Introdução: A modulação da resposta imune em muitas situações clínicas persiste como um dos problemas mais desafiadores em imunologia. Citocinas são fundamentais para esta regulação e são amplamente estudadas. Após a ligação com receptores específicos na superfície das células alvo, uma das principais vias de sinalização é o sistema JAKs/STATs. No entanto, em contraste com as citocinas, não existem estudos detalhados sobre a cinética expressão intracelulares de STAT in vitro. Objetivo: Determinar por citometria de fluxo, a cinética expressão de proteínas STAT 1, 3, 4, 5 e 6 fosforiladas, a produção de citocinas associadas e expressão de seus receptores em PBMC humanas estimuladas in vitro com fito-hemaglutinina (PHA) e antígeno de citomegalovírus (CMV). Metodologia: Foram avaliados CMNs de 23 doadores saudáveis em relação à cinética de expressão STATs (12 doadores estimulados com PHA e 11 estimulados com CMV), secreção de citocinas e expressão de seus receptores. Resultados: Em células estimulada com PHA e CMV, pSTAT1 e 6 tiveram sua expressão aumentada precocemente (4h e três dias, respectivamente). pSTAT3 teve sua expressão aumentada em momentos posteriores (respectivamente 36h e 6 dias). A indução de expressão de pSTAT4 e 5 foi observada nos tempos mais tardios da cinética em células estimuladas com PHA (24-36h), enquanto observamos constante baixo nível de expressão em todos os tempos analisados em células estimuladas com CMV. No que diz respeito á secreção de citocinas em células estimuladas com PHA, níveis maiores de IL-6, IL-10 e IL-4 foram detectados a partir de 12h, enquanto aumento da secreção de IFN-y e IL-2 ocorreu a partir de 24h. Com CMV, apenas IL-6 mostrou um aumento da secreção nos dias 4 e 6. Os receptores de citocinas CD119 (IFN-g), CD126 (IL-6), CD210 (IL-10), CD212 (IL-12), CD25 (IL -2) e CD124 (IL-4) tiveram um aumento da expressão após 24-36h de estimulação com PHA. Com estímulo de CMV, CD126, CD212, CD25, também aumentaram a expressão em tempos tardios (5-6 dias), enquanto os outros receptores mantiveram níveis baixos de expressão em todos os momentos estudados. Discussão: Houve uma correlação entre a cinética de expressão de pSTAT3 e 5, e a cinética das citocinas associadas e de seus receptores (IL-6 / CD126, IL-10 / CD210 e IL-2 / CD25). A cinética de expressão de pSTAT4 se correlacionou com a expressão de CD212. (IL-12p70 não foi detectada no presente estudo). Entretanto a expressão de pSTAT1 e 6 precedeu à de IFN-y / CD119 e IL-4 / CD124. Conclusão: A determinação da cinética de expressão pSTAT in vitro pode contribuir para a compreensão da regulação da resposta imune a patógenos distintos e, potencialmente, ajudar no desenvolvimento de novos alvos terapêuticos bem como de novas estratégias destinadas a modular as vias de sinalização em diversas condições clínicas associadas à desregulação imunológica / Introduction: Modulation of immune responses in many clinical situations persists as one of the most challenging issues in immunology. Cytokines are fundamental to this regulation and have already been extensively studied. After binding with its specific receptors on the surface of the target cells, the main signaling pathway is the JAKs/STATs system. However, in contrast to cytokines, there are no detailed studies on the in vitro intracellular expression kinetics of STATs. Objective: To determine by flow cytometry the kinetics of phosphorylated STAT1, 3, 4, 5 and 6 proteins expression in human PBMCs in vitro stimulated with phytohemagglutinin (PHA) and cytomegalovirus antigen (CMV), and the associated cytokine production and cytokine receptors expression. Methodology: We evaluated PBMCs from 23 healthy donors regarding the kinetics of STATs expression (12 donors stimulated with PHA and 11 stimulated with CMV), cytokine secretion and respective receptors expression. Results: In PHA and CMV stimulated cells, pSTAT 1 and 6 expression increased early, 4h and 3days respectively). pSTAT3 expression augmented at later times (respectively 36h and 6 days). pSTAT4 and 5 expression were observed late in PHA stimulated cells (24-36h), while there was a constantly low level of expression in all times analyzed. Regarding cytokine release In PHA stimulated cells, IL-6, IL10 and IL-4 secretion started to increase at 12h while IFN-y and IL-2 increased at 24h. With CMV, only IL-6 showed increased expression at days 4 and 6. The cytokines receptors CD119 (IFN-g), CD126 (IL-6), CD210 (IL-10), CD212 (IL-12), CD25 (IL-2) and CD124 (IL-4) had increased expression at 24-36h with PHA stimulation. With CMV stimulation, CD126, CD212, CD25 also had