La division cellulaire est un processus biologique universel nécessaire à la reproduction, au développement, à la survie cellulaire ainsi qu’à la réparation des tissus. Une ségrégation chromosomique exacte pendant la mitose est essentielle pour une répartition égale des chromosomes répliqués entre les cellules filles. Des erreurs dans la ségrégation des chromosomes mènent à une condition appelée aneuploïdie, définie par un nombre inadéquat de chromosomes dans une cellule. L’aneuploïdie est associée à une altération de la santé cellulaire, la tumorigénèse, des malformations congénitales et l'infertilité. Contre toute attente, les embryons préimplantatoires de mammifères, dont les humains, consistent souvent en un mélange de cellules euploïdes et de cellules aneuploïdes. Ce mosaïcisme est inexorablement causé par des erreurs dans la ségrégation des chromosomes au cours des divisions mitotiques suivant la fécondation et est associé à un potentiel de développement réduit lors des traitements de fertilité. Malgré sa découverte il y a 25 ans, les mécanismes qui sous-tendent l’apparition de l'aneuploïdie mosaïque dans les embryons préimplantatoires sont toujours méconnus. Pour explorer les causes et les conséquences des erreurs de ségrégation chromosomique, des approches d'imagerie de fine pointe ont été utilisées sur des embryons préimplantatoires murins. L'analyse de la dynamique de la ségrégation des chromosomes via l’imagerie de cellules vivantes a permis d’identifier les chromosomes retardataires, lors de l’anaphase, comme la forme la plus répandue des erreurs de ségrégation. Ces chromosomes retardataires entraînent fréquemment une encapsulation de chromosome unique dans une structure appelée micronoyau. D'autres expériences d'imagerie par immunofluorescence sur des cellules vivantes ou fixées ont révélé que les chromosomes des micronoyaux subissent des dommages importants à l'ADN et sont mal répartis de manière récurrente lors des divisions cellulaires subséquentes dans la phase préimplantatoire. D’autres approches ont aussi permis d’examiner l'efficacité du mécanisme de contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique, (SAC pour Spindle Assembly Checkpoint). Les résultats obtenus attestent que le SAC fonctionne, cependant la signalisation liée au SAC n’est pas efficace et ne permet pas de différer l'anaphase, malgré la présence de chromosomes retardataires et ce indépendamment de la taille des cellules. Les résultats présentés révèlent aussi qu’une inhibition partielle d’une cible du SAC, le complexe de promotion de l'anaphase (APC/C), cause une mitose prolongée et une réduction des erreurs de ségrégation. En outre, les études présentées démontrent que la fonction déficiente du SAC pendant le développement préimplantatoire est la cause principale d’une forte incidence de chromosomes retardataires qui entraînent une mauvaise ségrégation chromosomique répétée et qui causent une aneuploïdie mosaïque dans l’embryon. De plus, ce travail fournit la preuve que la modulation pharmacologique de la signalisation SAC-APC/C permet d’éviter les erreurs de ségrégation des chromosomes dans les embryons précoces. En conclusion, ces résultats apportent de nouvelles perspectives sur les causes et la nature des erreurs de ségrégation chromosomique dans les embryons. De plus, ce travail apporte de nouvelles explications mécanistiques sur l'apparition du mosaïcisme dans les embryons ce qui aura des implications importantes dans la détection et la prévention thérapeutique potentielle de l'aneuploïdie mosaïque dans les embryons préimplantatoires. / Cell division is a universal biological process necessary for reproduction, development, cell survival and the maintenance and repair of tissues. Accurate chromosome segregation during mitosis is essential to ensure replicated chromosomes are partitioned equally into daughter cells. Errors in chromosome segregation often result in cells with abnormal numbers of chromosomes, a condition termed aneuploidy, which is associated with impaired cellular health, tumorigenesis, congenital defects and infertility. Counterintuitively, preimplantation embryos from many mammalian species, including humans, often consist of a mixture euploid and aneuploid cells. Such mosaic aneuploidy in embryos is inexorably caused by errors in chromosome segregation during mitotic divisions following fertilization and has been associated with reduced developmental potential in fertility treatments. However, ever since its discovery 25 years ago, how and why mosaic aneuploidy arises in the preimplantation embryo has remained elusive. To explore the causes and consequences of embryonic chromosome segregation errors, advanced imaging approaches were employed in the mouse preimplantation embryo. Live cell imaging analysis of chromosome segregation dynamics identified lagging anaphase chromosomes as the most prevalent form of chromosome mis-segregation in embryos. Lagging chromosomes frequently result in the encapsulation of single chromosomes into micronuclei, which occur in embryos in vitro and in vivo. Further live imaging and immunofluorescence experiments revealed chromosomes within micronuclei are subject to extensive DNA damage and centromeric identity loss, failing to assemble functional kinetochores and being recurrently mis-segregated during ensuing cell divisions in preimplantation development. To uncover the underlying causes for the increased propensity for chromosome mis-segregation in embryos, live imaging and loss-of-function approaches were used to examine the effectiveness of the mitotic safeguard mechanism, the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). These studies demonstrated that the SAC normally functions to prevent segregation errors during preimplantation development but SAC signaling at misaligned chromosomes fails to delay anaphase. Moreover, SAC failure in embryos is most evident during mid-preimplantation development, independent of cell size. Partial inhibition of SAC target, the Anaphase Promoting Complex (APC/C), extended mitosis and reduced chromosome segregation errors in embryos. These studies have uncovered deficient SAC function during preimplantation development as a major cause for the high incidence of lagging chromosomes in embryos, which result in repeated mis-segregation of single chromosomes in a manner that necessarily causes mosaic aneuploidy. Additionally, this work provides proof-of-principle demonstration that pharmacological modulation of SAC-APC/C signalling can avert chromosome segregation errors in the early embryo. Altogether, these findings present new insights into the causes and nature of chromosome mis-segregation in embryos, providing novel mechanistic explanations for the occurrence of mosaicism that will have substantial implications for the detection and potential therapeutic prevention of aneuploidy in preimplantation embryos.

