Submitted by JACIARA CRISTINA ALMEIDA DO AMARAL (jaciaramaral@ufpa.br) on 2018-05-16T14:30:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Final Mestrado_Gisellle.pdf: 583039 bytes, checksum: b90040224f364b973f85fec59b9a37d8 (MD5) / Approved for entry into archive by JACIARA CRISTINA ALMEIDA DO AMARAL (jaciaramaral@ufpa.br) on 2018-05-16T14:31:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Final Mestrado_Gisellle.pdf: 583039 bytes, checksum: b90040224f364b973f85fec59b9a37d8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-16T14:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Final Mestrado_Gisellle.pdf: 583039 bytes, checksum: b90040224f364b973f85fec59b9a37d8 (MD5) Previous issue date: 2017-12-07 / 5-Hidroxi-2-hidroximetil-γ-pirona (AK), conhecido inibidor de tirosinase, enzima importante para síntese de melanina e por isso é usado para desordens de pigmentação. AK também promove significativa ativação de macrófagos e promove acúmulo citoplasmático de espécies reativas de oxigênio (EROs), o que sugere seu papel como potencializador do sistema imune como microbicida. Não existe trabalho na literatura que mostra a ação do AK no sistema nervoso central (SNC) como ativador celular e seu possível papel protetor frente a infecções. Para testar essa hipótese usamos glias de Muller da retina que apresentam propriedades semelhantes aos dos macrófagos e LPS, como ativador glial. Portanto, o presente trabalho avalia a ação do AK como possível papel protetor na morte celular induzida por LPS, em cultura de células da glia provenientes de embriões de galinha. Culturas enriquecidas com células da glia, foram tratadas com AK (10, 25, 50 e 100 μM) e LPS (0,1; 1; 10, 100 e 500 ng/mL) durante 24 horas. Após tratamento, as células não mostraram citotoxicidade tratadas com AK, entretanto, tratadas com LPS ocorreu morte celular, de uma maneira dose-dependente. Verificamos o acúmulo de EROs em grupos tratados com AK (100 μM) e LPS (100 e 500 ng/ml), sendo que nas culturas co-tratados com AK e LPS nas mesmas concentrações houve uma redução desse acúmulo. AK também foi capaz de inibir a atividade das enzimas antioxidantes, ( catalase e Superóxido dismutase) e inibir os níveis de glutationa, enquanto LPS produz um aumento na atividade dessas enzimas. AK foi capaz de inibir as enzimas antioxidantes e glutationa do aumento induzido por LPS. Esses dados revelam que AK promove a modulação do balanço oxidativo e antioxidativo como possível mecanismo protetor na morte celular produzido por LPS em células enriquecidas de Glia de Müller. / 5-Hydroxy-2-hydroxymethyl-γ-pyrone (AK), a known inhibitor of tyrosinase, an enzyme important for melanin synthesis and therefore used for pigmentation disorders. AK also promotes significant activation of macrophages and promotes cytoplasmic accumulation of reactive oxygen species (ROS), suggesting its role as a potentiator of the immune system and microbicide. There is no work in literature that shows the action of AK in the central nervous system (CNS) as a cellular activator and its possible protective role against infections. To test this hypothesis, it use retinal Muller glia which have similar properties to those of macrophages. Therefore, the present work evaluates the action of AK as a possible protective role in LPS-induced cell death in culture of glial cells from chicken embryos. Cultures enriched with glial cells were treated with AK (10, 25, 50 and 100 μM) and LPS (0.1, 10, 100, and 500 ng / ml) for 24 hours. After treatment, the cells did not show AK-treated cytotoxicity; however, treated with LPS, cell death occurred in a dose-dependent manner. We verified the accumulation of EROs in groups treated with AK (100 μM) and LPS (100 and 500 ng / ml). Cultures co-treated with AK and LPS in the same concentrations there was a reduction of accumulation of EROs. AK was also able to inhibit the activity of antioxidant enzymes, (catalase and Superoxide dismutase) and glutathione levels, while LPS produces an increase in the activity of these antixodants. AK was able to inhibit the antioxidant enzymes and glutathione from the increase induced by LPS. These data show that AK promotes the modulation of oxidative and antioxidative balance as a possible protective mechanism in the cell death produced by LPS in Müller's Glia enriched cells.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-03-04T18:46:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-03-05T15:37:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-05T15:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) Previous issue date: 2008 / A cromoblastomicose e uma infeccao subcutanea cronica, granulomatosa, causada pela implantacao traumatica de diversas especies de fungos demaceos, sendo Fonsecaea pedrosoi o principal agente etiologico. O Brasil possui a segunda maior prevalencia mundial da doenca, sendo o estado do Para a maior area endemica. Histologicamente, a cromomicose e caracterizada pela presenca de celulas gigantes, onde podem ser observadas celulas escleroticas fagocitadas por macrofagos. O objetivo do presente estudo foi analisar os diferentes aspectos da interacao de macrofagos peritoneais de camundongos BALB/c e C57/BL6 com conidios ou celulas escleroticas de F. pedrosoi, determinando os indices de infeccao, fagocitose e fusao celular. Os resultados mostraram indices de fagocitose e infeccao maiores em conidios do que em celulas escleroticas para BALB/c (p<0.05), ocorrendo efeito inverso no indice de fusao, com a formacao de celulas gigantes do tipo Langhans na interacao com celulas escleroticas e celulas gigantes do tipo corpo estranho na interacao com conidios. Os macrofagos de BALB/c em interacao com conidios produziram mais TNF-α que o controle nos tempos de 3 a 72h; e mais IL-10 apos 3h. Macrofagos interagindo com celulas escleroticas produziram mais TNF-α que o controle nos tempos de 1h e 3h; e a quantidade de IL- 10 foi maior apos 72h de interacao. No co-cultivo de macrofagos de C57/BL6 com conidios observou-se a presenca de vacuolos aumentados apos 