increased expression at late times (5-6 days) while the other receptors maintained low expression levels at all times. Discussion: There was a correlation in between the pSTAT3 and 5 expression kinetics and the associated cytokines and cytokine receptors kinetics (IL-6/CD126, IL-10/CD210 and IL-2/CD25. pSTAT4 expression kinetics correlated with that of CD212 expression (IL-12p70 was not detected in the present study). The higher pSTAT1 and 6 expressions preceded that of IFN-y/CD119 and IL-4/CD124, respectively. Conclusion: Determination of pSTAT expression kinetics in vitro can contribute to the understanding of the regulation of immune responses to distinct pathogens and potentially help in the design of new therapeutic targets as well as new strategies aimed at modulating signaling pathways

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-06T16:48:24Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CorrelacaoNiveisSericos.pdf: 2350716 bytes, checksum: b65d84de883c9922cf963257ddc6a7b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-12T12:41:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CorrelacaoNiveisSericos.pdf: 2350716 bytes, checksum: b65d84de883c9922cf963257ddc6a7b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-12T12:41:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_CorrelacaoNiveisSericos.pdf: 2350716 bytes, checksum: b65d84de883c9922cf963257ddc6a7b0 (MD5) Previous issue date: 2010 / A hepatite B crônica apresenta amplo espectro de manifestações clínicas, resultante de diversos fatores, tais como o padrão de secreção e polimorfismo nos genes de citocinas. Este trabalho objetiva correlacionar os polimorfismos TNF-α -308G/A, INF-γ +874A/T, TGF-β1 -509C/T e IL-10 -1081A/G e os níveis séricos destas citocinas com a apresentação clínica da hepatite B. Foram selecionados 53 casos consecutivos de hepatite B, sendo divididos em grupo A (portador inativo= 30) e B (hepatite crônica/cirrose= 23). Como grupo controle, selecionaram-se 100 indivíduos com anti-HBc e anti-HBs positivos. Os níveis séricos das citocinas foram determinados por ensaios imunoenzimáticos, tipo ELISA (eBiosceince, Inc. Califórnia, San Diego, USA). A amplificação gênica das citocinas se realizou pela PCR e a análise histopatológica obedeceu à classificação METAVIR. Identificou-se maior prevalência do genótipo TNF-α -308AG (43,3% vs. 14,4%) no grupo B do que nos controles e a presença do alelo A se correlacionou com risco de infecção crônica pelo VHB (OR= 2,6). Os níveis séricos de INF-γ e de IL-10 foram maiores (p< 0,001) nos controles do que os demais grupos e, inversamente, as concentrações plasmáticas de TGF-β1 foram menores no grupo controle (p< 0,01). Observou-se, na histopatologia hepática, que atividade inflamatória > 2 se correlacionou com maiores níveis de TNF-α e de INF-γ (p< 0,05), assim como a fibrose > 2 com maiores níveis de INF-γ (p< 0,01). Na população pesquisada, menores níveis séricos de INF-γ e de IL-10 e maiores de TGF-β1 estiveram associados com a hepatite B crônica, bem como a presença do alelo A no gene TNF-α - 308 aumentou em 2,6 o risco de cronificação. / Chronic hepatitis B has a wide spectrum of clinical manifestations resulting from various factors, such as the pattern of secretion and polymorphism in cytokine genes. This work aims to correlate the TNF-α -308G/A, INF-γ +874A/T, TGF-β1 -509C/T e IL-10 -1081A/G polymorphisms and serum levels of these cytokines with the clinical presentation of hepatitis B. It was selected 53 consecutive cases of hepatitis B divided into group A (inactive carrier= 30) and B (chronic hepatitis / cirrhosis= 23). As a control, we selected 100 individuals anti-HBc and anti-HBs positives. Serum levels of cytokines were determined by enzyme immunoassays (eBiosceince, Inc. California, San Diego, USA). The gene amplification of cytokines was carried out by PCR and histopathological analysis followed by METAVIR classification. It was identified that genotype TNF-α -308GA was more prevalent among B group than controls and that presence of A allele increased the risk for chronic disease (OR= 2,6). The serum levels of INF-γ and IL-10 were higher (p <0,001) in controls than others groups A and B and the TGF-β1 levels were lower (p < 0,01) in controls. It was noted that inflammatory activity > 2 correlated with higher levels of TNF-α and IFN-γ (p<0.01) and fibrosis > 2 with higher levels of INF-γ (p <0.01). In the studied population, lower INF-γ and IL-10 levels and higher TGF-β1 level were associated with chronic hepatitis B, and that the presence TNF-α -308 A allele increased in 2,6 the risk for chronic disease .