L'insuffisance cardiaque (IC) est un processus progressif et inexorable menant au remodelage pathologique du cœur et à la destruction du parenchyme cardiaque. Indépendamment de l'étiologie, on observe une diminution d'environ 30% du nombre de cardiomyocytes ventriculaires au stade terminal de la maladie. Reposant sur les données précliniques convergentes dans les modèles d'IC, le concept novateur de thérapie cellulaire a suscité beaucoup d’espoir en cardiologie. Bien que leur rôle dans l'homéostasie cardiaque soit controversé, les progéniteurs cardiaques endogènes (eCPCs) qui perdurent au sein du myocarde adulte possèderaient les caractéristiques optimales en vue de la régénération myocardique. Nos données électrophysiologiques montrent que le courant potassique dépendant du Ca2+ de conductance intermédiaire (IKCa3.1) est dominant et qu'il contribue à la détermination du potentiel membranaire (Vmem). L'hyperpolarisation engendrée par l'activation du canal KCa3.1 (SK4; KCNN4) maintient le gradient électrique et favorise l'entrée capacitive de Ca2+ (ECC). D'un point de vue fonctionnel, la potentialisation de la signalisation calcique intracellulaire induite par KCa3.1 semble cruciale pour la prolifération des eCPCs c-Kit+. Puisque le statut clinique est connu pour avoir des conséquences néfastes sur la fonctionnalité des cellules souches, nous avons comparé la densité du courant IKCa3.1 dans des eCPCs c-Kit+ provenant de cœurs sains et insuffisants. En accord avec les données électrophysiologiques, nos résultats démontrent que l'insuffisance cardiaque congestive (CHF) diminue significativement l'expression de KCa3.1 ainsi que des protéines régulatrices du cycle cellulaire. Les cellules souches dérivées d'explants cardiaques (EDCs) représentent un autre produit cellulaire prometteur pour la thérapie cellulaire en cardiologie. Les EDCs se composent de sous-populations complémentaires dont la proportion varie en fonction du statut clinique. Alors que la population CD90- constitue la fraction active en termes d'efficacité thérapeutique, il a été démontré qu'une proportion élevée de cellules CD90+ réduit le potentiel régénératif des EDCs. Afin de faire la lumière sur les déterminants ioniques de la thérapie cellulaire cardiaque, les propriétés électrophysiologiques des populations CD90+ et CD90- ont été comparées. Considérant l'importance de KCa3.1 pour la fonction des eCPCs c-Kit+, la présence de canaux potassiques Ca2+-dépendants (KCa) dans les EDCs a été investiguée. Nous avons identifié 2 types de canaux KCa dans les EDCs humaines. Le canal KCa1.1 (BKCa; KCNMA1) est exprimé de façon homogène alors que KCa3.1 est présent exclusivement dans les cellules CD90-. D'un point de vue fonctionnel, l'activité du canal KCa3.1 détermine le Vmem et supporte la prolifération des EDCs. Puisque ce canal est présent uniquement dans la population cardiogénique, l'expression de KCa3.1 pourrait être un facteur déterminant de la capacité régénérative des EDCs. Nous avons investigué cette hypothèse et confirmé que la transplantation de cellules génétiquement modifiées pour exprimer le canal KCa3.1 augmente la régénération cardiaque dans un modèle murin d'IC d'origine ischémique. Pour la première fois, nous avons fait la démonstration que la modulation des propriétés ioniques de cellules souches peut améliorer leur efficacité thérapeutique. / Heart failure (HF) is a progressive disease characterized by extensive pathological remodelling of the heart and myocardial damage. Regardless of the etiology, a decrease of about 30% in the number of ventricular cardiomyocytes is observed at the terminal stage of HF. Based on converging preclinical data in HF models, the innovative concept of cell therapy has generated a great deal of enthusiasm in cardiology. Although the role of cardiac stem cells in cardiac homeostasis is highly controversial, the multipotent progenitors that persist within the adult myocardium possess the ideal characteristics for cardiac regeneration, especially because of their cardiogenic committment. Plasma membrane ion channels are involved in the fundamental processes of virtually all cells that make up the human body, including stem cells. A wide range of functional ion channels was identified in ex vivo proliferated endogenous cardiac progenitor cells (eCPCs), but their function remains poorly understood. We have completed the very first characterization of the ionic profile of freshly-isolated c-Kit+ eCPCs. We found that the intermediate conductance Ca2+-activated potassium current (IKCa3.1) is the predominant conductance and contributes to the determination of membrane potential (Vmem). The hyperpolarization generated by the activation of the KCa3.1 channel (SK4; KCNN4) maintains the electrical gradient and promotes store-operated Ca2+-entry (SOCE) that activates progenitor cell proliferation. Experimental congestive heart failure (CHF) significantly decreased the expression of KCa3.1 as well as cell cycle regulatory proteins. Taken together, these findings suggest that alterations in KCa3.1 may have pathophysiological and therapeutic significance in regenerative medicine In addition to c-Kit+ eCPCs, cardiac explants-derived cells (EDCs) represent another promising cell product for myocardial repair. EDCs are obtained as a heterogeneous mixture composed of complementary subpopulations. Interestingly, it was found that a high proportion of CD90+ cells reduce the functional benefits of EDCs therapy. Consistent with this observation, it has recently been shown that the CD90- population constitutes the active fraction in terms of therapeutic efficacy. In order to gain insight into the ionic determinants of EDCs function, the electrophysiological properties of the CD90+ and CD90- populations were studied. Considering the importance of KCa3.1 in c-Kit+ CPCs, we evaluated the presence of KCa channels in human EDCs. We have identified 2 types of KCa channels in ex vivo expanded EDCs. While KCa1.1 (BKCa; KCNMA1) channel was homogeneously expressed in both subpopulations, KCa3.1 was found exclusively in the CD90- cell fraction. Similar to our previous observations in freshly isolated c-Kit+ eCPCs, KCa3.1 was responsible for the determination of Vmem under resting conditions and during SOCE. Importantly, we demonstrated that transplantation of genetically-modified EDCs to over-express KCNN4 potentiates cardiac regeneration in a murine model of ischemic cardiomyopathy. This study provides the first evidence in the literature that modulating the activity of a single plasma membrane ion channel can truly improves the therapeutic efficacy of progenitor cells.

