Tesis para optar al grado académico de Doctora en Bioquímica / Antecedentes y objetivo: La aterosclerosis se caracteriza por una desdiferenciación las células de músculo liso vascular (VSMC) a un fenotipo migratorio, proliferativo, con baja expresión de proteínas de contracción y una elevada síntesis de matriz extracelular. Esta enfermedad cardiovascular tiene un componente inflamatorio crónico con presencia del factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) en el tejido aterosclerótico. Además, se ha observado que las VSMC de placas de ateroma tienen inducida la autofagia, un mecanismo asociado con la degradación de proteínas y organelos intracelulares. El objetivo de este estudio fue evaluar si el TNF-α induce desdiferenciación en las VSMCs, transformándolas a un fenotipo proinflamatorio con mayor capacidad de migración y proliferación, y si este cambio de fenotipo es mediado por autofagia. Metodología: El modelo de estudio es la línea celular de VSMCs de aorta de rata A7r5. El estímulo de TNF-α fue de 100 ng/mL. La autofagia se determinó midiendo los niveles proteicos de LC3-II, p62 y formación de vacuolas autofágicas marcándolas con LC3-GFP. La participación de la autofagia se evaluó inhibiéndola farmacológicamente con cloroquina, y genéticamente con siRNA de Beclin1. La desdiferenciación celular se evaluó midiendo la expresión y organización de las proteínas de contracción α-SMA y SM22, los niveles de las proteínas de matriz extracelular colágeno tipo I y osteopontina, proliferación celular por incorporación de [3H]-timidina y ensayo de MTT, y migración por ensayo de herida y de transwell usando una cámara Boyden. Los parámetros inflamatorios se evaluaron mediante la medición de las proteínas IL-1β, IL-6 e IL-10 por ELISA. Resultados: El TNF-α indujo autofagia reflejado por un aumento de LC3-II (1,91±0,21 veces vs control, p<0,01) y una disminución de p62 (0,77±0,05 veces vs control, p<0,001). Esta autofagia fue dependiente de IKK ya que el aumento de LC3-II inducida por TNF-α se inhibió con BAY-117082. Además, TNF-α indujo migración celular (1,45±0,09 veces vs control, p<0,01), proliferación (2,33±0,24 veces vs control, p<0,05), secreción de IL-6 (258±53 veces vs control, p<0,01), aumento de las proteínas de matriz extracelular colágeno tipo I (3,09±0,85 veces vs control, p<0,01) y osteopontina (2,32±0,46 veces vs control, p<0,01) y disminución de las proteínas contráctiles α-SMA (0,74±0,12 veces vs control, p<0,05) y SM22 (0,54±0,01 veces vs control, p<0,05). Además, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB), un inductor clásico de desdiferenciación de VSMC, al igual que el TNF-α, también indujo un aumento de la secreción de IL-6 en las VSMC. Cuando se inhibió la autofagia farmacológica o genéticamente, estos cambios fenotípicos inducidos por TNF-α no ocurrieron. Conclusión: En este trabajo se demostró que el TNF-α induce desdiferenciación celular, proliferación y migración en VSMCs de forma dependiente de autofagia. Además, el TNF-α también aumentó la secreción de IL-6, efecto que fue también dependiente de autofagia. Debido a que el fenotipo proinflamatorio también se indujo con PDGF-BB, sugerimos que el fenotipo proinflamatorio podría ser una característica común de las VSMC desdiferenciadas. Palabras claves: VSMC, TNF-α, autofagia, desdiferenciación, migración, proliferación y citoquinas / Background and aim: Atherosclerosis is characterized by vascular smooth muscle cells (VSMC) dedifferentiation to a proliferative and migratory phenotype with low contractile protein expression and high extracellular matrix synthesis. This cardiovascular disease has a chronic inflammatory component with the presence of tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the atherosclerotic tissue. Furthermore, it has been observed that VSMC of atheromatous plaques have increased autophagy, a mechanism associated with protein and intracellular organelles degradation. The aim of this study was to evaluate if TNF-α induces VSMC dedifferentiation, triggering a proinflammatory phenotype with higher migration and proliferation capacity, and if this phenotype switching is mediated by autophagy. Methodology: Studies were performed in a rat aortic VSMC cell line A7r5. Cells were stimulated with TNF-α 100 ng/mL. Autophagy was determined by measuring LC3-II and p62 protein levels and autophagic vesicles formation using LC3-GFP. Autophagy was pharmacologically inhibited with chloroquine, and genetically with a siRNA Beclin1. Cell dedifferentiation was evaluated by measuring the expression and organization of contractile proteins α-SMA and SM22, extracellular matrix protein osteopontin and type I collagen levels. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine and MTT assay, and migration was evaluated by wound assay and transwell using a Boyden chamber. Inflammatory parameters were measured by the expression of IL-1β, IL16 and IL-10 proteins by ELISA. Results: TNF-α induced autophagy as determined by LC3-II level increase (1.91±0.21 fold vs control, p<0.01) and p62 level decrease (0.77±0.05 fold vs control, p<0.001). This autophagy was dependent on IKK because TNF-α-dependent LC3-II increase was inhibited by BAY-117082. In addition, TNF-α induced migration (1.45±0.09 fold vs control, p<0.01), proliferation (2.33±0.24 fold vs control, p<0.05), IL-6 secretion (258±53 fold vs control, p<0.01), extracellular matrix proteins collagen type I (3.09±0.85 fold vs control, p<0.01) and osteopontin (2.32±0.46 fold vs control, p<0.05), and decreased contractile proteins α -SMA (0.74±0.12 fold vs control, p<0.05) and SM22 (0.54±0.01 fold vs control, p<0.05). In addition, platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), a classic VSMC dedifferentiation inducer, as well as TNF-α, also induced an increase in IL-6 secretion in those cells. When autophagy was pharmacologically or genetically inhibited, these TNF-α-induced phenotypic changes did not occur. Conclusion: In this study it was shown that TNF-α induces cell dedifferentiation, proliferation and migration in VSMCs in an autophagy dependent manner. In addition, TNF-α also increases IL-6 secretion, this effect is also dependent of autophagy. Because the proinflammatory phenotype is also induced with PDGF-BB, we suggest that the proinflammatory phenotype could be a common feature of dedifferentiated VSMCs / Mecesup; Fondecyt; Fondap; Proyecto Anillo de Investigación de Ciencia y Tecnología

La temperatura modula las propiedades electrofisiológicas del tejido cardíaco. El enfriamiento o calentamiento del miocardio en modelos animales se ha utilizado con distintos fines relacionados con la investigación de las arritmias cardíacas. Hasta el momento, las limitaciones en la metodología empleada no han posibilitado que las modificaciones térmicas de carácter regional en el epicardio fueran acompañadas de una cartografía eléctrica simultánea. Esta tesis pretende avanzar en este campo trabajando con modelos de corazón aislado y perfundido de conejo. Se ha desarrollado un dispositivo con el que posteriormente se ha realizado la investigación: un electrodo multipolar de alta resolución con capacidad de modificar la temperatura epicárdica en la zona de registro. Se han determinado sus características técnicas y funcionales más relevantes. Se ha aplicado un protocolo experimental encaminado al estudio del efecto modulador de la temperatura sobre determinados parámetros electrofisiológicos. Se ha estudiado: el intervalo QT en ritmo sinusal, la aparición de respuestas repetitivas (despolarizaciones espontáneas) y la inducción de FV en condiciones de estimulación programada, y una vez instaurada la FV: la velocidad de conducción, la longitud de onda, la refractariedad ventricular, la complejidad de los mapas de activación epicárdica ventricular y la reversión de la arritmia mediante enfriamiento selectivo y gradual epicárdico. Los resultados muestran la viabilidad del dispositivo para este tipo de investigaciones. Ello ha posibilitado la inducción de heterogeneidades en la activación eléctrica del tejido: en ritmo sinusal el intervalo QT se prolongó con la hipotermia local y se redujo con la hipertermia; en condiciones de FV, la velocidad de conducción se enlenteció con el frío y se aceleró con el calor, los cambios de temperatura modularon la longitud de onda, el intervalo fibrilatorio y la refractariedad -estimada a partir del percentil 5 del intervalo fibrilatorio / Guill Ibáñez, A. (2012). Estudio de los efectos electrofisiológicos de la modificación local de la temperatura en un modelo experimental de corazón aislado mediante un electrodo específico de alta densidad con modulación térmica [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/16885 / Palancia

OBJETIVO .- Conocer la prevalencia del Síndrome Metabólico(SM) y de la enfermedad isquémica coronaria con sus factores de riesgo en la población docente de Ica. MATERIAL y METODOS.-Aplica diseño descriptivo correlacional, método transversal,muestra aleatoria de 295,fuente directa y proceso estadístico con SPSS 10.04 RESULTADOS.- Promedio de edad 49.9 a. Desv.St. +/- 11.5 años ,Raza Mestiza 91% Prevalencia: Síndrome Metabólico 27 %; Enf. Isquémica coronaria 6%; Diabetes II 5%; HTA 26%; HDL reducido 37%; Triglicéridos altos 34%; Obesidad abdominal 28%; Obesidad 15% y Sobrepeso 21% con IMC; Sedentarismo 78%,Tabaco 22% ,Personalidad 33%, Antecedentes familiares 21%. Riesgo Relativo para Isquémica Coronaria: Sindrome Metabólico 7.1; HTA 13; Sedentarismo 8.2 y Diabetes 5.1, p < 0.001 muy significativo; Tabaco, Obesidad y Dislipidemia con 2.9, p < 0.05 significativo. Los Factores Sexo Masculino, Antec. familiar y Personalidad RR bajo p > 0.10 no significativos. Coef.correlación lineal 0.5914 IMC vs.P.Abdominal. CONCLUSIONES.- Existe alta prevalencia de Síndrome Metabólico y de Factores de Riesgo para enfermedad isquémica coronaria con RR muy alto que indica necesidad de atención, cambio de estilo de vida y programa de vigilancia para mejorar calidad de vida de la población en riesgo. PALABRAS CLAVES: Síndrome Metabólico(SM); Enfermedad Isquemica Coronaria (EIC); Factor de Riesgo ( FR),Riesgo Relativo(RR).

Barcelona : Impr. universal de Juan Bautista Llop, 1893 / “En el estudio de las ciencias biológicas, como en el de las eminentemente prácticas, debe de relegarse á un lugar muy secundario y sospechoso todo cuanto no sea hijo legítimo de la más concienzuda experimentación (…) Cualquiera cuestión técnica expuesta en el seno de las doctas corporaciones, como cualquier hecho insólito de carácter epidémico que azote á las multitudes, es pretexto abonado para suscitar debates y pareceres, que se caracterizarán, no por tener una misma unidad de miras, no por correr parejas con un racional criterio, pero sí por ser tantos en número cuantas sean las individualidades lanzadas impremeditadamente al palenque. Que los médicos tengan opiniones, es muy natural y viejo; que ellas son múltiples y exajeradas, tampoco es nuevo; pero que sean encontradas y en su mayoría opuestas, es cosa muy lamentable. El médico joven que consagra toda su atención a los problemas científicos, hasta el punto de convertirse en su propio esclavo, cae en un mar de confusiones siempre que aquéllos se refieren á casos por él no vistos ni comprobados en las salas del Hospital; las mil y una soluciones que á dichos problemas se dan, acaban por trocar su entusiasmo científico por el más cruel de los excepticismos (…)Para no concurrir, pues, con un nuevo grano de arena á engrosar esos inconmensurables obstáculos, y para no incurrir en el delito de una innovación no consolidada por los méritos que son menester, nos decidimos á desenvolver nuestro trabajo reglamentario bajo un tema que podrá no suscitar grandes polémicas, ni predisponer á la divagación de ideas, no ser pródigo en emociones y sorpresas, pero cuya capitalísima y escepcional importancia tiene en su favor los sufragios de aquellos á quienes no se les oculta la gran utilidad que á muchos prácticos pudiera reportar una recopilación de las endocarditis crónicas en un solo capítulo, redactado con estilo sencillo, dispuesto con un plan y método lo más claros posible, consagrado sólo á lo decisivo y concluyente, y ajeno á los detalles supérfluos y á las ampulosidades de relumbrón, que siempre han de redundar en menoscabo de la sencillez, concisión y claridad de que tanto necesitan las cuestiones teórico-prácticas, Esto es lo que nosotros nos hemos propuesto; pero ¿nos ha sido dable conseguirlo en todos sus puntos? Juzgue y dígalo el doctísimo cuanto respetable tribunal”.

OBJETIVO .- Conocer la prevalencia del Síndrome Metabólico(SM) y de la enfermedad isquémica coronaria con sus factores de riesgo en la población docente de Ica. MATERIAL y METODOS.-Aplica diseño descriptivo correlacional, método transversal,muestra aleatoria de 295,fuente directa y proceso estadístico con SPSS 10.04 RESULTADOS .-Promedio de edad 49.9 a. Desv.St. +/- 11.5 años ,Raza Mestiza 91% Prevalencia : Síndrome Metabólico 27 %; Enf. Isquémica coronaria 6% ; Diabetes II 5% ; HTA 26%; HDL reducido 37% ;Triglicéridos altos 34% ;Obesidad abdominal 28% ; Obesidad 15% y Sobrepeso 21% con IMC ; Sedentarismo 78%,Tabaco 22% ,Personalidad 33%, Antecedentes familiares 21% . Riesgo Relativo para Isquémica Coronaria: Sindrome Metabólico 7.1 ; HTA 13 ; Sedentarismo 8.2 y Diabetes 5.1 , p < 0.001 muy significativo ; Tabaco , Obesidad y Dislipidemia con 2.9 , p < 0.05 significativo .Los Factores Sexo Masculino , Antec. familiar y Personalidad RR bajo p > 0.10 no significativos . Coef.correlación lineal 0.5914 IMC vs.P.Abdominal. CONCLUSIONES.-Existe alta prevalencia de Síndrome Metabólico y de Factores de Riesgo para enfermedad isquémica coronaria con RR muy alto que indica necesidad de atención, cambio de estilo de vida y programa de vigilancia para mejorar calidad de vida de la población en riesgo. PALABRAS CLAVES: Síndrome Metabólico(SM); Enfermedad Isquemica Coronaria (EIC); Factor de Riesgo ( FR),Riesgo Relativo(RR).

Objetivo general: • Determinar si la ecocardiografía tridimensional en tiempo real permite evaluar las dimensiones, función global y regional de la aurícula izquierda sin basarse en fórmulas que utilizan asunciones geométricas, en individuos sanos. Objetivos específicos: • Evaluar los volúmenes sistólico y diastólico por ecocardiografía tridimensional en tiempo real. • Evaluación de la fracción de eyección por ecocardiografía tridimensional en tiempo real. • Evaluación de la función regional por ecocardiografía tridimensional en tiempo real. • Proponer un modelo de la contracción fisiológica de la aurícula izquierda. • Comparar los métodos (Simpson Biplano y de detección semiautomática de bordes 3D) para la estimación de volúmenes y FE. • Elaborar una Tabla de valores normales para todos los parámetros antes descriptos en Ecocardiografia Tridimensional en individuos normales de todas las edades.

La información respecto a la respuesta del corazón aislado de ratas hipertensas espontáneas (SHR) a la isquemia-reperfusión y a los mecanismos de protección descriptos para ratas normotensas [pre y postacondicionamiento isquémicos (PI y PCI, respectivamente) y farmacológicos], es escasa. Por lo tanto, la participación de la vía PI3K/Akt/GSK-3β y del poro de permeabilidad transitoria de la mitocondria (PPTM) en los mecanismos responsables de la muerte ó la sobrevida de los cardiomiocitos de SHR, no están debidamente aclarados. El objetivo general de este trabajo de tesis fue estudiar en corazones de SHR aislados y perfundidos con la técnica de Langendorff los efectos de la isquemia global (IG, 45 min)-reperfusión (R, 60 min), del PI y PCI y del tratamiento con ClLi e IMI (inhibidores de GSK-3β) sobre el tamaño del infarto, el daño oxidativo, la sensibilidad del PPTM al Ca2+, la liberación de citocromo c al citosol y la ultraestructura mitocondrial. El protocolo de IG-R produjo un tamaño del infarto de aproximadamente 50% del área de riesgo y daño oxidativo, evidenciado por un aumento de la peroxidación lipídica (TBARS), una disminución marcada del contenido de GSH y un aumento de la actividad de SODT y SODMn. El contenido de P-GSK-3β y P-Akt y la sensibilidad del PPTM al Ca2+ disminuyeron, mientras que la expresión de citocromo c en el citosol aumentó. La microscopia electrónica reveló que la mayor parte de las mitocondrias estaban dañadas, con edema y destrucción de sus crestas. Las intervenciones PI y PCI y el tratamiento con los inhibidores de GSK-3β protegieron a los corazones de SHR de los daños antes mencionados. Por lo tanto, en los corazones intervenidos y tratados se observó una disminución del tamaño del infarto y del daño oxidativo evidenciado por la disminución de la peroxidación lipídica (TBARS), preservación parcial del contenido de GSH y disminución de la actividad de SODT y SODMn. La expresión de P-GSK3β y de P-Akt y de la sensibilidad del PPTM al Ca2+ aumentó mientras que el contenido de citocromo c en el citosol disminuyó. Por microscopia electrónica fue posible encontrar en estos grupos la presencia de algunas mitocondrias con ultraestructura conservada. Los efectos beneficiosos del PI y PCI fueron anulados cuando la vía de señalización de PI3K/Akt fue inhibida con wortmanina. Las variables mencionadas retornaron a los valores observados en los corazones isquémicos no tratados. De las relaciones examinadas surge que: a- el tamaño del infarto es mayor cuando la peroxidación lipídica aumenta y el contenido de GSH disminuye. En estas condiciones la sensibilidad del PPTM al Ca2+ es menor. La situación opuesta se da en presencia de intervenciones cardiorpotectoras. Por lo tanto, en ellas el tamaño del infarto es menor cuando la peroxidación lipídica disminuye y el contenido de GSH aumenta. En estas condiciones la sensibilidad del PPTM al Ca2+ tiende a recuperarse. En base a los datos obtenidos se concluye que las alteraciones de la formación y/ó apertura del PPTM, participan y determinan la muerte ó la sobrevida celular en el corazón hipertrófico de SHR sometido a isquemia-reperfusión. Así, la disminución del tamaño del infarto obtenida con las intervenciones y/ó tratamientos utilizados fue el resultado de la disminución del daño oxidativo íntimamente asociada a la recuperación parcial de la integridad mitocondrial -menor apertura del PPTM- vía P-Akt/P-GSK-3β. Otro hallazgo interesante fue que la protección por el tratamiento con ClLi (fármaco ampliamente utilizado en psiquiatría) fue similar a la obtenida con las intervenciones de acondicionamiento isquémico (PI y PCI). Por lo tanto, esta droga podría ser una posible herramienta terapéutica para atenuar la injuria por isquemia y reperfusión. / Information regarding to the response to ischemia-reperfusion in isolated hearts from spontaneously hypertensive rats (SHR) as well as the effect of the protective mechanisms described in normotensive rats (ischemic and pharmacological pre and postconditioning, IP and IPC), is scarce. Therefore, the participation of PI3K/Akt/GSK-3β pathway and the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in the mechanisms responsible for cardiomyocyte death or survival are not properly clarified. The objective of this investigation was to study in isolated hearts from SHR the effects of global ischemia (GI, 45 min) and reperfusion (R, 60 min), and the actions of IP, IPC, treatments with LiCl and IMI (GSK-3β inhibitors) on infarct size, oxidative damage, mPTP Ca2+ sensitivity, cytochrome c release to the cytosol and mitochondrial ultrastructure. The protocol of GI-R produced an infarct size of approximately 50%, increased oxidative damage as evidenced by an increase of lipid peroxidation (TBARS), a decrease of GSH content and an increase of Total SOD and MnSOD activity. The content of P-GSK-3β and P-Akt and the mPTP Ca2+ sensitivity decreased while the expression of cytochrome c in the cytosol increased. Electron microscopy showed that most of the mitochondria were damaged, presenting edema and destruction of the cristae. IP, IPC and pharmacologic treatments with both GSK-3β inhibitors protected the hearts against reperfusion injury. Therefore, in the hearts treated we observed a smaller infarct size and reduced oxidative damage (decreased lipid peroxidation (TBARS), partial preservation of GSH and decreased Total SOD and MnSOD activity) compared to non-treated ischemic hearts. The P-GSK-3β and P-Akt expression and mPTP Ca2+ sensitivity increased while the cytosolic cytochrome c content decreased. By electron microscopy it was possible to find some mitochondria with normal ultrastructure. The beneficial effects of IP and IPC were canceled when the PI3K/Akt was inhibited with wortmannin. All the parameters examined returned to the values observed in non-treated ischemic hearts. Analyzing the relationships: Infarct size vs. TBARS and GSH, and mPTP Ca2+ sensitivity vs. Infarct size and TBARS, it arises that: the Infarct size increased when lipid peroxidation increased and GSH content decreased. Under these conditions the mPTP Ca2+ sensitivity decreased. The opposite situation occurs in the presence of the cardioprotective interventions. Therefore, the infarct size decreased when lipid peroxidation decreased and GSH content increased. Under these conditions the mPTP Ca2+ sensitivity tended to recover. Based on the data obtained, we suggest that the alterations of formation and/or opening of the mPTP participate and determine cell death or survival in the hypertrophic heart of SHR subjected to ischemia-reperfusion. Thus, the reduction in infarct size obtained with the ischemic interventions and /or treatments derived from the decreased oxidative damage intimately linked to a partial recovery of mitochondrial integrity- less mPTP opening- via P-Akt/P-GSK-3β. Another interesting finding was that the protection by the treatment with LiCl (drug widely used in psychiatry) was similar to that obtained with ischemic interventions (IP and IPC). Therefore, this drug emerges as a potential therapeutic tool in reducing the post-ischemic changes.

El canvi en l’estil de vida que s’ha produït en les societats desenvolupades els darrers anys ha tingut com a contrapartida l’aparició de conductes sedentàries i modificacions en la dieta. Com a conseqüència d’aquests factors s’han produït diverses alteracions metabòliques que han causat un augment de la prevalença de l’obesitat. Aquesta obesitat té una sèrie d’efectes adversos sobre la fisiologia cardiovascular i és considerada un important factor de risc pel desenvolupament de la insuficiència cardíaca. De fet, el consum de dietes amb un elevat contingut en greixos (HFD) s’ha relacionat amb una sèrie d’alteracions cardíaques directes com són la inflamació, la hipertròfia i la disfunció contràctil. Durant el procés inflamatori que es produeix en les esmentades malalties cardiovasculars, les cèl•lules cardíaques humanes secreten citocines i quimiocines proinflamatòries com el TNF-α, MCP-1, i IL-6, molècules que es troben sota el control transcripcional del factor de transcripció ubic i induïble anomenat NF-κB. Aquestes citocines exerceixen diversos efectes pleiotròpics autocrins en les cèl•lules cardíaques, tot produint un efecte de retroalimentació positiva del procés inflamatori que contribueix al desenvolupament d’aquestes malalties. En condicions normals, el cor de mamífers adults obté energia en forma d’ATP principalment a partir de la β-oxidació d’àcids grassos en el mitocondri, encara que aquest orgànul és capaç de catabolitzar altres substrats com la glucosa o el lactat per tal d’assegurar una font constant d’energia. Ara bé, en determinades circumstàncies, com és el cas de la hipertròfia i la insuficiència cardíaques, aquesta flexibilitat de substrat es veu compromesa i la β-oxidació d’àcids grassos es redueix degut a que la font principal d’energia passa a ser la glucosa. Aquests canvis metabòlics comporten una desregulació del control transcripcional de gens relacionats amb el transport, captació i catabolisme dels àcids grassos i la glucosa. En el miocardi, els factors de transcripció implicats en el control d’aquests gens inclouen ERRα i PPARβ/δ. Ambdós factors de transcripció, participen en l’activació de la PDK4, enzim clau en la modulació homeostàtica de la glucosa. Aquesta cinasa regula l’activitat de la PDC, enzim que catalitza la reacció de descarboxilació del piruvat a acetil-CoA, tot limitant l’ús de carbohidrats com a font d’energia en mitocondris i afavorint així la β-oxidació d’àcids grassos. En l’activació de la transcripció de PDK4 també hi participa PGC-1α, que interacciona amb ERRα i PPARβ/δ, tot incrementant-ne la seva activitat transcripcional. Estudis recents però, semblen indicar que no només aquests dos factors de transcripció participen en la regulació de PDK4. És el cas d’E2F1, un factor de transcripció clau en la regulació de la transició de la fase G1 a la fase S del cicle cel•lular i del qual la regió promotora del gen que codifica per PDK4 en presenta dos llocs d’unió. Estudis recents suggereixen que PPARβ/δ, que és la forma predominant en les cèl•lules cardíaques, pot atenuar les vies de senyalització inflamatòries i, per tant, interferir en la remodelació cardíaca. Aquesta funció és en gran mesura deguda a la capacitat dels PPAR, un cop han estat activats per agonistes, de formar complexos amb altres factors de transcripció activats, com ara NF-κB i STAT resultant així en la inhibició de l’activitat transcripcional d’aquests últims. Així l’ús d’agonistes PPARβ/δ podria ser un camí força interessant de cara a trobar potencials fàrmacs per tal de pal•liar les afeccions cardíaques derivades d’alteracions metabòliques i amb un rerefons inflamatori. En conjunt en aquest treball es presenten una sèrie de resultats destinats a conèixer de forma més detallada els mecanismes moleculars que relacionen les alteracions metabòliques i els processos inflamatoris en cor, per tal de poder buscar potencials dianes farmacològiques amb l’objectiu de prevenir i tractar aquests estats patològics. / The change in lifestyle that has occurred in developed societies in recent years has been accompanied by the rise of sedentary behavior and changes in diet that have caused an increasing obesity prevalence. Obesity has a huge number of adverse effects on cardiovascular physiology and is considered an important risk factor for heart failure developement. In fact, high fat diets have been linked with direct cardiac abnormalities such as inflammation, hypertrophy and contractile dysfunction. During the inflammatory process that occurs in these diseases, human cardiac cells secrete proinflammatory cytokines and chemokines such as TNF-α, MCP-1, and IL-6, molecules that are under the control of the ubiquitous and inducible transcription factor NF-κB. In certain circumstances, such in hypertrophy and heart failure, the substrate flexibility in heart is compromised and the fatty acids β-oxidation is reduced because the main source of energy becomes the glucose. These metabolic changes lead to a deregulation on the transcriptional control of genes associated with transport, uptake and catabolism of fatty acids and glucose. In the myocardium, among the transcription factors involved in the control of these genes we found ERRα and PPARβ/δ. Both transcription factors, are involved in PDK4 activation, an important enzyme in the homeostatic modulation of glucose. This kinase regulates PDC activity, an enzyme that catalyzes the decarboxylation from pyruvate to acetyl-CoA, limiting the use of carbohydrates as energy source in mitochondria and thus favoring the fatty acid β-oxidation. In the PDK4 transcription activation also participates PGC-1α, which interacts with ERRα and PPARβ/δ, increasing its transcriptional activity. However recent studies, suggest that not only these two transcription factors are involved in PDK4 regulation. Other transcription factors as E2F1, which is crucial for cell cycle control, may regulate PDK4 expression. Overall, the results shown in this work are aimed to learn in more detail the molecular mechanisms linking the metabolic disorders and inflammatory processes in heart, in order to find potential drug targets to prevent and treat these pathological states.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El daño ocasionado por la ocurrencia de un infarto cardíaco es complejo, generando la muerte celular cardíaca entre otros efectos deletéreos tanto en el periodo isquémico de falta de oxígeno y nutrientes, así como también en la posterior reperfusión sanguínea. Frente a esta condición patológica los fibroblastos cardíacos son capaces de reaccionar, secretando y renovando la matriz extracelular; lo que los convierte en elementos celulares claves en la cicatrización y remodelado del tejido cardiaco dañado post-infarto al miocardio. Esto hace necesario el intentar preservar la viabilidad de estas células para una correcta cicatrización y mantención de la función cardíaca. En relación a esto se ha reportado el uso de factores de crecimiento como elementos cardioprotectores frente al daño ocasionado por I/R, entre los cuales destaca el factor de crecimiento análogo a insulina de tipo I (IGF-1); cuyas propiedades cardioprotectoras han sido reportadas frente a I/R. Sin embargo, estos efectos citoprotectores en corazón, otorgados por IGF-1 solo han sido estudiados en cardiomiocitos, por lo que sus efectos en fibroblastos cardíacos son aun desconocidos. Nuestro trabajo estudió la capacidad de IGF-1 de proteger a los fibroblastos cardíacos de ratas neonatas sometidos a un modelo in vitro de I/R e indagó en las vías de transducción implicadas con esta protección. El tratamiento con IGF-1 (10 ng/mL) previno la pérdida de viabilidad y apoptosis de fibroblastos cardiacos ocasionado por el daño por I/R. Más aun, esta protección se observó al incubar con IGF-1 durante el momento de reperfusión e I/R, pero no así en el período isquémico, lo que sugiere que la muerte de los fibroblastos cardiacos es causada principalmente por el daño por reperfusión. Akt fue rápidamente fosforilado por IGF-1 tanto en isquemia como en reperfusión, mientras que ERK 1/2 sólo se fosforiló en el momento de reperfusión. La utilización de los inhibidores LY29002 y PD98059, neutralizó la protección conferida por IGF-1. Por lo que nuestros resultados demuestran que el tratamiento con IGF-1 durante la reperfusión previene la muerte de los fibroblastos cardiacos sometidos a I/R mediante la activación de las vías PI3K/Akt y MEK-ERK 1/2 / Myocardial infarction causes complex injury, involving cell death among other detrimental effects in both ischemia and reperfusion periods. To face this pathological condition, cardiac fibroblasts are key cellular elements, capable of extracellular matrix secretion and renewal, allowing the healing and remodeling of damaged heart tissue post-myocardial infarction. It necessary then, to preserve the viability of these cells for a proper healing and maintenance of cardiac function. In regards to this, it has been demonstrated the use of several growth factors to protect cardiac cells from the effects of acute ischemia/reperfusión. Among these, insulin-like growth factor (IGF-1) has showed several cardioprotective properties in hearts exposed to ischemia/reperfusion. However these cytoprotective effects granted by IGF-1 have been studied only in cardiomyocytes, while their effects on cardiac fibroblasts remain unknown. In this study we have determined the ability of IGF-1 to protect cardiac fibroblasts against simulated in vitro I/R injury and investigated the potential mechanisms underlying this protection. Treatment with IGF-1 (10 ng/mL) promoted a increase in cell survival against I/R dependent cell death and a decrease in apoptosis induced by this injury. Furthermore, the IGF-1 induced protection was observed with treatment at the time of reperfusion but not with IGF-1 at the time of ischemia, suggesting that cardiac fibroblast death is induced by reperfusion injury. Akt was rapidly phosphorylated by IGF-1 at both ischemia and reperfusion, but ERK 1/2 was only phosphorylated by IGF-1 at the onset of reperfusion. IGF-1 induced protection was abolished when LY294002 and PD98059 were used, suggesting that the protection is mediated via a Akt and ERK 1/2 dependent pathways. Thus, the results suggest that IGF-1 treatment at reperfusion prevents cardiac fibroblast death induced by simulated in vitro I/R via the activation of PI3K/Akt and MEK-ERK 1/2 pathways

Tesis entregada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La autofagia es un proceso fisiológico clave para la sobrevida celular durante la privación de nutrientes (estrés nutricional), diferenciación celular y desarrollo. La autofagia se define como un proceso dinámico y programado que procede con el secuestro de proteínas citoplasmáticas y organelos dentro de vacuolas de doble membrana, que se contactan y fusionan con los lisosomas para formar los autolisosomas. Diferentes vías transduccionales regulan la autofagia, siendo la vía de la fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3-K) una de las más importantes. La PI3-K clase III se requiere en los estadios tempranos de la generación del autofagosoma, mientras que la de clase I tiene un efecto inhibitorio dependiente de la proteína kinasa mTOR. En los últimos años, la autofagia también se ha definido como un proceso de muerte programada. El factor de crecimiento análogo a insulina tipo-1 (IGF-1), tiene diversas acciones sobre el corazón, destacando sus efectos prohipertrófico e inotrópico. Nuestro Laboratorio y otros grupos de investigación han demostrado que IGF-1 protege a los cardiomiocitos de la apoptosis inducida por distintas formas de estrés. Las acciones prohipertróficas y antiapoptóticas del IGF-1 son mediadas por un receptor de membrana que posee actividad tirosina kinasa intrínseca y una red transduccional compleja, integrada por las siguientes vías de señalización: a) PI3-K/PKB/mTOR, b) Raf/MEK/ERK y c) calcio. En la literatura existen evidencias contradictorias respecto a las acciones del IGF-1 sobre la autofagia y sus mecanismos en varios tipos celulares. Dado que prácticamente se desconoce si este factor de crecimiento regula la autofagia cardiaca, en esta tesis se postuló como hipótesis que “IGF-1 inhibe la autofagia cardiaca inducida por estrés nutricional”. Los objetivos específicos propuestos fueron:  Estudiar in vitro si la vía transduccional PKB/mTOR es activada por IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a estrés nutricional.  Investigar in vitro el efecto del IGF-1 en el metabolismo y viabilidad del cardiomiocito expuesto a estrés nutricional.  Determinar in vitro si IGF-1 regula negativamente la autofagia inducida por estrés nutricional.  Estudiar in vivo el papel del IGF-1 en la autofagia inducida por estrés nutricional. Los modelos experimentales utilizados fueron cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a dos formas de estrés nutricional (privación de suero/glucosa o privación de suero/aminoácidos) y ratones transgénicos LID (“Liver IGF-1 deficiency”) y controles, ayunados por 48 h. Los ratones LID presentan una deficiencia selectiva en el gen de IGF-1 en el hígado que determina niveles plasmáticos de IGF-1 muy bajos en comparación a sus controles. Los resultados mostraron que el estrés nutricional por privación de suero/glucosa estimuló temprana y progresivamente la autofagia en cultivos primarios de cardiomiocitos determinada por el procesamiento de la proteína endógena LC3-I, efecto que no se observó en los cardiomiocitos expuestos al estrés nutricional por privación de suero/aminoácidos. El estrés nutricional por privación de suero/glucosa también incrementó la distribución punteada de LC3-GFP, disminuyó la fluorescencia de LC3-GFP en los cardiomiocitos transducidos con el adenovirus LC3-GFP pero no modificó los niveles de la proteína proautofágica beclin-1. La privación de suero/glucosa produjo una caída significativa en los niveles intracelulares de ATP y un aumento de la muerte celular, la cual que no tuvo las características bioquímicas de apoptosis. Sin embargo, el bloqueo de la inducción de autofagia con el inhibidor selectivo de PI3-K clase III 3-metiladenina incrementó la muerte de los cardiomiocitos expuestos a ambos tipos de estrés nutricional. Los dos tipos de estrés nutricionales disminuyeron tempranamente (1 h) los niveles basales de las formas fosforiladas de las proteínas PKB, p70-S6K y ERK, observándose sólo una recuperación paulatina de la fosforilación de ERK1 en los cardiomiocitos expuestos a privación de suero/glucosa. IGF-1 inhibió la autofagia, la muerte y recuperó los niveles intracelulares de ATP en los cardiomiocitos expuestos a estrés nutricional por privación de suero/glucosa. Este efecto fue selectivo ya que IGF-1 no recuperó los niveles intracelulares de ATP y la viabilidad de los cardiomiocitos privados de suero y aminoácidos. Por otra parte, IGF-1 estimuló las fosforilaciones de la PKB y p70-S6K en cardiomiocitos expuestos a estrés nutricional por privación de suero/glucosa, revelando que la vía transduccional mTOR está activa. Sin embargo, el efecto del IGF-1 sobre p70-S6K no se observó en los cardiomiocitos privados de suero y aminoácidos. En un modelo in vivo de estrés nutricional en el ratón, el ayuno por 48 h