Introdução: A modulação da resposta imune em muitas situações clínicas persiste como um dos problemas mais desafiadores em imunologia. Citocinas são fundamentais para esta regulação e são amplamente estudadas. Após a ligação com receptores específicos na superfície das células alvo, uma das principais vias de sinalização é o sistema JAKs/STATs. No entanto, em contraste com as citocinas, não existem estudos detalhados sobre a cinética expressão intracelulares de STAT in vitro. Objetivo: Determinar por citometria de fluxo, a cinética expressão de proteínas STAT 1, 3, 4, 5 e 6 fosforiladas, a produção de citocinas associadas e expressão de seus receptores em PBMC humanas estimuladas in vitro com fito-hemaglutinina (PHA) e antígeno de citomegalovírus (CMV). Metodologia: Foram avaliados CMNs de 23 doadores saudáveis em relação à cinética de expressão STATs (12 doadores estimulados com PHA e 11 estimulados com CMV), secreção de citocinas e expressão de seus receptores. Resultados: Em células estimulada com PHA e CMV, pSTAT1 e 6 tiveram sua expressão aumentada precocemente (4h e três dias, respectivamente). pSTAT3 teve sua expressão aumentada em momentos posteriores (respectivamente 36h e 6 dias). A indução de expressão de pSTAT4 e 5 foi observada nos tempos mais tardios da cinética em células estimuladas com PHA (24-36h), enquanto observamos constante baixo nível de expressão em todos os tempos analisados em células estimuladas com CMV. No que diz respeito á secreção de citocinas em células estimuladas com PHA, níveis maiores de IL-6, IL-10 e IL-4 foram detectados a partir de 12h, enquanto aumento da secreção de IFN-y e IL-2 ocorreu a partir de 24h. Com CMV, apenas IL-6 mostrou um aumento da secreção nos dias 4 e 6. Os receptores de citocinas CD119 (IFN-g), CD126 (IL-6), CD210 (IL-10), CD212 (IL-12), CD25 (IL -2) e CD124 (IL-4) tiveram um aumento da expressão após 24-36h de estimulação com PHA. Com estímulo de CMV, CD126, CD212, CD25, também aumentaram a expressão em tempos tardios (5-6 dias), enquanto os outros receptores mantiveram níveis baixos de expressão em todos os momentos estudados. Discussão: Houve uma correlação entre a cinética de expressão de pSTAT3 e 5, e a cinética das citocinas associadas e de seus receptores (IL-6 / CD126, IL-10 / CD210 e IL-2 / CD25). A cinética de expressão de pSTAT4 se correlacionou com a expressão de CD212. (IL-12p70 não foi detectada no presente estudo). Entretanto a expressão de pSTAT1 e 6 precedeu à de IFN-y / CD119 e IL-4 / CD124. Conclusão: A determinação da cinética de expressão pSTAT in vitro pode contribuir para a compreensão da regulação da resposta imune a patógenos distintos e, potencialmente, ajudar no desenvolvimento de novos alvos terapêuticos bem como de novas estratégias destinadas a modular as vias de sinalização em diversas condições clínicas associadas à desregulação imunológica / Introduction: Modulation of immune responses in many clinical situations persists as one of the most challenging issues in immunology. Cytokines are fundamental to this regulation and have already been extensively studied. After binding with its specific receptors on the surface of the target cells, the main signaling pathway is the JAKs/STATs system. However, in contrast to cytokines, there are no detailed studies on the in vitro intracellular expression kinetics of STATs. Objective: To determine by flow cytometry the kinetics of phosphorylated STAT1, 3, 4, 5 and 6 proteins expression in human PBMCs in vitro stimulated with phytohemagglutinin (PHA) and cytomegalovirus antigen (CMV), and the associated cytokine production and cytokine receptors expression. Methodology: We evaluated PBMCs from 23 healthy donors regarding the kinetics of STATs expression (12 donors stimulated with PHA and 11 stimulated with CMV), cytokine secretion and respective receptors expression. Results: In PHA and CMV stimulated cells, pSTAT 1 and 6 expression increased early, 4h and 3days respectively). pSTAT3 expression augmented at later times (respectively 36h and 6 days). pSTAT4 and 5 expression were observed late in PHA stimulated cells (24-36h), while there was a constantly low level of expression in all times analyzed. Regarding cytokine release In PHA stimulated cells, IL-6, IL10 and IL-4 secretion started to increase at 12h while IFN-y and IL-2 increased at 24h. With CMV, only IL-6 showed increased expression at days 4 and 6. The cytokines receptors CD119 (IFN-g), CD126 (IL-6), CD210 (IL-10), CD212 (IL-12), CD25 (IL-2) and CD124 (IL-4) had increased expression at 24-36h with PHA stimulation. With CMV stimulation, CD126, CD212, CD25 also had increased expression at late times (5-6 days) while the other receptors maintained low expression levels at all times. Discussion: There was a correlation in between the pSTAT3 and 5 expression kinetics and the associated cytokines and cytokine receptors kinetics (IL-6/CD126, IL-10/CD210 and IL-2/CD25. pSTAT4 expression kinetics correlated with that of CD212 expression (IL-12p70 was not detected in the present study). The higher pSTAT1 and 6 expressions preceded that of IFN-y/CD119 and IL-4/CD124, respectively. Conclusion: Determination of pSTAT expression kinetics in vitro can contribute to the understanding of the regulation of immune responses to distinct pathogens and potentially help in the design of new therapeutic targets as well as new strategies aimed at modulating signaling pathways