24h, enquanto na interacao com celulas escleroticas, os macrofagos se desprenderam da laminula nos tempos posteriores a 24 h. A quantidade de TNF-α e maior na interacao de conidios comparado ao controle em 1 e 72 h; e a quantidade de IL-10, no tempo de 48h. Ja na interacao com celulas escleroticas, apenas a quantidade de IL-10 diferiu do controle, sendo maior nos tempos de 1 a 48h. Estes dados sugerem que a resposta e macrofagos ao fungo e diferente entre os camundongos de BALB/c e C57/BL6, diferindo tambem a resposta de um mesmo tipo de macrofago para cada forma fungica, sendo as celulas escleroticas aparentemente mais imunogenicas que os conidios. / Chromoblastomycosis (CBM) is a chronic, subcutaneous, granulomatous infection caused by traumatic implantation in the skin of several dematiaceous fungi, usually Fonsecaea pedrosoi. Brazil has second highest disease prevalence in the world and Para State is the most endemic area. Histologically, CBM is characterized by the presence of multinucleated giant cells and sclerotic cells can be found engulfed by macrophages. The objective of this study was to analyze the different aspects of interaction between peritoneal macrophages from BALB/c or C57/BL6 mice with F. pedrosoi conidia or sclerotic cells, calculating infection, phagocytosis and cellular fusion rates. The results showed phagocytosis and infection rates with conidia higher than sclerotic cells to BALB/c (p <0.05), while the rate of cellular fusion was higher for sclerotic cells interaction, with Langhans giant cells formation, in comparison to foreign-body giant cells after interaction with conidia. Macrophages from BALB/c co-cultured with conidia produced more TNF-α than control group after 3 to 72 hours, and more IL-10 after 3h. Macrophages interacting with sclerotic cells produced more TNF-α than control group after 1h and 3h, and the amount of IL-10 was higher after 72h of interaction. In the co-culture of C57/BL6 macrophages with conidia, the presence of large vacuoles after 24h was observed, while in the coculture with sclerotic cells, macrophages were detached from coverslip glasses after 24 h. Our results indicate higher levels of TNF-α after interaction of conidia compared to controls at 1 and 72 h and increase of IL-10 after 48h. However, after interaction with sclerotic cells, only IL-10 differed from control, being higher after 1 to 48 hours. All of these data suggest that macrophage response to fungus is different between BALB/c and C57/BL6 mice, differing also on the response of the same type macrophage for each fungal form, sclerotic cells apparently being more immunogenic than conidia.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2014-01-22T18:12:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoMetodoFotooxidacao.pdf: 132738540 bytes, checksum: 24543aac4b55976eda3a952ad9d57a98 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-01-24T14:33:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoMetodoFotooxidacao.pdf: 132738540 bytes, checksum: 24543aac4b55976eda3a952ad9d57a98 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-24T14:33:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoMetodoFotooxidacao.pdf: 132738540 bytes, checksum: 24543aac4b55976eda3a952ad9d57a98 (MD5) Previous issue date: 2013 / A análise da morfologia celular é um aspecto crucial da neurobiologia, pois a relação entre forma e função pode definir os processos fisiológicos na saúde e na doença. Um dos principais métodos para avaliar a morfologia celular é por meio da fotooxidação de marcadores fluorescentes intracelulares, dentre os quais se tem o percloreto de 1,1’-dioctadecil-3,3,3’,3’-tetrametil-indocarbocianina (DiI), uma carbocianina lipofílica que pode marcar células vivas ou fixadas. O DiI foi escolhido para este trabalho devido, dentre outros fatores, à sua importante utilização para estudos de morfologia celular. Como modelo para avaliar a qualidade da fotooxidação do aparelho construído para essa finalidade, elegeu-se as células horizontais da retina humana com o intuito de prosseguir com estudo morfométrico posterior dessas células, tendo em vista a escassez de trabalhos com essa abordagem em retina humana. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a qualidade do método de fotooxidação do DiI através de LED e utilizando como modelo células horizontais da retina humana. O material foi obtido do Banco de Olhos do Hospital Ophir Loyola e, em sequência dissecado, marcado com cristais de DiI e fotooxidado com o aparelho de LED. As imagens que resultaram do novo método de iluminação para fotooxidação de traçador fluorescente apresentou elevada qualidade de detalhes da morfologia neuronal, similares aos resultados obtidos em reações de fotoconversão convencional com microscópio, o que permite concluir que o aparelho mantém a eficiência da fotooxidação por revelar detalhes finos da morfologia celular, inclusive com as vantagens de processar áreas maiores de tecido e considerável redução de custo por dispensar o emprego de microscópio para o processo. / The analysis of cell morphology is a crucial aspect of neurobiology, since the relationship between form and function can define the physiological processes in health and disease. One of the main methods to evaluate cell morphology is through photooxidation of intracellular fluorescent markers, among which is the perchlorate of 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethyl-indocarbocianina (DiI) a lipophilic carbocyanine that can make living or fixed cells. The DiI was chosen for this work because, among other factors, it is used for important studies of cell morphology. As a model for evaluating the quality of photooxidation of the apparatus constructed for this purpose, horizontal cells of human retina were elected in order to proceed with morphometric study these cells further, in view of the lack of studies with this approach in human retina. This study evaluated the quality of the DiI method photooxidation via LED and used the horizontal cells of the human retina as a model. The material was obtained from the Eye Bank of Ophir Loyola Hospital and sequence dissected, labeled with DiI crystals and photooxided with the LED device. The images resulting from the new method of lighting fluorescent tracer showed photooxidation of high-quality detailed neuronal morphology, similar to the results obtained in reactions of convencional photoconversion with a microscope, which indicates that the device maintains the efficiency of the photooxidation for revealing fine details of cellular morphology, including the advantages of larger areas of tissue processing and a considerable cost reduction for the use of microscopy dispensed into the process.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de câncer mais incidente no mundo para o sexo masculino, o segundo para o sexo feminino e a radioterapia é um dos tratamentos de primeira linha no combate a este tipo de câncer. Durante a progressão do CCR as células sofrem alterações morfogenéticas, sendo a desorganização do complexo juncional apical (CJA) um dos eventos iniciais desse processo. As junções oclusivas (JTs) são um dos principais componentes da CJA e desempenham papel importante no controle do fluxo paracelular, na determinação da polaridade celular e na transdução de sinais relacionados com a progressão tumoral. As claudinas são proteínas transmembrana, constituintes das JTs e cumprem um importante papel no controle desses eventos. Alterações na expressão das claudinas são observadas em tumores de diferentes órgãos e têm sido relacionadas com a progressão tumoral. No entanto os mecanismos que regulam essas alterações e sua consequência na progressão do CCR são poucos conhecidos. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da superexpressão da claudina-3 na radiorresposta de células CCR. Nossos resultados mostraram que a superexpressão de claudina-3 minimiza alterações morfológicas causadas pela radiação, causa diminuição da resistência elétrica transepitelial e não tem efeito na permeabilidade a macromoléculas após a irradiação. Além disso, observamos que a superexpressão de claudina-3 aumenta o potencial proliferativo das células e que esta característica torna as células mais sensíveis a radiação. Porém quando avaliamos eventos celulares relacionados a progressão tumoral observamos que apesar da radiação diminuir a capacidade migratória das progênies, as células que superexpressam claudina-3 apresentam migração mais elevada. Além disso, verificamos que a superexpressão de claudina-3 diminui a invasão e a capacidade de formação de colônias frente ao tratamento com a radiação. Em seguida fomos avaliar o efeito da inibição das vias de proliferação (MEK/ERK) e sobrevivência (PI3K-Akt) na resposta das células que superexpressam claudina-3 frente a radiação. Observamos que a inibição de MEK é capaz de sensibilizar as células que superexpressam claudina-3 à radiação no ensaio de proliferação celular, no entanto a inibição de MEK e PI3K antes da exposição à radiação é capaz aumentar a migração e a capacidade de formação de colônias de células que superexpressam claudina-3 contribuindo para o aumento do potencial maligno. Em conjunto nossos resultados mostram que a superexpressão de claudina-3 contribui para um fenótipo mais maligno, no entanto frente ao tratamento com a radiação é capaz de sensibilizar as células. / Colorectal cancer (CRC) is the third more incident cancer for males, the second for females worldwide and radiotherapy is one of the first-line treatments to fighting this type of cancer. During the progression of CRC cells undergo morphogenetic alterations and the apical junctional complex disorganization (AJC) is one of the initial events of this process. The tight junctions (TJs) is a major component of AJC and play an important role in paracellular flux control, determination of cell polarity and in signal transduction related to tumor progression. Claudins are transmembrane proteins, members of TJs and play an important role on these events. Changes on claudins expression are found in tumors of different organs and have been associated with tumor progression. However the mechanisms that regulate these changes and their consequences in the CRC progression are not completely understood. Thus, this study aimed to evaluate the influence of claudin-3 overexpression on cellular response after radiation treatment of CRC cells. Our results show that claudin-3 overexpression minimizes morphological changes caused by the radiation, decrease transepithelial electrical resistance, and has no effect on macromolecules permeability after irradiation. Moreover, we observed that claudin-3 overexpression increases the proliferation rate of cells and that this feature makes the cells more sensitive to radiation. However, when evaluating the cellular events associated tumor progression we observed that despite decrease on migratory capacity caused by radiation, cells that overexpress claudin-3 have higher migration. In addition, we found that claudin-3 overexpression decreases the invasion and the capacity to form colonies after treatment with radiation. Then we evaluate the effect of inhibition of proliferation (MEK / ERK) and survival (PI3K-Akt) pathways in cells that overexpress claudin-3 in the response to radiation. We observed that inhibition of MEK could sensitize cells overexpressing claudin-3 radiation on cell proliferation assay, but the inhibition of MEK and PI3K before radiation exposure can increase the migration and colony forming ability cells overexpressing claudin-3 contributes to the increase of malignant potential. Altogether, our results show that claudin-3 overexpression contributes to a more malignant phenotype, however, claudin-3 overexpression is able to sensitize the cells to radiation.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 383266.pdf: 823319 bytes, checksum: 310fb137797fb2ab616c91d119b2c6fa (MD5) Previous issue date: 2006-09-27 / A espectroscopia de infravermelho (IV) permite caracterizar molecularmente tecidos e flu?dos, uma vez que seus espectros s?o caracter?sticos e atuam como uma impress?o digital. O r?pido desenvolvimento da t?cnica de infravermelho na ?ltima d?cada tem aberto novas portas para o progn?stico e diagn?stico de patologias facilitando a procura de melhores tratamentos. Atualmente, o infravermelho (IV) vem sendo utilizado nos mais diversos modelos experimentais de sistemas biol?gicos. A sepse provoca mudan?as no ambiente celular e em suas trocas i?nicas, afetando o funcionamento da mitoc?ndria e aumentando a forma??o de esp?cies reativas de oxig?nio (EROs). O ?xido n?trico (NO) ? considerado um marcador da forma??o de radicais livres produzidos, enzimaticamente ou n?o, nos tecidos. O aumento dos radicais livres promove a oxida??o de res?duos de amino?cidos, aumentando a forma??o de grupos carbon?licos (CO) prot?icos que atuam como biomarcadores do estresse oxidativo. Devido a esses fatores, entre outros, as mitoc?ndrias e seus complexos v?m sendo avaliados pela espectroscopia de infravermelho nas regi?es das bandas de amidas I (espectro entre 1615 cm -? e 1700cm -?, referente a liga??es C=O) e II (espectro entre 1500 cm -? e 1600 cm -?, referente a liga??es C-H), caracter?stico de prote?nas, com o objetivo de observar altera??es que possam ocorrer nestas organelas. No presente trabalho de mestrado, nosso objetivo principal foi analisar as altera??es em mitoc?ndrias hep?ticas causadas pela sepse induzida por CLP em ratos (Rattus novergicus var. Wistar) atrav?s do FTIR-ATR. O experimento foi contemplado pela extra??o das mitoc?ndrias hep?ticas atrav?s de diferentes gradientes de centrifuga??o em meios contendo sacarose, heppes e EGTA. A dosagem de NO s?rico foi feita atrav?s da metodologia de Griess. Nossos resultados apresentaram diferen?as significativas nas bandas de amida I do espectro de infravermelho do grupo s?ptico em rela??o ao controle, controle anestesia e sham. As mesmas diferen?as foram percebidas para a dosagem de NO s?rico.

Orientador : Profª. Drª. Célia Regina Cavichiolo Franco / Coorientador : Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade / Autor não autorizou a divulgação de impresso e digital / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 29/02/2012 / Inclui referências : f. 105-109 / Área de concentração: Biologia celular e molecular / Resumo: Sete milhões e seiscentos mil pessoas no mundo morreram de câncer em 2008. Câncer é uma doença que apresenta controle anormal da divisão celular, resultando em crescimentos invasivos, ou formação de tumores, que podem se difundir por todo o corpo. Desde tempos antigos há uma busca por compostos naturais para a cura de doenças, sendo associado à medicina popular, assim pesquisas científicas têm sido intensificadas por todo o mundo. Drogas extraídas de diferentes fontes naturais podem ser utilizadas na quimioterapia para o câncer e no combate a outras doenças. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o potencial biológico de diferentes polissacarídeos, obtidos de cogumelos dos gêneros Pleurotus, Lentinus e Agaricus, em células de melanoma murino, linhagem B16F10. Quatro diferentes polissacarídeos foram empregados nesta pesquisa, denominados de P1, P2, P5 e P6. Após os experimentos realizados, os resultados demonstram que o P1 não apresenta citotoxicidade, não altera a proliferação celular, aumenta o espraiamento celular e reduz a capacidade invasiva das células. Já o polissacarídeo P2, também reduz a capacidade invasiva das células e aumentou a capacidade de adesão celular em laminina. O P6 modificou a morfologia celular visualizada em microscopia eletrônica de varredura. Já o P5 foi o menos promissor, pois modificou apenas o espraiamento celular. Evidências na literatura atual demonstram corroborar com nossos resultados, visto que muitos polissacarídeos apresentam as mesmas alterações em células tumorais, sendo promissores também em análises in vivo. Assim podemos concluir que os polissacarídeos P1, P2 e P6 serão possíveis agentes antitumorais. Estes resultados alcançados com os respectivos polissacarídeos, de forma promissora, nos dão motivação para seguir com estudos posteriores, que possam comprovar a eficiência desses compostos em modelos tumorigênicos in vivo. Palavras-chave: Melanoma. Polissacarídeos. Cogumelos. Pleurotus. Lentinus. Agaricus. B16F10. / Abstract: Seven and six hundred thousand million people worldwide died from cancer in 2008. Cancer is a disease that shows abnormal control of cell division, resulting in invasive growth or tumor formation which can spread throughout the body. Since ancient times there is a search for natural compounds for curing diseases being associated to popular medicine as well scientific research have intensified worldwide. Drugs extracted from different natural sources can be used in chemotherapy for cancer and to combat other diseases. This study aimed to assess the biological potential of different polysaccharides obtained from mushrooms of the genera Pleurotus, Lentinus and Agaricus; in murine melanoma cells, B16F10 line. Four different polysaccharides were used in this study, called P1, P2, P5 and P6. After the experiments, the results show that P1 non-cytotoxic, does not alter cell proliferation, increased cell spreading and reduces the invasiveness of cells. Since P2 polysaccharide also reduces the invasiveness of the cells and increase cell adhesiveness laminin. The P6 modified cell morphology displayed in scanning electron microscopy. But the P5 was the least promising because only modified cell spreading. Evidence in the literature demonstrates corroborate our results, as many polysaccharides have the same changes in tumor a cell, also promising and in vivo analyzes. Thus we conclude that the polysaccharides P1, P2 and P6 are possible antitumor agents. These results achieved with the respective polysaccharides, promisingly, give us motivation to continue with further studies that can demonstrate the effectiveness of these compounds in vivo tumorigenic models. Keywords: Melanoma. Polysaccharides. Mushrooms. Pleurotus. Lentinus. Agaricus. B16F10.

Orientador : Christian Macagnam Probst / Coorientador : Daniela Parada Pavoni / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 29/08/2016 / Inclui referências : f. 133-147 / Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente da doença de Chagas, sendo um protozoário flagelado pertencente à ordem Kinetoplastida. Este parasita está distribuído em 21 países. Possui um ciclo de vida bastante complexo com diferenças morfológicas ultra-estruturais, funcionais e bioquímicas, apresentando sob diferentes formas nos hospedeiros invertebrados e vertebrados. A forma epimastigota é não infectiva e proliferativa, encontrada naturalmente no trato digestivo do inseto vetor, podendo ser cultivada in vitro. Um importante passo para melhor entendimento desse parasita é estudo das suas características celulares e moleculares apresentadas durante a sua curva de crescimento. Nesse trabalho foi apresentada uma visão global do perfil de expressão gênica a partir das frações de mRNA total e polissomal ao longo de 10 dias da curva de crescimento de epimastigotas de T. cruzi. Usando a metodologia de RNA-seq, 2491 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados, dos quais 768 foram modulados em ambas as frações. De acordo com os padrões de modulação encontrados, os DEGs foram agrupados em 13 clusters e alguns destes apresentaram enriquecimento de termos de ontologia gênica (GO) indicando os processos biológicos e moleculares envolvidos. Análises do perfil polissomal podem revelar quais genes estão sendo traduzidos em uma determinada condição, assim o padrão de expressão desses mRNAs pode ser diferente nas frações de total e polissomal. No entanto, foi encontrada uma extensa sobreposição dos padrões de modulação para a maioria dos clusters. Claramente durante a fase estacionária o conteúdo de polissomos apresentou uma forte diminuição associado ao surgimento de grânulos de mRNA. Isto sugere que durante esta fase a maioria dos transcritos isolados a partir do colchão de sacarose está provavelmente associada a complexos de mRNA invés de polirribossomos. Isto pode indicar que os mRNAs da fase estacionária podem estar sendo protegidos por esses grânulos para posterior tradução quando o ambiente se tornar novamente favorável. Vários aspectos da curva de crescimento deste parasita foram destacados, principalmente em relação as alterações pelas quais o parasita transita ao longo da fase estacionária. Além disso, foi investigada uma possível via de controle através da concentração de glicose a qual foi proposta a partir de comparações com estudos de Saccharomyces cerevisiae. Para um estudo complementar da curva de crescimento foi realizada uma abordagem de proteômica. Os dados preliminares mostraram uma boa identificação de grupos de proteínas (3.249), a maioria representando uma proteína por grupo. Algumas proteínas diferencialmente expressadas (DEPs) foram detectadas, apesar do baixo poder estatístico das análises. Dentre 68 DEPs identificadas, 21 mostraram correlação no padrão de modulação com os dados de transcritômica. Também foi apresentada uma análise de transcritômica preliminar de epimastigotas em fase estacionária inicial submetidos a diferentes condições nutricionais (PBS, TAU e TAU3AAG) por 1, 2, 4, 6 e 24 horas. Foram identificados 612, 804 e 941 supra-genes diferencialmente expressos nos meios PBS, TAU e TAU3AAG, respectivamente. A maioria dos supra-genes modulados foram comuns nas três condições. Juntos, esses estudos representam uma etapa importante na obtenção de dados em larga escala que geração de conhecimento sobre o comportamento e resposta do parasita em diferentes condições ambientais. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doença de Chagas, curva de crescimento, RNA-seq, polissomos, proteômica e estresse. / Abstract: The Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoa that belongs to the Kinetoplastida order and is the etiologic agent of Chagas disease, an endemic illness distributed in 21 countries. The T. cruzi life cycle is complex including morphological, functional and biochemical changes. The epimastigote form is proliferative and non-infective, founded naturally in the insect vector gut and can be cultivated in vitro. An important step to comprehend the T. cruzi biology is the study of cellular and molecular features presented during its growth curve. Here, we show a global view of gene expression profile for total and polysomal RNA fractions along 10 days of the T. cruzi epimastigote growth curve in vitro. A total of 2491 differential expressed genes (DEGs) were established using RNA-Seq approach, of which 768 were modulated in both fractions. According to the modulation pattern, these DEGs were grouped into 13 clusters and some of them show enrichment to important GO terms, indicating molecular and cellular biological processes involved. The polysomal profile might reveal mRNAs that are being translated and their expression pattern could be different from the total RNA fraction, nevertheless, in most clusters we see remarkable overlapped modulation. Moreover, at the stationary phase the polysomal content greatly decline while the RNA granules seems to increase. This suggests that most of mRNAs isolated from sucrose cushion at this growth stage should be associated with granules instead with polyribosomes. This possible indicates that stationary phase mRNAs are being protected by granules for further translation when the environment becomes favorable. We highlight some views on the T. cruzi growth curve, mainly related to the alteration that the parasite pass along the stationary phase. Moreover, a possible sensing pathway for glucose depletion was suggested for T. cruzi based on Saccharomyces cerevisiae studies comparison. Growth curve complementary study was performed using proteomic approach. Preliminary data shows the identification of 3,249 protein groups, mostly representing one protein per group. Some differential expressed proteins (DEPs) were identified, besides the limited statistical power. Among the 68 DEPs identified, 21 showed correlation in their proteomic and transcriptomic modulation pattern. Preliminary transcriptomic analysis of epimastigote in early stationary phase under three nutritional different conditions (PBS, TAU, TAU3AAG) during 1, 2, 4, 6 and 24 hours were also present here. Total of 612, 804 and 941 differential expressed supra-genes were identified in PBS, TAU and TAU3AAG conditions, respectively. Most of supra-genes were common to all treatments. Together, these works represent an important step for large scale data generation that will provide insights into the parasite behavior and response to different environmental conditions. Key-words: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, growth curve, RNA-seq, polysomes, proteome and stress.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A junção aderente (JA) é um dos principais componentes do complexo juncional apical. Esta juncão é um complexo multiprotéico em que a E-caderina, uma glicoproteína transmembrana, atua como principal mediadora da adesão célula-célula. Sua ancoragem ao citoesqueleto de actina ocorre via proteínas da família das cateninas. Modificações pós-traducionais da E-caderina, como fosforilação e glicosilação, podem modular a estabilidade e organização das JAs. Muitos estudos têm sugerido que no câncer a invasão e a metástase podem estar associadas a arranjos de glicanos na superfície celular. Em câncer colo-retal, o papel de alterações na expressão de glicanos sobre a estabilidade da adesão mediada por Ecaderina ainda não está claro. Neste estudo, investigamos a relação entre estas alterações e a estabilidade das JAs em células de câncer colo-retal. Nós utilizamos duas linhagens celulares com diferentes potenciais metastáticos, Caco-2 and HCT- 116, que constituem dois modelos de JAs: estáveis e instáveis, respectivamente. Ensaios de precipitação de lectinas e immunoblotting demonstraram que em HCT- 116, a linhagem mais invasiva, a E-caderina apresenta uma diminuição de glicanos reconhecidos pelas lectinas HPA e WGA, que reconhecem resíduos de Nacetilgalactosamina e, _-N-acetilhexosaminas e ácido siálico, respectivamente. Concomitantemente, em HCT-116 também foi observado um aumento de glicanos reconhecidos pelas lectinas L-PHA e E-PHA, que reconhecem respectivamente: acetilglicosamina_1,6-ligada formando N-glicanos tri- e tetraantenados e, Nacetilglicosamina bisectante _1,4-ligada formando N-glicanos biantenados. Ensaios de imunofluorescência mostraram que a presença desses glicanos reconhecidos por L-PHA, em HCT-116, é intensa na região de contato célula-célula quando comparada com células Caco-2, em que a marcação foi observada, predominantemente, na região apical. Além disso, a inibição completa da Nglicosilação por tunicamicina ou a inibição da síntese de N-glicanos complexos por swainsonina, aumentou a associação da E-caderina com o citoesquleto de actina em células HCT-116, mas não em Caco-2. Em células HCT-116, a inibição de Nglicosilação por tunicamicina produziu uma diminuição da atividade de ERK1/2 e a formação de adesão célula-célula foi mais evidente. Estes dados sugerem que alterações na expressão e localização subcelular de diferentes glicanos podem ser importantes eventos associados à perda da estabilidade das JAs em câncer coloretal. / The adherent junction (AJ) is one of the main components of the apical junctional complex. It is a multiprotein complex where E-cadherin, a transmembrane glycoprotein, acts as the main mediator of cell-cell adhesion in epithelium. This protein is anchored to the actin cytoskeleton via proteins of the catenin family. Posttranslational modifications of E-cadherin, such as phosphorylation and glycosylation, can modulate the assembly of AJs. Various studies have suggested that invasion and metastasis is associated to glycan patterns on the cell surface of tumor cells. In colorectal cancer the role of altered glycans expression and stability of E-cadherin-mediated adhesion is not clear. In this study we investigated the relation between changes of the glycans expression and AJs stability in colorectal cancer cells. We used two colon adenocarcinoma cell lines with different metastatic potential, Caco-2 and HCT-116, both models of stable and unstable AJs, respectively. Lectin binding assays demonstrated that in HCT-116, the more invasive cell line, E-cadherin presents a decrease of the glycans recognized by HPA and WGA lectins, which recognize N-acetylgalactosamine and, _-N-acetylhexosamines and sialic acid, respectively. Conversely, in HCT-116, there was an increase of glycans recognized by E-PHA and L-PHA lectins, which recognize bisecting _1,4- branched and _1,6-branched N-acetylglucosamine, respectively. Immunofluorescence assays showed a stronger L-PHA binding on cell-cell contact regions of HCT-116 cells when compared with Caco-2. Furthermore, in HCT-116 cells a complete inhibition of N-glycosylation by tunicamycin or inhibition of complex N-glycans synthesis by swainsonine increased the association of E-cadherin with the actin cytoskeleton. Finally, it was possible to observe that the inhibition of N-linked glycosylation by tunicamycin, leaded to a decreasing of ERK1/2 phosphorylation concomitantly with the formation of more intimate cell-cell contacts. These findings suggest that altered expression and subcellular localization of different glycans can be important events associated to loss of AJs stability in colorectal cancer.

Os fibrócitos foram inicialmente identificados pelo seu recrutamento rápido para os tecidos lesionados e por atuar diretamente na resposta imune através do reconhecimento, apresentação antigênica e produção de citocinas e quimiocinas. Segundo Grab (2004) fibrócitos podem participar da resposta imune na leishmaniaose e por isso no presente estudo propomos analisar a resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por L. (L.) amazonensis. Para os experimentos in vivo camundongos C57BL/6 e knockout para o receptor TLR-2 foram inoculados na derme auricular com 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e 1, 7, 15 dias após a infecção as regiões de inóculo e os linfonodos foram retirados e processados para citometria de fluxo. Para os experimentos in vitro fibrócitos foram obtidos de mononucleares do sangue periférico de camundongos C57BL/6. Os fibrócitos foram avaliados quanto às suas características morfológicas e fenotípicas, infecção, expressão de MHC-II/B7-1/B7-2 e ativação de linfócitos T CD4+. As análises na região de inóculo mostraram o aumento no percentual de fibrócito na derme de camundongos após 15 dias de infecção tanto em animais C57BL/6 quanto em animais KO TLR-2. Neste sítio, os fibrócitos produziram citocinas e expressaram MHC-II, B7-1 e B7-2 podendo participar da resposta imune. As análises no linfonodo mostraram a existência de um alto percentual de fibrócitos nos animais controle, contudo, após infecção este percentual foi reduzido. Após infecção verificamos que os fibrócitos de animais WT C57BL/6 foram capazes de produzir as citocinas IL-4, IL-10 e IFN-&#61543; durante o primeiro dia. Entretanto, na ausência de TLR-2 os fibrócitos presentes no linfonodo produziram TNF-&#945; e IFN-&#61543; que podem estar relacionadas com a ativação celular e aumento da capacidade de apresentação antigênica destas células durante a infecção. No linfonodo verificamos que os fibrócitos podem participar da apresentação antigênica após a infecção por L. (L.) amazonensis. Contudo, nos linfonodos de animais WT C57BL/6 observamos a redução significativa no percentual destas células expressando MHC-II e B7-1, o que pode estar relacionada a presença do TLR-2. Nos ensaios in vitro fibrócitos de camundongos C57BL/6 apresentaram alta capacidade endocítica, eliminaram os parasitas nas primeiras 24 horas de infecção, expressaram MHC-II/B7-1/B7-2 e foram capazes de ativar linfócitos T CD4+. Com isso, nossos resultados sugerem que os fibrócitos podem atuar na resposta celular e na apresentação antigênica durante a infecção por L. (L.) amazonensis, contudo estas funções podem ser moduladas pela participação do TLR-2 e pelo microambiente onde estes se encontram. / Fibrocytes were initially identified by their fast recruitment to the injured tissues and by acting directly on the immune response through recognition, antigen presentation and production of cytokines and chemokines. According to Grab et al., 2004 fibrocytes may participate in the immune response to leishmaniasis and therefore, in this study we propose to examine the cellular response and antigen presentation of fibrocytes in infection by L. (L.) amazonensis. In vivo experiments C57BL/6 and knockout receptor TLR-2 animals were inoculated in the ear dermis with 105 promastigotes of L. (L.) amazonensis and 1,7, 15 days after infection ears and lymph nodes were removed and processed for flow cytometry. For in vitro experiments peripheral blood fibrocytes from C57BL/6 mice were evaluated for their morphological and phenotypic, MHC-II/B7-1/B7-2 expression and ability to activate CD4+ T cells. The analyses in the inoculum region showed significant increase in the percentage of fibrocyte in the C57BL/6 and TLR-2 knockout mice after 15 days of infection. At this site fibrocytes part of the immune response by cytokines production and MHC-II, B7-1 and B7-2 expression. The analyses in the lymph node showed the existence of a high percentage of fibrocytes in the control animals, however, after infection, this percentage was reduced. After infection it was verified that the fibrocytes of C57BL/6 were able to produce cytokines IL-4, IL-10 and IFN-&#61543; during the first days. However, in the absence of TLR-2 fibrocytes in the lymph produced TNF-&#945; and IFN-&#61543; that may be related to cell activation and increased antigen presentation capacity of these cells during infection. In the lymph node it was found that fibrocytes may participate in antigen presentation after infection with L. (L.) amazonensis. However, in lymph nodes of mice C57BL/6 it was observed the significant reduction in the percentage of those cells expressing MHC-II, B7-1, which can be related to the presence of the TLR-2. In vitro fibrocytes of C57BL/6 showed high endocytic capacity, eliminating the parasites within the first 24 hours after infection, and expressed MHC-II/B7-1/B7-2 being were able to activate CD4 + T cells. Thus, our results suggest that fibrocytes may act in cellular response and antigen presentation during infection by L. (L.) amazonensis, however these functions can be modulated by the involvement of TLR-2 and the in microenvironment.

Orientador : Profª. Drª. Rosana Nogueira de Morais / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 19/12/2016 / Inclui referências : f. 64-72;80-91 / Área de concentração : Fisiologia / Resumo: Durante o período embrionário a ação dos androgênios tem papel determinante na diferenciação sexual, no desenvolvimento dos órgãos sexuais masculinos e, naturalmente, produzem efeitos masculinizantes no cérebro. A baixa razão 2D:4D, obtida pela divisão do comprimento do segundo dedo (indicador) pelo quarto dedo (anelar), é apontada como indicador de androgenização pré-natal e associada com desempenho esportivo em muitas modalidades. Nós analisamos a associação da medida da razão 2D:4D com desempenho esportivo, caracteristicas fisicas, psicológicas e hormonais. Foram três estudos apresentados no formato de artigo. No estudo 1 analisanos a medida da razão 2D:4D direta (diretamente na mão do sujeito) e a medida indireta (em imagens da mão por escâner) de 114 homens e 90 mulheres e, adicionalmente, realizamos uma revisão de literatura minuciosa para comparar nossos dados. Demonstramos que há um efeito direcional no qual a medida direta da razão 2D:4D tende a ser maior que a medida indireta, ou seja, a medida indireta superestima o grau de androgenização pré-natal. No estudo 2, avaliamos, a produção de força muscular, liberação de testosterona, cortisol, agressividade e estabilidade emocional em 89 homens adultos, quando expostos a um vídeo contendo imagens de agressão no esporte (situação desafiadora) comparando com os mesmos em situação controle. Foi demostrado que a situação desafiadora modula um aumento de força muscular, de agressividade e de concentração de testosterona e ainda diminui a estabilidade emocional. A maior produção de força na situação de desafio, foi associada por regressão múltipla com baixa razão 2D:4D e a maior controle emocional. No estudo 3, avaliamos a razão 2D:4D de 64 tenistas infanto-juvenis do sexo masculino e observamos que a menor razão 2D:4D foi associada em 35% com melhor desempenho tenístico, em 20% com maior produção de força muscular, em 9% com maior potência muscular de membros inferiores e em 7% com maior índice de autoconfiança. Não encontramos associação da razão 2D:4D com concentrações hormonais, apenas confirmamos o resultado do estudo 2, no qual ocorre um aumento de testosterona em 13% quando os sujeitos foram submetidos aos desafios dos testes físicos. Por fim, indicamos que há associação da razão 2D:4D e desempenho no tênis, porém estudos em mulheres e mais aspectos necessitam ser investigados para entender melhor qual componentes explicam a relação da androgenização pré-natal e desempenho no tênis. Mesmo assim, apresentamos dados suficientes para sugerimos que a medida da razão 2D:4D pode auxiliar treinadores, como medida adicional, na avaliação física de jovens atletas. Palavras-chave: Diferenciação sexual, Razão do dedo, 2D:4D, medida direta e indireta, força estatística, testosterona, agressão, força de preensão manual. 2D:4D. / Abstract: Prenatal androgenization plays an important role in human brain development and influences human behaviour. Digit ratio (2D:4D), the relative lengths of the index finger (2D) and the ring finger (4D), is a putative marker for prenatal testosterone and is correlated with performance in many sports. This thesis analysed the relationship between 2D:4D ratio with sport performance and physical, psychological and endocrine characteristics. It divided in three studies, and in the first one we investigated a methodological question regarding 2D:4D measuring. We compared direct versus indirect measurement of digit ratio (114 males and 90 females). And reviewed the literature on this issue. We found that direct 2D:4D measuring tends to be larger than indirect ones, indicating that direct and indirect mean 2D:4D's should not be compared in between-population studies. On the second study, we hypothesised that correlation between 2D:4D and strength may be strongest in challenge conditions when short-term changes occur in steroid hormones. The challenge condition increased Handgrip strength (HGS), and elicited modest changes in testosterone (T), physical aggression and emotional stability. HGS correlated negatively with left hand 2D:4D. In a multiple regression, left hand 2D:4D was negatively related to HGS and emotional stability was positively related to HGS. In the control condition HGS was not correlated with 2D:4D. Our conclusions were that 2D:4D is a negative correlate of strength in challenge situations and this finding may in part explain associations between 2D:4D and sports performance. In the third study, we assessed 64 male junior tennis players and found that low 2D:4D ratios were associated in 35% with better tennis performance, in 20% with higher HGS, in 9% with explosive muscular strength and in 7% with best self-confidence. There was no relationship between 2D:4D ratios and steroid hormones, although, as we found on study two there was a T increase in 13% after the physical tests challenge. Finally, we suggest that there are associations with 2D:4D ratios and junior tennis performance, however, studies in female junior tennis players and other sports-related variables are still needed. We suggest that 2D:4D ratios could help sports coaches as an additional measure on young athlete assessments. Key words: Sexual Differentiation, Digit Ratio, 2D:4D; direct vs indirect measurement; Tennis; Testosterone; Aggression; Hand-grip Strength