indujo autofagia en el corazón, siendo este efecto mayor en los ratones transgénicos LID en comparación a los controles silvestres. Además, estos ratones LID sometidos a estrés nutricional por 48 h presentaron mayor fosforilación de la proteína AMPK en el tejido cardiaco, efecto que podría estar asociado a una mayor inducción de autofagia. Finalmente, los resultados obtenidos con el desarrollo de esta tesis permiten concluir que IGF-1 es un regulador negativo de la autofagia del cardiomiocito inducida por privación de nutrientes / Autophagy is a key physiological process for cell survival during nutrient deprivation, cell differentiation and development. Autophagy is a dynamic and programmed process that involves the engulfment of cytoplasmic proteins and organelles within a double membrane vacuole, which are fused with lysosomes to form the autolysosomes. Autophagy is regulated by different signaling pathways being the most important the PI3-K pathway. PI3-K class III is required in the early steps of autophagosome formation, while PI3-K class I has an mTOR protein kinase-mediated inhibitory effect. In recent years autophagy has also been identified as a type II programmed cell death. Insulin-like growth factor type 1 (IGF-1) has different actions on the heart, being the most important its pro-hypertrophic and positive inotropic effects. Moreover, our laboratory and other research groups have shown that IGF-1 protects cardiac myocytes from apoptosis induced by different cell stresses. Pro-hypertrophic and antiapoptotic IGF-1 actions are mediated by a membrane receptor with intrinsic tyrosine kinase activity and a complex signaling network, integrated by a) PI3-K/PKB/mTOR, b) Raf/MEF/ERK and c) Ca2+. In the literature conflicting evidence exists about the IGF-1 effects on autophagy and the mechanisms involved. Moreover, no information is available whether this growth factor regulates cardiac autophagy. Therefore, this thesis proposed as hypothesis that "IGF-1 inhibits the nutritional stress-induced cardiac autophagy". The specific aims were:  To study in vitro whether PKB/mTOR transductional pathway is activated by IGF-1 in cardiac myocytes exposed to nutritional stress.  To investigate IGF-1 in vitro effects on metabolism and viability in cardiac myocytes exposed to nutritional stress.  To determine in vitro whether IGF-1 negatively regulates nutritional stress-induced autophagy.  To study in vivo the role of IGF-1 on nutritional stress-induced autophagy. The experimental models were primary cultures of neonatal rat cardiac myocytes exposed to two forms of nutritional stresses (serum/glucose or serum/aminoacid deprivation), and transgenic mice LID (Liver IGF-1 Deficiency) on control mice starved for 48 h. The LID mice have a selective liver deficiency in IGF-1 gene that results in a lower IGF-1 plasma level than in control mice. Our results showed that nutritional stress by serum/glucose deprivation stimulated an early and progressive autophagy in primary cultures of neonatal rat cardiac myocytes, as determined by the processing of endogenous protein LC3-I. This effect was not observed in cardiac myocytes exposed to nutritional stress by serum/aminoacid deprivation. Nutritional stress by serum/glucose deprivation increased GFP-LC3 dot pattern and decreased GFP-LC3 fluorescence in cardiac myocytes transduced with an adenovirus overexpressing GFP-LC3, but any change was observed in the levels of the pro-autophagic protein beclin-1. The serum/glucose deprivation induced a significant decrease in intracellular ATP levels and an increase in cell death, which lacks the apoptotic biochemical features. However, inhibition of the induction of autophagy by 3-MA increased cell death in cardiac myocytes exposed to both types of nutritional stresses. Both types of nutritional stresses produced an early decrease (1 h) in phosphorylated forms of PKB, p70-S6K and ERK. Only a gradual recovery of ERK1 phosphorylation in cardiac myocytes exposed to deprivation of serum/glucose was observed. IGF-1 inhibited both autophagy and cell death, and recovered intracellular ATP levels in cardiac myocytes exposed to nutritional stress by serum/glucose deprivation. This effect was selective to this stress because IGF-1 did not recover intracellular ATP levels and viability in serum/aminoacid deprived cardiac myocytes. Moreover, IGF-1 stimulated PKB and p70-S6K phosphorylation in cardiac myocytes exposed to nutritional stress by serum/glucose deprivation, suggesting that mTOR transductional pathway was active. However, IGF-1 effect on p70-S6K was not observed in serum/aminoacid deprived cardiac myocytes. In an in vivo nutritional stress model produced by 48 h fasting, cardiac autophagy was induced. This induction was higher in transgenic LID mice as compared to control mice. In addition, the levels of phosphorylation of AMPK increased in cardiac tissue from 48 h fasted LID mice, effect that could be associated with a larger autophagy induction. Finally, these results allow us to conclude that IGF-1 inhibits nutrient deprivation-induced cardiac autophagy