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A leishmaniose visceral ou calazar é uma doença negligenciada, fatal que afeta a população pobre nos países em desenvolvimento. Há falha no controle da transmissão da doença devido à demora no diagnóstico, tratamento e toxicidade das drogas utilizadas, necessitando de novas estratégias. Dentre as estratégias seria de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina a fim de minimizar a frequência dos casos e eliminar a doença. Nesse estudo, avaliamos a resposta imune celular a 10 antígenos recombinantes (SMT, CPB, NH, A2, KMP11, VIZ92, NS, A2MAT, 8NSA e NSA) bem assim ao antígeno solúvel de Leishmania (SLA), dosando as seguintes citocinas: IL-1ß, IL-12p70, IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-27, TNF-α. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 37 indivíduos: LV ativa, LV curado, DTH+ e controles sadios foi estimulado com os antígenos acima por 72 horas a 37ºC/5% de CO2. Ressaltamos que não houve alteração significativa de outras citocinas, além do INF-γ, TNF-α e IL-10, em resposta aos demais antígenos recombinantes não destacados nos resultados deste estudo. Assim, observamos concentração elevada de INF-γ e/ou TNF-α acompanhados de resposta ao IL-10 em indivíduos mais protegidos em resposta ao estímulo dos antígenos: CPB, VIZ92 e 8NSA; destacamos que em relação ao antígeno CPB tem-se concentração significativa de INF-γ no grupo DTH+ se comparado ao grupo LV ativa e correlação direta entre as concentrações de INF-γ e TNF-α entre estes dois grupos. Sugerimos que os antígenos CPB, VIZ92 e 8NSA possam estar associados à indução de resposta protetora e ser promissores para utilização em imunoterapia e imunoprofilaxia. / A leishmaniose visceral ou calazar é uma doença negligenciada, fatal que afeta a população pobre nos países em desenvolvimento. Há falha no controle da transmissão da doença devido à demora no diagnóstico, tratamento e toxicidade das drogas utilizadas, necessitando de novas estratégias. Dentre as estratégias seria de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina a fim de minimizar a frequência dos casos e eliminar a doença. Nesse estudo, avaliamos a resposta imune celular a 10 antígenos recombinantes (SMT, CPB, NH, A2, KMP11, VIZ92, NS, A2MAT, 8NSA e NSA) bem assim ao antígeno solúvel de Leishmania (SLA), dosando as seguintes citocinas: IL-1ß, IL-12p70, IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-27, TNF-α. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 37 indivíduos: LV ativa, LV curado, DTH+ e controles sadios foi estimulado com os antígenos acima por 72 horas a 37ºC/5% de CO2. Ressaltamos que não houve alteração significativa de outras citocinas, além do INF-γ, TNF-α e IL-10, em resposta aos demais antígenos recombinantes não destacados nos resultados deste estudo. Assim, observamos concentração elevada de INF-γ e/ou TNF-α acompanhados de resposta ao IL-10 em indivíduos mais protegidos em resposta ao estímulo dos antígenos: CPB, VIZ92 e 8NSA; destacamos que em relação ao antígeno CPB tem-se concentração significativa de INF-γ no grupo DTH+ se comparado ao grupo LV ativa e correlação direta entre as concentrações de INF-γ e TNF-α entre estes dois grupos. Sugerimos que os antígenos CPB, VIZ92 e 8NSA possam estar associados à indução de resposta protetora e ser promissores para utilização em imunoterapia e imunoprofilaxia.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-14T11:53:05Z No. of bitstreams: 1 danilo-parmera.pdf: 3155055 bytes, checksum: ac63cd2b7c2719955b83925c310aabbc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T11:53:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 danilo-parmera.pdf: 3155055 bytes, checksum: ac63cd2b7c2719955b83925c310aabbc (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As culturas de células vêm sendo utilizadas extensivamente no desenvolvimento e na produção de uma variedade de produtos terapêuticos e profiláticos, tornando-se uma ferramenta indispensável para geneticistas, imunologistas, vacinologistas e a indústria farmacêutica. A adoção de sistemas de ensaios celulares in vitrotem sido aplicada como um método alternativo para a substituição ou diminuição do uso de animais nas fases de desenvolvimento, produção e testes de vacinas, demonstrando resultados promissores. Da mesma forma, sistemas computacionais podem ampliar a utilização desta ferramenta para etapas do desenvolvimento de vacinas candidatas na fase pré-clínica. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de umprotocolo in vitroutilizando culturas de células humanas - a linhagem de monócitos THP-1, para a seleção de um protótipo vacinal - a cepa Pasteur de Mycobacterium bovisBCG expressando o antígeno Sm14 de Schistossoma mansoni(BCG/sm14). Para isso foram empregadas duas metodologias – citometria de fluxo e imunocitoquímica, para a identificação do perfil da expressão das citocinas IL-10, IL-12 e TNF-α. Foram utilizados como controles a cepa Pasteur do M. bovisBCG e a construção da cepa Pasteur do M. bovisBCG contendo o vetor de expressão pAU5 (BCG/pAU5).Após padronização, a multiplicidade de infecção utilizada para os experimentos foi de 10 bacilos para 1 célula THP-1 (10MOI). A expressão daproteína Sm14 foi detectada em todos os protótipos vacinais. Para assegurar queo protótipo BCG/sm14 era capaz de diferenciar a linhagem de monócitos THP-1 em macrófagos, avaliamos a taxa de crescimento celular e foi possível observarque após a infecção estas células apresentavam o índice de proliferação diminuído em 2 logs em relação à célula não infectada. O protótipo vacinal BCG/sm14não mostrou diferenças quanto a capacidade de infecção, a taxa de persistência intracelular e a estabilidade da construção plasmidial. As duas metodologias empregadas mostraram resultados discrepantes em relação ao percentual de citocinas expressas após a infecção com o protótipo vacinal ou os BCG controles, mostrando um maior percentual de células positivas quando avaliados por citometria de fluxo.Contudo, mesmo com esta diferença observamos que o protótipo vacinal BCG/sm14 não alterou o perfil de expressão de IL-10, IL-12 e TNF-α. O fato do plasmídeo pAU5 ser um vetor de expressão citoplasmática, sugere que a proteína Sm14 não foi capaz de estimular a mudança de citocinas em monócitos humanos. Experimentos futuros devem investigar o papel do BCG/sm14em macrófagos maduros, quanto a indução de citocinas pró e anti-inflamatórias, TLR, bem como na indução da resposta imune adaptativa, como a apresentação antigênica, na tentativa de melhor entender a resposta imune a esta vacina candidata. / Cell cultures has been used extensively in the development of a broad range of therapeutic and prophylactic products, and are an important tool for geneticists, immunologists, vaccinologists and the pharmaceuticsindustry. In vitrocell assay has been applied as an alternative method to replace ordiminish the use of animal model in the developmental, production in vaccine test phases, with promising results. Otherwise, computational methods should amplify theuse of cell cultures tools to test candidate vaccines. The mean goal of this work was to develop an in vitro protocol using human cell line – monocytic cell THP-1, to select a vaccine prototype – strain Pasteur Mycobacterium bovisBCG expressing Schistosoma mansoniSm14-antigen (BCG/sm14). Two methodologies were employed – a flow cytometry and immunocytochemistry, to quantify the expression of IL-10, IL-12 e TNF-α. Pasteur M. bovisBCG and the strain Pasteur do M. bovisBCG containing the expression vector pAU5 (BCG/pAU5) were used as controls. Multiplicityof infection (MOI) was determined and showed a better 10 bacilli to 1 cells ratios, regarding the expression of intracellular cytokines. Sm14 protein expressionwas detected in all vaccine prototype before use. To assure that BCG/sm14was able to differentiate monocytic THP1 cell line in mature macrophage, we evaluated the proliferative ration after BCGs infection and all strain showed the ability toinduce monocytic THP1 cells maturation, diminishing in 2.0 logs the cell proliferation. No differences were seen in the uptake, intracellular persistence and plasmidial stability. Interestingly, we observe discrepant results regarding the amount of positivecells expressing cytokines detected by the two methods used, independent of which BCG was tested. The overall results obtained by the cytometric method was high than immunocytochemistry. However, beside these ambiguous results, no alteration in the IL-10, IL-12 and TNF-alfa profile was observed whenBCG/sm14was compared with BCG. These results point to the plamidial BCG construction pAU5 and its intracellular expression, suggesting no modification in the cytokine profile in human monocytic cell lines. Further experiments should be addressedto identify the role of BCG/sm14 in modulate mature macrophage and, the induction ofadaptive immune response, as antigen presentation, pro- and anti-inflammatory cytokines, TLR expression and activation, to better understating the vaccine prototype immune response.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2013-03-20T19:12:45Z No. of bitstreams: 1 Tiago_Póvoa.pdf: 6904413 bytes, checksum: 89b7d7a97e24eb2dfd28a1d63fbce130 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-20T19:12:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiago_Póvoa.pdf: 6904413 bytes, checksum: 89b7d7a97e24eb2dfd28a1d63fbce130 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A dengue representa um sério problema de saúde pública mundial entre as doenças causadas por arbovírus. Seu agente etiológico, o vírus da dengue, compreende 4 sorotipos antigenicamente distintos (DENV1-4). Os sintomas da dengue variam desde a febre da dengue (FD) até a febre hemorrágica da dengue (FHD) e a síndrome do choque da dengue (SCD). No presente trabalho, iniciamos um estudo com o material obtido de diferentes órgãos (fígado, baço, pulmão, coração e rim) de quatro casos fatais de dengue. Análises histopatológicas revelaram, em todos os casos, áreas com edema e hemorragia; presença de esteatose (micro e macrovesicular) e necrose no fígado; degeneração de fibras cardíacas; necrose tubular aguda dos túbulos contorcidos proximais renais; destruição dos centros germinativos e atrofia de folículos linfóides do baço; espessamento dos septos alveolares e hipertrofia de macrófagos alveolares nos pulmões dos quatro pacientes e também a formação de membrana hialina nos casos 1 e 2. Detectamos antígenos virais em todos os órgãos e também um aumento de infiltrado inflamatório mononuclear, com aumento da população de macrófagos ativados e linfócitos B no rim; predomínio somente de linfócitos B no coração; aumento do número de macrófagos ativados e linfócitos T CD4+ no fígado e pulmão, e de linfócitos T CD8+ no pulmão. No baço, observamos uma diminuição das populações de linfócitos T CD4+, T CD8+ e B. A quantificação de células expressando citocinas mostrou: aumento da expressão de RANTES em todos os órgãos; um equilíbrio entre a produção das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IFN-γ) e anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β) no fígado, rim e pulmão; aumento das citocinas pró-inflamatórias e diminuição das anti-inflamatórias no baço e o perfil oposto no tecido cardíaco, com predomínio da detecção de TGF-β. Além disso, avaliamos o efeito da infecção com DENV-2 em camundongos BALB/c inoculados pelas vias intraperitoneal (i.p.) e intravenosa (i.v.). A análise histopatológica do fígado e baço destes animais revelou alterações semelhantes às observadas nos casos de dengue (áreas de edema e hemorragia, esteatose, necrose e tumefação no fígado, e desorganização da arquitetura dos folículos no baço). De um modo geral, a inoculação pela via i.p. induziu danos em áreas focais, enquanto a via i.v. provocou lesões mais difusas em ambos os tecidos. Entretanto, essas diferenças entre as vias de inoculação não se refletiram em diferenças nas subpopulações de linfócitos. Verificamos que, em ambos os casos, as alterações das subpopulações linfocitárias ocorreram já no segundo dia de infecção. A quantificação dessas subpopulações revelou uma diminuição de linfócitos B totais e um aumento de linfócitos T CD4+ totais no fígado dos camundongos infectados, enquanto que no sangue, observamos um comportamento inverso dessas subpopulações. Já no baço, verificamos uma diminuição da subpopulação de linfócitos T CD8+ totais e um aumento de linfócitos T CD8+ ativados nos animais com 2 dias de infecção. De um modo geral, tais resultados poderão contribuir para um melhor entendimento da doença e para a validação do modelo experimental murino em novas abordagens vacinais ou terapêuticas. / Dengue is a serious worldwide public health problem among the diseases caused by arboviruses. Its etiologic agent, the dengue virus, comprises four antigenically distinct serotypes (DENV1-4). Dengue symptoms range from the dengue fever (DF) to the dengue hemorrhagic fever (DHF) and dengue shock syndrome (DSS). In the present work, we initiated a study with materials obtained from different organs (liver, spleen, lung, heart and kidney) of four dengue fatal cases. Histopathological analysis revealed, in all cases, areas with edema and hemorrhage; the presence of steatosis (micro and macrovesicular) and necrosis in the liver; degeneration of cardiac fibers; acute tubular necrosis of renal proximal convoluted tubules; destruction of the germinal centers and atrophy of lymphoid follicles in the spleen; thickened alveolar septa and hypertrophy of alveolar macrophages in the lungs of the four patients and also the presence of hyaline membrane in cases 1 and 2. Virus antigens were detected in all organs as well as an increase of mononuclear cell infiltration, with the increase of activated macrophages population and B lymphocytes in the kidney; predominance of only B lymphocytes in the heart; increased number of activated macrophages and CD4+ T cells in the liver and the lung, and of CD8+ T cells in the lung. In the spleen, we observed a decrease of CD4+ T, CD8+ T and B populations. The quantification of cells expressing cytokines showed: increase of RANTES expression in all organs, a balance between production of proinflammatory (TNF-α e IFN-γ) and anti-inflammatory (IL-10 and TGF-β) cytokines in the liver, kidney and lung; increase of proinflammatory and decrease of anti-inflammatory cytokines in the spleen, while the opposite profile was observed in the cardiac tissue, with the predominance of TGF-β. In addition, we evaluated the effect of DENV-2 infection in BALB/c mice inoculated by the intraperitoneal (i.p.) and intravenous (i.v.) routes. Histopathological analysis in the liver and the spleen of these animals showed alterations similar to those observed in the dengue cases (areas of edema and hemorrhage, steatosis, necrosis and swelling hepatocytes in the liver, as well as disorganization of splenic follicle architectures). In general, results indicated that the i.p. inoculation induced damages in focal areas, whereas the lesions caused by the i.v. route were more diffused in both tissues. However, these differences between the two inoculation routes were not reflected in differences in the lymphocyte subsets. We observed that changes in lymphocyte subpopulations occurred by the second day after infection in both cases. The quantification of these subpopulations revealed a decrease of total B lymphocytes and an increase of total CD4+ T cells in the liver of infected mice, whereas in the blood we were observed an inverse behavior of such subpopulations. In the spleen, we verified a decrease of the total CD8+ T lymphocyte subpopulation and an increased of activated CD8+ T cells, two days after infection. Overall, these results may contribute to a better understanding of the disease and to the validation of this murine experimental model for novel vaccine or therapeutic approaches.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 204.pdf: 1337649 bytes, checksum: 244b0e0500a3148923b324ca08b898bf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O lúpus eritematoso sistêmico juvenil (LESJ) é uma doença inflamatória crônica causada pela produção de autoanticorpos, que reconhecem como estranhos antígenos próprios do organismo, e possuem alta morbidade e mortalidade em relação à doença no adulto. Em sua patogênese estão envolvidos fatores ambientais, hormonais, imunológicos e genéticos. Estudos de associação genética demonstraram que a susceptibilidade ao lúpus é poligênica, e entre os genes envolvidos está o HLA-G que é responsável pela regulação da resposta imune. No estudo, foi analisada a expressão de isoforma da molécula HLA-G e observamos o perfil de resposta imune em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico juvenil. Os pacientes que participaram do estudo foram selecionados no serviço de Reumatologia do Hospital das Clínicas e foi coletado sangue periférico de 10 pacientes no momento ativo e inativo do LESJ. O estudo comparou a expressão do mRNA do HLA-G5, IL-10 e TNF, os níveis plasmáticos de sHLA-G e citocinas Th1, Th2 e Th17 entre os grupos com a doença ativa, inativa e o grupo de crianças saudáveis aplicando os testes de Mann-Whitney U e Kruskal-Wallis. Os resultados mostraram que pacientes com LESJ ativo apresentaram níveis elevados das citocinas IL-10 (p=0,004) e IL-6 (p=0,011), além de apresentarem expressão de mRNA do TNF mais elevada em relação ao grupo inativo (p0,05). Mesmo com número reduzido, foi possível caracterizar que houve mudança do perfil de citocinas durante a ativação do LESJ, e a relação dessa ativação com a expressão de HLA-G solúvel, além de servir como base para proposta de um modelo de regulação imunológica, que poderá ser validado em futuros experimentos

Made available in DSpace on 2016-06-17T14:12:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Dissertaçao-AlmeidaAF-Final.pdf: 1255683 bytes, checksum: a7eec12079ba89af0a1d43bf178a08d9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Disserta?ao-AlmeidaAF-Final.pdf.txt: 152410 bytes, checksum: edb416d121ad44fbbca484f722d9f79f (MD5) Disserta?ao-AlmeidaAF-Final.pdf: 1255683 bytes, checksum: a7eec12079ba89af0a1d43bf178a08d9 (MD5) license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / As leishmanioses são um grave problema de saúde em todo o mundo e a forma cutânea é encontrada em todas as regiões do Brasil, sendo endêmica no estado de Pernambuco. Infecções por Leishmania levam à ativação da resposta imunológica no hospedeiro, destacando-se a resposta celular. Esta é caracterizada por expansão de vários tipos celulares, sobretudo de linfócitos T, com produção de diferentes perfis de citocinas. Este estudo teve como objetivo caracterizar imunofenotipicamente pacientes portadores de leishmaniose tegumentar ativa quanto à produção das citocinas IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-4. Verificou-se a produção sérica de IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ e IL-17 em pacientes com doença ativa (AT), após tratamento (PT) e de pacientes que apresentaram cura espontânea das lesões (CE). Buscou-se também a associação entre produção de citocinas na resposta imune celular de pacientes AT, relacionando a resposta imune dos perfis Th1, Th2 e Th17. Foi observada maior proporção de linfócitos T CD3+ e T CD4+ , maior produção de IL- 17 e IL-23 por linfócitos T CD4+ e de IL-4 por linfócitos T CD4+ e T CD8+ em AT, em comparação aos controles, e também maior produção de IL-10 por linfócitos T CD8+ em AT. Os resultados revelaram maior concentração sérica de IL-6 em CE em comparação aos outros grupos. Além disso, observou-se associação positiva significativa entre citocinas Th1 (IFN-γ) e Th2 (IL-4) em AT. Os resultados mostram que a proporção de linfócitos T CD3+ e T CD4+ é importante no processo de cura das lesões. O predomínio de citocinas Th2 na doença ativa sugere uma desregulação imunológica temporária inicial. No entanto, pode haver um favorecimento para a cura clínica nos pacientes que apresentam uma boa indução para a resposta Th17 com produção significativa de IL-6, como observado em CE. Portanto, um balanço adequado entre as respostas imunes no paciente pode ser o ideal para uma melhor resolução das patologias causadas L. (V.) braziliensis.

TEIXEIRA, Fabrícia Martins. Marcadores de ativação de linfócitos T e de suas citocinas como ferramentas diagnósticas na hipersensibilidade alérgica a fármacos. 2012. 110 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Rede Nordeste de Biotecnologia- Renorbio, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-23T12:51:39Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_fmteixeira.pdf: 12054646 bytes, checksum: 9a383e69304dd6755cbdf120633dadc1 (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-23T12:52:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_fmteixeira.pdf: 12054646 bytes, checksum: 9a383e69304dd6755cbdf120633dadc1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-23T12:52:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_fmteixeira.pdf: 12054646 bytes, checksum: 9a383e69304dd6755cbdf120633dadc1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Drug allergy reactions represent one third of adverse drug reactions, and although they are infrequent, they present high rates of morbidity and mortality, revealing a major public health problem. The main challenges related to drug hypersensitivity result from its unpredictability, no animal model for research and individual variability with regard to drug metabolism. Drug allergy reactions are difficult to be diagnosed once there is a lack of laboratorial tests for their investigation. The present study aimed to establish some immunological in vitro methods for diagnosing drug allergy. Patients (n=20) attending a dermatology outpatient clinic, Hospital Universitario Walter Cantídio, Universidade Federal Ceara, with mucocutaneous and systemic manifestations due to drug hypersensitivity were investigated by clinical history, laboratory findings, and in vivo and in vitro tests. The lymphocyte activation markers, CD25 and CD69, were evaluated by flow cytometry on the peripheral blood mononuclear cells previously incubated with different concentrations of the suspected drug, and analysis of interferon γ and interleukin 5 was done in the culture supernatant by enzyme immunoassay. Eighteen patients were tested by skin tests; nine patients showed positive results to one or more drugs. Fifteen patients showed positivity for at least one of activation markers in response to the suspected drug. The markers CD69 and/or CD25 were expressed by T cells CD4+ and CD8+, both in immediate and delayed reactions. Comparing stimulation index of the markers between patients and healthy no allergic individuals, it was observed a significant difference for CD4+CD69+ in the three suspected drug concentrations and CD4+CD25+ only in the lower drug concentration. No significant differences were found for the cytokines IFN-γ and IL-5 between patients and healthy individuals. The detection of both activation markers CD69 and CD25 increased the diagnostic sensitivity of the test. The use of both markers represents a promising tool in drug allergy diagnosis. Nonetheless, this hypothesis needs to be confirmed with a greater number of patients and controls. / As reações alérgicas a fármacos representam um terço das reações adversas a medicamentos, e embora sejam pouco freqüentes, apresentam altas taxas de morbidade e mortalidade, revelando um importante problema de saúde pública. Os principais desafios relacionados com a hipersensibilidade a fármacos decorrem do fato de sua imprevisibilidade, de que não existe um modelo animal para pesquisa e devido à variabilidade individual no que diz respeito ao metabolismo do fármaco. As reações alérgicas a medicamentos são difíceis de serem diagnosticadas, uma vez que há carência de métodos laboratoriais para sua investigação. O presente estudo teve como objetivo estabelecer alguns métodos imunológicos in vitro para o diagnóstico de alergia a medicamentos. Vinte pacientes atendidos no Ambulatório de Dermatologia do Hospital Universitário Walter Cantídio, Universidade Federal do Ceará, com manifestações muco-cutâneas e sistêmicas decorrentes de hipersensibilidade a fármacos foram investigados através de história clínica, exames laboratoriais in vivo e in vitro. Foram avaliados os marcadores de ativação de linfócitos CD25 e CD69 através de citometria de fluxo, em células mononucleares do sangue periférico previamente incubadas com diferentes concentrações do fármaco suspeito, e análise das citocinas interferon γ e interleucina 5 no sobrenadante da cultura através de teste imunoenzimático. Dezoito pacientes foram submetidos aos testes cutâneos, sendo que nove mostraram resultados positivos a um ou mais fármacos. Quinze pacientes apresentaram positividade para pelo menos um dos marcadores de ativação em resposta ao fármaco suspeito. Os marcadores CD69 e/ou CD25 foram expressos pelas células T CD4+ e CD8+, tanto em reações imediatas como nas não imediatas. A comparação dos índices de estimulação desses marcadores entre pacientes e indivíduos saudáveis não alérgicos, resultou em diferença significativa para CD4+CD69+ nas três concentrações do fármaco suspeito e para CD4+CD25+ apenas na menor concentração do fármaco suspeito. Nenhuma diferença significativa para as citocinas IFN-γ e IL-5 foi observada entre os pacientes e os indivíduos controles. A detecção de ambos os marcadores de ativação CD69 e CD25 aumentou a sensibilidade diagnóstica do teste. O uso combinado dos marcadores representa uma ferramenta promissora no diagnóstico laboratorial das reações alérgicas a medicamentos. Não obstante, essa hipótese deve ser confirmada com um número maior de pacientes e controles.

Orientador: Márcia Marinho / Coorientador: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Helio Langoni / Banca: Simone Baldini Lucheis / Banca: José Fernando Garcia / Banca: Flávia Resende Eugênio / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi verificar a dinâmica da resposta imune celular in vitro utilizando-se cultivos de macrófagos de camundongos (J774A.1) quando expostos às amostras virulenta, atenuada e saprófita de Leptospira, observados nos períodos de 1h, 3h, 6h, 12h, 24h, 36, 48h e 72h após a exposição. Foram realizados ensaios que determinaram a produção de intermediários reativos do nitrogênio (NO), expressão de genes para citocinas e interleucinas, pela técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) e a presença e quantificação das mesmas no sobrenadante do cultivo celular pelo teste ensaio imunoenzimático (ELISA). Avaliam-se as diferenças na modulação da expressão gênica do hospedeiro por cepas de Leptospira com variados graus de virulência, pelo método do microarranjo. Os resultados demonstraram que as amostras virulenta e atenuada proporcionaram um estímulo maior aos macrófagos em comparação à amostra saprófita, principalmente na fase tardia da infecção, considerando-se os valores expressos por óxido nítrico (NO), óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e induzido (iNOS). Os valores, embora estatisticamente não significativos, apresentaram uma dinâmica maior à resposta de citocinas (TNF-α, IL-1β) pela amostra virulenta em comparação à atenuada e saprófita. Outro fator relevante foi o encontro de Caspase-3 e -8 na fase inicial da infecção, sugerindo que a apoptose dos macrófagos ocorreu no começo do processo, logo após a internalização das Leptospiras, atingindo ní... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of the present work was verify the dynamic of the cellular immune response in vitro using macrophages cultures of mice (J774A.1) when exposed to virulent, attenuated and saprophytic Leptospira samples, observed in eight time intervals after exposure: 1h, 3h, 6h, 12h, 24h, 36, 48h and 72h. The assays that determined the production of reactive nitrogen intermediates (NO), the expression of genes for cytokines and interleukins by polymerase chain reaction (PCR) and the presence and quantification of them in the supernatant of the cell culture were performed by the assay ELISA. In this context, we aimed to evaluate the differences in modulation of host gene expression by Leptospira strains with varied virulence degrees, using the microarray method. The results demonstrated that the virulent and attenuated samples provided a greater stimulus to the macrophages compared to the saprophyte sample, especially in the late phase of the infection, considering the values expressed by nitric oxide (NO), endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and induced (iNOS). The values, although statistically insignificant, presented a greater dynamics to the cytokine response (TNF-α, IL-1β) by the virulent sample compared to the attenuated and saprophyte. Another important factor was the finding of Caspase-3 and -8 in the initial phase of the infection, suggesting that macrophage apoptosis occurred early in the process, soon after Leptospiras internalization, reaching high levels at 24 ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor