O Sistema renina-angiotensina (SRA) tem sido relatado como um importante modulador de processos inflamatórios e imunológicos, incluindo a doença periodontal (DP). Estudos sugerem neste sistema um eixo alternativo (ECA-2 /ANG(1-7) /MAS) que atuaria como um contra-regulador de efeitos mediados pelo clássico eixo (ECA /ANGII /AT1). Sabe-se que bactérias periodontopatogênicas, como a Porphyromonas gingivalis (Pg), possuem componentes bioativos de membrana (ex. lipopolissacarídeos-LPS) capazes de induzir uma forte resposta imune no hospedeiro devido à liberação de citocinas nas células, entre elas Interleucina (IL)- 1β. Neste contexto, fibroblastos são as células mais abundantes nos tecidos periodontais e possuem em sua superfície celular receptores necessários para o reconhecimento da invasão bacteriana, ativando cascatas intracelulares, que levam à produção de citocinas. O objetivo deste estudo foi verificar se os eixos ECA/ ANGII/ AT1 e ECA-2/ ANG(1-7)/ MAS contribuem para a produção e/ ou regulação de citocinas inflamatórias (CI) por fibroblastos de gengiva humana (HGF) e ligamento periodontal humano (HPLF) estimulados por IL-1β. Após o pré-tratamento com Losartan e Ang (1-7) ou silenciamento mediado por RNA de interferência (RNAi) de AT1, HGF e HPLF foram estimulados por IL-1β por 3 horas (RNAm) ou 24 horas (proteína). Expressão de RNAm para AT1, MAS, ECA, ECA-2, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-β, CXCL12, RANK-L e OPG foram avaliados por RT-qPCR e das proteínas IL-6, IL-8, ECA e ECA-2 por ELISA. Foi realizado também Western Blot para detecção de AT1 e ECA nos extratos celulares e dosagem de nitrito no sobrenadante das culturas. Ambos os subtipos de fibroblastos mostraram aumento da expressão de RNAm para AT1, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α e OPG, quando estimulados por IL-1β. No entanto, apenas em HPLF foi observado aumento para MAS, ECA e TGF-β. Losartan e Ang (1-7) não modularam o transcrito, a secreção de CI e nem a produção de nitrito no sobrenadante das culturas, tanto em HGF como em HPLF. O silenciamento do receptor AT1 reduziu a secreção de IL-6 e IL-8 induzida por IL-1β em cultura de HGF e HPLF e aumentou a expressão gênica de OPG somente em HGF. Estes resultados sugerem que o silenciamento de AT1, mas não o bloqueio farmacológico deste receptor pelo antagonista Losartan, em HGF e HPLF, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal. / The renin-angiotensin system (RAS) has been reported as an important modulator of inflammatory and immune responses, including periodontal disease (PD). Studies suggest an alternative axis as part of this system (ACE-2 / ANG (1-7) / MAS) that would act as counter-regulatory to the classical axis (ECA / ANGII / AT1). It is known that periodontal bacteria such as Porphyromonas gingivalis (Pg) have bioactive components in their membrane (such as lipopolysaccharide-LPS) capable of inducing a strong immune response in the host due to the release of cytokines in cells, including interleukin (IL) - 1β. In this regard, fibroblasts are the most abundant cells in periodontal tissues and receptors needed for the recognition of bacterial invasion by activating intracellular cascades that lead to cytokine production. The aim of this study was to determine whether the axes ACE / ANGII / AT1 and ACE-2 / ANG (1-7) / MAS contribute to the production and / or regulation of inflammatory cytokines (IC) by fibroblasts of human gingiva (HGF) and human periodontal ligament (HPLF) stimulated IL-1β. After pre-treatment with Losartan, Ang (1-7) or silencing mediated by RNA interference (RNAi) of AT1, HGF and HPLF were stimulated by IL-1β for 3 hours (RNAm) or 24 hours (protein). Expression mRNA for AT1, MAS, ACE, ACE-2, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-β, CXCL12, RANK-L and OPG was assessed by RT- qPCR and proteins IL-6, IL-8, ACE and ACE-2 by ELISA. Western Blot for the detection of AT1 and ECA and dosage of nitrite was also performed. Experiments stimulated by IL-1β showed a positive control for gene expression AT1, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α and OPG in HGF and HPLF and MAS, ACE and TGF-β only HPLF. Losartan and Ang (1-7) did not modulate the transcription and secretion of IC and no nitrite production in the culture supernatant of HGF and HPLF. The silencing AT1 reduced IL-6 secretion and IL-8 induced by IL- β in cultured HGF and HPLF and increased OPG gene expression only HGF. These results suggest that silencing AT1, but not pharmacological blockade of this receptor by Losartan in HPLF and HGF, can control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to the pathogenesis of periodontal disease.

