειξε μία σημαντική αύξηση τόσο των επιπέδων EZH2 όσο και SOX2 στα grade III και IV σε σχέση με τα grade II αστροκυττώματα. Ισχυρή συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση των δύο δεικτών σε όλες τις κατά grade υποομάδες. Η Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε ότι, η υψηλή EZH2 και SOX2 πρωτεϊνική έκφραση συνιστούν αρνητικό παράγοντα πρόγνωσης τόσο στο σύνολο των ασθενών όσο και κατόπιν διαστρωμάτωσης κατά grade. Τέλος, η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση συνυπολογίζοντας την ηλικία, το φύλο, το grade και την έκφραση των δύο πρωτεϊνών έδειξε ότι μόνο η υψηλή EZH2 έκφραση μαζί με το υψηλό grade, αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες δυσμενούς πρόγνωσης. Συμπεράσματα. Οι παράγοντες ERβ, AIB1, TIF2 και PELP1 ενέχονται στους παθογενετικούς μηχανισμούς ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, με τον ERβ να διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο και τους AIB1, TIF2 και PELP1 να εμφανίζουν ογκο – προαγωγό δράση. Το ογκογενετικό δυναμικό των παραγόντων AIB1, TIF2 και PELP1 φαίνεται πως διαμεσολαβείται μέσω ανεξάρτητων του οιστρογονικού υποδοχέα μηχανισμών. Η έκφραση του ERβ, διαχωρίζοντας κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς ιδίου grade, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο κατά τη λήψη εξατομικευμένων κλινικών αποφάσεων. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων σε αστροκυτταρικούς όγκους, να βοηθήσουν τη βελτιστοποίηση τόσο διαγνωστικών όσο και προγνωστικών διαδικασιών στην κλινική πράξη, και να κατευθύνουν την ανάπτυξη εξατομικευμένων στρατηγικών θεραπείας. / Astrocytic tumors are the most common primary neoplasms of the central nervous system (CNS) and have traditionally been associated with disappointing clinical outcomes. The current challenge is to develop more efficacious and targeted therapeutic paradigms, exploiting the knowledge derived from the systems approach of understanding the complex networks underlying tumor formation and progression. Estrogen receptor beta (ERβ) and co-regulators of transcription AIB1, TIF2 and PELP1, are key components of complex cellular networks and integrate diverse signaling afferents with transcription programs controlling various physiological cellular processes and a variety of disease states including cancer. SOX2 and EZH2 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Elucidating the behavior of this particular network in cancer and its role in the formation of putative cancer stem cells is considered essential for the understanding of cancer as an adaptive complex system and subsequently allowing the discovery of more successful therapeutic designs. Purpose. In the context of the systems approach of comprehending tumorigenesis in astrocytomas, we sought to investigate the expression of ERβ and co – regulatory proteins AIB1, TIF1 and PELP1, as well as parallel expression of SOX2 and EZH2 in astrocytomas of various grades, and correlate the protein expression profiles with clinicopathological parameters and patients’ prognosis. Materials and methods. Expression of ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 and SOX2 was evaluated in 86 cases of astrocytic tumors, using Immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Twenty grade II astrocytomas, 22 grade III anaplastic astrocytomas and 46 grade IV glioblastomas multiforme (GBM) were included in this study. Polymer based technique (Envision, Dako, CA, USA) or MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) and primary antibodies against ERβ1 (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) and SOX2 (R&D Systems, Inc.) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Representative areas were selected at low power (x100) magnification. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. ERβ levels were significantly decreased with the progression of tumors’ grade. High expression of ERβ was an independent favorable prognostic factor on multivariate analysis. Expression of AIB1, TIF2 and PELP1, was not correlated to ERβ expression and followed an opposite trend, with increasing levels in grade III and IV relative to grade II tumors. Univariate survival analysis revealed that high AIB1, TIF2 and PELP1 expression was associated with worse prognosis. Statistical analysis further revealed significantly higher expression of EZH2 and SOX2 in high grade III and IV astrocytomas, compared to low grade II astrocytomas. Strong correlation between EZH2 and SOX2 was also detected within all subgroups according to grade. Kaplan-Meier showed that EZH2 and SOX2 high expression was predictive of worse overall survival in the whole cohort as well as after subgroup analysis by grade. Finally, multivariate Cox analysis that included age, gender, grade, and expression of both proteins, revealed that high EZH2 together with higher grade were strong negative prognostic factors. Conclusions. ERβ, AIB1, TIF2 and PELP1 appear to play an important role in the pathogenesis of astrocytic tumors, with ERβ exhibiting a protective effect, whereas AIB1, TIF2 and PELP1 facilitate malignant progression. AIB1, TIF2 και PELP1 contribution in tumor progression is speculated to be achieved through ERβ independent pathways. Moreover, the expression status of ERβ, by distinguish patient subpopulations with different prognosis within the same grade, could be a useful tool accommodating personalized clinical decision-making. EZH2 and SOX2 may serve as potential cancer stem cell markers in astrocytomas and as such help optimizing diagnostic and prognostic assessments and devising novel individually tailored treatment strategies.

Ce travail poursuit l’exploration du potentiel thérapeutique de peptides antagonistes des domaines transmembranaires (TM) de récepteurs impliqués dans la croissance tumorale. J’ai montré l’effet anti-angiogénique de MTP-NRP1, un peptide ciblant le récepteur Neuropline-1 et confirmé sa capacité d’inhibition de prolifération, migration et de croissance d’une lignée de glioblastome (GBM) humain. J’ai ensuite démontré que le récepteur Plexine-A1 est corrélé à l’agressivité des gliomes et semble être un marqueur pronostique négatif de la survie des patients atteints de GBM. J’ai démontré le rôle du segment TM de PlexA1 dans ses interactions. Le peptide MTP-PlexA1, inhibe la signalisation et la formation du complexe NRP1-PlexA1, réduit la prolifération et la migration des cellules de GBM, impacte la croissance tumorale in vivo y compris de cellules souches tumorales. J’ai décrit le rôle pro-angiogénique de PlexA1 par des tests d’angiogenèse et de CAM où MTP-PlexA1 bloque cette fonction. / This thesis work continues the exploration of the therapeutic potential using peptides targeting transmembrane (TM) domains of receptors involved in tumor growth. I showed the anti-angiogenic effect of MTP-NRP1, a peptide targeting Neuropilin-1 and confirmed its capability to impact proliferation, migration and in vivo growth of a human glioblastoma (GBM) cell line. Then, I demonstrated that the expression of Plexin-A1 is correlated with glioma aggressiveness and seems to be a bad prognosis marker for GBM patients. We described the importance of PlexA1 TM domain in the control of their interactions. The peptide MTP-PlexA1 inhibits complex formation and signaling of NRP1-PlexA1, impacts tumor growth in vivo and cancer stem cells engrafting and development. I demonstrated the pro-angiogenic role of PlexA1 with in vitro angiogenesis assays and CAM assay in which MTP-PlexA1 is able to block this function.

Le glioblastome (GBM), tumeur de plus haut grade du système nerveux central (OMS grade 4) a un pronostic très sombre, quelque soit le traitement, lié à une résistance à l’apoptose. L’erlotinib (Tarceva®, OSI 774) est un inhibiteur de la tyrosine kinase du récepteur au facteur de croissance épithélial (EGFR). L’hyper-expression et l’amplification du gène de l’EGFR dans 40 à 60% des GBM, fourni un rationnel pour utiliser l’erlotinib. Nous avons montré sur U87-MG et DBTRG-05MG, deux lignées de GBM, l’absence d’apoptose avec l’erlotinib, liée soit à un déficit en pro-caspase 3, soit à une accumulation d’αB-crystalline bloquant l’activation de la caspase-3. L’absence d’apoptose dévie alors la cellule vers l’autophagie. L’inhibition de l’autophagie par ARN interférents ou par la chloroquine permet d’obtenir une synergie avec l’erlotinib en induisant la mort des cellules tumorales à des doses acceptables.Les GBM ont composition cellulaire hétérogène, avec un petit nombre d’éléments appelés cellules souches cancéreuses (CSC). Douées d’auto-renouvellement, elles participent à la propagation tumorale et à la résistance aux traitements. Nous avons testé l’erlotinib sur trois lignées issues de GBM humains, ayant deux modes de croissance distincts selon les conditions de milieu: en neurosphères (NS) et de type adhérent. Erlotinib a un effet inhibiteur minime sur les trois lignées adhérentes, alors que l’effet est significatif sur les lignées NS, traduisant l’importance de la voie d’EGFR pour les NS. Dans les lignées en NS, l’erlotinib est efficace sur les cellules progénitrices, mais n’a pas d’action ni sur les cellules initiatrices de NS, ni sur les cellules différenciées. L’auto-renouvellement des NS n’est pas non plus altéré. L’association cyclopamine, inhibiteur pharmacologique de la voie de Hedgehog, -erlotinib est synergique en bloquant la croissance et l’initiation des NS, laissant présager une efficacité sur les CSC. Les résultats obtenus sur ces différents modèles permettent d’une part de préciser certains mécanismes de résistance des cellules de GBM, et aussi d’orienter les indications et le choix des traitements susceptibles d’être les plus efficaces. / Glioblastoma (GBM) is the most common primary central nervous system tumor in adults and the prognosis remains dismal, any treatment used. Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is amplified, overexpressed, and/or mutated in GBM, making it a rational for therapy. Erlotinib, an EGFR kinase inhibitor is strongly associated with clinical response in several cancers. We showed for U87-MG and DBTRG-05MG, two human GBM cell lines, that erlotinib can’t trigger apoptosis, related either to accumulation of αB-crystallin capable to impair caspase 3 cleavage, or to constitutive deficit for procaspase 3 in DBTRG-05MG. Apoptosis deficit switches the cell to autophagic process. Inhibition of autophagy with RNA interference or chloroquine resulted in sensitization of U87 and allowed a synergistic effect with erlotinib at therapeutic doses.Moreover, GBM showed a heterogeneous cell composition with cancer stem cells, progenitors and more differentiated cells. In this study, we test erlotinib in vitro on other GBM models: three cell lines established from surgically resected GBM specimens, grown along two features adherent and neurospheres. On the three differentiated adhering cell lines, erlotinib had only a moderate activity. Conversely, on neurosphere forming cell lines, erlotinib induced a strong inhibition of cell growth related to the EGFR amplification and EGFR expression. A short erlotinib exposure induced cell death primarily in nestin-positive cells; however it was found without effect on neurosphere initiating activity and self renewal. These results suggest that EGFR pathway activation is essential for the proliferation of GBM progenitor cells but dispensable for stem-like cancer cells self–renewal. As Hedgehog pathway is known to be activated in neural stem cells, we assayed the Hedgehog pathway inhibitor cyclopamine in association with erlotinib. While each drug separately was without effect on sphere initiation, their combination led to a 25 fold decrease in the sphere number (p=0.0004).These in vitro models are convenient to investigate resistance mechanisms in GBM. Furthermore, they focus on the necessity to exploit drug combinations for greatest efficiency.

Les cancers des voies aéro-digestives supérieures (VADS) sont des cancers de mauvais pronostic avec 50% de rechute des patients dans les deux ans qui suivent leur traitement. La surexpression des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 est un des marqueurs corrélés avec la résistance aux divers traitements. L’objectif de ce travail a été d’évaluer l’efficacité d’une approche thérapeutique associant l’irradiation à un inhibiteur des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, l’ABT-737 (Laboratoires Abbott), ceci à la fois sur des lignées issues de cancers de VADS, mais également sur une sous-population de cellules souches cancéreuses (CSC).La première partie de ce travail a démontré que cette association thérapeutique provoque une radio-sensibilisation des lignées cellulaires étudiées in vitro, avec augmentation de la mort cellulaire par apoptose. Cet effet synergique fait intervenir la mitochondrie, module le métabolisme des céramides et modifie l’expression de certaines protéines de la famille Bcl-2 dont l’équilibre est déterminant dans la destinée de la cellule cancéreuse. De plus, le traitement par l’ABT-737 permet de ralentir très sensiblement la croissance tumorale après irradiation sur un modèle in vivo.La deuxième partie de ce travail a permis de révéler une efficacité cytotoxique encore plus importante de l’ABT-737 sur une sous-population de CSC, résistante à l’apoptose, proliférante et tumorigène, dont le rôle dans la résistance aux divers traitements fait l’objet de nombreux travaux. A cette efficacité cytotoxique s’ajoute une diminution de la migration et de l’invasion des CSC, effet très prometteur dans la lutte contre la récidive locale et la dissémination métastatique, caractéristiques des cancers de VADS de haut grade / Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) are frequently characterized by chemotherapy and radiation resistance and 5-year survival rates have lingered around 50% for several decades. The frequent resistance of HNSCC is due, in large part, to aberrant inhibition of apoptosis and overexpression of antiapoptotic members of the Bcl-2 protein family. The aim of this study was to examine, in association with radiation, the impact of ABT-737, a potent small-molecule inhibitor of Bcl-XL and Bcl-2, on HNSCC cells and cancer stem cells (CSC).The first part of our work demonstrated that ABT-737 strongly synergized with radiotherapy to promote HNSCC cell death and loss of clonogenic survival. This effect involves mitochondrial damage, modulates ceramide metabolism and modify the expression of some proteins of the Bcl-2 family whose interactions with other family members determine cell fate. Moreover, we found that this combination is able to significantly slow tumor growth.The second part of our work revealed that ABT-737, even without radiation, had a preferential cytotoxic activity in vitro towards CSC. Thus, as CSC have a greater capacity for tumor relapse, increased motility and invasiveness, our data suggest that ABT-737 could effectively complement a first line of therapy with chemotherapy or radiotherapy in order to target residual quiescent HNSCC CSC

Tumors exhibit complex organization and contain a variety of cell populations. The realization that the regenerative properties of a tumor may be largely confined to a cell subpopulation (cancer stem cell) is driving a new era of anti-cancer research. Cancer stem cells from Glioblastoma Multiforme tumors express markers that are also expressed in non-cancerous neural stem cells, including nestin and Sox2. We previously showed that the transcription factor Hes3 is a marker of neural stem cells, and that its expression is inhibited by JAK activity. Here we show that Hes3 is also expressed in cultures from glioblastoma multiforme which express neural stem cell markers, can differentiate into neurons and glia, and can recapitulate the tumor of origin when transplanted into immunocompromised mice. Similar to observations in neural stem cells, JAK inhibits Hes3 expression. Hes3 RNA interference reduces the number of cultured glioblastoma cells suggesting a novel therapeutic strategy.

L’hadronthérapie par ions carbone est une alternative à la radiothérapie photonique dans le traitement des cancers des VADS, en raison d’une balistique précise et d’une efficacité biologique élevée, y compris au sein des zones tumorales hypoxiques. Ces cancers sont de mauvais pronostic en raison d’un risque élevé de récidives liées à la présence de cellules souches cancéreuses (CSCs). L’objectif de ce travail était de déterminer les spécificités moléculaires de la réponse aux ions carbone par rapport aux photons dans deux lignées cellulaires de cancer des VADS et leur sous-population CSCs en hypoxie et normoxie. Il s’est focalisé sur le rôle de la protéine HIF-1α dans la survie cellulaire, dans la mesure où l’hypoxie favorise sa stabilisation mais également la radiorésistance; sur la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la détection-réparation des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN. HIF-1α est stabilisée plus précocement dans les CSCs par rapport aux non-CSCs. Son activation, tout comme celle des voies de l’EMT (STAT3, MEK/p38/JNK et Akt/mTOR) est dépendante des radicaux libres oxygénés (RLO), dont la production est homogène dans la cellule en réponse aux photons. Par contre, les RLO produits dans la trace des ions carbone ne permettent pas d’activer HIF-1α et les voies de l’EMT. Sous hypoxie, une relation a été établie entre l’activation d’HIF-1α et celles des voies de détection (ATM) et de réparation (Rad51) des CDBs (Recombinaison Homologue). Ces travaux démontrent que l’avantage thérapeutique des ions carbone repose sur la répartition spatiale des RLO à l’échelle nanométrique et consécutivement sur la non-activation de voies clés de la défense cellulaire tumorale / Hadrontherapy using carbon ions is an alternative to photon irradiation in the treatment of Head and Neck cancers, because of accurate ballistics and high biological efficiency, including hypoxic tumor areas. These cancers are of poor prognosis because of a high risk of recurrences related to the presence of cancer stem cells (CSCs).The aim of this work was to determine the molecular specificities of the response to carbon ion irradiations compared to photons in two cancer cell lines and their CSCs’ subpopulation, in hypoxic and normoxic conditions. This work focused on the role of the HIF-1α protein in cell survival, since hypoxia promotes its stabilization, but also in the radioresistance; the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and the detection and repair of DNA double-strand breaks (DSBs). HIF-1α is stabilized earlier in CSCs compared to non-CSCs. Its activation, as well as the EMT pathways (STAT3, MEK/p38/JNK and Akt/mTOR), are dependent on reactive oxygen species (ROS), whose production is homogeneous in response to photons. At the opposite, the ROS produced in the carbon ion tracks are insufficient to activate HIF-1α and the upstream EMT pathways. Under hypoxic conditions, a relationship has been established between HIF-1α activation and that of the DSBs detection (ATM) and repair (Rad51) pathways (Homologous Recombination). These studies demonstrate that the therapeutic advantage of carbon ions is based on the spatial ROS distribution at the nanoscale and consequently on the non-activation of key pathways involved in tumor cell defense