Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ricardo Raposo.pdf: 417410 bytes, checksum: 600f3dd5eb4dd6870f6ed34eb69d4426 (MD5) Previous issue date: 2014-12-09 / Toxocariasis is a geohelminth zoonosis with worldwide distribution, mainly through the ingestion of embryonated eggs of nematodes of the Toxocara genus. The disease can also be transmitted to humans as a result of eating raw or undercooked meat of parathenic hosts, such as birds. Studies on the humoral immune response through antibodies in chickens, however, are scarce. The aim of this study was to evaluate the production of IgY (IgG) in broiler chickens experimentally infected with Toxocara canis. Three groups (n=12 per group) of female broiler chickens (G1, G2 and G3), 34 days of age, were infected orally (gavage), with 100, 1000 and 5000 T. canis eggs, respectively. Another, non-infected group (G4, n=12), was assessed as the control. Blood samples were obtained at the following time points: 0 (pre-infection), 7, 14, 21, 28, 45 and 60 days post-infection (DPI). Kinetic and avidity index (AI) of IgY were determined using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis was performed for each time point, and subsequently analyzed to differentiate the initial or acute phase (7 to 21 DPI) and the final or chronic stage (28 to 60 DPI). The cutoff point was 0.368, and the test showed 91.7% sensitivity (CI 95%: 77.5-98.3) and 100% specificity (CI 95%: 92.6-100). The highest efficiency (97.0%) was observed at 60 DPI. Regarding the kinetics of antibodies, the seroconversion of the birds in the G2 and G3 groups occurred before (21 DPI) those in the G1 (28 DPI). The AI was medium at 21 DPI, becoming high after 28 DPI, indicating a chronic phase of infection. The results of the study demonstrate that the ELISA test could be a highly efficient tool for the detection of anti-Toxocara antibodies in birds, serving both for seroepidemiological studies and to evaluate the role of chickens as indicators of environmental contamination of Toxocara spp. / A toxocaríase é uma geozoonose de distribuição mundial provocada principalmente pela ingestão de ovos embrionados de nematódeos do gênero Toxocara. A doença também pode ser transmitida ao homem pela ingestão de carne crua ou mal cozida de hospedeiros paratênicos, como aves. Estudos sobre resposta humoral de anticorpos em aves, porém, são escassos na literatura. O objetivo do estudo foi avaliar a produção de IgY (IgG) em frangos infectados experimentalmente com Toxocara canis. Três grupos (n=12 por grupo) de frangos de corte da linhagem Cobb (G1, G2 e G3), fêmeas, com 34 dias de idade, foram infectados, por via oral (gavagem), com 100, 1000 e 5000 ovos embrionados de T. canis, respectivamente. Outro grupo não infectado (G4; n=12) foi avaliado como controle. Amostras de sangue foram obtidas nos momentos 0 (pré-infecção), 7, 14, 21, 28, 45 e 60 dias pós-infecção (DPI), para obtenção de soro. Foi realizada a padronização do ensaio imunoenzimático ELISA indireto, utilizando-se antígenos de excreção e secreção (TES) de larvas de T. canis e conjugado anti-IgY de frango marcado com peroxidase, bem como avaliado o índice de avidez (IA) destes anticorpos. Uma Curva ROC foi obtida para todos os momentos, e outras para a fase inicial ou aguda (7 a 21 DPI) e fase final ou crônica (28 a 60 DPI). O ponto de corte foi de 0,368, e o teste apresentou 91,7% de sensibilidade (IC 95%: 77,5-98,2) e 100% de especificidade (IC 95%: 92,6-100). A eficiência foi de 97,0% aos 60 DPI. Em relação à cinética de anticorpos, a soroconversão das aves do G2 e G3 ocorreu antes (21 DPI) daquelas do G1 (28 DPI). Os Índices de Avidez foram médios aos 21 DPI, passando a altos valores após 28 DPI, indicando uma fase crônica da infecção. Os resultados do estudo mostram que o teste de ELISA pode ser uma ferramenta de alta eficiência para detecção de anticorpos anti-Toxocara em aves, servindo tanto para estudos seroepidemiológicos como para avaliar o papel das aves como marcadores de contaminação ambiental por ovos de Toxocara spp.

A utilização de amostras de leite para a realização do diagnóstico precoce de prenhez em bovinos tem se tornado uma alternativa relevante para propriedades produtoras de leite, principalmente nas quais o suporte técnico é limitado. Atualmente, muitas fazendas coletam amostras de leite para avaliação da sanidade da glândula mamária e/ou para controle nutricional. Eventualmente, a utilização desta mesma amostra para a realização do teste de prenhez, viabilizaria o processo de coleta e diminuiria os custos com materiais e transporte destas amostras. Porém, ainda não se tem conhecimento de como o processamento da amostra de leite, desde a coleta até a análise laboratorial, pode afetar os resultados do teste de prenhez. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos de estratégias de coleta, armazenamento, conservação e processamento das amostras de leite sobre os resultados do teste de prenhez. Para isso, foram realizados 5 experimentos. No experimento 1, que avaliou o efeito do período do dia no qual a amostra foi coletada, foram utilizadas amostras de 51 animais (duas amostras por animal, uma obtida na ordenha da manhã e outra na ordenha da tarde). No experimento 2, que avaliou a ocorrência do \"efeito de arraste\" no medidor de leite do equipamento de ordenha, foram utilizadas amostras de leite de 94 animais pertencentes a duas fazendas distintas. De cada animal foram obtidas duas amostras de leite, uma direto do teto antes do início da ordenha e outra do medidor de leite ao término desta. No experimento 3, que avaliou o impacto das condições e do tempo de armazenamento das amostras de leite, 40 amostras foram coletadas e divididas em 4 idades (0, 3, 6 e 9 dias entre a coleta e a análise) e 2 temperaturas de armazenamento (ambiente e refrigerado). No experimento 4, que avaliou o efeito do pré-aquecimento das amostras de leite, o teste de prenhez foi realizado em 14 amostras que haviam sido submetidas ao banho-maria. Enquanto que, no experimento 5, que avaliou a ocorrência do \"efeito de arraste\" nos equipamentos de análise laboratorial, amostras de leite de 11 animais foram submetidas primeiro à análise de qualidade e depois ao teste de prenhez. Para verificar a existência de impacto de todos estes fatores, o coeficiente kappa foi calculado utilizando o software R. Como resultado, a coleta da amostra de leite na ordenha da manhã ou na ordenha da tarde não afetou os resultados do teste de prenhez. As concentrações de PAG das amostras coletadas na fazenda 2 sofreram maior influência do \"efeito de arraste\" quando comparadas as amostras obtidas na fazenda 1. Os níveis de PAG não apresentaram variação quando analisadas até 9 dias após a coleta, armazenadas tanto na temperatura ambiente como na refrigerada. O pré-aquecimento das amostras no banho-maria e a submissão aos equipamentos laboratoriais para análise de qualidade também não afetaram os níveis de PAG e nem os resultados do teste de prenhez. / The use of milk samples to perform the early pregnancy diagnosis in cattle has become an important alternative for dairy farms, especially when the technical support is limited. Currently, many farms use milk samples to evaluate the health of the mammary glands and the nutritional status of dairy cows. Eventually, the use of the same sample to make the pregnancy test could facilitate the collection process and decrease costs of materials and transport of samples. However, there is not enough knowledge about how processing the samples, from collection to laboratorial analysis, can affect the results of the pregnancy test. Therefore, the objective of the present study was to evaluate the effects of strategies of collecting, storing, conserving and processing milk samples on the results of the pregnancy test. For that purpose, five experiments were carried out. In experiment 1, the effect of the period of the day when the samples were collected is evaluated, samples of 51 animals were used (two samples per animal, one from the morning milking and another from the afternoon milking). In experiment 2, it was evaluated the carryover in the milk meter of the milking equipment, milk samples of 94 animals belonging to two different farms were used. Two samples were obtained from each animal, one collected directly from the tit before milking and the other by the meter at the end of milking. In experiment 3, it was evaluated the impact of different conditions: storage time and temperature of milk samples, 40 samples were collected and divided into four ages (0, 3, 6 and 9 days between collection and analysis) and two storage temperatures (ambient and refrigerated). In experiment 4, which evaluated the effect of pre-heating the milk samples, the pregnancy test was performed on 14 samples that had been subjected to water bath. In experiment 5, it was evaluated the occurrence of the carryover in laboratory analysis equipment, samples from 11 animals were first submitted to the milk quality analysis and after to the pregnancy test. To check the impact of all these factors, the kappa was calculated using the software R. The results show that sampling the milk in the morning or afternoon did not affect the results of the pregnancy test. PAG concentrations of samples collected on farm 2 had a greater influence on carryover compared to samples from farm 1. PAG levels did not show variation when analyzed until 9 days after collection, storage in ambient temperature or refrigerated. Preheating the samples in water bath and test in laboratory equipment of quality analysis also did not affect PAG levels or the results of the pregnancy test.

A proteína de ligação em Duffy (PvDBP) dos merozoítos de P. vivax se liga a glicoproteínas de membrana, chamadas de grupo sanguíneo Duffy, conhecidas como DARC. Indivíduos DARC negativos são normalmente resistentes a infecção estágio sanguínea por P. vivax; portanto, PvDBP é um forte antígeno canditato a vacina. Aqui, investigamos respostas de anticorpos contra três proteínas derivadas de PvDBP e MSP119, em 343 indivíduos de uma região Amazônica brasileira. Anticorpos contra Sal III-His, OII-His, Sal III-IV-GST e MSP119-GST foram encontrados em 43,7%, 39,0%, 14,3% e 38,8% dos indivíduos. Os indivíduos FY*BESFY*BES foram os que menos apresentaram anticorpos contra PvDBP, porém encontramos proporções similares de respondedores entre indivíduos com outros genótipos. A análise de sequências revelou muitas variantes da região II de PvDBP em 41 isolados. A mais comum (encontrada em 28,8% dos isolados), difere de Sal I e PNG- O em seis codóns de aminoácidos. Nenhuma variante tipo Sal I, cujo protótipo de vacina está em teste clínico, foi encontrada nos parasitas locais. / The Duffy binding protein (PvDBP) of the P. vivax merozoites, which binds to a erythrocyte membrane glycoprotein known as Duffy blood group antigen for chemokines (DARC). DARC-negative individuals are usually resistant to blood-stage infection with P. vivax; therefore, PvDBP is a major vaccine candidate antigen. Here, we investigated antibody responses to three proteins derived from PvDBP and MSP119, in 343 subjects in the Amazon of Brazil. Antibodies to Sal III-His, OII-His, Sal III-IV-GST and MSP119-GST were found in 43,7 %, 39,0%, 14,3% and 38,8% of the subjects. FY*BESFY*BES individuals were less likely to have antibodies to PvDBP, but we found similar proportions of seropositive subjects with other genotypes. Sequence analysis revealed several region II PvDBP variants in 41 local P. vivax isolates. The most common of them (found in 28,8% isolates) differs from Sal I and PNG-O alleles in six amino acid codons. No Sal I-type variant, from which a PvDBP-based vaccine prototype currently under clinical testing has been derived, was found in local parasites.

L’émergence de nouvelles technologies basées sur la microfluidique de gouttes offre l’espoir de développer des immuno-essais complexes consommant peu d’échantillon. Cette thèse est dédiée d’une part au développement d’une plateforme d’analyse qui consiste au fractionnement d’un mélange de peptides amyloïdes par focalisation isoélectrique (IEF) pour ensuite procéder à l’immuno-détection en gouttes des différentes fractions. Une méthode d’IEF en capillaire a été développée et a permis la séparation des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 ainsi que leur collecte dans des solutions individuelles. Ces solutions de collectes ont été analysées par Elisa sur particules magnétiques. L’immuno-essais a permis de déterminer la distribution des peptides dans les différentes collectes. Ces analyses ont d’abord été réalisées en « batch » où les particules magnétiques sont en suspension dans une solution non-confinée. Ensuite, un dispositif permettant de réaliser des immuno-essais en gouttes a été utilisé. Cette plateforme a été adaptée et optimisée pour le dosage des peptides Aβ 1-40 et Aβ 1-42 standard en vue de doser ces peptides dans le LCR et d’étendre l’analyse aux autres peptides (Aβ 2-40 et Aβ 5-40). D’autre part, une partie de la thèse a été dédiée à un travail sur micro-puce en vue de la conception d’un microsystème d’analyse totale intégrant en ligne les trois étapes majeures (séparation, compartimentalisation, immuno-détection en gouttes) de la plateforme d’analyse recherchée. Pour cette partie nous avons choisi le THV Dyneon qui a déjà servi au transport de bio-molécules en gouttes. Une première étude a consisté pour la première fois à réaliser des séparations électrocinétiques de protéines et de fluorophores hydrophobes dans les puces en THV Dyneon en utilisant deux modes de séparation (ECZ et NACE, respectivement). Ceci a permis de démontrer que ce nouveau matériau constitue un candidat prometteur pour le futur microsystème couplant séparation et compartimentalisation en gouttes. Une dernière étude a consisté au développement d’une méthode de marquage des peptides amyloïdes par un nouvel agent fluorescent, le Chromeo P540, particulièrement adapté pour des analyses IEF. Cet agent de marquage permettra de détecter les peptides durant la conception de l’interface de couplage (IEF/gouttes). / Emerging droplet-based microfluidic platform provide new opportunities to develop complex immunoassay with low sample consumption. This manuscript is dedicated on the development of an analytical platform for isoelectric focusing of amyloid peptides followed by their detection by immunoassay droplet-based microfluidic platform. A capillary isoeletric focusing method was developed first and allowed separation and collection of Aβ 1-40, Aβ 2-40 and Aβ 5-40 peptides in individual solutions. The fractions collected were analyzed off-line by Elisa on magnetic beads in batch-wise. This immune-detection allows the determination of peptide distribution in the different fractions collected. Then, we used a droplet-based microfluidic platform for immunoassay on magnetic beads. This platform was adapted and optimized to quantify standard Aβ 1-40 and Aβ 1-42 peptides. The next step will rely on the quantification of amyloid peptides on cerebrospinal fluid. In parallel, a study dedicated on microchip analyses to design a total-analysis-system has been performed. The final purpose is to integrate on-line three main steps; separation, compartmentalization and immune-detection in droplet. For this study, THV Dyneon has been chosen since this material was also used for the droplet-based microfluidic platform. A first study demonstrated for the first time electrokinetic separation, of biomolecules (proteins) and hydrophobic dyes in Dyneon THV chip using two separations modes (CZE and NACE respectively). This work highlighted the THV Dyneon micro-chip versatility. We can concluded that this new material is promising for further development dedicated to micro system combining separation and compartmentalization in droplet. A last work aimed to develop a labeling method for amyloid peptides with a new dye, the Chromeo P540, which is adapted for isoeletric focusing (IEF) analysis. This dye will allow peptides monitoring during the development of IEF/droplet interface.

Proteins secreted or shed by tumors can be found in serum. Detecting these proteins by mass spectrometry (MS) is difficult, due to the wide dynamic range of protein concentrations in serum. To circumvent this issue, we mined the conditioned media of epithelial ovarian cancer (EOC) cell lines which is a less complex fluid to work with. We hypothesize that some of the proteins shed or secreted by EOC cell lines are similar to those secreted or shed by EOC tumors and that some of these proteins can be used as biomarkers. We mined the conditioned medium of four ovarian cancer cell lines (HTB75, TOV-112D, TOV-21G and RMUG-S) by two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry. Our study identified 1208, 1252, 885, and 463 proteins from the HTB-75, TOV-112D, TOV-21G, and RMUG-S cell lines respectively. In all, we identified 2039 proteins from which we focused on 420 extracellular and plasma membrane proteins. High abundance proteins such as albumin and immunoglobulins, which are problematic for serum proteomics, did not interfere with our study. Several known markers of EOC including CA-125, HE4, Mesothelin, and KLK6, were identified in this study. The list of 420 extracellular and membrane proteins was cross-referenced with the proteome of ascites fluid to generate a final list of 51 potential candidates. According to Ingenuity Pathway Analysis, two of the top 10 diseases associated with our list of 51 proteins were cancer and reproductive diseases. Of the 51 candidates, 10 proteins were selected for verification in sera from ovarian cancer patients and healthy individuals. Clusterin showed a significant difference between cancer patients and normal, with sera from cancer patients showing higher levels. Another protein, NPC2, did not show a difference in sera between cancer and normals. Protein expression studies using immunohistochemistry showed that NPC2 is highly expressed in ovarian cancer tissue and absent in normal ovarian surface epithelium. In summary, clusterin and NPC2 appear to play a role in ovarian cancer pathobiology and their role in EOC need to be studied further.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El diagnóstico definitivo y específico de la brucelosis en caninos, causada por Brucella canis (B. canis), se realiza mediante el aislamiento de la bacteria desde muestras patológicas o fluidos. Sin embargo, como la enfermedad se caracteriza por presentar periodos abacterémicos, un cultivo negativo no excluye la posibilidad de infección. Debido a que se utiliza ampliamente la detección de anticuerpos frente a la infección y que tanto B. ovis y B. canis comparten componentes antigénicos con la cepa vacuna Brucella abortus RB51 (B. abortus CRB51), ésta podría ser usada como antígeno en el diagnóstico serológico de la enfermedad. En el presente estudio, se describe un enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA-I) para el serodiagnóstico de brucelosis canina utilizando un extracto altamente purificado de lipopolisacárido rugoso (LPS-R) de Brucella abortus CRB51, cuyos resultados fueron comparados con la técnica contrainmunoelectroforesis (CIEF) que utiliza un antígeno extraído de una cepa rugosa de B. ovis, con diferentes componentes, incluyendo al LPS-R. En este estudio se incluyeron 156 sueros de perro, muestras para diagnóstico de brucelosis canina mediante CIEF, que fueron recibidas en el laboratorio de Microbiología de FAVET. El análisis de los resultados indicó asociación estadística entre ambas pruebas (p>0,05) para el diagnóstico de brucelosis canina. Además, ambas pruebas obtuvieron un alto índice de concordancia (K= 0,961). Estos resultados hacen del ELISA-I propuesto una prueba promisoria al utilizar un antígeno más purificado y entregar resultados cuantitativos

Geólogo / La geología de la zona cordillerana de la 3ra Región de Atacama en el norte de Chile ha sido ampliamente estudiada y documentada por una multitud de autores permitiendo un buen entendimiento de la evolución estratigráfica y tectónica de esta zona del país, en gran parte gracias a la excelente preservación y exposición de los rasgos estratigráficos y estructurales que se han conservado y expuesto dado el particular clima que impera desde hace varios millones de años. Sin embargo, existen aún muchas inconsistencias y dudas respecto a algunas definiciones estratigráficas y temporalidades de eventos geológicos, de lo cual nace una necesidad de ahondar aún más en los estudios, aprovechando ciertas zonas de ejemplar y única exposición, que conservan registros privilegiados de la historia geológica de la parte norte del país. En virtud de lo anterior surge este estudio cuyo fin es aportar mediante un mapeo de detalle a escala 1:25.000 y un análisis de los rasgos estructurales, a una mayor comprensión de la evolución geológica del norte de Chile. El trabajo se centró en la Formación Hornitos, ubicada directamente al este de la falla Elisa de Bordos, con particular énfasis en las estructuras de carácter inverso y de rumbo sinestral observadas en la zona. La descripción detallada de la secuencia estratigráfica de la Formación Hornitos ubicada al noreste de Vallenar, arroja nuevas luces sobre las relaciones entre formaciones y definiciones estratigráficas de las secuencias del Cretácico Superior, ayudando a su vez a dilucidar, con apoyo de los datos geocronológicos existentes, a una mejor acotación del rango de edades en las que se depositó la secuencia. Por otra parte, el análisis detallado de las estructuras presentes aporta información interesante sobre los diferentes eventos tectónicos y regímenes de esfuerzo que operaron durante y posteriormente a la deposición de la secuencia estratificada, tectónica que estará dominada por un régimen transpresivo a nivel regional que se verá reflejado tanto a escala local como regional, con presencia importante de eventos compresivos asociados a una zona de transferencia condicionada por la geometría a gran escala de la falla Elisa de Bordos. Estas estructuras tienen una geometría consecuente con la morfología de las fallas mayores y con los patrones de rotación identificados mediante estudios paleomagnéticos.

Determination of the concentration of α1 - antitrypsin in the stool is a diagnostic indicator of inflammatory diseases of the small and the large intestine, especially malabsorption syndrome. α1 - antitrypsin belongs to the family of plasma proteins with antiproteinase effect. α1 - antitrypsin is synthesized in liver, in small amount in macrophage and is a protease inhibitor of serine proteases sercected from neutrophils. α1 - antitrypsin is acute phase protein. Higher α1 - antitrypsin values are in early phase of inflammation associated with raised CRP and other pozitive acute phase proteins. Fecal α1 - antitrypsin clearance is a sensitive and specific marker of protein loss. For α1 - antitrypsin determination in stool samples ELISA method can be used. ELISA is noncompetetive immunoassay used to detect presence of antibody or an antigen in a sample. The aim of this work was to compare two ELISA sets (Immundiagnostik and Ridascreen) used for determination α1 - antitrypsin in the stool. Then examine stability of α1 - antitrypsin in the stool and in extract prepared from stool in various storing conditions temperature and time. After this establish this method as routine in laboratory. 20 patient stool samples were examined to compare ELISA sets. Samples were suggested to be α1 - antitrypsin...

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Fundamentos: Parvovirus B19 (PV-B19) pertenece a la familia Parvoviridae, género Eritrovirus. Es un virus ADN de hebra simple que presenta secuencias palindrómicas en sus extremos. Es muy prevalente en la población general, llegando a detectarse anticuerpos anti PV-B19 en más del 85% de la población geriátrica. Este virus es el agente causal de una amplia gama de manifestaciones clínicas, cuya severidad depende del estado inmunológico y hematológico del hospedero, e incluye el eritema infeccioso, problemas hematológicos y reumatológicos e hidrops fetal, entre otras. Objetivo: Se determinó la presencia de Parvovirus B19 en pacientes con manifestaciones clínicas asociadas a este virus. Materiales y Métodos: Se analizaron 262 muestras de sangre de pacientes provenientes de distintos centros hospitalarios de la Región Metropolitana y del Servicio de Diagnóstico del Programa de Virología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. De estas muestras, 211 fueron analizadas mediante la técnica de ELISA para la pesquisa de IgM anti PV-B19, 244 con PCR anidado (PCR-Nested), para detectar genoma viral y 185 muestras con ambas técnicas. Resultados: De las muestras analizadas mediante la técnica de PCR anidado, se detectó genoma viral en un 25% de éstas y de las muestras analizadas mediante la técnica de ELISA, se localizó IgM anti PV-B19 en un 19%. Considerando sólo las 185 muestras que fueron analizadas con ambas técnicas, se detectó un 31.9% de positividad. En los casos positivos para el virus, las manifestaciones clínicas prevalentes fueron síndrome febril y eritema infeccioso

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se describe la evolución de anticuerpos caninos contra Brucella canis, de dos perras inoculadas experimentalmente, mediante un ensayo inmunoenzimático indirecto (ELISA-I) usando como antígenos el lipopolisacárido rugoso (LPS-R) y proteínas citosólicas de Brucella abortus Cepa RB51. El objetivo fue discriminar el momento en que se hacen detectables los anticuerpos para cada ELISA-I y describir la evolución de éstos en el tiempo. Se utilizaron sueros de dos perras infectadas con B. canis, A y B, con un total de 20 y 16 muestras de sueros seriados, respectivamente. Para ambos ELISA-I se usaron líneas de corte obtenidas por metodología “Receiver-Operator Characteristic” (ROC), que determinaron la positividad o negatividad a la prueba. