Orientadora : Profª. Drª. Lia Sumie Nakao / Orientadora : Profª. Drª. Marcia Helena Appel / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2013 / Inclui referências / Área de concentração :Biologia / Resumo: Quiescina/sulfidril oxidase isoforma 1b (QSOX1b) é uma enzima secretada, e catalisadora da oxidação de proteínas nascentes e mal dobradas. Esta oxidação induz a formação de pontes dissulfeto, que são cruciais para a conformação e estabilidade de diversas proteínas. A literatura propõe que a oxidação de proteínas intra e extracelular, ou aquelas de superfície celular, acarreta em mudanças no estado redox destes microambientes, e também em alterações conformacionais das micro e macroestruturas proteicas. Baseado nisso, tivemos como objetivo analisar o papel de QSOX1b recombinante de camundongo (mQSOX1b) como possível oxidase da fibronectina (FN), uma glicoproteína dimérica de matriz extracelular (MEC). Através das determinações de peróxido de hidrogênio e de tióis em ensaios cinéticos com mQSOX1b e FN reduzida (redFN), in vitro, constatamos que redFN é oxidada pela enzima. A constante de Michaelis menten medida foi de aproximadamente 456 nM (com uréia) e 290 nM (sem uréia). redFN, per se, auto fibrila, produzindo multímeros solubilizados por deoxicolato (DOC), contudo, verificamos que mQSOX1b acelera a formação destes multímeros. Estas estruturas fibrilares possuem massa molecular maior que 800 kDa, e são desfeitas por agentes redutores, mas não são desfeitas por DOC (2%), indicando que são mantidas por pontes dissulfeto. Os multímeros não afetam a interação de redFN com gelatina, como indicado por imunoensaio. Coatings com multímeros de FN (nativa e reduzida) não alteraram a capacidade adesiva de Rasm (células musculares lisas de aorta de rato), HeLa (células de câncer cervical, Henrietta Lacks) ou 3t3 (Fibroblasto de camundongo), contudo, a proliferação foi aumentada quando Rasm e HeLa foram incubados sobre natFN junto a mQSOX1b. Ao analisar a superexpressão da mQSOX1b sobre o estado redox da MEC e superfície celular nas linhagens Hek293t (células de rim de embrião humano para transfecção) e HeLa, pudemos constatar a promoção do estado mais oxidado para estes ambientes. Sendo assim, propomos para QSOX1b funções biológicas sobre a formação e remodelamento de componentes da MEC, aqui demonstrado especificamente sobre FN. Sendo assim, a presença de QSOX1 pode estar associada com o controle do crescimento e sobrevivência celular, tanto em situações fisiológicas quanto patológicas. Palavras chaves: Quiescina/Sulfidril Oxidase 1b (QSOX1b); Matriz extracelular (MEC); Fibronectina (FN); oxidação; estado redox. / Abstract: Quiescin/Sulfhydryl Oxidase isoform 1b (QSOX1b) is a secreted enzyme, and catalyzes the oxidation of nascent and misfolded proteins. This oxidation leads to the formation of disulfide bonds which are critical to the conformation and stability of various proteins. The literature suggests that oxidation of intra-and extracellular proteins or those at cell surface leads to changes in the redox state of these microenvironments, as well as conformational changes in the protein micro and macrostructure. Based on that, we aimed to analyze the role of mouse recombinant QSOX1b (mQSOX1b) as a possible oxidase for fibronectin (FN), a dimeric glycoprotein of the extracellular matrix (ECM). In vitro, through enzyme kinetics assays and measurement of thiols in the presence of mQSOX1b and reduced FN (redFN), we found that redFN is oxidized by the enzyme. The KM values found were approximately 456 nM (urea) and 290 nM (without urea). FN multimers are also generated by auto fibrillation and can be solubilized by deoxycholate (DOC), however, we found that the QSOX1b accelerates the formation of these multimers. These fibrillar structures have molecular mass greater than 800 kDa, and are lost in the presence of reducing agents but not DOC (2%), indicating that multimers are maintained by disulfide bonds. The multimers forms no affect the gelatin-redFN interaction, indicated by ELISA. Coatings with multimers of FN (native and reduced FN) did not alter the adhesive capacity of Rasm, HeLa or 3T3, however, the proliferation was increased when Rasm and HeLa were incubated on natFN along mQSOX1b. Analyzing mQSOX1b overexpression influence on the ECM redox state and cell surface protein thiols at HEK293T and HeLa cells, we found more oxidized state for these environments. Therefore, we propose as biological functions to QSOX1b the formation and remodeling ECM components, here specifically FN. Thus, the presence of QSOX1 may be associated with cellular growth and survival control, probably in physiological and pathological conditions. Keywords: Quiescin/sulfhydryl oxidase 1b (QSOX1b), extracellular matrix (ECM), fibronectin (FN); oxidation; redox state.

Orientador : Dr. Samuel Goldenberg / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2007 / Inclui bibliografia / O Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, que continua sendo um importante problema de saúde pública na América Latina. Os estudos sobre o T. cruzi têm sido facilitados pela possibilidade de cultivo e diferenciação in vitro dos principais estágios evolutivos do parasita. Este trabalho aborda o estudo de aspectos morfológicos e moleculares da diferenciação in vitro de tripomastigotas metacíclicos para amastigotas (amastigogênese extracelular). Extensas mudanças morfológicas foram caracterizadas por microscopia óptica e eletrônica durante a diferenciação, como brotamento, crescimento e liberação de uma estrutura muito semelhante à forma amastigota, com capacidade replicativa e positiva para a marcação com o anticorpo alfa-Ssp-4 específico para amastigotas. Análises por espectrometria de massas mostraram que o perfil lipídico total é alterado, com aumento na proporção de liso-lipídios durante a diferenciação, podendo estar correlacionado às alterações morfológicas observadas no processo de amastigogênese. Com o intuito de obter amostras enriquecidas de membrana plasmática, foi elaborada uma nova estratégia, baseada na interação biotina/avidina. Tal estratégia visou o estudo mais detalhado dos constituintes da membrana, visto que foi observada alteração em sua forma, sugerindo sua relevância para o processo de diferenciação. Foram também feitas análises do transcritoma de amastigotas extracelulares utilizando microarranjos de DNA, comparando-os com os demais estágios, principalmente tripomastigotas metacíclicos e amastigotas obtidos de cultura de células. Estas análises proporcionaram uma visão geral dos grupos de genes diferencialmente expressos entre tripomastigotas metacíclicos e amastigotas extracelulares, no qual se pode destacar como aumentados em amastigotas genes envolvidos na replicação, reparo e transcrição do DNA, e no processamento de RNA. Também foram detectados genes com o mesmo padrão de expressão em amastigotas extracelulares e amastigotas de cultura de célula, sugerindo a proximidade entre os dois tipos de formas replicativas intracelulares. Tais grupos gênicos podem ser agora melhor investigados, corroborando para a elucidação dos mecanismos de regulação de sua expressão, suas funções em cada estágio e sua importância durante a diferenciação. Os dados aqui apresentados abrem muitas perspectivas para a investigação da amastigogênese, um fenômeno ainda pouco conhecido, de vital importância para o T. cruzi e que pode conter novas informações para o desenvolvimento de terapias para doença de Chagas. / Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas’ disease, which still represents an important public health problem in Latin America. Studies on T. cruzi have been rendered feasible by the possibility to reproduce under in vitro culture conditions the life-cycle of the parasite. This work is focused on the description of the morphological and molecular changes occurring in the course of the in vitro differentiation of metacyclic trypomastigotes to amastigotes (extracellular amastigogenesis). The morphological changes have been characterized by optical and electron microscopy investigation during differentiation, including budding, development and release of a structure resembling to amastigote forms. These extracellular amastigotes are able to replicate and react with an antibody against the Ssp-4 antigen, which is specific for amastigotes. Mass-spectrometry analyses have shown total lipid profile changes during amastigogenesis, with an increase in lyso-lipids ratios during differentiation; this could be related to morphological alterations observed in the course of the amastigogenesis process. In order to obtain plasma membrane enriched samples, a new strategy was elaborated based on biotin/avidin affinity purification. The strategy aims to identify plasma membrane and its components, since important morphological changes occur during amastigogenesis which are very likely relevant to differentiation process. Furthermore, the transcriptome analysis of extracellular amastigotes is described using DNA microarrays to compare metacyclic trypomastigotes and cell culture derived amastigotes. These analyses allowed a broad comparison between metacyclic trypomastigotes and extracellular amastigotes differentially expressed group of genes, such as those involved in replication, repairing and transcription of DNA, and processing of RNA, almost all of them more expressed in extracellular amastigotes. Genes presenting similar expression patterns have been also observed in extracellular and intracellular amastigotes, suggesting the similarity between these developmental forms. These genes are being investigated in order to get further insight into the mechanisms involved in their expression regulation and their relevance to the differentiation process. The data presented herewith pave the way to investigate the amastigogenesis process, an important step of T. cruzi life-cycle.

Orientador : Profª. Drª. Andrea Senff-Ribeiro / Coorientador : Profª. Drª. Olga Meiri Chaim / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 17/02/2017 / Inclui referências : f. 102-115 / Área de concentração / Resumo: As aranhas do gênero Loxosceles (aranhas-marrons) são responsáveis pela maioria dos acidentes envolvendo animais peçonhentos em Curitiba e região metropolitana, sendo consideradas um problema de saúde pública. O veneno dessas aranhas tem sido amplamente estudado e diversos grupos de pesquisa têm investido na caracterização de suas toxinas. Entretanto, a literatura referente à hemolinfa dessas aranhas é bastante restrita: o único artigo existente foi publicado pelo nosso grupo em 2015. Baseado na premissa de que o conhecimento dos conteúdos celular, lipídico e protéico podem fornecer informações importantes sobre a toxinologia e sobre moléculas bioativas, o objetivo deste trabalho foi a caracterização bioquímica e celular da hemolinfa de L. intermedia, bem como analisar potenciais atividades biológicas da hemolinfa e suas moléculas. O perfil proteico da hemolinfa de L. intermedia em eletroforese (SDS-PAGE) uni e bidimensional revelou a presença de proteínas e peptídeos com massas variando de 20 a 200 kDa. As proteínas da hemolinfa apresentaram os resíduos de glicosilação: galactose ? (1,4) N-acetilglucosamina e alta manose. Por meio de espectrometria de massas foi verificado que os lipídios predominantes na hemolinfa são a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina. Quanto à fração celular da hemolinfa, quatro tipos de hemócitos foram identificados: os pró-hemócitos, os plasmatócitos, os adipohemócitos e os granulócitos. A atividade esfingomielinásica da toxina recombinante fosfolipase-D de L. intermedia (LiRecDT1) foi reduzida em 70% na presença da hemolinfa, contudo não foi encontrado um inibidor específico para essa enzima, sugerindo que essa redução tenha sido decorrente da dificuldade da toxina em encontrar seu substrato preferencial. O ensaio de imunodetecção indicou na hemolinfa a presença de uma proteína de aproximadamente 36 kDA com epítopo similar ao da toxina LiRecDT1, mas a hemolinfa não apresentou toxicidade para camundongos nas concentrações testadas. O cultivo primário dos hemócitos foi realizado em meio Sf-900-III SFM contendo 250 ?g/ml de gentamicina e 10% de soro (SFB). Verificou-se que a incubação dos hemócitos com veneno de L. intermedia e com a toxina loxoscélica recombinante LiRecDT1 não alterou as características morfológicas das células em microscopia optica, sugerindo ausência de processos de apoptose ou necrose. Dificuldades metodológicas não permitiram a caraterização dos hemócitos por microscopia eletrônica de transmissão. O estudo de proteômica (shotgun) não identificou inibidores de proteases ou de outras enzimas presentes no veneno; e grande parte das identificações foram relacionadas a proteínas estruturais e à hemocianina. Os experimentos de citometria de fluxo utilizando a sonda fluorescente Mitotracker permitiram a separação eficiente das populações de pró-hemócitos e plasmatócitos, contudo havia granulócitos nas duas amostras isoladas. Os ensaios de atividade antimicrobiana de peptídeos presentes na hemolinfa isolados por HPLC não evidenciou a inibição do crescimento dos microrganismos Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A hemolinfa é uma amostra biológica muito rica que deve continuar a ser investigada, contudo as dificuldades de estudá-la estão relacionadas com o baixo rendimento da coleta da amostra e a grande complexidade bioquímica do seu conteúdo (celular e proteica). Palavras-chaves: hemolinfa, L. intermedia, hemócitos, antimicrobiano, cultivo primário, inibidores, citometria. / Abstract: Loxosceles genus spiders (Brown spiders) are responsible for most of the accidents involving venomous animals in Curitiba and metropolitan region and for this reason they are considered a public health problem. The venom from these spiders has been widely studied and several research groups have been focused in the characterization of the toxins. However, the literature on the hemolymph from these spiders is rather restricted: the only article was published by our group in 2015. Based on the premise that knowledge of the cellular, lipidic and proteic contents can provide important information about toxinology and bioactive molecules, the aim of this work was biochemical and cellular characterization from L. intermedia hemolymph as well as to analyze potential biological activities present in this hemolymphand yours molecules. The protein from hemolpymph of L. intermedia hemolymph in one and two-dimensional SDS-PAGE revealed the presence of proteins and peptides with molecular mass varying from 20 to 200 kDa. The protein from hemolymph presented glycosylation: galactose ? (1,4) N-acetylglucosamine and high mannose. By means of mass spectrometry analysis was verified the lipidic predominance in the hemolymph are phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. In relation to the hemolymph cellular fraction four types of hemocytes were identified: pro-hemocytes, plasmatocytes, adipohemocytes and granulocytes. The sphingomyelinase activity of L. intermedia recombinase phospholipase-D (LiRecDT1) was decreased 70% In the presence of hemolymph, however, no specific inhibitor to this enzyme was found, suggesting that this reduction was related to difficulty of the toxin to find your preferential substrate. The immunodetection assay indicated there are in the hemolymph a protein with nearly 36 kDa with epitope resembling LiRecDT1, but this protein showed no toxicity to mice at the concentrations tested. The primary culture of hemocytes was done in Sf-900-III SFM medium plus 250 ?g /ml gentamycin and 10% FBS. It was found that the incubation venom from L. intermedia and toxin LiRecDT1with hemocytes did not present morphological alterations in these cells analyzed by optical microscopy, indicated no apoptosis or necrosis. Methodological difficulties did not allow the hemocytes to be characterization by transmission electron microscopy. In proteomic (shotgun) analysis no protease inhibitors or other enzymes present in the venom; and the most of identification were related to structural proteins and hemocyanin. The experiments of flow citometry with MitoTracker probe labeling resulted in the efficient isolation of prohemocytes and plasmatocytes, however there was granulocytes in both of samples isolated. The antimicrobial activity assays of peptides present in hemolymph isolated by HPLC did no show isolated activity against Candida albicans, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Hemolymph is a very rich biological sample that needs to be investigated more thoroughly, but the difficulties of studying it are related to the low amount of sample (cellular and protein). Key-words: Hemolymph, L. intermedia, hemocytes, antimicrobial, primary culture, inhibitors, cytometry.

Orientadora : Profª Drª Maria Cristina L. G. Santos / Co-orientador : Prof. Dr. Ricardo Lehtonen de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 24/09/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O tendão tibial posterior (TTP) é particularmente vulnerável e sua insuficiência é reconhecida como a principal causa do pé plano adquirido do adulto. Alguns pacientes têm uma predisposição sem causa clinicamente reconhecida, sugerindo que as características individuais, incluindo fatores genéticos, desempenham um papel importante na tendinopatia. As metaloproteinases da matriz (MMP) são enzimas responsáveis por degradar e remodelar o colágeno, principal componente dos tendões. O objetivo do presente estudo foi investigar a associação do polimorfismo -77 (rs2252070) da MMP-13 isoladamente e em haplótipo com os polimorfismos -519 (rs1144393) e -1607 (rs1799750) da MMP-1 e -799 (rs11225395) da MMP-8 e a predisposição a disfunção do TTP. A amostra de 200 pacientes selecionados foi dividida em: grupo teste com 100 pacientes submetidos à procedimentos cirúrgicos e de diagnóstico histopatológico de lesão degenerativa do tendão tibial posterior e grupo controle com 100 pacientes com tendão do tibial posterior intacto e sem sinais de degeneração. O DNA dos voluntários foi obtido a partir de células epiteliais da mucosa bucal, por extração com acetato de amônio. A identificação dos genótipos foi realizada por PCR e RFLP. A análise estatística dos resultados foi realizada pelos testes de Mann-Whitney U (idade), Exato de Fisher (IMC), Regressão logística múltipla, Análise por combinação, Chi-quadrado (frequências alélicas e genotípicas) e SNPstats (haplótipos), todos com nível de significância de 5%. Houve uma diferença significativa nas frequências alélicas e genotípicas entre os grupos teste e controle para os polimorfismos -77 da MMP-13, -519 e -1607 da MMP-1 e -799 da MMP-8. Análise de haplótipo indicou diferença significativa entre os dois grupos estudados. De acordo com nossos resultados o polimorfismo -77 da MMP-13 isoladamente e em haplótipo com polimorfismos -519 e -1607 da MMP-1 e -799 da MMP-8 está associado à tendinopatia no tendão do tibial posterior. Palavras-chave: MMPs, MMP-1, MMP-8, MMP-13, Metaloproteinases, Polimorfismos em MMPs, Tendinopatia do Tibial Posterior. / Abstract: Posterior tibial tendon (PTT) is particularly vulnerable and its insufficiency is recognized as the main cause of adult acquired flatfoot. Some patients have a predisposition without clinically recognized cause, suggesting that individual characteristics, including genetic factors, play an important role in tendinopathy. The matrix metalloproteinases (MMP) are enzymes responsible for degrading and remodeling the collagen, the main compomente tendons The objective of the present study is to investigate the association of -77 (rs2252070) matrix metalloproteinase-13 (MMP-13) polymorphism and its haplotypes with -1607 (rs1799750), -519 (rs1144393) MMP-1 and -799 (rs11225395) MMP-8 and risk of PTT dysfunction. The sample of 200 selected patients was divided into test group: 100 patients undergoing surgical procedures and pathological diagnosis of degenerative lesions of the posterior tibial tendon, and control group: 100 patients with posterior tibial tendon intact and no signs of degeneration. The DNA of the volunteers was obtained from oral mucosa epithelial cells, by extraction with ammonium acetate. PCR and RFLP were used for analysis of genotypes. Statistical analysis of results was performed by Man Whitney U test (age), Fisher's Exact (IMC), multiple logistic regression, analysis by combining and Chi-squared (allelic and genotype frequency) and SNPstats (haplotype), test with significance level of 5%. There was a significant difference in the presence of the different alleles and genotypes between the control group and test group for the -77 MMP-13,-519 and -1607 MMP-1, -799 MMP-8, polymorphism. Global haplotype analysis indicated a significant difference between both groups. According to our results, -77 MMP-13polymorphism isolated and its haplotypes with -519, -1607 MMP-1 and -799 MMP-8 are associated to tendinopathy in posterior tibial tendon. Keywords: MMPs, MMP-1, MMP-8, MMP-13, metalloproteinases, Polymorphisms in MMPs, Posterior Tibial Tendinopathy.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-04T12:41:05Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2165872 bytes, checksum: 7b20ed84916fcf93be218e2ce4393822 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-04T12:41:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2165872 bytes, checksum: 7b20ed84916fcf93be218e2ce4393822 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ordem Hemiptera compreende um grupo diversificado de insetos com cerca de 89 mil espécies descritas e agrupadas nas quatro subordens: Heteroptera, Sternorrhyncha, Coleorrhyncha e Auchenorrhyncha. Esta última possui mais de 25 mil espécies descritas dentro de duas grandes infraordens: Cicadomorpha (Cercopoidea, Cicadoidea e Membracoidea) e Fulgoromorpha (Fulgoroidea). A subordem Heteroptera é dividida nas infraordens: Enicocephalomorpha, Dipsocoromorpha, Gerromorpha, Nepomorpha, Leptopodomorpha, Pentatomomorpha e Cimicomorpha. Ela possui mais de 400 mil espécies descritas que podem ser predadoras, fitófagas e hematófagas caracterizando essa subordem como de importância econômica e de saúde pública. As relações filogenéticas dentro dos Auchenorrhyncha e dos Heteroptera ainda são temas de muito debate. O conhecimento da biologia reprodutiva e da morfologia dos espermatozoides podem contribuir para estudos taxonômicos e filogenéticos dessas duas subordens. Nesse contexto, no presente trabalho descrevemos, usando as microscopias de luz e eletrônica de transmissão, a estrutura e ultraestrutura dos espermatozoides de Dalbulus maidis e Collaria oleosa e Prepops zetterstedti. No primeiro capítulo, nós redescrevemos os espermatozoides de D. maidis, que mediram de 118,1-128,5 μm de comprimento, sendo este valor cerca de três vezes menor do que o descrito anteriormente. A região da cabeça é formada por acrossomo e núcleo. O acrossomo é paracristalino e tem a base bifurcada que está encaixada em duas cavidades em um lado da região anterior do núcleo. O núcleo mediu 19,3-22,9 μm de comprimento e, em corte transversal, exibiu a forma de meio lua com uma fina projeção central, mas nas extremidades ele se mostrou oval. O flagelo consistiu de um axonema com 9+9+2 microtúbulos, dois derivados mitocondriais simétricos, dois corpos acessórios associados a uma pequena estrutura sub-elipsoidal e um "material centro-flagelar". A porção final do flagelo de todos os espermatozoides era ramificada em três filamentos. No segundo capítulo nós caracterizamos morfologicamente os espermatozoides de dois percevejos da família Miridae, C. oleosa e P. zetterstedti. Os espermatozoides de C. oleosa e P. zetterstedti mediram 171,3 μm e 276,0 μm de comprimento, dos quais 24,7 μm e 27,2 μm representaram o núcleo, respectivamente. Em ambas espécies, essas células apresentaram na região de cabeça um acrossomo e núcleo, e no flagelo um axonema de 9+9+2 microtúbulos e dois derivados mitocondriais simétricos. Em C. oleosa, não em P. zetterstedti, o acrossomo é revestido por uma espessa camada de material denso. Na transição núcleo-flagelo das duas espécies foi observado um longo adjunto do centríolo cilíndrico formando uma ponte entre núcleo e os componentes flagelares, essa característica é exclusiva para Miridae. / The order Hemiptera comprises a diverse group of insects with about 89 thousand species described and group in four suborders: Heteroptera, Sternorrhyncha, Coleorrhyncha and Auchenorrhyncha. The latter has more than 25 thousand species described within two major infraorders: Cicadomorpha (Cercopoidea, Cicadoidea and Membracoidea) and Fulgoromorpha (Fulgoroidea). The suborder Heteroptera is divided in the infraordens: Enicocephalomorpha, Dipsocoromorpha, Gerromorpha, Nepomorpha, Leptopodomorpha, Pentatomomorpha and Cimicomorpha. It has more than 400 thousand species described that can be predatory, phytophagous and hematophagous, characterizing this suborder as of economic importance and public health. Phylogenetic relationships within Auchenorrhyncha and Heteroptera are still subjects of much debate. The knowledge of reproductive biology and morphology of spermatozoa can contribute to taxonomic and phylogenetic studies of these two suborders. In this context, the present work described, using light microscopy and transmission electron microscopy, the structure and ultrastructure of spermatozoa of Dalbulus maidis, Collaria oleosa and Prepops zetterstedti. In the first chapter, we redescribed the spermatozoa of D. maidis, which measured 118.1-128.5 μm in length, being about three times smaller than that previously described. The head region is formed by acrosome and nucleus. Acrosome is paracrystalline and has a bifurcated base which was docked in two cavities on one side of the anterior region of the nucleus. The nucleus measured 19.3-22.9 μm in length and, in cross section, showed a half-moon shape with a thin central projection, but at the extremities it was oval. The flagellum consisted of an axonema with 9+9+2 microtubules, two symmetrical mitochondrial derivatives, two accessory bodies associated with a small sub-ellipsoidal structure and a ‘center-flagellar material’. The final portion of the flagellum of all spermatozoa was branched into three filaments. In the second chapter, we morphologically characterized the spermatozoa of two Miridae bugs, C. oleosa and P. zetterstedti. The spermatozoa of C. oleosa and P. zetterstedti measured 171.3 μm and 276.0 μm in length, of which 24.7 μm and 27.2 μm represented the nucleus, respectively. In both species, the head region presented acrosome and nucleus, and in the flagellum an axoneme of 9+9+2 microtubules and two symmetrical mitochondrial derivatives. Only in C. oleosa, not in P. zetterstedti, acrosome is coated by a thick layer of dense material. In the nucleus-flagellum transition of the two species a long cylindrical centriole adjunct forming a bridge between the nucleus and flagellar components was observed, this feature is exclusive to Miridae.

As leucemias são desordens proliferativa nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica ou Aguda). Descrito em 1960, o cromossomo philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica associada a uma neoplasia, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Em 1973, foi demonstrado que o cromossomo Ph resulta da translocação recíproca entre os braços longos do cromossomo 9 e 22 [t(9;22)(q34;q11)], produzindo um gene quimérico BCR-ABL, encontrado em 95% dos casos de LMC. A proteína quimérica codificada, BCR-ABL, com atividade tirosina quinase descontrolada, é o fator causal da LMC. Durante os anos 1990, uma série de moléculas sintéticas foram desenvolvidas e testadas para inibir especificamente a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL, o Imatinib (STI-571 ou Gleevec) foi a primeira dessas drogas aprovadas e usadas como agente terapêutico contra a LMC, demonstrando redução do número de células leucêmicas em quase todos pacientes. No entanto muitos pacientes com resistências primárias ou secundárias foram frequentemente relatados. Os mecanismos de resistência são provavelmente heterogêneos, e no mínimo dois mecanismos envolvendo o gene BCR-ABL foram descritos em estudos realizados in vivo: amplificação do gene e ocorrência de mutações que resultam em substituições de aminoácidos associadas com o fenótipo de resistência. Diferentes níveis de resistência são frequentemente associadas a mutações pontuais recorrentes encontradas no domínio quinase da proteína c-ABL em regiões como: sítio catalítico, alça de ativação (A-loop) e alça de fosforilação (P-loop). Os primeiros estudos computacionais foram realizados com o mutante Thr334Ile e mutações na região do P-loop, e ajudaram a entender num nível molecular, os mecanismos de resistência ao Imatinib. Neste trabalho, realizamos um estudo estrutural e termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além de determinar a importância do solvente (com particular interesse na molécula de água denominada Cw - que medeia a interação fármaco-proteína) no processo de resistência aos fármacos. No presente trabalho, utilizamos o método semi-empírico de energia de interação linear (LIE) de maneira alternativa: analisando as interações entre diferentes mutantes da proteína c-ABL e um inibidor (Imatinib ou Nilotinib). Os coeficientes de LIE obtidos foram os seguintes: com Cw fixa (restrição de Cw na posição inicial) = 0,2169; = 0,0654; = 1,4159; e Cw livre (sem restrição de Cw na posição inicial) = 0,0394; = 0,0077; = -2,0503. O melhor ajuste dos coeficientes de LIE foram obtidos nas simulações sem restrição da posição inicial de uma molécula de água conservada (Cw), essa escolha foi baseada no valor de energia livre absoluta da proteína c-ABL selvagem ( ) ser sempre um número mais negativo quando comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada. O uso do método LIE (Linear Interaction Energy) com essa estratégia foi eficiente para analisar o efeito da interação entre diferentes proteínas c-ABL mutantes e um ligante (Imatinib ou Nilotinib). Até o momento não existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros domínios da proteína BCR-ABL: SH2 e SH3.

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As células descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metabólico pelo MTT e de unidades formadoras de colônias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservação das células CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparação com a solução padrão de criopreservação. Já na segunda fase do estudo, após as análises de todos os testes vimos que a solução que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manutenção da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A solução que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparável com seu controle (2,5%DMSO), porém quando avaliamos a solução que continha apenas trealose intracelular não obtivemos resultados satisfatórios. A catalase pode atuar sobre a redução dos níveis ERO na solução de criopreservação das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das células durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clínicos futuros, ela poderá ser um potencial crioprotetor das células-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da solução de criopreservação, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infusão de produtos criopreservados nos pacientes. / The umbilical cord blood (UCB) has been used as a source of primitive hematopoietic stem cells (HSC) to reconstitute the hematopoiesis. Most often, it is required the cryopreservation of HSC, which remain frozen in banks for possible future use. For cryopreservation of HSC, the chemical reagent dimethylsulfoxide (DMSO) has been used as a cryoprotectant. Many organisms in nature have a capacity of survive freezing and dehydration by accumulating disaccharides, so the trehalose, has been actively investigated as an alternative cryoprotector, other damage which is very common during freezing is oxygen free radicals formation which decreases the cellular viability after thawing, so the addition of bioantioxidants in the solution of cryopreservation of cells is very important. This study was divided into two phases: first, we evaluated the results obtained with the addition of antioxidants in the solution for cryopreservation of cord blood cells and the second phase: evaluate the hypothesis that the cryopreservation solution containing intracellular and extracellular trehalose improves recovery and viability of cord blood stem cells after cryopreservation. UBC was processed and subjected to cryopreservation solutions containing for the first phase: solutions with different concentrations of DMSO (10%, 5% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (5%, 2.5 %) with a disaccharide (60 mmol/L), ascorbic acid and/or catalase (10mg/mL), and for the second phase: solutions containing different concentrations of DMSO (10% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (2.5%) with intracellular trehalose (trehalose was introduced into the cell by means of liposomes) and solutions containing extra and intracellular trehalose without DMSO, stored for two weeks in N2L, and thawed. The thawed cells were assessed by flow cytometry, MTT and colony forming units (CFU) assays. In the first phase of the study our analysis showed catalase improved the preservation CD34+ and CD123+ cells, cell viability and CFU compared to standard cryopreservation solution. In the second phase, after testing of all test we observed that the solution containing intra/extracellular trehalose and DMSO showed superior capacity of maintaining the cell viability/integrity in relation to the others, the solution containing intra-and extracellular trehalose without DMSO, obtained a result that can be compared with its control (2.5% DMSO), and that the solution containing only intracellular trehalose did not generate satisfactory results. The catalase can act on reducing the levels of reactive oxygen species in the solution for cryopreservation of HSC of UCB reducing the damage it caused, trehalose must be present on both sides of the cells during the freezing process. Future clinical trials are needed to confirm that it may be a potential cryoprotectant of stem cells from cord blood, which can totally replace the DMSO in cryopreservation solution, eliminating the side effects from the infusion of cryopreserved products in patients already suffering from the disease base.

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As células descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metabólico pelo MTT e de unidades formadoras de colônias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservação das células CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparação com a solução padrão de criopreservação. Já na segunda fase do estudo, após as análises de todos os testes vimos que a solução que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manutenção da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A solução que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparável com seu controle (2,5%DMSO), porém quando avaliamos a solução que continha apenas trealose intracelular não obtivemos resultados satisfatórios. A catalase pode atuar sobre a redução dos níveis ERO na solução de criopreservação das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das células durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clínicos futuros, ela poderá ser um potencial crioprotetor das células-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da solução de criopreservação, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infusão de produtos criopreservados nos pacientes. / The umbilical cord blood (UCB) has been used as a source of primitive hematopoietic stem cells (HSC) to reconstitute the hematopoiesis. Most often, it is required the cryopreservation of HSC, which remain frozen in banks for possible future use. For cryopreservation of HSC, the chemical reagent dimethylsulfoxide (DMSO) has been used as a cryoprotectant. Many organisms in nature have a capacity of survive freezing and dehydration by accumulating disaccharides, so the trehalose, has been actively investigated as an alternative cryoprotector, other damage which is very common during freezing is oxygen free radicals formation which decreases the cellular viability after thawing, so the addition of bioantioxidants in the solution of cryopreservation of cells is very important. This study was divided into two phases: first, we evaluated the results obtained with the addition of antioxidants in the solution for cryopreservation of cord blood cells and the second phase: evaluate the hypothesis that the cryopreservation solution containing intracellular and extracellular trehalose improves recovery and viability of cord blood stem cells after cryopreservation. UBC was processed and subjected to cryopreservation solutions containing for the first phase: solutions with different concentrations of DMSO (10%, 5% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (5%, 2.5 %) with a disaccharide (60 mmol/L), ascorbic acid and/or catalase (10mg/mL), and for the second phase: solutions containing different concentrations of DMSO (10% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (2.5%) with intracellular trehalose (trehalose was introduced into the cell by means of liposomes) and solutions containing extra and intracellular trehalose without DMSO, stored for two weeks in N2L, and thawed. The thawed cells were assessed by flow cytometry, MTT and colony forming units (CFU) assays. In the first phase of the study our analysis showed catalase improved the preservation CD34+ and CD123+ cells, cell viability and CFU compared to standard cryopreservation solution. In the second phase, after testing of all test we observed that the solution containing intra/extracellular trehalose and DMSO showed superior capacity of maintaining the cell viability/integrity in relation to the others, the solution containing intra-and extracellular trehalose without DMSO, obtained a result that can be compared with its control (2.5% DMSO), and that the solution containing only intracellular trehalose did not generate satisfactory results. The catalase can act on reducing the levels of reactive oxygen species in the solution for cryopreservation of HSC of UCB reducing the damage it caused, trehalose must be present on both sides of the cells during the freezing process. Future clinical trials are needed to confirm that it may be a potential cryoprotectant of stem cells from cord blood, which can totally replace the DMSO in cryopreservation solution, eliminating the side effects from the infusion of cryopreserved products in patients already suffering from the disease base.

Submitted by Jadson Francisco de Jesus SILVA (jadson@uefs.br) on 2018-09-14T21:35:37Z No. of bitstreams: 1 LARISSA EMANUELLE - CARACTERIZA??O CITOGEN?TICA E MOLECULAR DE ACESSOS DE MARACUJ? DA CAATINGA (P.pdf: 1500343 bytes, checksum: fe0bb966270a60a1929a285b717b71db (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-14T21:35:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LARISSA EMANUELLE - CARACTERIZA??O CITOGEN?TICA E MOLECULAR DE ACESSOS DE MARACUJ? DA CAATINGA (P.pdf: 1500343 bytes, checksum: fe0bb966270a60a1929a285b717b71db (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Passiflora cincinnata Mast. is a native species of Brazil with a wide geographic distribution, which can be exploited as a source of resistance to biotic and abiotic stresses, presenting good productivity, as well as high nutritional quality for human consumption, besides other uses. On the other hand, both molecular and cytogenetic characterization is an important step for the conservation and use of genotypes, considering the potential genetic diversity of the species. The objective of this work was to characterize the genetic diversity among the passion fruit of the caatinga (P. cincinnata), conserved in the active bank of passion fruit germplasm of Embrapa Semi?rido, using cytogenetic techniques of conventional analysis, double CMA3/DAPI staining and using molecular markers from type ISSR. The different ISSR molecular markers showed efficiency in detecting polymorphism, revealing intraspecific variability among the accessions. Diploid chromosome numbers 2n=18 were observed, being classified in the chromosomal group with basic number x=9. The double CMA/DAPI staining allowed the identification of four CMA positive bands, semi-reticulated interphase nuclei with presence of CMA+ blocks. The colorability of the pollen grains using acetic carmine and Alexander reactive allowed to estimate high pollen viability with values above 98% for both dyes analyzed, indicating the potential use of this species in breeding programs. / Passiflora cincinnata Mast. ? uma esp?cie nativa do Brasil com ampla distribui??o geogr?fica, que pode ser explorada como fonte de resist?ncia a estresses bi?ticos e abi?ticos, apresentando boa produtividade, bem como alta qualidade nutricional para a alimenta??o humana, al?m de outros usos. Por outro lado, a caracteriza??o tanto molecular como citogen?tica ? uma etapa importante para conserva??o e uso de gen?tipos, considerando a diversidade gen?tica potencial da esp?cie. O presente trabalho objetivou caracterizar a diversidade gen?tica entre acessos de maracuj? da caatinga (P. cincinnata) conservados no Banco Ativo de Germoplasma de maracuj? da Embrapa Semi?rido, utilizando t?cnicas citogen?ticas de an?lise convencional, dupla colora??o CMA3/DAPI e utilizando marcadores moleculares do tipo ISSR. Os diferentes marcadores moleculares ISSR mostraram efici?ncia na detec??o de polimorfismo, revelando variabilidade intraespec?fica entre os acessos. Foram observados n?meros cromoss?micos diploides 2n=18, sendo classificados no grupo cromoss?mico com n?mero b?sico x=9. A dupla colora??o CMA/DAPI, permitiu identificar quatro bandas CMA positivo, n?cleos interf?sicos semirreticulados com presen?a de blocos CMA+. A colorabilidade dos gr?os de p?len utilizando carmim ac?tico e reativo de Alexander permitiu estimar uma alta viabilidade pol?nica com valores acima de 98% para ambos os corantes analisados, indicando o uso potencial dessa esp?cie em programas de melhoramento.

A Educação Superior Brasileira passou nos últimos anos por uma verdadeira revolução, o que nos leva a pensar na necessidade de se fazer uma reflexão acerca dos métodos de ensino que são adotados nos cursos superiores. Temos atualmente uma grande variedade de práticas pedagógicas que podem ser adotadas, sobretudo as digitais que estão cada vez mais presentes no universo de alunos e professores. No entanto, ainda é comum, sobretudo no ensino superior, o uso exclusivo de aulas expositivas como ferramenta didática, onde o aluno assume uma postura passiva em relação ao seu aprendizado, e o professor o papel de detentor do saber e transmissor do conhecimento. Esse tipo de prática é especialmente observado nos cursos das áreas de saúde e biológicas, onde a maioria das disciplinas são muito técnicas e as aulas são praticamente teórico-expositivas. Neste contexto pode ser incluída a disciplina de Biologia Celular, a qual é básica para esses cursos e envolve o estudo de estruturas e processos microscópicos, de difícil visualização, interpretação e imaginação. Para auxiliar no ensino dessa disciplina desenvolvemos neste trabalho um conjunto de animações e esquemas, utilizando o programa Adobe Flash CS5 Professional, sobre os conteúdos comumente abordados nessa disciplina, e criamos o software BioCell UNIFAL-MG. Com o material aqui produzido desenvolvemos uma estratégia de ensino, utilizada nas aulas de Biologia Celular do curso de Licenciatura em Biologia da Universidade Federal de Alfenas-MG, na qual os alunos tiveram contato com as animações e os esquemas produzidos em dois momentos distintos. O primeiro durante as aulas teóricas da disciplina, que para isso foram reformuladas para inclusão do material produzido, e o segundo momento durante monitorias oferecidas ao longo do semestre no laboratório de informática, onde os alunos podiam estudar livremente utilizando o software. Ao final do semestre o método desenvolvido foi avaliado pelos alunos, através da resposta de um questionário fechado, o qual foi avaliado através de análises estatísticas, e de um instrumento de percepção aberto. A maioria dos alunos aprovou o método e isso foi comprovado após avaliação de aspectos como “Qualidade do Material” e o “Aprendizado com o material desenvolvido”, sendo que a assertiva “As animações apresentadas facilitam o entendimento” foi a de melhor resultado dentre todas as analisadas. Os resultados obtidos nos permitem concluir que o uso de animações pode auxiliar no aprendizado dessa disciplina, tornando sua compreensão mais simples, e que há uma grande demanda por parte dos alunos por novas estratégias pedagógicas para o ensino em nível superior na UNIFAL-MG / Nowadays there was a revolution in he Brazilian High Education leading us to start to introducing new teaching methods in the University courses. We currently have a wide range of pedagogical practices that can be adopted, especially digital ones that are increasingly in the students and teachers universe. However, it is still common, especially in high education, the use of only lectures as a teaching tool, where the student assumes a passive stance in relation to their learning, and the teacher is assumed as a knowledge holder and a simple information transmitter. This type of practice is especially observed in health and biology areas, where the majority of subjects are very technical and the classes are main expositive. Cell Biology teaching is included in this context, as a basic discipline for these courses and involves the study of microscopic structures and processes which it is very difficulty to learn just from static images and texts. To assist in his kind of discipline, we developed in this work an animations and layouts set using Adobe Flash Professional CS5 on the contents commonly addressed in this discipline, and created the BioCell Unifal- MG software. With the material here produced, we developed a teaching method used in the Unifal-MG Biology course, which students had contact with the animations and diagrams showed during lectures and offered tutoring throughout the semester in the computer lab, where they could freely studied using the software. At the end of the semester the developed methodology was evaluated by an attitudinal measure scale instrument. The majority Most f the students approved the method and this was confirmed by the evaluation of points as “Material quality” and “Learning with the developed material ”, been the assertive “the animations make easy to me understand” the best evaluated by the students. The results allow us to conclude that the animation used helps in the cell biology learn and that the students are very interested in known new teaching strategies in the UNIFAL-MG.