A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que causa perda progressiva e irreversível das funções cerebrais, atualmente não tem cura e não existe um tratamento específico eficaz. Uma estratégia para o tratamento paliativo é restaurar o neurotransmissor acetilcolina utilizando fármacos inibidores das enzimas colinesterase (ChEI), nesse contexto a tacrina foi o primeiro fármaco aprovado para o tratamento da DA. Há mais de uma década os análogos dímeros da tacrina, conhecidos como bis-tacrina, mostraram maior eficiência na inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE) comparativamente ao fármaco tacrina e seus análogos, devido à ação simultânea em dois sítios da enzima, catalítico e periférico. Desde então, vários compostos dímeros e híbridos contendo o núcleo tacrina tem sido sintetizados e testados como ChEI. Neste trabalho realizou-se a síntese de dímeros quirais do tipo bis-tacrina, onde dois núcleos da tacrina com substituintes quirais estão conectados por uma cadeia espaçadora de carbonos metilênicos. A reação de condensação de Friedlander foi a estratégia adotada para a obtenção do núcleo tacrina, onde uma ciclocetona quiral de origem terpênica foi condensada com um ácido o-aminobenzóico na presença de POCl3, formando os intermediários do tipo 9-cloroacridinas quirais. As ciclocetonas quirais foram sintetizadas a partir da reação de retro-aldol do monoterpeno natural pulegona, comercialmente disponível nas formas (R)-(+)- e (S)-(-). A preparação dos homodímeros envolveu a reação de substituição nucleofílica aromática (SNAr) entre as 9-cloroacridinas e a 1,7-heptanodiamina, que contém a cadeia alquílica espaçadora. A síntese dos heterodímeros necessitou a preparação dos precursores 9-(1,7-diaminoeptil)-1,2,3,4-tetraidroacridina, contendo o núcleo tacrina e o grupo amino separados pela cadeia espaçadora, para posterior reação de SNAr com as 9-cloroacridinas. Os produtos obtidos neste trabalho foram purificados por cromatografia em coluna e caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, no infravermelho (IV), atividade óptica e medidas de ponto de fusão. As análises de atividade óptica mostraram que a quiralidade foi mantida nos intermediários e nos produtos finais sintetizados. Foram realizados ensaios biológicos de inibição das enzimas AChE e BuChE com os compostos quirais disponíveis, e os dímeros da série (R) mostraram ser ativos como inibidores das enzimas. / Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder which causes progressive and irreversible loss of brain functions and currently has no cure and no effective specific treatment. A strategy for palliative treatment of AD is the restoration of neurotransmitter acetylcholine using drugs cholinesterase inhibitors (ChEI) and tacrine was the first drug approved for the treatment of AD. About fifteen years ago, bis(n)-tacrine analogues linked by an alkylene chain were prepared, and it was proved that these dimeric molecules of tacrine offered a much stronger potency and selectivity toward AChE. Bis(7)-tacrine simultaneously binds at both the CAS and the PAS sites and provides a higher selectivity towards AChE over BuChE.. Since then, several dimmers and hybrid compounds containing the nucleus tacrine, have been synthesized and tested as cholinesterase inhibitors. In this work were carried out the syntheses of chiral homodimers and heterodimers of bis-tacrine type, where two nucleus of tacrine with chiral substituents were connected by an alkyl chain as spacer. The Friedländer condensation reaction was performed to obtain the tacrine nucleus, the cycloketone from a chiral terpene source was condensed with an o-aminobenzoic acid in the presence of POCl3, forming 9-chloroacridine intermediates. The chiral cycloketone were obtained from natural monoterpene pulegone, commercially available in (R)-(+)- and (S)-(-) enantiomers. The preparation of homodimers involved the nucleophilic aromatic substitution (SNAr) reaction between 9-chloroacridines and 1,7-diaminoheptane, which contains the spacer alkyl chain. The synthesis of heterodimers required the preparation of precursor 9-(1,7-diaminoheptyl)-1,2,3,4-tetraydroacridine, containing tacrine nucleus and the amino group separated by spacer chain, for subsequent SNAr reaction with the 9-chloroacridines. The products obtained in this work were purified by column chromatography and characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy of 1H and 13C, infrared spectroscopy (IR), optical activity and melting point measurements. The analysis of optical activity showed that the chirality was maintained in the intermediate and final products synthesized. Biological assays of inhibition of AChE and BuChE enzymes were performed with chiral compounds. The dimers of (R)-series were active as cholinesterase inhibitors.

A Doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa relacionada à idade, que se caracterizada pela perda progressiva da memória, pela incapacidade de realizar atividades do cotidiano e alterações de personalidade. Esta doença é caracterizada histopatologicamente pela presença de placas senis e dos emaranhados neurofibrilares e também pela perda sináptica e morte neuronal. Além disso, já está bem estabelecido que a neuroinflamação é uma característica proeminente do cérebro de pacientes com doença de Alzheimer, no qual respostas inflamatórias desempenham um papel significativo na progressão da doença. Infelizmente, os fármacos utilizados no tratamento desta doença são limitados a inibidores da acetilcolinesterase que não têm impacto na patogênese da doença. As estatinas, que pertencem à classe de drogas redutoras de colesterol, têm sido propostas como novos agentes úteis na terapia da doença de Alzheimer devido às suas propriedades neuroprotetoras e anti-inflamatórias. Neste estudo, avaliamos o efeito neuroprotetor da atorvastatina, um inibidor da HMG-CoA redutase contra a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. As culturas foram tratadas com 2,5 uM ou 5μM de atorvastatina e então expostas a 25μM do peptídeo Aβ25-35 durante 48h. Também foi investigado o envolvimento da via de sinalização PI3K, as respostas oxidativas, a ativação astroglial, e os níveis de sinaptofisina (marcador pré-sináptico) e de citocinas. O tratamento com atorvastatina impediu a lesão celular induzida pela exposição ao Aβ25-35, reduziu as respostas inflamatórias e oxidativa e aumentou o imunoconteúdo de sinaptofisina. Além disso, a atorvastatina preveniu significativamente a ativação da GSK-3β, a ativação astroglial e o aumento nos níveis de TNF-α e IL-6. Tomados em conjunto, estas observações sugerem que a atorvastatina pode proporcionar uma eficaz ação neuroprotetora contra a neurotoxicidade induzida pelo Aβ através da ativação da via de sinalização PI3K/AKT e atenuação das respostas oxidativas e neuroinflamatórias, podendo ser uma potencial terapia a ser usada na DA. / Alzheimer’s disease is an age-related neurodegenerative disorder characterized by progressive memory loss, inability to perform the activities of daily living and personality changes. AD is characterized histopathologically by the presence of senile plaques, neurofibrillary tangles, synapse loss and neuronal death. Moreover, it is now recognized that neuroinflammation is a proeminent feature of Alzheimer’s disease brain, with inflammatory responses playing a significant role in modulating disease progression. Unfortunately, drugs effective for this disease are limited to acetylcholinesterase inhibitors that do not impact disease pathogenesis. Statins, which belong to the class of cholesterol-reducing drugs, were proposed as novel agents useful in AD therapy due the neuroprotective and anti-inflammatory properties that they have. In this study, we evaluated the neuroprotective effect of atorvastatin, a HMG-CoA reductase inhibitor, against Aβ25-35 peptide induced toxicity in organotypic hippocampal slice cultures. The cultures were treated with 2.5μM or 5μM of atorvastatin and then exposed to 25μM of Aβ25-35 for 48h. We also investigated the involvement of PI3K signaling pathway, oxidative responses, astroglial activation, and synaptophysin (pre-synaptic marker) and cytokines levels on the atorvastatin protection against β-amyloid-induced toxicity. Atorvastatin treatment prevented the cell damage induced by the exposure to peptide Aβ25-35, reduced inflammatory and oxidative responses and increased the immunocontent of synaptophysin. In addition, atorvastatin significantly prevented the activation of GSK-3β, the astroglial activation and the β-amyloid-induced increase in TNF- and IL-6 levels. Taken together, these observations suggest that atorvastatin may provide an effective neuroprotective action against neurotoxicity induced by Aβ through the activation of the PI3K/AKT signaling pathway and attenuation of oxidative responses and neuroinflammation, and could be a potencial drug used on Alzheimer disease.

O aumento da longevidade da população mundial tem como consequência uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a desordem neurodegenerativa mais prevalente e a principal causa de demência após os 60 anos. A DA caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Esses sintomas são acompanhados pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: os emaranhados neurofibrilares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis constituídas pelo peptídeo beta-amiloide (A ). O peptídeo A tem sido considerado o principal responsável pelos processos de disfunção sináptica, morte neuronal e consequente declínio cognitivo dos pacientes com DA. O cenário atual ao qual se enquadram nossos conhecimentos sobre a etiologia, fisiopatologia e terapêutica da DA ainda não permitem um entendimento completo e satisfatório sobre essa doença e seu tratamento. A curcumina, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Alguns estudos têm demonstrado que a curcumina possui propriedades antioxidantes, antiinflamatórias e anti-amiloidogênicas em modelos animais de DA. Entretanto, as bases moleculares para a sua neuroproteção ainda não estão totalmente esclarecidas. Neste trabalho, avaliamos diversos mecanismos que são modulados pela curcumina em modelos in vivo e in vitro de toxicidade induzida pelo peptídeo A 1-42. Inicialmente, demonstramos que o co-tratamento com curcumina reduziu a morte celular induzida pela exposição ao peptídeo A por 48 h em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Em paralelo, a curcumina preveniu a redução da proteína sinaptofisina, a geração de espécies reativas, a ativação astrocitária e microglial, bem como, a alteração na secreção de importantes mediadores inflamatórios. Além disso, o mecanismo envolvido com sua neuroproteção pode estar associado com a regulação da fosforilação da proteína -catenina e da modulação da via de sinalização PI3K, através da regulação dos substratos Akt e GSK-3 , visto que o uso do inibidor LY294002 bloqueou o efeito neuroprotetor da curcumina. Diante da intensa ativação astrocitária observada no primeiro capítulo, investigamos o efeito da curcumina na reatividade astrocitária em cultura primária de astrócitos expostos ao peptídeo A . Neste trabalho observamos que os mecanismos de proteção da curcumina envolvem a prevenção da ativação da proteína JNK e a regulação do perfil de sumoilação de astrócitos, visto que a superexpressão de SUMO-1 diminui a reatividade astrocitária induzida pelo peptídeo A . Além do efeito neuroprotetor contra a morte celular, a curcumina demonstrou ter efeitos benéficos na transmissão sináptica, evitando a diminuição da excitabilidade neuronal em fatias organotípicas de hipocampo de ratos expostas por 24 h ao peptídeo A e este efeito parece estar associado com a modulação das proteínas CaMKII e sinapsina I. Para a avaliação do efeito neuroprotetor da curcumina no modelo in vivo de toxicidade ao peptídeo A 1-42, devido a sua baixa biodisponibilidade, comparamos a eficiência de nanocápsulas de curcumina e curcumina livre na prevenção dos danos cognitivos induzidos pela injeção icv do peptídeo A . De modo interessante, observamos um significativo aumento do desempenho in vivo da curcumina nanoencapsulada, a qual apresentou efeitos similares ou melhores com uma dose 20 vezes menor do que a dose efetiva de curcumina livre. Os mecanismos de neuroproteção da curcumina neste modelo parecem envolver o fator neurotrófico BDNF e a via de sinalização PI3K/Akt. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial da curcumina no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor da curcumina através da nanobiotecnologia. / The increased longevity of the population has resulted in a higher prevalence of neurodegenerative diseases. Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the leading cause of dementia in persons over 60 years. The AD is characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by the presence of structural changes in brain tissue: neurofibrillary tangles formed by hyperphosphorylated tau protein and amyloid plaques formed by amyloid beta-peptide (A ). A has been considered the main processes responsible for synaptic dysfunction, neuronal death and subsequent cognitive decline in patients with AD. The current scenario of our knowledge of the etiology, pathophysiology and therapy of AD does not allow a full and satisfactory understanding of this disease and its treatment. Curcumin, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Over the past decade, studies have been shown that curcumin is associated with antioxidant, anti-inflammatory and anti-amyloidogenic properties in models of AD; however, the molecular basis for its neuroprotection is not yet fully understood. In this study, we evaluated several mechanisms that are modulated by curcumin in in vitro and in vivo models of A 1-42-induced toxicity. Initially, we demonstrated that co-treatment with curcumin reduced the cell death induced by exposure to peptide A for 48 h in organotypic hippocampal slice cultures. In parallel, curcumin prevented the reduction of synaptophysin protein, generation of reactive species, astrocytic and microglial activation and the changes in the release of important inflammatory mediators. Furthermore, the mechanism involved in this neuroprotection may be associated with regulation of phosphorylation of -catenin protein and modulation of PI3K signaling pathway, by regulating the substrates Akt and GSK-3 , since the use of inhibitor LY294002 blocked the neuroprotective effect of curcumin. Given the intense astrocytic activation observed in the first study, we investigated the effect of curcumin on astrocytic reactivity in primary culture of astrocytes exposed to A 1-42. In this study we observed that the protective mechanisms of curcumin involve the prevention of JNK activation and regulation of SUMOylation profile of astrocytes, whereas overexpression of SUMO-1 reduces astrocyte reactivity induced by A . Besides the neuroprotective effect against cell death, curcumin shown to have beneficial effects in synaptic transmission, avoiding the reduction of neuronal excitability in organotypic hippocampal slices exposed for 24 h to A 1-42 and this effect could be associated with CaMKII and synapsin I modulation by curcumin. For evaluating the neuroprotective effect of curcumin in an in vivo model of A -induced toxicity, due to its poor bioavailability, we compared the efficiency of curcumin-loaded lipid-core nanocapsules and free curcumin in preventing cognitive impairments induced by icv injection of A 1- 42. Interestingly, we observed a significant increase in the in vivo performance of nanoencapsulated curcumin, which presented similar or better neuroprotective results in a dose 20-fold lower compared to the effective dose of free curcumin. The neuroprotective mechanisms of curcumin in this model appear to involve the neurotrophic factor BDNF and PI3K/Akt signaling pathway. Taken together, our results not only confirm the potential of curcumin in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of curcumin through nanobiotechnology.

A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por um quadro clínico complexo e multifatorial, que envolve perdas cognitivas, déficit de memória e prejuízo na convivência social, observadas mais precocemente nessa população. O tecido cerebral dos portadores apresenta perdas neurais, disfunções neurovasculares, processos inflamatórios, gliose e lesões características da doença como as placas neuríticas e os emaranhados neurofibrilares. Ademais, as evidências apontam para similaridade entre DA e a demência induzida por diabetes mellitus, visto haver uma relação direta que liga a resistência e a deficiência na sinalização da insulina, com as mudanças no metabolismo da glicose. Essas alterações resultam em redução no estado de O-glicosilação com N-acetil-glucosamina das proteínas intracelulares, ativação das células gliais e o desequilíbrio homeostático na relação entre cinase/fosfatase desencadeada pela redução de metabólitos endógenos e aumento de cálcio intracelular. A resposta direta dessas mudanças é caracterizada pela expressão de marcadores celulares e liberação de mediadores inflamatórios que contribuem para a progressão e severidade da doença. Ainda, interações entre variações metabólicas e a ativação inflamatória alteram o microambiente do sistema nervoso central, ativando aguda e cronicamente astrócitos e microglia. Neste estudo investigamos a hipótese de que a infusão intracerebroventricular da estreptozotocina (STZ) desencadeia alterações patofisiológicas e moleculares em hipocampos. Em nossos experimentos, foram avaliadas as mudanças promovidas pela infusão de STZ após 1 e 4 semanas. Nossos resultados demonstram que a STZ afeta elementos importantes na via de sinalização da insulina no hipocampo, declínio da funções cognitivas e alterações neuroquímicas. Demonstramos que o grupo STZ apresentou níveis elevados da serina 307 do IRS-1 e redução na captação de glicose no hipocampo, possivelmente, através da resistência local à insulina e por disfunções astrocíticas. Além disso, demonstramos o impacto da ativação excessiva da calcineurina e a sinalização do fator nuclear de ativação das células T (NFAT), têm consequências a curto e longo prazo na progressão dos processos neurodegenerativos observados no modelo de DA esporádico. / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by a complex and multifactorial clinical presentation, which includes cognitive loss, memory deficits, and impairment in social coexistence, observed earlier in this population. The patients’ brain tissue presents neural losses, neurovascular dysfunctions, inflammatory processes, gliosis, and characteristic lesions of the disease, such as senile plaques and neurofibrillary tangles. In addition, the evidence indicates to similarity shared AD and dementia induced by diabetes mellitus by occur a direct relationship of insulin resistance and deficiency in insulin signaling with changes in glucose metabolism. These changes result in lower levels of protein modified by glycosylation with O-linked β-N-acetyl-glucosamine of intracellular, in activation of glial cells, and homeostatic imbalance in the kinase/phosphatase relationship triggered by the decrease of endogenous metabolites and increase of intracellular calcium. The direct response of these changes is characterized by the expression of cellular markers and the release of inflammatory mediators that contribute to the progression and severity of the disease. Furthermore, interactions among metabolic variations and inflammatory activation alter the microenvironment of the central nervous system, activating acute and chronic astrocytes and microglia. We hypothesized that intracerebroventricular infusion of streptozotocin (STZ) triggers pathophysiological and molecular changes in hippocampus. The changes promoted by the STZ infusion were evaluated after one and four weeks. Our results show that insulin STZ affects important elements of the insulin-signaling pathway in the hippocampus, cognitive decline and neurochemical changes. Here, we show that STZ group had elevated levels of serine 307 phosphorylation of IRS-1 and decrease in the uptake of glucose into the hippocampus, possibly, through local resistance to insulin and by astrocytic dysfunction. In addition, these results indicate that aberrant calcineurin activation and nuclear factor of activated T cells (NFAT) signaling develop earlier and later consequences in the progression of the neurodegenerative processes observed in the sporadic AD model.

A Doença de Alzheimer é uma desordem que acomete milhões de indivíduos por todo o mundo, e a sua incidência tem aumentado muito nas últimas décadas. A doença é caracterizada por diversas alterações no sistema nervoso central, e dentre elas ocorrem alterações importantes no metabolismo da glicose, com redução da utilização desse composto, levando a um importante déficit energético. A Doença de Alzheimer está intimamente relacionada com o Diabetes Mellitus, pois além de ocorrerem alterações semelhantes nas duas desordens, pacientes com diabetes têm risco aumentado de desenvolver Alzheimer. Além da correlação com Diabetes Mellitus, existem evidências de que a hipercolesterolemia também está associada ao maior risco de desenvolver Doença de Alzheimer, o que nos levou a investigar o potencial neuroprotetor das estatinas. Esse trabalho tem como objetivo avaliar alterações comportamentais e bioquímicas em dois modelos de desordens do metabolismo da glicose, bem como avaliar o possível papel neuroprotetor das estatinas, aminoguanidina e n-acetil-cisteína. / Alzheimer’s disease is a disorder that affects millions of individuals around the world, and its incidence has increased in recent decades. Alzheimer’s disease is characterized by several alterations in the central nervous system, and changes in glucose metabolism is among the most important, reducing the uptake of this compound, leading to a significant energy deficit. Alzheimer’s disease is closely related to Diabetes Mellitus, and similar metabolic changes occur in both disorders. Besides, diabetic patients present increased risk for Alzheimer’s disease. In addition, another risk factor to Alzheimer’s is high levels of plasma cholesterol, which lead some research groups to evaluate the potential neuroprotective effect of statins. The aim of this study is to asses behavioral and biochemical changes in two models of glucose metabolism disorders, and evaluate the possible neuroprotective role of statins, aminoguanidine and N-acetyl-cysteine

A doença de Alzheimer (DA) é uma devastadora desordem neurológica que afeta mais de 37 milhões de pessoas ao redor do mundo, caracterizada pelo progressivo dano cognitivo e pela perda da memória. Estas alterações clínicas são acompanhadas por alterações histológicas cerebrais características da doença, as quais incluem atrofia cerebral, perda de neurônios e disfunção sináptica secundárias à deposição extracelular do peptídeo beta-amilóide (Aβ) e à deposição intracelular de emaranhados neurofibrilares constituídos da proteína tau. Fármacos disponíveis para a terapia da DA apresentam efeito limitado e tratamentos utilizando um único medicamento ou a combinação de terapias que possam efetivamente parar ou modificar o curso da doença ainda não se encontram disponíveis. O resveratrol, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Diversos estudos têm demonstrado que o resveratrol possui propriedades anti-amiloidogênicas; entretanto, os efeitos biológicos in vivo do resveratrol são fortemente limitados devido a sua baixa biodisponibilidade, a qual representa uma barreira no desenvolvimento de aplicações terapêuticas do resveratrol. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi desenvolver uma nova formulação capaz de superar a baixa solubilidade, a limitada estabilidade, a elevada metabolização e a baixa biodisponibilidade do resveratrol e avaliar o seu efeito frente à toxicidade induzida pelo Aβ em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente, o isômero trans do resveratrol foi incorporado em nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (RSV-LNC) e a distribuição destas nanocápsulas nos tecidos cerebral, hepático e renal foi avaliada após a administração intraperitoneal (i.p.) ou por gavagem em ratos saudáveis. As nanocápsulas apresentaram elevada capacidade de encapsulamento do resveratrol e animais tratados com RSV-LNC exibiram maior concentração do resveratrol no cérebro, no fígado e no rim quando comparados aos animais tratados com resveratrol livre (RSV) após administrações diárias pelas vias i.p. ou gavagem. Na sequência, nós comparamos o efeito do tratamento com RSV e RSV-LNC frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da exposição de culturas organotípicas de hipocampo ao Aβ1-42 por 48 h. Tanto o tratamento prévio quanto o simultâneo das culturas com RSV ou RSV-LNC reduziram significativamente a morte celular induzida pelo Aβ, com o RSV-LNC apresentando efeito mais pronunciado. O pré-tratamento com ambos, RSV ou RSV-LNC, preveniu a produção de espécies reativas de oxigênio; entretanto, o tratamento simultâneo com RSV não protegeu as culturas do dano oxidativo. Ambos os tratamentos, prévio e simultâneo, com RSV-LNC bloquearam a neuroinflamação desencadeada pelo Aβ de maneira sustentada. Além disso, apenas os tratamentos com RSV-LNC foram capazes de aumentar a liberação da IL-10 mesmo na presença do Aβ e prevenir/reduzir a ativação glial e a fosforilação da JNK. Finalmente, nós avaliamos o efeito do resveratrol frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da injeção intracerebroventricular do Aβ1-42 em ratos. Nós observamos que os animais que foram injetados com o Aβ1-42 exibiram um significativo défcit na memória, o qual foi acompanhado pela significativa redução nos níveis da sinaptofisina no hipocampo. É importante ressaltar que através do uso das nanocápsulas o resveratrol foi capaz de reduzir estes efeitos deletérios do Aβ1-42 enquanto o tratamento com RSV não foi capaz de proteger da toxicidade induzida pelo Aβ, o que pode ser explicado pelo robusto aumento na biodisponibilidade cerebral do resveratrol atingida pelo uso das nanocápsulas. Adicionalmente, a ativação astrocitária e microglial, bem como fosforilação da JNK desencadeada pelo Aβ foram reduzidas somente após o tratamento com RSV-LNC, enquanto ambos os tratamentos com RSV e RSV-LNC foram capazes de reestabelecer os distúrbios na sinalização mediada pela GSK-3β e a desestabilização da β-catenina desencadeadas pelo Aβ. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial do resveratrol no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor do resveratrol através de um sistema nanocarreador. Estes resultados fornecem suporte para futuros estudos objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos no efeito neuroprotetor do resveratrol. Além disso, a combinação do resveratrol com o sistema de entrega mediado por nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico abrem novas possibilidades para o tratamento da doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a devastating neurological disorder that affects more than 37 million people worldwide, characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by characteristic histological changes in the brain, which include brain atrophy, loss of neurons and loss of synaptic function secondary to extracellular deposition of amyloid-beta peptide (Aβ) and intracellular deposition of neurofibrillary tangle composed of the microtubule-associated protein tau. Available drugs for AD therapy have small effect sizes and we still not have a single treatment or combination therapy that can effectively stop or reverse the relentless progression of AD. Resveratrol, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Several studies have been shown that resveratrol is associated with anti-amyloidogenic properties; however, the in vivo biological effects of resveratrol appear strongly limited by its low bioavailability, which is a barrier to the development of therapeutic applications. In this context, the present study was designed to develop a novel resveratrol formulation to overcome its poor solubility, limited stability, high metabolization and weak bioavailability, and to evaluate the effects of resveratrol against in vitro and in vivo Aβ-induced toxicity. Initially, trans-resveratrol was loaded into lipid-core nanocapsules (RSV-LNC) and the nanocapsule distribution in brain, liver and kidney tissues was evaluated by intraperitoneal (i.p.) and gavage routes in healthy rats. Lipid-core nanocapsules showed high entrapment of resveratrol and animals treated with RSV-LNC displayed a higher resveratrol concentration in the brain, the liver and the kidney than those treated with free resveratrol (RSV) after daily i.p. or gavage administration. Next, we compared the effects of RSV and RSV-LNC treatment against Aβ-induced toxicity by expositing organotypic hippocampal cultures to Aβ1-42 by 48 h. Pre- and co-treatment of cultures with both, RSV and RSV-LNC, significantly attenuated Aβ-induced cell death, with RSV-LNC showing somewhat higher potency. Reactive oxygen species formation was prevented by pretreatment with both RSV or RSV-LNC; however, co-treatment with RSV failed to protect cultures from oxidative damage. Pre- and co-treatment with RSV-LNC was able to block the neuroinflammation triggered by Aβ in a sustained pattern. Furthermore, only RSV-LNC treatments were able to increase IL-10 release even in the presence of Aβ, and prevent/decrease glial activation and JNK phosphorylation. Finally, we evaluated the effects of resveratrol against Aβ-induced toxicity by using an intracerebroventricular injection of Aβ1-42 model in rats. We found that Aβ1-42-injected animals showed a significant impairment on learning-memory ability, which was paralleled by a significant decrease in hippocampal synaptophysin levels. Noteworthy, by using lipid-core nanocapsules, resveratrol was able to rescue these deleterious effects of Aβ1-42 while treatment with RSV failed to protect against Aβ-induced toxicity, which can be explained by robust increase of brain bioavailability of resveratrol achieved by lipid-core nanocapsules. Additionally, activated astrocytes and microglial cells, as well as JNK phosphorylation triggered by Aβ was reduced only after RSV-LNC treatment, while both RSV and RSV-LNC treatments were able to restore the disturbance in GSK-3β signaling and destabilization of β-catenin triggered by Aβ. Taken together, our results not only confirm the potential of resveratrol in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of resveratrol by nanocarrier delivery system. These findings provide further support for future studies aiming at precisely understanding of mechanisms involved in the neuroprotective effects of resveratrol. Furthermore, the combination of resveratrol and lipidcore nanocapsules-based delivery system may open new avenues for the treatment of Alzheimer’s disease.

A cafeína é a substância psicoativa mais consumida no mundo. Ela aumenta o estado de alerta, estabiliza o humor e também pode proporcionar melhora no desempenho cognitivo. Diversos estudos epidemiológicos e com roedores indicam uma relação inversa entre consumo de cafeína (um antagonista dos receptores de adenosina) e o comprometimento da memória associado ao envelhecimento e à Doença de Alzheimer. Considerando que o comprometimento da sinalização encefálica da insulina é um componente importante da fisiopatologia da Doença de Alzheimer, a estreptozotocina vem sendo utilizada, via intracerebroventricular, para produzir um modelo de Doença de Alzheimer com características neuroquímicas, fisiopatológicas e comportamentais semelhantes à Doença de Alzheimer em humanos. Dessa forma, está tese teve como objetivo avaliar as alterações dos receptores de adenosina e a imunoreatividade neuronal no hipocampo de ratos submetidos à administração intracerebroventricular de estreptozotocina, bem como um possível efeito protetor da cafeína sobre esses parâmetros e sobre a memória de reconhecimento. Como resultado, encontramos comprometimento da memória, modificação do imunoconteúdo e da expressão do receptor de adenosina A2A e perda neuronal no hipocampo no modelo animal de Doença de Alzheimer. O tratamento crônico com cafeína foi eficaz na prevenção do comprometimento da memória e das alterações neuronais observadas no hipocampo do modelo de Doença de Alzheimer. Essas observações fornecem suporte adicional para a possibilidade de que o consumo de cafeína poderia ser uma estratégia para prevenir o déficit mnemónico. No entanto, o efeito positivo da cafeína foi observado somente no modelo de Doença de Alzheimer. Nos animais controles, a cafeína não produziu nenhum efeito sobre a memória. / Caffeine is the most consumed psychoactive substance in the world, utilized to increase alertness, stabilize humor and enhance cognitive performance. Several epidemiological and animal studies indicate an inverse correlation between caffeine intake (an adenosine receptors antagonist) and memory impairment associated with ageing and Alzheimer’s disease. Considering that impaired brain insulin signaling is a main feature of Alzheimer’s disease, intracerebroventricular streptozotocin has been used as a model of Alzheimer’s disease with features resembling those of Alzheimer's disease patients. Therefore, the aim of this thesis was to evaluate the adenosine receptors immunocontent and neuronal immunoreactivity in the hippocampus of rats submitted to intracerebroventricular streptozotocin, as well as a possible protective effect of caffeine on these parameters and on recognition memory. The results showed memory impairment, modification of A2A adenosine receptor immunocontent and neuronal loss in the hippocampus of the animal model of Alzheimer’s disease induced by streptozotocin. Chronic caffeine treatment was effective in preventing the memory impairment and neuronal changes observed in Alzheimer’s disease rats. These assessments provide additional support for the hypothesis that caffeine consumption might be a valid strategy in preventing mnemonic deficit. Nonetheless, the positive effects of caffeine consumption were observed only among Alzheimer’s disease rats. Caffeine consumption had no effect over control animal’s performance.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por um declínio cognitivo global, incluindo uma perda progressiva de memória, orientação e raciocínio, associada com a degeneração especifica de neurônios colinérgicos. As alterações histopatológicas que definem a DA são protéicos de β-amilóide e tau hiperfosforilada em placas senis e emaranhados neurofibrilares, respectivamente. Porém, os mecanismos moleculares que levam a DA não estão bem caracterizados e ainda não há nenhum tratamento eficaz para prevenir ou reverter os seus sintomas. Parte dessa dificuldade se deve à escassez de modelos experimentais adequados. Previamente nosso grupo estabeleceu condições experimentais para a diferenciação do neuroblastoma humano SH-SY5Y em neurônios dopaminérgicos a partir da adição de ácido retinóico (AR). Alguns estudos sugerem que esta linhagem, quando tratada com AR e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), apresenta uma mudança para um fenótipo colinérgico. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo caracterizar a diferenciação colinérgica desta linhagem e estabelecer as melhores condições de tratamento com ácido ocadáico (AO), que promove a hiperfosforilação e deposição da proteína tau, em combinação com oligômeros solúveis de β-amilóide (Aβ1-42), para uso como modelo in vitro ao estudo da DA. As células proliferativas foram cultivadas em meio DMEM/F12 com 10% de soro fetal ( FB). A diferenciação foi induzida com 10μM de AR em meio a cultura com 1% de SFB durante sete dias, sendo o BDNF (10 nM) acrescentado a partir do quarto dia. Determinamos a atividade da Acetilcolinesterase (AChE), da Colina Acetiltransferase (ChAT) e o imunoconteúdo de ChAT como marcadores colinérgicos. O co-tratamento com BDNF resultou em células com notável morfologia neuronal, apresentando aumento na densidade e comprimento de neuritos e nos marcadores colinérgicos. Após o estabelecimento do modelo colinérgico, as células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y foram desafiadas com uma curva de dose das neurotoxinas Aβ1-42 ou AO, e a neurotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) em combinação com a densidade de neuritos. A partir desses resultados, doses subletais das toxinas foram selecionadas para estabelecer o modelo in vitro da Doença de Alzheimer. Esses resultados fazem dessa linhagem celular uma ferramenta útil no campo da neurociência, podendo torná-la um modelo adequado para o estudo da Doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a global cognitive decline, including progressive loss of memory, orientation and reasoning associated with a specific degeneration of cholinergic neurons. Histopathological changes that define AD are amyloid-β hyperphosphorylated tau deposits in senile plaques and neurofibrillary tangles, respectively. However, the leading molecular mechanisms are not well elucidated and still there is no effective treatment to prevent or reverse the symptoms. Part of this difficulty is due to the lack of suitable experimental models. Our group previously established experimental conditions for the differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into dopaminergic neurons-like with retinoic acid (RA) addition. Some studies suggested that when treated with RA and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) this cell line has a shift to a cholinergic like phenotype. Thus, this study aims to characterize the cholinergic differentiation of SH-SY5Y cell line and to determine the best conditions for okadaic acid (OA) treatment, which promotes the deposition and hyperphosphorylation of tau protein, in combination with solubleoligomers of β- myl (Aβ - 42). Thereby we established a suitable AD in vitro model. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained in DMEM / F12 medium with 10% fetal bovine serum (FBS). Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 7 days, BDNF was added on 4th day. We determined Acetylcholinesterase (AChE) and Choline Acetyltransferase (ChAT) enzymatic activities and the ChAT immunocontent as cholinergic markers. Once the cholinergic like in vitro model was established, the differentiated SH- Y5Y cells were challeng with of Aβ -42 or AO dose curve, and neurotoxicity was evaluated by an 3-(4,5-dimethylthiazol-2il)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay in combination with neurite density. Hence, sublethal doses of neurotoxins were selected to determine the in vitro model of Alzheimer's disease. Taken together, these results suggested SH-SY5Y cell line as a useful and suitable model in Alzheimer's disease research.

A demência é caracterizada como um declínio progressivo nas funções cognitivas e perda grave de memória. A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência. Dentre as características neuropatológicas, a doença caracteriza-se por perdas seletivas neuronais e sinápticas, presença de placas neuríticas extracelulares contendo o peptídeo β- amilóide (Aβ) e emaranhados neurofibrilares (NFTs) compostos de formas hiperfosforiladas da proteína tau. Diversos modelos animais têm sido desenvolvidos para investigar a etiologia da DA, embora ainda não estabelecida, muitos fatores de riscos e alterações patológicas tem sido utilizados para a elaboração de modelos in vivo e in vitro da DA. O ácido ocadáico (AO), um potente inibidor de fosfatase 1 e 2A, ocasiona a deposição de Aβ, perda neuronal e sináptica, e subsequente déficit de memória, características semelhantes às ocorridas na DA. O objetivo deste trabalho foi avaliar uma possível disfunção cognitiva e alterações nos parâmetros bioquímicos astrocitários de ratos submetidos ao ácido ocadáico, intrahipocampal, como modelo de demência. Ratos Wistar machos (90 dias) foram submetidos à infusão intrahipocampal e bilateral de AO (100 ng), e 12 dias após a cirurgia, avaliada a memória pelo teste de memória espacial no labirinto aquático de Morris, e realizados testes bioquímicos. Usando este modelo animal de infusão do AO, nós observamos um déficit cognitivo espacial e alterações neurogliais, particularmente, em marcadores de astrogliose, como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e S100B. Houve alterações no metabolismo do glutamato, pela diminuição significativa do transportador de aminoácido excitatório 2 (EAAT2/GLT-1) e atividade da glutamina sintetase; bem como, é característico na DA, um aumento no estresse oxidativo, observado pelo aumento das proteínas carboniladas e diminuição no conteúdo de glutationa (glutationa reduzida) no modelo de infusão do AO. Foram observadas também, alterações na via das MAPKs, onde a infusão do AO aumentou a fosforilação da p38MAPK, não alterando outras MAPKs, como a JNK 1/2 e ERK 1/2. Em conclusão, a injeção bilateral de AO foi capaz de induzir um déficit cognitivo espacial e estresse oxidativo no modelo de demência proposto, e pela primeira vez ao nosso conhecimento, alterações astrogliais em modelo de demência induzido pelo AO. Por fim, as alterações astrogliais observadas neste modelo de demência contribuem para a compreensão da fisiopatologia da DA e de outras doenças acompanhadas de déficit cognitivo, bem como contribuem para a identificação de alvos terapêuticos para a DA. / Dementia is characterized as a progressive decline in cognitive functions and severe memory loss. Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia. The defining neuropathological characteristics of AD are the presence of extracellular accumulation of aggregated β-amyloid in senile plaques in the brain, and also by intraneuronal aggregates of neurofibrillary (NFT) consisting of hyperphosphorylated tau proteins, wich leads to progressive brain dysfunction. Although the cause of AD remains elusive, many possible risk factors and pathological alterations have been used in the elaboration of in vivo and in vitro models of this disease, including intrahippocampal infusion of okadaic acid (OA). Okadaic acid (OA), a potent inhibitor phosphatase 1 and 2A, leads to the deposition of β-amyloid, subsequent neuronal degeneration, synaptic loss and memory impairments, all of which resemble AD-like pathology. In this study, our aim was evaluate spatial cognitive deficit and neuroglial alterations in rats submitted to the OA-induced dementia model. Male Wistar rats (90 days old) were submitted to bilateral intrahippocampal OA-injection (100 ng), and 12 days after the surgery the rats were submitted to training and test in the Morris water maze, and biochemistry tests were performed. Using this model, we evaluated spatial cognitive deficit and neuroglial alterations, particulary astroglial protein markers such as glial fribillar acidic protein (GFAP) and S100B. There have been changes in the metabolism of glutamate, the significant decrease in the excitatory amino acid transporter 2 (EAAT2/GLT-1) and glutamine synthetase activity, as is characteristic of AD, increased oxidative stress, observed by increased protein carbonyl and decreased glutathione in rats submitted to injection of OA. Were also observed, alterations in the MAPKs pathway, where the infusion of OA increased the phosphorylation of p38MAPK, without altering other MAPKs, such as JNK 1/2 and ERK 1/2. In conclusion, bilateral injection of OA induces spacial cognitive deficit, and causes oxidative stress in this model and demonstrate, for the first time to our knowledge, neuroglial alteriations. Findings contribute to understanding diseases accompanied by cognitive deficit and the OA model of dementia.

A doença de Alzheimer (DA) resulta de múltiplos eventos patogênicos, que incluem anormalidades no processamento protéico, inflamação e estresse oxidativo, levando à destruição seletiva de populações neuronais, especialmente de neurônios colinérgicos. Tal hipótese colinérgica justifica o uso de inibidores da acetilcolinesterase (AChE) como a estratégia utilizada para tratamento de pacientes com DA. Huperzina A (HupA), um alcalóide Licopodium extraído de uma espécie vegetal (Huperzia serrata) de uso tradicional pela medicina chinesa, parece se apresentar como uma alternativa. A HupA atua como um inibidor potente, reversível e altamente específico da AChE. Sua potência como anticolinesterásico é similar ou superior à da fisostigmina, galantamina, donepezil e tacrina, anticolinesterásicos aprovados para o tratamento da DA Este alcalóide também demonstrou múltiplos efeitos neuroprotetores, incluindo modificação do processamento do peptídeo -amilóide, redução do estresse oxidativo, proteção neuronal contra apoptose e regulação da expressão e secreção de fatores tróficos, tais como fator de crescimento neuronal e em situações de injúria com comprometimento de funções glutamatérgicas. A S100B é uma proteína da família S100 de proteínas ligantes de cálcio, produzida e secretada por astrócitos no SNC. Quando em baixas concentrações no meio extracelular (nanomolar), ela é trófica; já em concentrações maiores (micromolar), é tóxica, podendo levar à apoptose. Sabe-se que a S100B está envolvida na patofisiologia de diversas doenças neurodegenerativas, como por exemplo, na DA, no qual ocorre um aumento dos níveis dessa proteína no líquor em sua fase precoce. Neste trabalho investigamos o efeito da HupA, da tacrina (tetraaminoacridina ou THA) e da acetiltiocolina (ATCh) em astrócitos e em fatias hipocampais, quanto à secreção e conteúdo intracelular de S100B e proteína fibrilar glial ácida (GFAP), durante 1 e 24 h. A HupA (100 μM) aumentou a secreção em cultura de astrócitos em 1 h, mas diferentemente causou uma redução em fatias hipocampais, bem como ATCh (100 μM). Após 24 h de tratamento, foi possível observar em cultura de astrócitos um efeito da tacrina a 100 μM sobre a redução do conteúdo de S100B intracelular, mas não de HupA ou ATCh. O imunocontéudo de GFAP não foi alterado após os tratamentos. Uma análise geral desses resultados nos mostra que a HupA pode regular mecanismos de secreção da S100B. Além disto, a modulação de secreção desta proteína parece ser modulada por receptores colinérgicos. / Alzheimer´s Disease (AD) results in multiple pathogenic events, which include abnormalities of protein process, inflammation and oxidative stress, leading to a neuronal population destruction, especially of cholinergic neurons. This cholinergic hypothesis justifies the use of acetylcholinesterase inhibitors (IAChE) as the strategy for patients with AD. Huperzine A (HupA), a novel Lycopodium alkaloid isolated originally from a traditional Chinese medicine, seems to be an alternative. HupA is a reversible, potent and selective IAChE. Its potency and duration of AChE inhibition rival those of physostigmine, galanthamine, donepezil and tacrine, approved for treatment of DA. HupA also demonstrated multiple neuroprotector effects, including modifying the β-amyloid processing, decreasing oxidative stress, protecting neurons against apoptosis and also expressing and regulating secretion of trophic factors, such as neuronal growth factor (NGF) and also acts reducing glutamatergic excitotoxicity. S100B is a calcium-binding protein, produced and secreted by astrocytes in the central nervous system (CNS) and plays a regulatory role in the cytoskeleton and cell cycle. Moreover, extracellular S100B, a marker of glial activation in several conditions of brain injury, for example in AD, has a trophic or apoptotic effect on neurons, depending on its concentration. Here we investigated the effect of HupA, tacrina (tetraminoacridine or THA) and acetilthiocholine (ATCh), on S100B secretion, S100B and GFAP intracellular contend in cortical astrocytes cultures and hippocampal slices treated for 1 and 24 h. For 1 h, HupA and ATCh (100 μM) increased the secretion in astrocytes for 1 h, but caused a reduction on hippocampal slices (P < 0.05). After 24 h of treatment, tacrine (100 μM) reduced the S100B intracellular contend in astrocytes cultures, but it was not observed with HupA or ATCh. The GFAP immunocontent did not change after these treatments. Generally, our data show that HupA can regulate S100B secretion mechanisms and that this modulation could be activated by cholinergic receptors.