As neoplasias mieloproliferativas (NMP) são doenças hematológicas caracterizadas pela proliferação aumentada e acúmulo de células mieloides maduras de uma ou mais séries hematopoéticas: granulocítica, eritrocítica, megacariocítica ou mastocítica. Os pacientes com NMP podem apresentar mutações como a JAK2V617F, MPL e CALR, cujas descrições foram fundamentais para o início da elucidação da fisiopatologia das NMP. As células neoplásicas das NMP apresentam resistência à apoptose e proliferação celular exacerbada. Sabe-se ainda que essas doenças são consideradas oncoinflamatórias e pré-leucêmicas. Apesar de todos esses conhecimentos sobre os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na patogênese das NMP, não há até a presente data tratamentos eficazes que curam ou alteram a história natural de progressão dessas desordens para LMA. Pelo exposto, foi aqui investigada a potencial participação dos membros da via de sinalização Hippo na fisiopatologia das NMP BCR-ABL1 negativas mais frequentes, a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MF). A via de sinalização Hippo foi descrita como supressora de tumor e é uma das responsáveis pela regulação da proliferação, diferenciação e morte celular. Foi analisada, ainda nesse estudo, a correlação dos níveis de expressão dos genes da via Hippo com o perfil de citocinas plasmáticas dos pacientes com PV, TE e MF, a associação com o \"status mutacional\" e com a expressão dos genes que regulam a apoptose celular pela via intrínseca. Os principais achados nos pacientes com PV foram a diminuição da expressão dos genes supressores de tumor LATS2, MST1 e MST2 acompanhada pela presença de elevada concentração de citocinas pró-inflamatórias e fenótipo de resistência a apoptose. Na TE, os dados relevantes foram a detecção da diminuição da expressão dos genes supressores de tumor LATS1, LATS2 MST1 e SAV1, e o observação da relação entre alta expressão dos genes SAV1 e MOB1B e a mutação da CALR. Em MF destaca-se a redução da expressão dos genes SAV1 e TAZ da via de sinalização Hippo e do gene AURKB do ciclo celular. Em conclusão, os dados indicam que a diminuição da expressão dos genes supressores de tumor da via Hippo contribui para a fisiopatologia e para o fenótipo de resistência das células neoplásicas à apoptose das NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are hematological disorders characterized by increased proliferation of mature myeloids cells of one or more hematopoietic series: granulocytic, erythrocytic, megakaryocytic or mastocytic. Patients with MPN may present mutations such as JAK2V617F, MPL and CALR, which were essential descriptions for the beginning of pathophysiological elucidation of MPN. The NMP neoplastic cells show resistance to apoptosis and exacerbated cell proliferation. It is known that these entities are considered also oncoinflamatory and pre-leukaemic. Despite all this knowledge about the molecular and cellular mechanisms involved in the pathogenesis of MPN, there are no effective treatments that cure or alter the natural history of progression of these disorders to AML. For the above, a participatory potential of the Hippo signaling pathway members in the pathophysiology of the most frequent negative BCR-ABL1 MPN, the polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) were investigated. The Hippo signaling pathway has been described as tumor suppressor and is responsible for the regulation of proliferation, differentiation and cell death. The correlation analysis of the expression levels of the Hippo pathway genes with the plasma cytokine profile of patients with PV, ET and PMF, the association with the mutational status and the expression of the genes that regulate intrinsic cellular apoptosis were performed. The main findings in patients with PV were decreased expression of the tumor suppressor genes LATS2, MST1 and MST2 accompanied by the presence of high concentration of proinflammatory cytokines and phenotype of resistance to apoptosis. In ET, relevant data were the detection of decreased expression of the tumor suppressor genes LATS1, LATS2 MST1 and SAV1, and the observation of the relationship between high expression of the SAV1 and MOB1B genes and the mutation of the CALR. In PMF, stands out the reduction of the SAV1 and TAZ gene expression of the Hippo signaling pathway and the AURKB gene of the cell cycle. In conclusion, the data indicate that decreased expression of the tumor suppressor genes of the Hippo pathway contributes to the pathophysiology and neoplastic cell resistance phenotype to the apoptosis of MPN.