La neurogenèse est présente, dans le cerveau adulte, dans la zone sous-ventriculaire (ZSV) encadrant les ventricules latéraux et dans le gyrus dentelé (GD) de l’hippocampe, permettant l’apprentissage, la mémoire et la fonction olfactive. Ces micro-environnements possèdent des signaux contrôlant l’auto-renouvellement des cellules souches neurales (CSN), leur prolifération, leur destin et leur différenciation. Or, lors du vieillissement, les capacités régénératives et homéostatiques et la neurogenèse déclinent. Les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA), comme le modèle animal reproduisant cette maladie (3xTg-AD), montrent une accélération des phénotypes liés au vieillissement dont une diminution de la neurogenèse. Notre hypothèse est que la découverte des mécanismes affectant la neurogenèse, lors du vieillissement et de la MA, pourrait fournir de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir le déclin cognitif. Les études sur l’âge d’apparition et les mécanismes altérant la neurogenèse dans la MA sont contrastées et nous ont guidé vers deux études. L’examen des changements dans les étapes de la neurogenèse lors du vieillissement et du développement de la neuropathologie. Nous avons étudié la ZSV, les bulbes olfactifs et le GD de souris femelles de 11 et 18 mois, et l’apparition des deux pathologies associées à la MA : les plaques amyloïdes et les enchevêtrements neurofibrillaires. Nous avons découvert que les souris 3xTg-AD possèdent moins de cellules en prolifération, de progéniteurs et de neuroblastes, induisant une diminution de l’intégration de nouvelles cellules dans le GD et les bulbes olfactifs. Notons que le taux de neurogenèse chez ces souris de 11 mois est similaire à celui des souris de phénotype sauvage de 18 mois, indiquant une accélération des changements liés au vieillissement dans la MA. Dans la ZSV, nous avons aussi démontré une accumulation de gouttelettes lipidiques, suggérant des changements dans l’organisation et le métabolisme de la niche. Enfin, nous avons démontré que le déficit de la neurogenèse apparait lors des premières étapes de la MA, avant l’apparition des plaques amyloïdes et des enchevêtrements neurofibrillaires. A l’examen des mécanismes inhibant la neurogenèse lors de la MA, nous voyons que chez des souris de 5 mois, le déficit de la neurogenèse dans la ZSV et le GD est corrélé avec l’accumulation de lipides, qui coïncide avec l’apparition du déclin cognitif. Nous avons aussi découvert que dans le cerveau humain de patients atteints de la MA et dans les 3xTg-AD, des gouttelettes lipidiques s’accumulaient dans les cellules épendymaires, représentant le principal soutien des CSN de la niche. Ces lipides sont des triglycérides enrichis en acide oléique qui proviennent de la niche et pas d’une défaillance du système périphérique. De plus, l’infusion locale d’acide oléique chez des souris de phénotype sauvage permet de reproduire l’accumulation de triglycérides dans les cellules épendymaires, comme dans la MA. Ces gouttelettes induisent un dérèglement de la voie de signalisation Akt-FoxO3 dans les CSN, menant à l’inhibition de leur activation in vitro et in vivo. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de la régulation de la neurogenèse par le métabolisme lipidique. Nous avons démontré un nouveau mécanisme par lequel l’accumulation des lipides dans la ZSV induit une inhibition des capacités de prolifération et de régénération des CSN lors de la MA. Les travaux futurs permettront de comprendre comment et pourquoi le métabolisme lipidique du cerveau est altéré dans la MA, ce qui pourrait offrir de nouvelles voies thérapeutiques pour la prévention et la régénération. / In the adult brain, neurogenesis continues in the subventricular zone (SVZ) surrounding the lateral ventricles and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus where it plays a critical role in learning, memory, and olfactory function. Within these microenvironments, combinatorial signals control neural stem cell (NSC) self-renewal, proliferation, fate determination and differentiation. Unfortunately, during aging, neurogenesis declines along with many other homeostatic and regenerative capabilities. Furthermore, Alzheimer’s disease (AD) patients and many AD models show an acceleration of several aging related phenotypes including neurogenesis. We hypothesize that uncovering how neurogenesis is affected during aging and in AD will provide novel targets for prevention of cognitive decline. However, conflicting findings including the age of onset and the mechanisms altering neurogenesis in AD propelled us to perform the two following studies. First, we examined the various steps of neurogenesis and how they change as a result of aging, neuropathology development, and neurogenic niches. We studied neurogenesis in the SVZ, olfactory bulb, and DG of 11- and 18-month-old female mice and simultaneously measured the stages of the two major AD-associated pathologies, amyloid plaques and neurofibrillary tangles. We found that, 3xTg-AD mice had fewer proliferating cells, neural progenitors and neuroblasts, resulting in decreased numbers of adult-born cells added to the dentate granule cell layer and the olfactory bulbs. Interestingly, the levels of neurogenesis in 11-month-old 3xTg mice were similar to those in 18-month-old WT mice, indicating an acceleration of aging-related changes in neurogenesis. Interestingly, we found that the deficits in neurogenesis appear at early stages of AD-associated pathologies, before the appearance of the hallmark Aβ plaques and neurofibrillary tangles. Instead, we found a pronounced accumulation of large lipid droplets, suggestive of significant organizational and metabolic changes (Chapter 2). Second, we examined the mechanisms inhibiting neurogenesis in AD. Studying young 5-month-old mice, we found that deficits in SVZ and DG neurogenesis still correlated with extensive lipid accumulation coinciding with the onset of cognitive decline. Importantly, we found that postmortem AD brains and 3xTg-AD mice accumulate neutral lipids within ependymal cells, the main support cell of the SVZ niche. Using novel mass spectrometry techniques, we identified these lipids as oleic acid-enriched triglycerides. Moreover, analysis of plasma, cerebrospinal fluid, and microdissected SVZs showed that these lipids originate from niche-derived rather than peripheral lipid metabolism defects. Remarkably, locally increasing oleic acid in wild-type mice was sufficient to recapitulate the AD-associated ependymal triglyceride phenotype and led to a de-regulation of the Akt-FoxO3 NSC preservation pathway, and inhibition of NSC activation in vitro and in vivo (Chapter 3). Together, this work suggests a novel mechanism of cognitive defects. Specifically, lipid accumulation within SVZ niche cells during early adulthood inhibits the proliferative and regenerative capacity of NSCs in AD. Future work aimed at understanding how and why brain lipid metabolism is altered in AD could provide therapeutic targets for preventative and regenerative strategies for those suffering from AD.

Le diabète de type 2 (DT2) résulte de l’incapacité des cellules β sécrétrices d’insuline à compenser la résistance à l’insuline qui s’installe chez les patients obèses. Un traitement potentiel viserait donc à augmenter la sécrétion d’insuline. Dans ce sens, les récepteurs aux acides gras GPR120 et GPR40 potentialisent la sécrétion d’insuline. Cependant, la signalisation GPR120 dans les îlots est méconnue. L’activation de GPR120 diminue la sécrétion de somatostatine (SST), un inhibiteur de la sécrétion d’insuline, par les cellules δ. Ces deux récepteurs régulent l’homéostasie du glucose et sont donc possiblement complémentaires. Nos objectifs étaient d’étudier la signalisation GPR120 dans les îlots pancréatiques, ainsi que la complémentarité des récepteurs GPR120 et GPR40 dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. À l’aide d’îlots isolés de souris n’exprimant pas GPR120, constitutivement ou uniquement dans les cellules δ, nous avons étudié le rôle de GPR120 dans les sécrétions d’insuline, glucagon et de SST. Nous avons ensuite étudié des souris n’exprimant pas GPR40, GPR120 ou les deux, sous une diète riche en gras pendant 12 semaines pour étudier la complémentarité des deux récepteurs. L’activation de GPR120 diminue la sécrétion de SST et stimule les sécrétions d’insuline et de glucagon dans les îlots isolés. Cet effet est aboli par la délétion de GPR120 dans les cellules δ in vitro, et la double délétion de GPR120 et GPR40 ne révèle pas d’action complémentaire dans l’homéostasie glucidique. Ces résultats suggèrent que la signalisation GPR120 dans les cellules δ est responsable de l’amélioration de la fonction des îlots. Une meilleure compréhension du rôle joué par GPR120 dans la fonction des îlots et l’homéostasie du glucose est cruciale et pourrait permettre le développement de nouvelles options thérapeutiques dans le traitement du diabète. / In obese patients, type 2 diabetes stems from the failure of the insulin-secreting beta cells to compensate for insulin resistance. Increasing insulin secretion is therefore a viable treatment strategy. In this regard, G protein-coupled receptors (GPCR) are proven therapeutic targets. Activation of the GPCR for long-chain saturated and unsaturated fatty acid GPR40 and GPR120 increase insulin secretion in response to glucose. However, exactly how GPR120 potentiates insulin secretion is unknown. GPR120 and GPR40 both regulate glucose homeostasis and therefore could act in a complementary manner. We aimed to decipher GPR120 signalling in the pancreatic islets and study the complementary roles of GPR120 and GPR40 in maintaining glucose homeostasis. To this aim, we first measured insulin, glucagon and somatostatin secretion following GPR120 activation in isolated islets from mice with a global or somatostatin-cell-specific knock-out of GPR120. Then we studied glucose metabolism in mice with global deletion of GPR120, GPR40 or both, under a high fat diet for 12 weeks. We observed increased insulin and glucagon secretions mirrored by a decreased in somatostatin release following GPR120 activation in isolated islets, an effect abolished by a global or δ-specific deletion of GPR120. A double deletion of GPR120 and GPR40 did not have more impact on glucose metabolism or beta-cell function compared to a simple deletion of either receptor. A better understanding of the GPR120 role in islet function is crucial and could lead to the discovery of new therapeutic options.

Les cytokines jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire ; elles modulent les propriétés et la survie de nombreuses cellules immunitaires. Les lymphocytes T (LT) sont régulés par un large spectre de cytokines. Néanmoins certaines sous-populations de LT restent peu définies à ce jour tout comme l’impact de cytokines sur ces cellules en conditions physiologiques et pathologiques. Une population de LT caractérisée par la double expression des corécepteurs CD4 et CD8 a été identifiée en périphérie chez des donneurs sains et sa fréquence est augmentée chez les patients atteints de certaines pathologies. Cependant, peu d’études ont déterminé le phénotype et les fonctions de ces cellules. Nous avons caractérisé le phénotype ex vivo des LT CD4+CD8+ issus de sujets sains et étudié la réponse de ces cellules à plusieurs cytokines importantes dans l’homéostasie et l’activation des lymphocytes. Notre étude révèle que les LT CD4+CD8+ forment une population hétérogène présentant de nombreuses caractéristiques des cellules mémoires. De plus, notre étude montre que ces cellules ont une capacité accrue de produire des cytokines et enzymes lytiques comparée aux LT CD4 et CD8. Finalement, nous avons observé qu’une plus grande proportion de LT CD4+CD8+ répond aux cytokines IL-2, IL-15 et IL-7 comparée aux LT CD4 et CD8 simples positifs. Plusieurs études ont révélé que certaines cytokines participent à la pathobiologie de maladies auto-immunes notamment la sclérose en plaques (SEP). La SEP est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une destruction de la gaine de myéline et une perte axonale à l’origine des symptômes cliniques. L’impact des médiateurs immunitaires dans la destruction et/ou la réparation reste néanmoins à éclaircir. Plusieurs études suggèrent que l’interleukine-27 (IL-27) joue un rôle central dans la SEP : l’IL-27 diminue la sévérité de la maladie dans un modèle murin de la SEP ; la réponse des patients à certaines thérapies corrèle avec des niveaux périphériques élevés d’IL-27. Notre étude avait pour but de déterminer comment l’IL-27 module les LT des patients atteints de SEP. Nous avons observé des niveaux d’IL-27 augmentés à la fois en périphérie et dans le SNC des patients SEP. Nous avons mis en évidence que les effets induits par l’IL-27 sont altérés dans les LT des patients SEP ; notamment l’induction de PD-L1 et la réponse à l’IL-12 sont plus faibles comparées aux LT de sujets sains. La voie de signalisation STAT3 est induite plus fortement en réponse à l’IL 27 dans les cellules de patients SEP en comparaison à celles de sujets sains. Finalement, nous avons démontré que la forme soluble du récepteur à l’IL-27 est présente en plus grande quantité dans le sérum des patients SEP et ces niveaux sont suffisants pour bloquer l’effet de l’IL-27 sur ses cellules cibles. En conclusion, nos résultats permettent de mieux comprendre comment certaines cytokines participent à la régulation des populations lymphocytaires. En condition pathologique, la modulation de ces cytokines pourrait s’avérer efficace dans un but thérapeutique afin de promouvoir et/ou inhiber certaines réponses immunitaires notamment dans la SEP. / Cytokines play an essential role in modulating the immune response. They act on cells from both innate and adaptive immunity by modulating their phenotype and influencing their survival. T cells are highly regulated by a broad spectrum of cytokines. Nevertheless, some subsets of T cells remain ill-defined and a better understanding of cytokine-mediated responses in physiological and pathological conditions requires further investigation. A T cell population characterized by the dual expression of CD4 and CD8 co-receptors has been identified in the periphery of healthy donors and its frequency is notably increased in several pathologies. However, very few studies have determined the phenotype and functions of these cells under physiological conditions. We performed an ex vivo phenotypic characterization of CD4+CD8+ T cells from healthy subjects and analyzed the response of these cells to several important cytokines implicated in homeostasis and activation of immune cells. Our study reveals that CD4+CD8+ T cells are heterogeneous and exhibit many characteristics of memory cells. In addition, our study shows that these cells have an enhanced ability to produce cytokines and lytic enzymes compared to CD4 and CD8 T cells. Finally, we found that a higher proportion of CD4+CD8+ T cells respond to IL-2, IL-15 and IL-7 cytokines compared to CD4 and CD8 counterparts. Numerous studies showed that lymphocyte populations and some cytokines are involved in the development of several autoimmune diseases, including multiple sclerosis (MS). MS is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS) characterized by the destruction of the myelin sheath, axonal loss and oligodendrocytic death leading to clinical symptoms. The immune mediators involved in the destruction and/or repair remain to be clarified. Several studies suggest that interleukin-27 (IL-27) plays a central role in MS: IL-27 dampens the severity of the disease in a MS mouse model and in MS patients the response to some therapies correlates with higher levels of peripheral IL-27. The purpose of our study was to determine how IL-27 modulates T cells in MS patients. We observed that IL-27 levels are increased in both periphery and CNS of MS patients. We found that IL-27-mediated effects are impaired in T cells from MS patients in particular PD-L1 induction and IL-12 response that are lower compared to T cells from healthy subjects. IL-27-triggered STAT3 signaling pathway is also enhanced in cells from MS patients compared to healthy subjects. Finally, our study showed that the soluble form of the receptor of IL-27 is present in greater levels in the serum of MS patients and the measured doses are sufficient to block the capacity of IL-27 to act on its target cells. To conclude, our results provide a better understanding of how certain cytokines participate in the regulation of lymphocyte populations. Under pathological conditions, modulation of these cytokines may be effective for therapeutic applications in order to promote and/or inhibit immune responses, particularly in MS.

L’immunothérapie a permis des avancées majeures dans la thérapie du cancer. Le traitement par des cellules T modifiées pour exprimer un récepteur chimérique d’antigène (CAR) a changé complètement la vision de la thérapie de la leucémie. L’efficacité de ce traitement sur des cancers résistants, a ouvert la voie à la thérapie cellulaire et génique dans ce contexte. Malgré les premiers résultats très positifs, il s’avère que l’épuisement cellulaire et la perte des cellules T thérapeutiques est un problème majeur pour maintenir l’efficacité de la thérapie CAR et prévenir les rechutes. Les travaux présentés dans cette thèse visent à permettre l’utilisation d’autres types cellulaires pour la thérapie CAR. L’hypothèse de travail est que les cellules NK ou les cellules souches hématopoïétiques (HSC) permettrait de dépasser les limites de la thérapie CAR utilisant les cellules T. Pour permettre l’utilisation des cellules NK, un des problèmes technique est la transduction par les vecteurs viraux. Les travaux présentés ici démontrent que l’utilisation de l’enveloppe BaEV permet une transduction efficace des NK avec un vecteur lentiviral. Par cette méthode nous avons pu générer de grandes quantités de cellules NK transduites avec un CAR, prouvant la possibilité d’utiliser les NK dans la thérapie CAR. L’utilisation des HSC dans la thérapie CAR, permettrait de produire des cellules CAR T en permanence pour renouveler les cellules T épuisées. Cependant, la surexpression d’un récepteur CAR sur toutes les cellules dérivant des HSC pourrait être un problème. Pour permettre l’utilisation des HSC, nous avons développé des promoteurs spécifiques courts restreignant l’expression du transgène à une population précise. Nous avons prouvé la spécificité d’un promoteur T et démontré la possibilité de l’utiliser dans le contexte de la thérapie CAR utilisant les HSC. Ces travaux sont une preuve de concept de l’utilisation d’autres cellules que les cellules T dans la thérapie CAR. / Immunotherapy has allowed major advances in cancer therapy. The treatment using modified T cells with a chimeric antigen receptor (CAR) completely changed the vision of leukemia therapy. The efficiency against resistant cancer paved the way to cellular and gene therapy in this context. Despite very positive results at first, the disappearance and exhaustion of therapeutic cells seems to be a major problem to maintain the efficiency of the CAR treatment and prevent relapses. The work of this thesis is to allow the use cell types other than T cells for CAR therapy. The hypothesis is that NK cells or hematopoietic stem cells (HSC) could overcome the limitation of CAR therapy using T cells. To allow the use of CAR NK cells, a major technical issue is the transduction by viral vectors. The work presented here shows the use of BaEV envelope to pseudotype vectors allows an efficient transduction of NK cells. Using this method, we were able to produce large amounts of CAR NK cells, showing the possibility to use NK cells in CAR therapy. The use of HSC in CAR therapy, could allow the permanent replenishment of the pool of CAR T cells once exhausted. Despite that advantage, the overexpression of a CAR receptor on all hematopoietic cells coming from those HSC could be an issue. To allow the use of HSC, we developed short specific promoters restraining the expression of the transgene to a precise population. We prove the specificity of a T cell promoter and demonstrated the possibility to use it in CAR therapy using HSC. This work is a proof of concept of the use of other population than T cells in CAR therapy.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la première néoplasie létale du foie, représentant 80 à 90% des cas. Actuellement, la majeure partie des patients bénéficient de solutions thérapeutiques avec des efficacités très modestes. La haute variété étiologique, l’hétérogénéité des tumeurs ainsi que l’absence de médiateurs oncogéniques clés connus dans le développement de cette pathologie sont responsables du manque d’options thérapeutiques. À partir d’un crible génétique du kinome humain, nous avons identifié la tyrosine kinase Yes comme un acteur majeur de la prolifération des cellules de CHC. Yes appartient à la famille des kinases Src qui contrôlent de nombreux processus cellulaires notamment la prolifération, la motilité et la survie. La sur-expression ou activation anormale de Yes est retrouvée dans de nombreux cancers et est souvent associée à un mauvais pronostic. Nous avons démontré par des expériences in vitro et in vivo l’activité pro-proliférative de Yes ainsi que son potentiel oncogénique. Notamment, dans un modèle murin de carcinogenèse hépatique induit par le diéthylnitrosamine, la déplétion génétique de Yes abolit totalement la formation de tumeurs. Grâce aux profils transcriptionnels obtenus dans plusieurs modèles cellulaires de CHC, nous avons découvert que l’activité de Yes est associée à une augmentation des signatures géniques des régulateurs transcriptionnels YAP et TAZ ainsi que du facteur transcriptionnel c-Myc. Ces observations ont abouti à identifier YAP, TAZ et c-Myc comme des nouveaux substrats de la tyrosine kinase Yes. Nous avons montré que la phosphorylation par Yes de YAP et TAZ médie leur recrutement dans le noyau ce qui conduit à une hausse de leur activité transcriptionnelle. Nous avons d’ailleurs confirmé l’importance de YAP et TAZ dans les propriétés prolifératives de Yes, notamment dans différents modèles murins de carcinogenèse hépatique. De manière intéressante, nous avons observé que près de 50% de CHCs humains présentent une activation anormale des kinases Src qui corrèle avec la phosphorylation et activation de YAP. Enfin, nous avons observé in vitro et in vivo que Yes stabilise c-Myc. En effet, l’expression transgénique de Yes constitutivement actif dans des hépatocytes entraine la stabilisation de c-Myc à des stades précoces du développement tumoral et une induction de plusieurs de ses gènes cibles à des stades plus tardifs. En plus de leur synergie d’action, cette étude propose que la tyrosine Yes intervient dans les propriétés oncogéniques de c-Myc. Finalement, nous avons découvert que la kinase Yes joue un rôle dans la progression de la stéatose hépatique. En effet, la progression de la pathologie est abolie à la suite de la déplétion de Yes ou suivant l’inhibition pharmacologique des kinases Src. De plus, la survie des cellules tumorales face à leur élimination par le système immunitaire semble être favorisé par la signalisation Yes qui induit l’expression des points de contrôle immuns PD-L1/2. En conclusion nous avons découvert et caractérisé trois nouveaux effecteurs clés de la signalisation oncogénique de la tyrosine kinase Yes dans le CHC. D’ailleurs, la signature génique induite par Yes permet de prédire la survie des patients atteints de CHC. Ces données fournissent de robustes évidences qui placent la tyrosine kinase Yes comme une cible thérapeutique de choix pour la maladie du CHC. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the first lethal neoplasia of the liver, representing 80 to 90% of cases. Currently, for most patients the therapeutic option only provides modest efficiencies. The high etiological variety and heterogeneity of the tumors as well as the absence of known key oncogenic mediator in the development of this pathology is mainly responsible for the lack of therapeutic option. Based on a genetic screen of the human kinome, we identified the tyrosine kinase Yes as a major player in the proliferation of HCC cells. Yes belongs to the family of Src kinases which control many cellular processes including proliferation, motility and survival. The over-expression or abnormal activation of Yes is detected in many cancers and is often associated with poor prognosis. We have demonstrated in vitro and in vivo the pro-proliferative activity of Yes as well as its oncogenic potential. In particular, in a mouse model of hepatic carcinogenesis induced by diethylnitrosamine, the genetic depletion of Yes completely abolishes the formation of tumors. Thanks to the transcriptional profiles obtained in several cellular models of CHC, we discovered that the activity of Yes is associated with an increase in the gene signatures of the transcriptional regulators YAP and TAZ as well as of the transcriptional factor c-Myc. These observations led to the identification of YAP, TAZ and c-Myc as new substrates for the tyrosine kinase Yes. We have shown that the phosphorylation of YAP and TAZ by Yes mediates their recruitment into the nucleus associated with an increase in their transcriptional activity. We have also confirmed the importance of YAP and TAZ in the proliferative properties of Yes in various mouse models of hepatocarcinogenesis. Interestingly, we observed that nearly 50% of human CHCs exhibit an abnormal activation of Src kinases that correlates with phosphorylation and activation of YAP. Moreover, in vitro and in vivo experiments revealed that Yes stabilizes c-Myc. Indeed, the transgenic expression of constitutively active Yes into hepatocytes leads to the accumulation of c-Myc protein at early stages of tumor development and to the induction of several of its target genes at later stages. In addition to their synergistic action, this study suggests that Yes is involved in the oncogenic properties of c-Myc. Finally, we discovered that Yes kinase plays a role in the progression of fatty liver diseases. Indeed, the progression of the pathology is abolished following the depletion of Yes or the pharmacological inhibition of Src kinases. In addition, the survival of Yes-active tumor cells is associated with the induction of PD-L1/2 immune checkpoints that protect cells from immune elimination. In conclusion, we have discovered and characterized three new key effectors of the oncogenic tyrosine kinase Yes in HCC. Interestingly, the gene signature induced by Yes can predict the survival of patients with HCC. These data provide strong evidence for targeting the tyrosine kinase Yes in HCC.

Many cellular and molecular mechanisms are involved in the structural changes (morphogenesis) taking place during embryonic development. Indeed, the cytoskeleton is dynamically modified by intracellular signaling cascades, controlling cell morphogenesis during division or epithelial organization. Signal transduction mechanisms establishes homeostasis during morphogenetic processes. The cell cortex, composed by plasma membrane and underlying cytoskeleton meshwork, is responsible for integrating cell shape changes and organizing structural elements required for intercellular communication. The composition of the cell cortex is thus constantly changing in response to morphogenetic needs. However, the signaling network controlling this cortical plasticity is still unclear. This work has identified a new signaling pathway involved in cell cortex organization. The laboratories of Dr Carréno and Dr Hipfner use Drosophila as a model organism to study cell and tissue morphogenesis. Dr Carréno and Dr Hipfner had previously found that Ste20 Slik kinase was responsible for dMoesin activation by phosphorylation. dMoesin acts as a cross-linker between the cytoskeleton and the plasma membrane. This way, activation of dMoesin by Slik controls cortical stability during mitosis and epithelial integrity in Drosophila. This research project found that dSTRIPAK phosphatase activity promotes cortical localization of Slik in order to activate dMoesin at the plasma membrane. In addition, it showed that dSTRIPAK, as Slik and dMoesin, controls mitotic morphogenesis and epithelial tissue integrity. On top of that, Dr Hipfner has previously shown that Slik induces growth signaling at distance and independently of its catalytic activity. My research has led to the discovery that Slik is located along specialized signaling filopodia, called cytonemes. In addition, our data showed that Slik lengthens cytonemes, while dSTRIPAK is necessary for their biogenesis and signaling function. Slik and dSTRIPAK thus control tissue growth during the embryonic development of Drosophila. We have not determined the molecular mechanisms involved in the formation of cytonemes by dSTRIPAK/Slik yet. Together, our research projects led to the discovery that the dSTRIPAK complex regulates the catalytic and non-catalytic functions of Slik. We have thus identified a new signaling pathway controlling cell and tissue morphogenesis, through the cytoskeleton and intercellular communication. These processes are essential for maintaining homeostasis during embryogenesis. However, alteration of these morphogenetic processes can cause tumorigenesis. Our research might lead to the exploration of new anti-cancer therapeutic avenues. / De nombreux mécanismes moléculaires et cellulaires sont à la base des changements structurels (appelés la morphogenèse) qui ont lieu durant le développement d’un organisme. En effet, le cytosquelette est dynamiquement modifié par des cascades de signalisation intracellulaires contrôlant ainsi la morphogenèse cellulaire durant la division ou l’organisation d’un épithélium. L’homéostasie entre les différents processus morphogénétiques est établie grâce à des échanges de molécules signalisatrices. Le cortex de la cellule, composé de la membrane plasmique et du réseau de protéines du cytosquelette sous-jacent, est responsable d’intégrer les changements de forme cellulaire et d’organiser les éléments structurels requis pour la communication intercellulaire. Donc la composition du cortex cellulaire varie constamment en réponse aux besoins morphogénétiques. Toutefois, les réseaux de signalisation qui contrôlent cette plasticité corticale ne sont pas toujours connus. Ce travail a identifié une nouvelle voie de signalisation impliquée dans l’organisation du cortex cellulaire. Le laboratoire d’accueil (Dr Carréno) ainsi que celui du Dr Hipfner utilisent la drosophile comme organisme modèle pour l’étude fondamentale de la morphogenèse cellulaire et tissulaire. Le Dr Carréno et le Dr Hipfner avaient précédemment découvert que la kinase Ste20 Slik était responsable d’activer la dMoésine par phosphorylation. Celle-ci lie le cytosquelette à la membrane plasmique. L’activation de la dMoésine par Slik contrôle ainsi la stabilité corticale durant la mitose et l'intégrité épithéliale chez la drosophile. Durant mon projet de recherche, nous avons ensuite mis en évidence que le complexe phosphatase-kinase dSTRIPAK promeut la localisation corticale de Slik afin d’activer la dMoésine à la membrane plasmique. Nous avons également révélé que dSTRIPAK contrôle, tout comme Slik et dMoésine, la morphogenèse mitotique et l’intégrité du tissu épithélial. D'autre part, le Dr Hipfner avait précédemment constaté que Slik induisait une signalisation de croissance à distance, de façon indépendante de son activité catalytique. Mes recherches ont amené à découvrir que Slik est localisée le long de filopodes spécialisés dans la signalisation à distance, appelés cytonèmes. En outre, nos résultats révèlent que Slik allonge les cytonèmes, alors que dSTRIPAK est nécessaire à leur biogenèse et fonction de signalisation. Slik et dSTRIPAK contrôlent ainsi la croissance tissulaire au cours du développement embryonnaire de la mouche. Il reste à déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des cytonèmes par dSTRIPAK/Slik. Au final nos recherches ont mené à la découverte que le complexe dSTRIPAK régule les fonctions catalytiques et non-catalytiques de Slik. Nous avons ainsi identifié une nouvelle voie de signalisation contrôlant la morphogenèse cellulaire et tissulaire, par le biais du cytosquelette et de la communication intercellulaire. Ces processus sont essentiels au maintien de l’homéostasie durant l’embryogenèse. Toutefois, l’altération de ces processus morphogénétiques peut causer la tumorigenèse. Notre travail de recherche participe donc potentiellement à l’exploration de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses.

Le développement des plantes nécessite la coordination des mécanismes de différenciation des cellules méristématiques en cellules hautement spécialisées: la division, la croissance et la formation de la géométrie cellulaire. La différenciation et la morphogenèse cellulaires sont étroitement liées et régulées par les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire. Les mécanismes conduisant à l’émergence de diverses formes et fonctions des tissus végétaux sont complexes et encore peu compris. Ma thèse de doctorat approfondie les principes mécaniques à la base de la formation des cellules épidermiques ondulées. Je me suis également penché sur l’étude des avantages mécaniques que confèrent les motifs imbriqués. Les cellules épidermiques sont constituées de deux parois cellulaires périclines parallèles reliées par des parois anticlines. Aux jonctions, les cellules épidermiques forment des cavités et des saillies imbriquées les unes aux autres. Des images en 3D, prises en microscopie confocale, de cotylédons marqués par des fluorophores spécifiques à la cellulose montrent une déposition accrue de cellulose au niveau des cavités des parois périclines s’étendant le long des parois anticlines. Le marquage des cotylédons par COS488 démontre également une plus grande abondance de pectines dé-estérifiées aux mêmes sites. J'ai développé des modèles par éléments finis de la déformation de la paroi cellulaire et simulé les disparités biochimiques en alternant les régions plus rigides à travers et au long des parois périclines des deux côtés d'une paroi anticline. Le modèle montre que les parois rigidifiées non déformables se développent en cavités lorsque la pression interne étire la paroi cellulaire. Le modèle suggère également la présence de contraintes mécaniques plus élevées au niveau des saillies. Les résultats du modèle indiquent qu'une boucle de rétroaction positive entre la contrainte et la rigidité de la paroi cellulaire générerait les formes ondulées à partir de différences infinitésimales de rigidité ou de contrainte de la paroi cellulaire. En outre, le modèle suggère que des événements de flambage stochastiques peuvent initier la morphogenèse des cellules. On a longtemps émis l'hypothèse que le motif imbriqué de cellules épidermiques améliore l'adhérence cellule-cellule et donc la résistance de traction de l'épiderme. L'étirage des feuilles d'Arabidopsis de type sauvage ou du mutant any1 (caractérisé par une réduction de l'ondulation cellulaire) n'a montré aucun détachement cellulaire en cas de rupture du tissu. J'ai émis l'hypothèse que les jonctions des cellules ondulantes renforcent la résistance de l'épiderme contre la propagation de fissures. J'ai observé une grande anisotropie dans la réponse mécanique à la rupture de l'épiderme d'oignon selon l’orientation des cellules. Les fissures qui suivent l’alignement des cellules se propagent sans trop de résistance, entraînant une rupture fragile du tissu. Ceci découlerait de la propagation de la ligne de rupture par suite du détachement des cellules. Les fissures se propagent difficilement lorsqu’elles sont perpendiculaires à l'axe principal des cellules. En fracturant des feuilles dont les cellules épidermiques sont ondulées, j'ai remarqué que les fissures se propageaient, par intermittence, à la fois au niveau des jonctions de la cellule et de la paroi cellulaire. J'ai émis l'hypothèse que ce motif de fracture d'épiderme à cellules ondulées se caractérisait par une augmentation de la résistance à la fracture. Pour n’étudier que les effets de la géométrie des cellules sur cette résistance, j’ai éliminé le rôle que jouerait l’anisotropie des matériaux en concevant des modèles physiques macroscopiques de l'épiderme. J’ai gravé au laser des motifs cellulaires sur du poly-méthacrylate de méthyle. De cette façon, le matériau isotrope permettait d'étudier uniquement l'effet de la géométrie cellulaire. Alors que la fracturation des spécimens de contrôle sans gravure et des spécimens avec des cellules gravées longitudinalement ont démontré une rupture fragile, une fracturation transversale aux rangées cellulaires, dans les modèles mimant des cellules d’oignon ou des cellules ondulées de cotylédons d’Arabidopsis, a montré une résistance accrue à la fracture. En conclusion, je démontre que la forme ondulée des cellules épidermiques est le résultat d’une distribution alternée de la rigidité dans la paroi cellulaire, un processus qui pourrait être initié par une anisotropie de stress stochastique due au flambement. De plus, ces formes cellulaires augmentent la résistance à la rupture de l'épiderme végétal en le protégeant contre la propagation des fissures; un mécanisme de défense ingénieux pour les surfaces les plus exposées. / Plant development entails cell division, cell growth and shaping, and the differentiation of meristematic cells into highly specialized cell types. Differentiation and cell shape are closely linked and involve the regulation of the mechanical properties of the cell wall. The mechanisms leading to the generation of the diverse array of shapes and functionalities found in plant tissues are perplexing and poorly understood. In my Ph.D. research, I investigated the mechanical principles underlying the formation of wavy leaf pavement cells. Further, I studied the putative mechanical advantage that emerges from the interlocking patterns. Epidermal pavement cells consist of two parallel periclinal walls connected by vertical anticlinal walls. At the borders, wavy pavement cells make interlocking indentations and protrusions. 3D confocal micrographs of cotyledons stained with cellulose-specific fluorophores revealed a significant accumulation of cellulose at the sites of indentation on the periclinal walls extending down the anticlinal walls. Staining the cotyledon samples with COS488 also suggested a higher abundance of de-esterified pectin at these sites. I developed finite element models of the cell wall deformation and simulated the biochemical inhomogeneities by assigning alternately stiffened regions across and along the periclinal walls on two sides of an anticlinal wall. It was observed that the non-deforming stiffened regions develop into sites of indentations when the internal pressure stretches the cell wall. The model also suggested higher stresses to associate with the neck regions. The model results indicate that a positive feedback loop between stress and cell wall stiffness could generate wavy shapes starting from infinitesimally small differences in cell wall stiffness or stress. Further, the model suggests that stochastic buckling events can initiate the cell shaping process. It has been long hypothesized that the interlocking pattern of pavement cells improves cell-cell adhesion and thus the tensile strength of the epidermis. Stretching to rupture the leaf samples of wild-type Arabidopsis or any1 mutant with reduced cell waviness did not show any cell detachment upon failure. However, I hypothesized the undulating cell borders could enhance the resistance of the epidermis against the propagation of damage. I observed a considerable anisotropy in the tear behavior of onion epidermis parallel and perpendicular to the cells’ main axis. Tears along the cell lines propagated without much resistance resulting in brittle failure of the tissue. This was observed to originate from tears propagating by cell detachment. Perpendicular to the cells’ main axis, tears had considerable difficulty in propagating. Fracturing the leaf samples with wavy epidermal cells, I noticed the cracks propagated in both the cell borders and the cell wall intermittently. I hypothesized that this pattern of fracture in the epidermis with wavy cells indicates an increase in the fracture toughness. To untangle the influence of material anisotropy from the cell geometry on fracture toughness, I designed macroscopic physical models of the epidermis by laser engraving the cell patterns on polymethylmethacrylate. This way, the isotropic material would allow studying only the effect of cell geometry. While fracturing the control specimens with no engraving and the specimens with longitudinally placed cells demonstrated a brittle fracture, fractures transverse to cell lines in the onion cell patterns or across the Arabidopsis cotyledon wavy cell pattern showed an increased fracture toughness. I suggest the wavy shape of pavement cells in the epidermis results from the alternate placement of stiffer regions in the cell wall, a process that can initiate from a stochastic stress anisotropy due to buckling. Further, these shapes increase the fracture toughness of the plant epidermis protecting it against the spread of damage; an ingenious defense mechanism at the most exposed surfaces.

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