Estudo anterior de nosso grupo demonstrou que superfície de titânio (Ti) com nanotopografia obtida por condicionamento com H2SO4/H2O2 e funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção promove o aumento da mineralização de culturas primárias de células osteogênicas. O presente estudo teve como objetivos avaliar: 1) os efeitos da pós-adsorção de proteínas principais do plasma- albumina, fibrinogênio e fibronectina, em superfícies de Ti controle e com nanotopografia, funcionalizadas com GDF-5 a 200 ng/mL por simples adsorção, sobre a formação de matriz mineralizada in vitro; 2) parâmetros moleculares e fenotípicos característicos da aquisição do fenótipo osteogênico in vitro sobre superfícies de Ti funcionalizadas com GDF-5 por simples adsorção ou por filmes LbL; 3) parâmetros de formação óssea adjacente a implantes de Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 pelos dois métodos, em modelo de tíbia de coelhos. Os resultados mostraram que a pós-adsorção de proteínas plasmáticas não afetou o potencial osteogênico in vitro, com exceção para o efeito inibidor da albumina, quando pós-adsorvida isoladamente. Tanto a superfície de Ti como o método de funcionalização de GDF-5 afetaram, quantitativamente, as formações de matriz mineralizada, com a maior diferenciação osteogênica para Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção e a menor, para os filmes LbL, independentemente das superfícies sobre as quais eles eram montados. A atividade de ALP foi maior em culturas sobre nanotopografia de Ti, incluindo aquelas funcionalizadas com GDF-5, cujos valores, no entanto, não corresponderam, necessariamente, à maior atividade osteogênica. Apesar disso, todos os grupos exibiram expressão de marcadores de diferenciação osteoblástica, com sobre-expressão de osteopontina e osteocalcina para culturas sobre LbL. As análises microtomográfica, histológica e histomorfométrica não revelaram diferenças qualitativas e quantitativas in vivo entre nanotopografias de Ti funcionalizadas ou não com GDF-5, ainda que uma tendência à maior formação óssea tenha sido observada para as superfícies funcionalizadas e, entre essas, para os filmes LbL. Considerados conjuntamente, os resultados do presente estudo contribuem para o melhor entendimento das respostas de osteoblastos e do tecido ósseo quando se propõe a estratégia de funcionalização de superfícies de Ti com GDF-5 visando à otimização da osseointegração. / It has been demonstrated that a nanostructured titanium (Ti) surface obtained by treatment with H2SO4/H2O2 and functionalized with GDF-5 by simple adsorption promotes the enhancement of mineralized matrix formation in osteogenic cell cultures. This study aimed to evaluate: 1) the effects of post-adsorption of major plasma proteins, i.e. albumin, fibrinogen and fibronectin, on control and nanostructured Ti surfaces, functionalized with 200 ng/mL GDF-5 by simple adsorption, on mineralized matrix formation by calvarial osteogenic cell cultures; 2) molecular and phenotypic parameters characteristics of the acquisition of the osteogenic phenotype in vitro on Ti surfaces functionalized with GDF-5 by either simple adsorption or layer by layer (LbL) films; 3) parameters of bone formation adjacent to Ti implants with a nanostructured surface functionalized with GDF-5 by the two methods described in item 2, in a rabbit tibia model. The results showed that the post-adsorption of plasma proteins did not affect the osteogenic potential of cultures, except for the inhibitory effect of albumin when post-adsorbed alone. Either the Ti surface topography or the method for GDF-5 functionalization quantitatively affected mineralized matrix formation, with the higher osteogenic differentiation for nanostructured Ti functionalized with GDF-5 by simple adsorption and the lower one for LbL films, irrespective of the Ti surface topography on which they were mounted. ALP activity was higher for cultures grown on nanostructured Ti, including those functionalized with GDF-5, whose values, however, did not necessarily correspond to the higher osteogenic activity. Despite that, all groups expressed osteoblast differentiation markers, with a remarkable increase in osteopontin and osteocalcin mRNA levels for cultures grown on LbL films. The microtomographic, histologic and histomorphometric analyses revealed no qualitative or quantitative differences in vivo among the nanostructured Ti implants, yet a tendency for enhanced bone formation was observed for the functionalized surfaces and, between them, for the LbL films. Taken together, the results of the present in vitro and in vivo studies contribute to a better understanding of osteoblast and bone tissue responses to the functionalization of Ti surfaces with GDF-5 aiming to optimize osseointegration.

A causa mais comum da osteoporose é o declínio do hormônio sexual feminino, o estrógeno, que ocorre após a menopausa. Esse hormônio regula a produção de citocinas que influenciam a proliferação dos osteoclastos, aumentando a reabsorção óssea. Os efeitos da cafeína no metabolismo ósseo são controversos e podem estar associados ao aumento significativo de doenças periodontais, fraturas, aumento do cálcio urinário e redução da densidade mineral óssea, por exercer efeitos inibidores sobre as funções dos osteoblastos. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o efeito in vitro de diferentes concentrações de cafeína no metabolismo de células osteoblásticas da medula óssea de ratas osteoporóticas. Após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais, ratas Wistar foram divididas em dois grupos experimentais: controle (C) e submetidas à ovariectomia (OVX). Após 60 dias da cirurgia, as ratas foram sacrificadas para coleta dos fêmures e das células mesenquimais da medula óssea, que foram induzidas à diferenciação em osteoblastos com meio osteogênico com três concentrações de cafeína (1, 3 e 5 mM - grupos OVX1, OVX3 e OVX5) e cultivadas em placas de 24 poços (n = 5) para avaliação da proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP) bioquímica e in situ, detecção e quantificação de nódulos mineralizados e análise da expressão de genes relacionados à atividade osteoblástica através de PCR em tempo real. Os ensaios foram realizados em triplicata e analisados por meio do software estatístico GraphPad Prism, com nível de significância fixado em 5%. A proliferação celular foi menor nos grupos osteoporóticos com adição de cafeína, tendo a menor queda o grupo com adição de 1mM. O método bioquímico de ALP não foi significante nos períodos analisados, entretanto, aos 10 e 14 dias, a atividade aumentou quando a concentração de cafeína era maior. Já na atividade de ALP in situ, o grupo OVX1 foi o que apresentou melhor resultado nos períodos avaliados (p < 0,05), com pico aos 14 dias. A quantificação de matriz mineralizada foi maior no grupo OVX comparado ao grupo C; entre as concentrações, a maior quantificação dos nódulos de cálcio se deu no grupo com 1mM de cafeína. Os resultados obtidos no PCR mostraram que o gene para fosfatase alcalina teve maior expressão no grupo OVX, seguido do grupo OVX1 aos 7 e 10 dias; a expressão gênica de osteocalcina foi maior para o grupo OVX1 aos 10 e 14 dias e esse grupo apresentou a maior expressão em todos os períodos para os genes Runx2 e RankL. No caso do Bmp4, o grupo OVX3 foi o mais expresso aos 10 e 14 dias. Os genes osteoprotegerina e osteopontina variaram sua expressão de acordo com o período e grupo avaliado. A expressão de osterix foi similar entre os grupos aos 7 e 10 dias, enquanto a expressão de Bsp, aos 7 e 14 dias, mostrou semelhança entre os grupos controle e OVX1. Frente aos resultados obtidos, sugere-se que a concentração de 1mM de cafeína pareceu ser a menos prejudicial ao metabolismo das células osteoblásticas neste modelo experimental de osteoporose. / The most common cause of osteoporosis is the decrease of estrogen after menopause. This hormone regulates the production of cytokines that influence osteoclast proliferation, increasing bone resorption. The effects of caffeine in bone metabolism are controversial and may be associated to periodontal disease, bone fractures, increase of urinary calcium levels and reduction of mineral bone density due to inhibition of osteoblast activities. Thus, the goal of this investigation was to evaluate the in vitro effect of different caffeine concentrations in the metabolism of bone marrow osteoblastic cells from osteoporotic rats (OVX). After Ethical Committee approval, wistar female rats were divided in two experimental groups: control (C) and submitted to ovariectomy (OVX). After 60 days of surgery, femurs were removed to isolate bone marrow mesenchymal cells, which were induced to osteoblastic differentiation in osteogenic medium along with three different concentrations of caffeine (1, 3 and 5 mM - OVX1, OVX3 e OVX5 respectively) and posteriorly seeded in 24-well plates (n = 5) to evaluate cell proliferation, alkaline phosphatase activity and its in situ detection, detection and quantification of mineralized nodules as well as assess quantitative expression of genes associated to osteoblastic activity by means of real time PCR. All the experiments were performed in triplicate and analyzed by means of the statistical software GraphPad Prism for p<0.05. Cell proliferation was diminished in the all osteoporotic groups that received caffeine, with group OVX1 being the less affected. Biochemical assay of ALP activity did not show differences among the groups in the periods analyzed; nevertheless there was a tendency to a higher activity proportional to the higher concentration of caffeine. The in situ detection of ALP showed better results in group OVX1 after 14 days of culture. Mineralized matrix quantification was higher in OVX groups when compared to control group; among the concentrations, the higher quantification of calcium nodules was in group OVX1. The results obtained with PCR showed that the gene for ALP had its highest expression in OVX group, followed by OVX1 at 7 and 10 days; expression of osteocalcin was higher in OVX1 after 10 and 14 days and this same group presented higher expression in all periods for genes Runx2 e Rankl. Analysis of Bmp4 gene showed that it was expressed in group OVX3 after 10 and 14 days. The genes that code for osteoprotegerin and osteopontin had different expression values in accordance to the period and group evaluated. The expression of osterix was similar between the groups after 7 and 10 days, whereas the expression of Bsp was similar between control and OVX1 groups after 7 and 14 days. The results suggest that the concentration of 1mM of caffeine is the most beneficial to the metabolism of osteoblastic cells in a model of osteoporosis.

A osteoporose, uma doença óssea progressiva, é considerada um grave problema de saúde pública, sendo uma das condições mais importantes associadas ao envelhecimento e que afeta milhões de pessoas no mundo. Esta doença multifatorial é caracterizada pela densidade óssea reduzida e deterioração da microarquitetura óssea. O objetivo deste trabalho foi investigar as mudanças comportamentais em células mesenquimais da medula óssea e células osteoblásticas da calvária de ratas induzidas à osteoporose. Após aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais, 18 ratas Wistar foram utilizadas e divididas em grupos controle e ovariectomizadas. Após 150 dias, as ratas de ambos os grupos foram sacrificadas para coleta dos fêmures e fragmentos da calvária. As células recolhidas a partir da medula óssea e calvária foram cultivadas em placas de 24 poços (n = 5) para avaliação da proliferação e viabilidade celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), detecção e quantificação de nódulos mineralizados e análise da expressão gênica por meio de PCR em tempo real. Os dados foram submetidos ao testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, com nível de significância de 5%. As células da medula óssea do grupo controle (MC) mostraram uma diminuição significativa na proliferação quando comparado com as células do grupo controle da calvária (CC) em todos os períodos (p < 0,05). Por outro lado, as células da medula óssea de ratas com osteoporose (MO) revelaram um aumento significativo na taxa de proliferação após 7 e 10 dias (p < 0,01) em comparação às células da calvária de ratas ovariectomizadas (CO). A viabilidade celular foi maior em todos os períodos estudados dos grupos CC e CO em relação aos grupos MC e MO (p < 0,05). A atividade de fosfatase alcalina não foi significativamente diferente após 7 dias de cultura entre os grupos estudados; por outro lado, após 10 e 14 dias, observou-se uma diminuição da sua atividade no grupo MC quando comparado ao grupo CC (p < 0,01). Nas ratas com osteoporose, as células da medula óssea mostraram um aumento desta atividade quando comparada às células de calvária (p < 0,01). A análise dos nódulos mineralizados após 14 e 21 dias revelou que os grupos controle CC e MC não apresentaram diferenças significativas, ao passo que no grupo MO observou-se um aumento da mineralização quando comparado ao grupo CO nos mesmos períodos experimentais. Os resultados obtidos na análise de expressão gênica mostraram que para os genes Runx2, Oc, Alpl, Rank-l e Er&alpha; a expressão no grupo MO foi maior que no grupo MC (p < 0,05), enquanto que para as células da calvária, CC teve maior expressão gênica que CO (p < 0,05). Os genes Opg e Er&beta; apresentaram variações de acordo com o grupo avaliado. Frente aos resultados obtidos, sugere-se que existam alterações no metabolismo das células progenitoras e células diferenciadas após a indução da osteoporose e que as células da medula óssea apresentam um aumento da sua função como uma resposta compensatória neste modelo animal ovariectomizado. / Osteoporosis, a progressive bone disease, is considered a serious public health problem, being one of the most important conditions associated with aging, affecting millions of people worldwide. This multifactorial disease is characterized by reduced bone density and deterioration of bone microarchitecture. The objective of this work was to investigate the behavioral changes in mesenchymal cells from bone marrow and osteoblastic cells from calvaria bone of female rats induced to osteoporosis. After institutional review board approval, 18 Wistar female rats were used and divided into control and ovariectomized groups. After 150 days, the rats of both groups were sacrificed for collection of femurs and calvariae fragments. The cells collected from bone marrow and calvaria were cultured in 24-well plates (n=5) for the assessment of cell proliferation and viability, alkaline phosphatase (ALP) activity and detection and quantification of mineralized nodules. The data were submitted to Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests, with significance level set at 5%. The cells from bone marrow control group (MC) showed a significantly decrease in proliferation when compared to the cells from calvaria bone control group (CC) in all periods evaluated (p < 0,05). On the other hand, bone marrow cells from osteoporotic rats (MO) revealed a significant increase in their proliferation rate after 7 and 10 days (p < 0,01) compared to calvaria cells from ovariectomized rats (CO). Cell viability was higher in all investigated periods of CC and CO groups compared to MC and MO groups (p < 0,05). Alkaline phosphatase activity was not significantly different after 7 days of culture among the studied groups; in spite of that, after 10 and 14 days, there was a decrease in its activity in MC group when compared to CC (p < 0,01). In the osteoporotic rats, bone marrow cells showed an increase in this activity when compared to calvaria cells (p < 0,01). The analysis of mineralized nodules after 14 and 21 days revealed that control groups (CC and MC) did not have significant differences, whereas it was observed in MO group an increase in the mineralization when compared to CO in the same experimental periods. The data obtained in the analysis of gene expression showed that for Runx2, Oc, Alpl, Rank-l and Er&alpha; genes, the expression in MO group was higher than in MC (p < 0,05), whereas for the calvaria cells, CC group had higher gene expression than CO group (p < 0,05). The Opg and Er&beta; genes showed variations according to the evaluated group. Thus, it is suggested that there are changes in the metabolism of progenitor and differentiated cells after osteoporosis induction and that bone marrow cells present an enhancement of their function as a compensatory response in this ovariectomized rat model.

Moléculas de origem vegetal foram há muito testadas como fonte de drogas antineoplásicas com sucesso promissor. Este trabalho trata dos efeitos antiangiogênicos do Metil Jasmonato. Este derivado hidrofóbico do ácido jasmônico foi demonstrado anteriormente como um agente de dano seletivo para a mitocôndria de células neoplásicas. In vitro, o Metil Jasmonato 1-10 mM promoveu a morte celular de células endoteliais humanas de cordão umbilical (HUVEC) e de melanoma murino (B16 -F10), enquanto concentrações micromolares foram inócuas. A inclusão do Metil Jasmonato em liposomos de fosfatidilcolina e em um nanocarreador hidrofílico baseado em açúcar mostrou efeitos diferenciais sobre a citotoxicidade. A interrupção do ciclo celular foi observada em concentrações citotóxicas, enquanto a diminuição na produção de VEGF e algum grau de autofagia foram sugeridos em concentrações micromolares. In vivo, Metil Jasmonato 1-10mM foi francamente tóxico, e reduziu a densidade de vasos em membranas corioalantóicas de embrião de galinha (CAM). Entretanto, concentrações entre 1-10 ?M produziram um efeito complexo. Ocorreu aumento no brotamento capilar, mas os novos vasos apresentaram-se frágeis e menos organizados que os controles correspondentes. Sugere-se que, além da toxicidade direta, a ação do Metil Jasmonato sobre a angiogênese seja relevante para seu efeito antineoplásico. / Molecular plant components have long been tested as sources for antineoplasic drugs with promising success. The present work deals with the anti-angiogenic effects of Methyl Jasmonate. This hydrophobic Jasmonate derivative was previously demonstrated to selectively damage the mitochondria of cancer cells. In vitro, 1-10 mM Methyl Jasmonate induced the cell death of the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and the Murine melanoma cells (B16-F10), while micromolar concentrations were ineffective. Methyl Jasmonate inclusion in phosphatidylcholine liposomes and in an hydrophilic sugar based nanocarrier presented differential effects upon citotoxicity. Cell cycle arrest was observed in citotoxic concentrations, while VEGF withdrawn and some autophagy was suggested in the micromolar range. In vivo, 1-10mM concentrations were explicitly toxic and reduced the vessel density of the Chorioallantoic Membrane of the Chicken Embryo (CAM). However, 1-10 ?M concentrations produced a complex effect. There was increased capillary budding, but the new vessels were leakier and less organized than corresponding controls. It is suggested that not only direct toxicity, but also the drug effects upon angiogenesis are relevant to the antineoplasic effects of Methyl Jasmonate.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial de frango. Doenças respiratórias compreendem o principal problema sanitário e levam à condenação de um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. Dentre estes problemas, o vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) tem adquirido grande importância nos últimos anos, devido a surtos da doença clínica, como em Bastos (SP) em 2002. Mais recentemente, VLTI vem sendo isolado de galinhas e perus das regiões Sudeste-Sul do Brasil. Dando continuidade aos trabalhos desenvolvidos no laboratório, um isolado de peru foi inoculado experimentalmente em galinhas e perus susceptíveis reproduzindo a doença de forma branda em ambas as espécies. Também foram testados diferentes cultivos celulares de linhagem CER, CEC-32, HD11, Vero e um primário de embrião de galinha para a efetiva replicação do ILTV, com o propósito de aumentar o título viral e a qualidade do DNA viral extraído. O cultivo primário de fibroblasto de embrião de galinha foi o cultivo mais eficiente na replicação do ILTV dentre todos os estudados. Isolados de perus e galinhas foram seqüenciados a partir das regiões genômicas da timidina kinase e glicoproteína C, e alinhados com uma cepa vacinal e amostras de referência, obtidas no GenBank, demonstrando alta similaridade entre as amostras, sugerindo uma origem comum recente. Com o propósito de desenvolvimento de um recombinante com deleção da glicoproteína E, com o objetivo de atenuar a virulência do ILTV, foi concluído um cassete de clonagem contendo as regiões flanqueadoras da glicoproteína E e um gene marcador EGFP. / Actually, Brazil is the second major poultry producer and exporting country. Respiratory diseases comprising the most important sanitary problems that leads to condemnation of many poultry carcass and productivity losses. Between these problems, the laryngotracheitis virus (ILTV) is displaying great importance following by outbreaks of the disease, such as that occured in Bastos (SP), 2002, Brazil. Epidemiological studies showed the presence of antibodies from avian flocks and the existence of carrier birds without clear clinical signs. More recently, the ILTV has been isolated from chicken and turkeys of the southest-south of Brazil. Continuing the works at laboratory, a turkey isolate was inoculated experimentally in susceptible chicken and turkeys and the reproducible of a mild disease was displayed in both species. Also, different line cell cultures CER, CEC-32, HD11, Vero and a primary fibroblast cell culture were tested for the effective propagation of ILTV with the propose to get greatest titers and the quality of viral DNA extracted. The primary fibroblast cell culture was the most efficient to replicate ILTV. Turkey and chicken isolates was sequenced from de regions of thymidine kinase and glycoprotein C and were alignment with a vaccine strain and reference strains (GenBank) displaying high homology between them, suggesting a common origin. A cloning cassette containing the regions flanking glycoprotein E and a marker gene EGFP was constructed with the purpose to develop a recombinant with deletion of the glycoprotein E.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-04T13:11:29Z No. of bitstreams: 1 Rosana Leo de Santana.pdf: 693786 bytes, checksum: b9d2b7d60669ce82e4b87ed63463daad (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-04T13:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosana Leo de Santana.pdf: 693786 bytes, checksum: b9d2b7d60669ce82e4b87ed63463daad (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / Contagious ectima is a severe and proliferartive virus among ovine and caprine caused by the contagious ectima virus (ECV) of the Parapoxvirus genus. The control of the infection in endemic regions is done with vaccines, however there are limitations in the vaccine production due to the difficulties in replicating the virus in cell cultures. The purpose of this paper is to evaluate the behavior of ECV samples in primary cultures of fetal caprine cornea cells, a system of cultures yet untested for the replication of ECV. Crust samples from nine sheep and two goats from the states of Bahia, Sergipe and Paraiba and presenting the clinical symptoms of EC were inoculated in monolayers of the cells, during seven consecutive passages at weekly intervals. During all the occasions we observed, after 24 hours of infection, the cytopathic effect (CE) characterized by cell rounding, fusion with the formation of small sincicia, cytoplasmatic inclusion and vacuolation. The intensity of detachment from the cell layers ranged from 25% to 100% which varied according to the sample. We concluded that the primary cell cultures of the fetal caprine cornea appeared highly permissible to replication of ECV and the isolated samples of ECV appeared to adapt to the utilized culture with slight variation among samples. / Ectima contagioso (EC) é uma virose aguda e proliferativa de ovinos e caprinos, causada pelo vírus do ectima contagioso (ECV), do gênero Parapoxvirus. O controle da infecção em regiões endêmicas é realizado através de vacinação, porém existem limitações nas técnicas de produção de vacinas, que é a dificuldade de replicação do vírus em cultivo celular. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de isolar e avaliar o comportamento das amostras de ECV em cultivo primário de células de córnea fetal caprina (CFC), sistema de cultivo ainda não testado para replicação de ECV. Amostras de crostas de nove ovinos e de dois caprinos que apresentavam sintomatologia clínica de EC, originários dos Estados da Bahia, Sergipe e Paraíba, foram inoculadas em monocamadas de células epiteliais de córnea de feto caprino, durante sete passagens consecutivas, a intervalos semanais. Observou-se em todas passagens, a partir de 24 horas pós infecção, efeito citopático (ECP) caracterizado pelo arredondamento celular, fusão com formação de pequenos sincícios, vacuolização e corpúsculos de inclusão citoplasmático, com intensidade de 25% a 100% de desprendimento da camada celular, que variou de acordo com a amostra. Conclui-se que as culturas de células primárias de córnea fetal caprina mostraram-se altamente permissíveis à replicação do ECV e que as amostras de ECV isoladas mostraram-seadaptadas ao cultivo utilizado, com pequena variação entre as amostras.

Orientador: Carlos Eduardo Steiner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_KarinaSoares_M.pdf: 3290868 bytes, checksum: 62ac845d38c989b1515d635bf2bfa79b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Mosaico pigmentar tipo Ito é uma alteração cutânea frequente, caracterizada por hipopigmentação da pele que, na maioria dos casos, segue o padrão linhas de Blaschko, geralmente associada a anomalias extracutâneas, sobretudo anomalias do Sistema Nervoso Central (SNC). Sugere-se que esse padrão decorre da presença e migração de duas linhagens celulares no período embrionário, com diferente expressão de genes associados à pigmentação, que darão origem à epiderme e ao SNC no feto. Diversos tipos de mosaicismo foram associados ao quadro e acredita-se que os casos em que não houve tal detecção se devam à limitação das células analisadas. Devido à função, origem embrionária e migração celular, possivelmente o mosaicismo seria melhor identificado em melanócitos e queratinócitos, principalmente na presença de alterações no SNC, as alterações poderiam ter envolvimento com o prognóstico neurológico. Neste estudo foi realizada análise citogenética de linfócitos e fibroblastos de 15 indivíduos com mosaico pigmentar do tipo Ito. Os objetivos incluíram padronizar a cultura de células de melanócitos e queratinócitos, visando analisar o cariótipo desses indivíduos nesses tipos celulares. O estudo citogenético nesses tipos celulares, porém, não pode ser realizado devido à dificuldade de se obter metáfases adequadas para análise. Assim, foi desenvolvido protocolo de cultura e análise citogenética em queratinócitos, o qual funcionou adequadamente em indivíduos testes, porém sem resultado semelhante nos sujeitos de pesquisa. A preparação cromossômica a partir de melanócitos, por outro lado, não se mostrou adequada. Na análise de linfócitos e fibroblastos, foram encontradas alterações cromossômicas diferentes em quatro indivíduos (26% da casuística), presentes em ambos os tipos celulares. Não foram observadas divergências nas amostras a partir de pele hipo e normopigmentadas. Essas alterações incluíram um caso de t(X;21) regular, para o qual foram realizados estudos complementares de forma a aprimorar a investigação laboratorial, sendo análise por array-CGH, FISH e estudo de inativação de X. Um caso se tratou de trissomia 18 em mosaico, nesse indivíduo não foi possível a coleta de biópsia, porém foi realizado FISH interfásico em células da mucosa oral. Houve também um caso de r(22) em mosaico, o único que apresentou diferença na proporção de células alteradas em fibroblastos e linfócitos, possivelmente por maior instabilidade in vitro de cromossomos em anel em culturas de longa duração. O último caso alterado se refere a um cromossomo marcador, também em mosaico. Os resultados obtidos foram comparados com dados da literatura prévia. Assim, apenas um caso apresentou alteração cromossômica não em mosaico, representada por uma translocação X/autossomo regular, para a qual as técnicas de estudo utilizadas não detectaram justificativa para o padrão de mosaicismo observado clinicamente / Abstract: Pigmentary mosaicism of Ito type is a skin abnormality often characterized by hypopigmentation of the skin following, in most cases, the Blaschko lines, usually associated with extracutaneous abnormalities, especially abnormalities of the central nervous system (CNS). It is suggested that this pattern arises from the presence and migration of two cell lineages in the embryonic period, with different expression of genes associated with pigmentation, which will give rise to the epidermis and the CNS in the fetus. Several types of mosaicism have been associated with this disorder. In cases in which no mosaicismo was detected, it is believed that this may be secondary to the limitation of the cells analyzed. Due to the function and embryonic cell migration, in individuals with pigmentary mosaicism, a cytogenetic mosaicism possibly would be better identified in melanocytes and keratinocytes, especially in the presence of changes in the CNS. Besides, these changes could prognose the neurological outcome. This study comprehended cytogenetic analysis of lymphocytes and fibroblasts from 15 individuals with pigmentary mosaicism of Ito type. The targets included standardize the cell culture of melanocytes and keratinocytes in order to analyze the karyotype of these individuals in these cell types. The cytogenetic study in these cell types, however, was not possible due to difficulties in obtaining adequate metaphases for analysis. Given this difficulty, another cell type (fibroblasts) was studied. In the end, chromosomal abnormalities in lymphocytes and fibroblasts were identified in four individuals. These included one case of a balanced traslocation X/21, one case of trisomy 18 mosaicism, one case of a ring 22 mosaic and one marker chromosome, also in mosaic. Considering the results of cytogenetic lymphocytes and fibroblasts, additional studies were undertaken to enhance the laboratory investigation of these cases, including array-CGH, FISH and study of X inactivation. The results were compared with previous literature data. In conclusion, we developed protocol for culture and cytogenetic analysis in keratinocytes, which worked well on test subjects, but without similar results in study subjects. The chromosome preparation from melanocytes, however, was not adequate. There were no differences in samples from different area of skin. Only one case showed different proportion of cells altered in fibroblasts and lymphocytes, possibly due to instability of ring chromosomes in long duration cultures. Finally, only one case showed no chromosomal abnormality in mosaic, represented by a regular translocation X/autosome, for which the techniques used to study detected no explanation for the pattern of mosaicism observed clinically / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Regina Maria Puppin-Rontani / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:32:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castilho_AlineRogeriaFreirede_D.pdf: 4223932 bytes, checksum: d68ac38e0ad424f4cce1e0e952fd0608 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Procedimentos de remoção parcial de cárie, indicados para os dentes com lesão de cárie profunda, utilizam-se do preceito de retirar a dentina mais amolecida e infectada,deixando-se uma fina camada de dentina afetada por cárie, sobre a câmara pulpar, evitandoseassim, exposição pulpar mecânica. Contudo, algumas bactérias cariogênicas podem permanecer na dentina por indeterminados períodos de tempo, podendo ocasionar progressão da lesão. Assim, estudos conduzidos com o propósito de melhorar a propriedade antibacteriana de materiais restauradores, sem, contudo produzir efeitos citotóxicos em células odontoblastóides e capaz de manter as propriedades básicas do material pode ser uma alternativa no tratamento de lesões de cárie profundas, uma vez que não existe um produto comercialmente disponível que associe todas estas características. No intuito de facilitar a apresentação desta Tese, a mesma foi dividida em dois capítulos, como descrito nas proposições seguintes. Capítulo 1: avaliar in vitro as propriedades biológicas (ação antibacteriana contra Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei e Actinomyces viscosus, e cito toxicidade em células de linhagem odontoblástica MDPC-23)e mecânicas (resistência à compressão e à tração diametral) de um cimento de ionômero de vidro modificado por resina (Fuji Lining LC), contendo digluconato de clorexidina em diferentes concentrações (0,2%, 0,5%, 1,25% e 2,5%) e assim determinar a concentração terapêutica para utilização desta substância em tratamentos restauradores. Capítulo 2:verificar in vitro o comportamento de um cimento de ionômero de vidro modificado por resina (Fuji Lining LC) contendo hiclato de doxiciclina nas concentrações 1,5%, 3% e 4,5%frente a diferentes patógenos cariogênicos (Streptococcus mutans, Lactobacillusacidophilus, Lactobacillus casei e Actinomyces viscosus), células odontoblástóides MDPC-23 e quando submetidos aos ensaios mecânicos de resistência à compressão e à tração diametral. Os resultados observados em ambos os estudos mostraram que a incorporação de antimicrobianos ao cimento de ionômero de vidro, é capaz de melhorar significativamente efeito inibitório do cimento contra microrganismos criogênicos. A adição de dig luconato de clorexidina a 2,5% promoveu ligeira alteração no metabolismo e morfologia das células MDPC-23. O hiclato de doxiciclina, quando incorporado ao ionômero de vidro mesmo em maiores concentrações, não causou efeitos tóxicos em cultura de células odontoblásticas MDPC-23. Além disso, o cimento de ionômero de vidro contendo digluconato declorexidina a 2,5% apresentou resistência à compressão reduzida, sem alteração da propriedade de resistência a tração diametral do cimento. A adição de hiclato de doxiciclina não alterou as propriedades mecânicas do cimento. Assim, a adição de hiclato de doxiciclina e de digluconato de clorexidina nas concentrações estudadas produziu aumento na atividade antimicrobiana sem efeitos citotóxicos e alteração nas propriedades mecânicas da mistura, exceto para o digluconato de clorexidina a 2,5%, que apresentou o menor resistência a compressão e alterações no metabolismo e morfologia de células pulpares. / Abstract: Partial caries removal approaches are indicated to the management of deep caries. It consists of the incomplete removal of softened carious dentine during cavity preparation, leaving a soft dentine layer over the pulp, so that it is not mechanically exposed. However, some viable cariogenic bacteria have been found in the remaining affected dentine, which may promote caries lesion progression. Therefore, studies aimed to improve inhibitory effect of the restorative materials, without cytotoxic effects on odontoblast cells and able to keep properties of material could be an alternative to the treatment of deep caries lesions. Nevertheless, the disposal-marketed products do not associate all those features. In order to facilitate the accomplishment of this Thesis, it was divided into two chapters, as described on the following descriptions. Chapter 1: to evaluate in vitro biological properties (antibacterial effect against Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Actinomyces viscosus, and cytotoxicity at odontoblast cell line MDPC-23) and mechanical properties (compressive strength and diametral tensile strength) of a resin-modified glass ionomer cement (Fuji Lining LC) containing different concentrations of chlorhexidine digluconate (0.2%, 0.5%, 1.5% and 2.5%) and, thus to determine the therapeutic concentration of it for using in restorative dental treatment. Chapter 2: to verify in vitro the performance of a resin-modified glass ionomer cement (Fuji Lining LC) containing the antibiotic doxycycline hyclate at 1.5%, 3% and 4.5% against some cariogenic pathogens (Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Actinomyces viscosus); to analyze it indirect contact with odontoblast-like MDPC-23 cells; and, to reveal the mechanical properties under compressive strength and diametral tensile strength. Results of both studies proved that the incorporation of antimicrobials at adequate proportions into the glass ionomer cement have the ability to become better inhibitory effects of the cement against cariogenic bacteria. The 2.5% chlorhexidine digluconate added to glass ionomer cement promoted slight alteration on the mebolism and morfology of MDPC-23 cells. The incorporation of doxycycline hyclate to glass ionomer cement, even in the highest concentration, did not cause toxic effects on culture of odontoblast-like MDPC-23 cells. In addition, 2.5% chlorhexidine digluconate-containing glass ionomer cement decreased the compressive strength of cement, although there was no difference to diametral tensile strength. The adding of doxycycline hyclate did not alter mechanical properties of cement. It was concluded that doxycycline hyclate and chlorhexidine digluconate in the studied concentrations produced increased antimicrobial activity without cytotoxic effects and changes in mechanical properties of the mixture, except for the 1.25% chlorhexidine digluconate that presented the lowest compressive strength and alterations on metabolism and morphology of pulp cells. / Doutorado / Odontopediatria / Doutor em Odontologia

Orientadores: Francisco Humberto Nociti Junior, Karina Gonzales Silvério Ruiz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:11:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_Thaisangela_D.pdf: 14210209 bytes, checksum: 51042175513bdc9b288a951af21a21ac (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A formação deficiente do cemento acelular sobre a raiz dentinária de pacientes com hipofosfatasia (HPP) elucida a importância da expressão local da enzima fosfatase alcalina (TNAP) durante a cementogênese. Os objetivos desses estudos foram: i) apresentar dois casos clínicos de perda prematura de dentes decíduos diagnosticados como odonto-HPP; ii) caracterizar diferencialmente o perfil de expressão gênica de células da polpa e ligamento periodontal em indivíduos saudáveis e com HPP em relação a genes envolvidos com o metabolismo do fosfato inorgânico (Pi). iii) caracterizar o reparo e regeneração dos tecidos periodontais em modelo de fenestração periodontal realizado em camundongos com bloqueio do gene da proteína de anquilose (Ank KO). Métodos: i) Pacientes apresentaram esfoliação precoce dos decíduos aos dois anos de idade, mantendo-se em tratamento odontológico rigoroso. Ambos apresentaram baixos níveis séricos de fosfatase alcalina (ALP), porém sem anormalidade esquelética chegando-se ao diagnóstico de odonto-HPP; ii) Análise da expressão de genes associados à homeostasia entre fosfato e pirofosfato (Pi/PPi) foi realizada em tecidos da polpa e ligamento periodontal (PDL) de indivíduos saudáveis. Cultura de células primárias da polpa e PDL obtidas de pacientes saudáveis e com HPP foram estabelecidas para os ensaios de mineralização e expressão gênica; iii) Defeitos de fenestração periodontal (2mm/1mm/0,5mm) foram criados na vestibular de molares mandibulares de camundongos Ank KO e wild-type (WT). Após 15 e 30 dias das cirurgias, as mandíbulas foram coletadas para análise histológica, histomorfometria, avaliação in vivo com marcadores fluorescentes, e imunohitoquímica para proteínas da matriz extracelular. Resultados: i) Cuidados odontopediátricos e terapia periodontal de suporte foram realizados durante 19 anos com o objetivo de prevenir/adiar possíveis perdas de dentes permanentes; ii) Nos tecidos saudáveis, PDL manteve maior e significativa expressão basal para os genes reguladores chaves do PPi quando comparado com a polpa, como fosfatase alcalina (Alpl), proteína de anquilose pregressiva (Ank), e glicoproteína 1 (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 - Enpp1). In vitro, embora as alterações mais dramáticas fossem encontradas nas células do PDL, tanto as células HPP PDL como HPP-polpa exibiram significativamente baixa atividade de ALP, menor mineralização e expressões reduzidas dos genes associados com a mineralização e regulação do Pi/PPi, comparado ao controle; iii) Grande quantidade de novo cemento foi observada nos camundongos Ank KO após 15 e 30 dias da cirurgia. (p<0,05). Os marcadores fluorescentes indicaram maior atividade de deposição cementária nas áreas dos defeitos nos Ank KO vs. WT. Durante os períodos de 15 e 30 dias de cicatrização, regeneração do cemento e células associadas nos Ank KO recapitularam o padrão de expressão gênica mapeada durante o desenvolvimento, incluindo expressão limitada de BSP e forte OPN e DMP1 na matriz cementária, bem como elevada expressão de NPP1 nos cementoblastos. Conclusões: Dentro dos limites desse estudo, podemos concluir que: i) a perda prematura de dentes decíduos na ausência de desordens esqueléticas pode servir como um sinal inicial crítico para o diagnóstico de odonto-HPP e outros subtipos; ii) os dados sugerem que há uma diferença importante no comportamento in vitro entre as células controle e HPP, incluindo a expressão basal dos genes relacionados ao cemento bem como suas capacidades de promoverem a formação de minerais; iii) Dentro dos limites do estudo, os achados sugerem que níveis reduzidos de PPi local pode promover um aumento da regeneração do cemento. Portanto, a modulação entre Pi/PPi pode ser uma potente abordagem terapêutica para alcançar melhoras na regeneração do cemento. / Abstract: The defective formation of acellular cementum along the tooth root in patients with hypophosphatasia (HPP) have been highlighted the importance of local expression of alkaline phosphatase enzyme (TNAP) for cementogenesis. The aims of these studies were: i) to present two clinical cases that premature loss of primary teeth guided to the diagnosis of odontohypophosphatasia (odonto-HPP); ii) to determine factors contributing to the divergent response of the periodontium and dentin to alterations of phosphate (Pi) metabolism; and iii) to analyze tissue repair and regeneration in a periodontal fenestration model in Ank knock-out (KO) mice. Methods: i) Patients had teeth exfoliation at 2 yearsold, and have been under maintenance visits since then. Both exhibited low levels of serum alkaline phosphatase (ALP) activity, but no additional skeletal abnormalities, prompting a diagnosis of odonto-HPP; ii) Constitutive expression of Pi/PPi-associated genes in periodontal ligament (PDL) versus pulp tissues obtained from healthy subjects were analyzed. Primary cell cultures from control and HPP-PDL and pulp tissues were established to assay mineralization and gene expression; iii) Periodontal fenestration defects (2mm/1mm/0.5mm) were created on the buccal aspects of mandibular molars in Ank KO and wild-type (WT) mice. Mandibles were harvested at 15, and 30 days postsurgery for histology, histomorphometry, evaluation of in vivo fluorochrome labeling, and immunohistochemistry (IHC) for extracellular matrix proteins. Results: i) Pediatric dental care and supportive periodontal therapy were performed during the subsequent 19 years, aimed at avoiding or delaying loss of permanent teeth. ii) In healthy tissues, PDL maintained significantly higher basal expression of key PPi regulators, liver/bone/kidney alkaline phosphatase (Alpl), progressive ankylosis protein (Ank) and ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (Enpp1), versus pulp. In vitro, although more dramatic changes were found for PDL-harvested cells, both HPP-PDL and HPP-pulp cells exhibited significantly lower alkaline phosphatase activity, mineralization, and depressed expression of genes associated with mineralization and regulation of Pi/PPi, versus control cells. iii) A greater amount of new cementum was observed for Ank KO mice at 15 and 30 days post-surgery (p<0.05). Fluorochrome labeling further indicated a higher appositional activity in the defect areas in Ank KO vs. controls. At days 15 and 30 during healing, regenerating cementum and associated cells in Ank KO recapitulated expression patterns mapped during development, including limited BSP and strong OPN and DMP1 in the cementum matrix, as well as elevated NPP1 in cementoblasts. Conclusions: Within the limits of these studies, we can conclude that: i) premature loss of deciduous teeth in absence of skeletal disorders may serve as a critical trigger sign for diagnosis of odonto- HPP or other subtypes; ii) the data suggest that there are important differences in the in vitro behavior of control versus HPP cells, including basal expression of cementum-related genes as well as their capacity to promote mineral formation; iii) these findings suggest that reduced local levels of PPi can promote increased cementum regeneration. Therefore, local modulation of Pi/PPi may be a potential therapeutic approach for achieving improved cementum regeneration. / Doutorado / Periodontia / Doutor em Clínica Odontológica