Orientador: Luciane Alarcão Dias-Melicio / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, prevalente na América Latina, que tem por agentes etiológicos diferentes espécies de Paracoccidioides. Entre eles encontra-se o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), espécie composta por um complexo de agrupamentos geneticamente isolados, classificados como espécies filogenéticas: S1, PS2, PS3 e PS4. O P. brasiliensis possui distribuído pela parede fúngica e dentro de vesículas citoplasmáticas uma glicoproteína de 43KDa, a gp43. Esta molécula é considerada como o principal componente antigênico produzido e secretado pelo fungo, a qual é encontrada no soro de pacientes acometidos pela PCM e, está associada aos fatores de virulência e escape do patógeno. Sabendo disso, tornou-se extremamente importante a avaliação da interação dessa proteína com as células do sistema imune inato e sua consequente atuação sobre os mecanismos moduladores celulares. Assim, nosso estudo avaliou os neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) que estão presentes em abundância desde o início e durante a infecção pelo Paracoccidioides, e que apresentam além de suas ações efetoras diretas contra o fungo, uma importante ação moduladora da resposta imune. Estas ações envolvem o reconhecimento do fungo por Receptores de Reconhecimento de Padrão (PRRs) que culminam em ativação celular com consequente produção e liberação de diferentes mediadores inflamatórios. Dessa maneira, o presente trabalho avaliou o envolvimento dos receptores cel... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease, prevalent in Latin America and has as etiological agents Paracoccidioides spp. One of them is Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) composed by a complex of genetically isolated clusters, classified as phylogenetic species: S1, PS2, PS3 and PS4. P. brasiliensis present along the cell wall and inside cytoplasmic vesicles a 43 KDa glycoprotein, known as gp43. This molecule is recognized as the main antigenic component produced and secreted by the fungus into sera of PCM patients and is associated with the escape and virulence factors of the pathogen. Thereby, becomes extremely important to evaluate the interaction mechanisms of this protein with cells from the innate immune system and their consequent action on cellular functions. Polymorphonuclear neutrophils (PMNs) has prominent participation in PCM, once these cells are present in a great amount at the beginning and during Paracoccidioides infection. PMNs perform effector actions directly against the fungi as well as an important immune modulatory function. Such actions involve the recognition of fungal components by pattern recognition receptors (PRRs) that leads to cell activation and consequent production of inflammatory mediators. So, the present study evaluated the involvement of TLR2 and TLR4 on cytokines and eicosanoids release by PMNs from healthy human stimulated with gp43. Cells were initially incubated in the presence or absence of monoclo... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Marlos Gonçalves Sousa / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Gláucia Bueno Pereira Neto / Resumo: A degeneração mixomatosa da válvula mitral (DMVM) é uma cardiopatia progressiva e crônica em cães, caracterizada por um quadro de insuficiência cardíaca congestiva (ICC). Embora os sinais clínicos congestivos sejam importantes, o processo de remodelamento miocárdico que acompanha as cardiopatias pode indicar que o organismo está reagindo contra as imposições da doença. Dessa forma, este estudo foi concebido para avaliar as concentrações séricas das interleucinas (IL) 1b e 4, correlacionando-as aos indicadores ecodopplercardiográficos de função cardíaca em cães com DMVM, apresentam ICC classes Ib e II. O estudo ecocardiográfico evidenciou alterações morfológicas progressivas à medida que a enfermidade se intensificava, comparativamente aos cães saudáveis empregados como controle. Valendo-se do recurso doppler tecidual, constatou-se disfunção diastólica nos animais com DMVM e ICC classe II. A análise das concentrações séricas de IL-1b identificou valores estatisticamente inferiores nos cães da classe Ib comparativamente aos animais controle. Contudo, os cães da classe II apresentaram resultados semelhantes ao grupo controle e aos animais da classe Ib. Da mesma forma, a análise dos resultados da concentração sérica de IL-4 não demonstrou quaisquer diferenças significativas entre grupos. Houve correlação positiva entre IL-1 e as frações de encurtamento e ejeção, ao passo que correlação negativa foi constatada entre a velocidade máxima da onda A do fluxo mitral e as concentrações séricas de IL-1b e IL-4. Foi possível concluir que a ICC decorrente de DMVM desencadeia alterações morfológicas no coração, resultando em disfunção diastólica nos cães classe II. Por outro lado, as concentrações séricas de IL- 1b and IL-4 não permitiram categorizar a severidade da DMVM / Abstract: Myxomatous mitral valve disease (MMVD) is a progressive and chronic cardiopathy, which is characterized by the development of congestive heart failure (CHF). Although the signs of congestion are paramout, the process of remodeling that accompanies cardiac disease might indicate a reaction of the body against the alterations caused by the malady. Therefore, this study was conceived to evaluate the serum concentrations of interleukins (IL) 1b and 4, correlating them with the echocardiographic indicators of cardiac function in dogs with MMVD and CHF classes Ib and II. The echocardiographic study disclosed morphological alterations that progressed along the intensification of the disease, as compared with the control healthy dogs. The analysis of tissue doppler imaging documented diastolic dysfunction in dogs with MMVD and class II CHF. The serum concentration of IL-1b was statistically lower than those of both class Ib CHF and control healthy dogs. Nonetheless, similar results were recorded for dogs of class II CHF group and both controls and class Ib animals. Similarly, no significant difference among groups was attained regarding the serum concentration of IL-4. There was a positive correlation between IL-1b and both fractional shortening and ejection fraction, whereas a negative correlation was demonstrated between the peak velocity of mitral A wave and the serum concentrations of IL-1b and IL-4. It was concluded that CHF attributable to MMVD causes cardiac morphological alterations, leading to diastolic dysfunction in class II CHF dogs. Also, the serum concentration of IL-1b and IL-4 did not allow categorizing the severity of MMVD / Mestre

Orientador: Fábio Santos de Lira / Banca: Patricia Monteiro Seraphim / Banca: Romualdo Araújo Fernandes / Banca: William Tadeu Lara Festuccia / Banca: Patricia Chimin Perandini / Resumo: O treinamento físico aeróbio é considerado uma terapia para doenças inflamatórias crônicas de baixo grau devido sua resposta anti-inflamatória mediada por células do sistema imunológico. O receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama (PPAR-γ) é capaz de regular a polarização M1 (caráter pró-inflamatório) e M2 (caráter anti-inflamatório), assim como a resposta imunometabólica dos macrófagos. Desta maneira, propusermos na presente tese verificar se a deleção condicional do PPAR-γ em macrófagos teria algum efeito sobre o papel anti-inflamatório do exercício aeróbio moderado. Para testar nossa hipótese, foram utilizadas duas linhagens de animais: PPAR-γ LyzCre+/+ (KO) e animais controle da mesma ninhada (WT). Cada genótipo foi dividido em 1) dieta controle sedentário; 2) dieta controle e treinamento moderado; 3) dieta hiperlipídica sedentário (HF) e 4) dieta hiperlipídica e treinamento moderado (HFT). O protocolo experimental teve duração de doze semanas, sendo quatro semanas apenas de dieta e oito semanas de dieta e exercício. Foram avaliados o perfil metabólico dos animais e o perfil inflamatório de macrófagos peritoneais e do tecido adiposo subcutâneo (TAS). A deleção do PPAR-y não afetou a composição corporal ou o desempenho no teste físico em animais alimentados com dieta controle, no entanto o treinamento não apenas proporcionou melhoras metabólicas mas também na resposta imune de animais nocaute. A indução da obesidade promoveu hipertrofia no TAS de animais KO, no... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Aerobic physical training is considered a therapy for chronic low-grade inflammatory diseases due to its anti-inflammatory response mediated by immune cells. The peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) is able to regulate the M1 (pro-inflammatory) and M2 (anti-inflammatory) polarization, as well as the immunometabolic response of macrophages. Thus, we propose in the present thesis to verify whether the conditional deletion of PPAR-γ in macrophages would have any effect on the anti-inflammatory role of moderate aerobic exercise. To test our hypothesis, two animal strains were used: PPAR-γ LyzCre+/+ (KO) and littermates control animals (WT). Each genotype was divided into 1) sedentary control diet; 2) control diet and moderate training (T); 3) sedentary high fat diet (HF) and 4) high fat diet and moderate training (HFT). The experimental protocol lasted for 12 weeks, four weeks of diet only and eight weeks of diet and exercise. The metabolic profile of the animals and the inflammatory profile of peritoneal macrophages and subcutaneous adipose tissue (SAT) were evaluated. The PPAR-γ deletion did not affect body composition or physical test performance in control diet fed animals, however the training not only provided metabolic but also the immune response enhancements on knockout animals. The induction of obesity promoted hypertrophy in the SAT, though the inflammatory profile was not exacerbated in KO animals. Peritoneal macrophages of KO animals exhibited a ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A molécula CD14 é uma glicoproteína expressa na membrana de leucócitos e células não mieloides, e pode ser encontrada tanto na membrana plasmática ancorada por glicosilfosfatidilinositol (GPI), como na forma solúvel no espaço extracelular. Esta molécula atua como co-receptor associado a receptores semelhantes a Toll (TLR), dentre eles o TLR4, e auxilia na ativação celular após reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Macrófagos ativados por produtos microbianos, como pelo lipopolissacarídeo (LPS), liberam citocinas e óxido nítrico (NO) que participam do processo inflamatório e sinalizam para células vizinhas ou distantes sobre a presença de agente agressor ou alterações teciduais. Após a ativação dos macrófagos, também são produzidos eicosanoides (EICs) que são mediadores lipídicos, como as prostaglandinas (PGs), os tromboxanos (TXs) e os leucotrienos (LTs). Os EICs são derivados em parte dos corpúsculos lipídicos (CLs) que são organelas citoplasmáticas funcionais, dinâmicas, ricas em lipídios e enzimas. Resultados anteriores do nosso grupo já demonstraram o envolvimento da molécula CD14 na produção de mediadores lipídicos, sem, contudo, elucidar os mecanismos. Assim, empregando macrófagos derivados da medula óssea (MDMO) estimulados com alta (500 ng/mL) e baixa (10 ng/mL) concentrações de LPS, tivemos como objetivo investigar a participação do CD14 na formação de CLs e na produção de prostanoides. A relevância da molécula CD14 foi ainda investigada na ativação de MDMO pelo ácido araquidônico exógeno (AA) (estímulo não específico). Nossos resultados demonstraram que a molécula CD14 contribui não somente para a formação de CLs e produção de prostanoides, como PGE2 e TXB2, mas também é essencial para a síntese de mediadores inflamatórios, como NO, TNF-? e IL-10, principalmente quando estimulados com baixa concentração de LPS / The CD14 molecule is a membrane-bound glycoprotein expressed by leukocytes and nonmyeloid cells, which can be attached to the plasma membrane by glycosylphosphatidylinositol (GPI) or in its soluble form in the extracellular space. This molecule acts as a co-receptor associated with Toll-like receptors (TLRs), including TLR4, and assists in cell activation after recognition of molecular patterns associated with pathogens (PAMPs). Macrophages activated by microbial products, such as lipopolysaccharide (LPS), release cytokines and nitric oxide (NO) that participate in the inflammatory process and signal to nearby or distant cells about the presence of an aggressive agent or tissue changes. After activation of macrophages, the lipid mediators denominated eicosanoids, such as prostaglandins (PGs), thromboxanes (TXs) and leukotrienes (LTs) are also produced. Eicosanoids are derived in part from lipid droplets (LDs) which are functional, dynamic cytoplasmic organelles, rich in lipids and enzymes. Previous results from our group have already demonstrated the involvement of the CD14 molecule in the production of lipid mediators, without, however, elucidating the mechanisms. Thus, using bone marrow-derived macrophages (BMDM) stimulated with high (500 ng/mL) and low (10 ng/mL) LPS concentrations, we aimed to investigate the participation of CD14 in the formation of LDs and in the production of prostanoids. The relevance of the CD14 molecule was further investigated by the activation of BMDM by exogenous arachidonic acid (AA) (nonspecific stimulus). Our results demonstrated that the CD14 molecule contributes not only to the formation of CLs and the production of prostanoids, such as PGE2 and TXB2, but it is also essential for the synthesis of inflammatory mediators, such as NO, TNF-? and IL-10, especially when stimulated with low LPS concentration

A pancreatite aguda (PA) é uma doença que frequentemente está associada a uma inflamação local e sistêmica não controlada que é responsável pela alta morbidade e mortalidade desta doença. Independentemente do mecanismo inicial, o processo inflamatório ocorre após uma lesão nas células acinares, levando ao recrutamento de células inflamatórias que produzem citocinas e quimiocinas que são capazes de desempenhar um papel importante na patogênese dessa doença. A inflamação pancreática induz distúrbios profundos na homeostase levando ao dano tecidual em outros órgãos, tais como o intestino e o pulmão. Por outro lado, órgãos como o cérebro têm mecanismos estruturais e celulares de proteção contra a inflamação. Tem sido descrito, que pacientes com insuficiência cardíaca apresentam lesão cardíaca, levando a produção de citocinas pró-inflamatórias, ativação de células T e do sistema complemento. Além da cascata inflamatória, durante todo o estágio da PA o sistema cardiovascular pode sofrer alterações cardíacas e histológicas compatíveis com o processo inflamatório desencadeado pela PA. A intensidade da inflamação sistêmica devido à PA é semelhante em ratos jovens e idosos, porém, a duração da inflamação sistêmica parece ser muito maior nos idosos. A idade avançada é considerada um fator prognóstico independente para um pior prognóstico na PA, mas os mecanismos envolvidos não são totalmente compreendidos. Decidimos analisar a expressão gênica de diversas citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento no coração de ratos idosos e jovens submetidos ao modelo animal de PA, com o objetivo de investigar os efeitos da inflamação sistêmica no coração e determinar se esses efeitos sofrem algum tipo de modificação durante a senilidade. Ratos jovens e idosos foram submetidos à PA utilizando-se ácido taurocólico 2,5% e, após 11 horas, o tecido cardíaco foi coletado para histologia e para a extração de RNA. A determinação do RNAm de citocinas e quimiocinas foi feita através do PCR Array. Como resultado, a expressão das interleucinas IL-6 E IL-10, e as quimiocinas CCL7 e CCL19 nos ratos idosos com PA foi menor do que nos ratos jovens com PA. Entretanto, os níveis de CXCL3 e CCL20 aumentaram nos idosos com PA. A expressão de CCL20 e CCL19 foi significativamente alta em ambos os grupos jovens e idosos com PA quando comparados com seus respectivos controles. Nos idosos com PA houve uma redução na expressão de CXCL1, CCL1, CCL11 e IL-10 comparados com seus controles, já entre os grupos saudáveis os idosos expressaram mais do que os jovens. Na análise histológica, a infiltração dos neutrófilos foi significativamente maior no tecido cardíaco dos ratos jovens e idosos com PA, comparado com seus controles. Esse estudo indica que a inflamação sistêmica pode mostrar características únicas para diferentes órgãos do corpo, e a diminuição da expressão gênica de algumas quimiocinas no tecido cardíaco de ratos mais velhos com PA pode sugerir um possível mecanismo cardioprotetor em animais mais velhos / Acute pancreatitis (AP) is a disease frequently associated with uncontrolled local and systemic inflammation that is responsible for the morbidity and mortality of this disease. Regardless of the initial mechanism, the inflammatory process is triggered by injury to the pancreatic acinar cells, leading to recruitment of inflammatory cell that produce cytokines and chemokines, which play an important role in the pathogenesis of this disease. Pancreatic inflammation induces profound disturbances in homeostasis, leading to tissue injury in other organs such as the intestine and lung. On the other hand, organs such as the brain have structural and cellular mechanisms of protection against inflammation. It has been described that patients with heart failure exhibit cardiac injury, leading to the production of pro-inflammatory cytokines, activation of T cells and activation of the complement system. In addition to inflammatory cascade during all stage of the PA, the cardiovascular system may suffer cardiac and histological changes compatible with inflammatory process triggered by the AP. The intensity of systemic inflammation associated with AP is similar in young and old rats, however, the duration of systemic inflammation is much longer in older animals. Advanced age is considered to be an independent prognostic factor for a poorer prognosis in AP, but the mechanisms involved are not fully understood. We analyzed the gene expression of several cytokines, chemokines and growth factors in young and aged rats hearts in an animal model of AP to investigate the effects of systemic inflammation on the heart, and to determine whether the effects are modified with age. Young and old rats were subjected to AP using taurocholic acid (2.5%) and after 11 hours, the cardiac tissue was collected to histology and RNA extraction. The determination of mRNA of cytokines and chemokines was performed by PCR array. The expression of interleukins IL-6 and IL-10 and the chemokines CCL7 and CCL19 in the aged AP rats was lower than young AP rats. However, CXCL3 and CCL20 levels showed opposite results, with increased levels in the aged AP group. The expression of CCL20 and CCL19 was greater in both young and aged AP rats compared with their respective controls. In aged AP rats there were a reduction in the expression of CXCL1, CCL1, CCL11 and IL-10 compared to their controls, and among healthy groups, the elderly rats expressed more than the young rats. In histological analysis, the neutrophils infiltration was significantly higher in the heart tissue of AP rats, both young and old, compared with their controls. This study indicates that systemic inflammation may show unique features for different organs in the body and decreased gene expression of some chemokines in the heart tissue of older AP may suggest a possible cardioprotective mechanism in older animals

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

O sistema imune de mucosas representa uma importante ferramenta de defesa contra a colonização da cavidade oral, especialmente pela presença das imunoglobulinas salivares no início da vida. Além das imunoglobulinas, as citocinas salivares também possuem funções importantes, pois utilizam células linfoides para amplificar ou deprimir a resposta inflamatória e podem ser consideradas biomarcadores proteicos. No entanto, pouco se sabe sobre a ontogenia dos componentes do sistema imune de mucosas em recém-nascidos a termo (AT) e especialmente em pré-termo (PT, com gestação inferior a 37 semanas) que reconhecidamente apresentam imaturidade imunológica. O objetivo do presente estudo foi o de analisar os níveis de imunoglobulinas (Ig) A (IgA) e M (IgM), citocinas: interleucinas (IL) IL-6, IL-10, IL-12 e interferon (IFN) (IFN-?) e 20 tipos distintos de bactérias orais em amostras de salivas de crianças ao nascer (T0) e após 3 meses de vida (T3) em PT e AT. Para isto, 123 amostras de saliva (70 AT e 53 PT) foram coletadas e os níveis de IgA e IgM foram quantificadas por ensaios ELISA. Em um subgrupo de 50 amostras (25 AT e 25 PT) foram analisadas a presença de 20 tipos diferentes de espécies bacterianas através de Checkerboard e os níveis de citocinas através de ensaio Luminex®. Dados socioeconômicos e do nascimento foram avaliados através de questionários. Os resultados do Checkerboard mostraram que nenhuma criança apresentou níveis detectáveis das bactérias testadas. Houve diferenças estatisticamente significantes (p<0.05) nos níveis de IgA em T0, sendo que PT apresentaram níveis inferiores aos AT, o que não aconteceu em T3. Diferentemente, não houve diferenças nos níveis de IgM entre os grupos e visitas (p>0.05). A análise prospectiva mostrou que houve um aumento dos níveis de IgA de T0 para T3 em ambos os grupos. Quanto à citocinas, houve diferenças somente em T0 entre PT e AT, nos níveis de IL-6 e IL10 que foram significantemente superiores em PT (p<0.05). Desta maneira, os dados sugerem que a prematuridade pode levar a algumas diferenças no status da resposta imunológica de mucosas no nascimento o que não acontece após 3 meses. / The mucosal immune system through the secretion of salivary immunoglobulins represent an important line of defense against initial acquisition and bacteria colonization of the oral cavity especially early in life. Cytokines are protein signaling molecules that lymphoid cells use to amplify or down regulate the inflammatory response. Little is known about the ontogeny of the mucosal immune system and bacterial colonization in saliva from neonates at fullterm (FT) and especially preterm (PT, with less than 37 weeks gestation), known to have an immunological immaturity. The aim of this study was to analyze the levels of immunoglobulin A (IgA) and M (IgM), four cytokines: interleukin (IL) IL-6, IL-10, IL-12 and interferon gamma (IFN-?) and 20 types of bacteria in saliva samples at birth (T0) and after 3 months (T3) in PT and FT. For this, 123 saliva samples (70 FT and 53 PT) were collected and levels of IgA and IgM were quantified by ELISA assays. In a subgroup of 50 samples (25 FT and 25 PT) was analyzed for the presence of 20 different types of bacterial species using checkerboard and the levels of cytokines through Luminex® assay. Economic data and birth partners were assessed through questionnaires. The results the Checkerboard showed that no child had detectable levels of bacteria. There were statistically significant (p <0.05) in IgA levels at T0, and PT showed lower levels than FT, which has not happened in T3. In contrast no differences in levels of IgM and visits between the groups (p> 0.05). The prospective analysis showed that there was an increase of IgA levels from T0 to T3 in both groups. As for cytokines, there were only differences at T0 between PT and AT, in IL-6 and IL-10 that were significantly higher in PT (p <0.05). Thus, the data suggest that prematurity may lead to differences in the status of the mucosal immune response at birth but not at 3 months of age.

Neste estudo investigamos os mecanismos reguladores associados à indução da inflamação pulmonar decorrente da /IR intestinal. A hipótese é que mediadores inflamatórios gerados no intestino, drenados pelo sistema linfático medeiam as repercussões pulmonares observadas na SDRA. Grupos de ratos foram submetidos à isquemia intestinal por meio da oclusão da artéria mesentérica superior (45 min) seguida da reperfusão intestinal por 2h. Grupos de ratos foram submetidos à obstrução do fluxo linfático (canulação do dueto torácico linfático, ou sua secção) previamente à indução da I/R intestinal. Os dados indicaram que a secção do dueto linfático torácico reduziu a atividade pulmonar de MPO (índice indireto de presença de neutrófilos), bem como a permeabilidade vascular (extravasamento do corante Azul de Evans) pulmonar e intestinal e aumento da atividade de LDH intestinal (índice de lesão tecidual). Sistemicamente, a ligação do dueto linfático antes da indução de l/R intestinal reduziu os níveis séricos de TNF-<font face=\"symbol\">a, IL- 1<font face=\"symbol\">b e elevou aqueles de IL-10, LTB4e TXB2. Ainda, observamos que a linfa coletada nesses animais é rica em TNF-<font face=\"symbol\">a, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-10, LTB4 e TXB2. O tratamento dos animais previamente à l/R intestinal com o inibidor de síntese de TNF-<font face=\"symbol\">a, pentoxifilina (PTX), reduziu a atividade de MPO pulmonar nos animais submetidos a l/R intestinal com o dueto linfático intaeto e a potencializou naqueles onde o dueto torácico linfático foi seccionado. A PTX reduziu o aumento de permeabilidade vascular pulmonar e intestinal em condições onde dueto linfático torácico foi mantido intacto. Por outro lado em animais l/R intestinal com o dueto linfático seccionado, a PTX não causou redução adicional da permeabilidade vascular, mas reduziu os níveis séricos de IL-1<font face=\"symbol\">b e aumentou os de LTB4, enquanto na linfa, o tratamento com PTX aumentou a concentração de IL-10 e LTB4 e reduziu a de IL-1<font face=\"symbol\">b e TXB2. A inibição não seletiva das NOS com o composto L-NAME causou aumento dos níveis séricos de TNF-<font face=\"symbol\">a, os quais foram reduzidos pela secção do dueto linfático. O bloqueio da geração do NO nos animais com dueto seccionado não alterou o perfil no soro de IL-10, mas elevou a concentração de IL-1<font face=\"symbol\">b. Ainda, na linfa dos animais tratados com L-NAME, houve aumento de IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-10, LTB4 e TXB2 e redução de TNF-<font face=\"symbol\">a. Nossos dados ainda revelaram que o pulmão dos animais I/R intestinal gerou IL1<font face=\"symbol\">b e IL-10 quando o dueto linfático estava intacto, e que sua secção reduziu os níveis gerados dessas citocinas. A PTX reduziu a geração de IL-1<font face=\"symbol\">b e aumentou a IL-10 no pulmão.O L-NAME aumentou a IL-1<font face=\"symbol\">b e IL-10 nos animais com o dueto intacto e interrupção do fluxo linfático aumentou os níveis de IL-1<font face=\"symbol\">b. A I/R intestinal, em animais com o dueto intacto, aumentou, enquanto na vigência da obstrução do fluxo linfático, houve redução da expressão de ICAM-1, Mac-1 e E-selectina no pulmão. Finalmente, os dados apresentados neste estudo sugerem que eventos isquêmicos intestinais seguidos de sua reperfusão, induzem a geração de mediadores inflamatórios locais (intestino) os quais uma vez drenados pelo sistema linfático mesentérico são transportados pela linfa e atingem o pulmão. Nessas condições observa-se inflamação pulmonar e geração adicional de mediadores inflamatÓrios os quais são lançadas à circulação e concorrem para o desenvolvimento da inflamação sistêmica e eventualmente para a falência múltipla dos órgãos. / In this study we investigated the role of lymphatic system on the mechanisms associated to the induction of lung inflammation afier intestinal I/R in rats. The hypothesis ofthe study was that upon intestinal I/R, inflammatory mediators are generated in the intestine and once drained by mesenteric lyrnphatic system interfere with the lung homeostasis contributing to lung dysfunction observed in ARDS. To these purposes groups of rats were submitted to occlusion of superior mesenteric artery (45 min) followed by intestinal reperfusion during 2h when the rats were killed. Groups of rats were subjected to thoracic lymphatic duct ligation previously to induction of the intestinal I/R. The data showed that the thoracic duct ligation significantly reduced the increased pulmonary MPO activity and the augrnented vascular perrneability (extravasation of the Evans blue dye) in lung and intestine. In addition, thoracic duct ligation increased the intestinal activity of LDH. Systemically, the obstruction of lymph flow, leaded to reduction of TNF in serum of rats upon intestinal I/R and increased the levels of IL-1O, LTB4 and TXB2. Elevated levels of TNF-<font face=\"symbol\">a, IL-l<font face=\"symbol\">b), IL-1O, LTB4 and TXB2 were also found in lymph ofrats upon intestinal I/R. The treatment of the animals previously to the intestinal I/R induction with inhibitor of TNF-<font face=\"symbol\">a synthesis, pentoxyfilline (PTX), reduced the lung MPO activity upon lymphatic duct intact that was exacerbated by thoracic duct ligation. PTX treatment reduced the increased vascular permeability of the lung and intestine conditions in rats with lymphatic duct intact. On the other hand, when the thoracic duct was ligated, the PTX did not cause additional reduction of vascular permeability in both tissues , but reduced the serum levels of IL-1<font face=\"symbol\">b) and increased those of LTB4. Lymph of rats treated with PTX revealed an increased leveI of IL-10 and LTB4 and a reduced leveI of IL-<font face=\"symbol\">b) and TXB2. L-NAME treatment increased the serum levels of TNF-<font face=\"symbol\">a, which were reduced by the thoracic lymphatic duct ligation. The blockade of NO synthesis in rats with lymphatic duct ligation did not modify the IL-10 serum levels, but increased those of IL-1<font face=\"symbol\">b). Lymph of rats upon L-NAME treatment, an increased level of IL-1<font face=\"symbol\">b), IL-1O, LTB4 and TXB2 and a reduction of TNF-<font face=\"symbol\">a levels were detected. Pulmonary tissue of Iymphatic duct intact rats after intestinal I/R were increased the release of IL-1<font face=\"symbol\">b) and IL-10 whereas the thoracic duct ligation reduced the release of these cytokines. PTX treatment reduced the levels of IL-1<font face=\"symbol\">b) and increased the IL-10 in the lung. L-NAME treatment increased the IL-1<font face=\"symbol\">b) and IL-10 in lung of intact duct rats but the obstruction of lymph flow caused an increase release of IL-1<font face=\"symbol\">b levels. Intestinal I/R in intact duct rats, increased whereas the thoracic duct ligation reduced the pulmonary expression of ICAM-1, Mac-1 and E-selectin. In conclusion, our data suggest that intestinal I/R, induces the generation of local inflammatory mediators (intestine) which drained by the mesenteric lymphatic system are carried by the lymph and reach the lung. ln these conditions we observed pulmonary inflammation and additional generation of inflammatory mediators and eventually the development of the systemic inflammation. Our data support the view that lymphatic system play a role a path underlying the spread oflung and gut injury after intestinal I/R.

A presença de IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN e MMPs foi avaliada em camundongos infectados com o fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Aos 15 dias, IFN-<font face=\"symbol\">g foi observado em granulomas (Gr), aumentando em resistentes (A/J) aos 120d. Suscetíveis (B10.A) tiveram mais macrófagos e células gigantes (CGs) OPN+, alta carga fúngica e baixo NO aos 15d. A/J tiveram aumento em OPN, maior NO e menor carga fúngica do que B10.A aos 120d. Camundongos infectados apresentaram MMP9 em macrófagos, GCs e Pb e atividade de MMP9 e MMP2. Aos 15d, KOiNOS tiveram Gr com necrose, debris de Pb e OPN e seus controles, Gr com muitos Pbs e OPN. Aos 120d, os controles apresentaram Gr extensos contendo muitos Pbs e expressão de OPN; KOiNOS tiveram Gr compactos com células OPN+ ou lesões residuais com pouca OPN e baixa carga fúngica. Maiores níveis de OPN foram detectados em KOiNOS. A OPN está associada com gravidade no início da infecção, mas com certo controle na fase tardia e no desenvolvimento e organização do Gr. Sugere-se que a presença de MMPs exerça influência no padrão do Gr e na disseminação fúngica. / We studied IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN and MMPs in mice infected with the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). IFN-<font face=\"symbol\">g was found in granulomas (Gr) at 15d and increased in resistant mice (A/J) at 120d. At 15d, macrophages and giant cells (MGCs) were more OPN+ in susceptible mice (B10.A) which had high fungal load and low NO. At 120d, A/J had numerous intensely stained OPN(+) cells and higher NO and lower fungal load than B10.A. MMP9 was found in macrophages, MGCs and Pb of infected mice, which had MMP9 and MMP2 activity. At 15d, KOiNOS had Gr with necrosis, altered Pb and OPN; controls had Gr with many Pb and OPN. At 120d, controls had large Gr with many Pb and OPN expression; KOiNOS had compact Gr with OPN+ cells or residual Gr with weak OPN and decreased fungal load. More OPN levels were detected in KOiNOS. OPN is associated with infection severity at the beginning and with some control at later stages of infection and is involved in Gr development and organization. We show the presence of MMPs and suggest their influence in Gr pattern and in Pb dissemination.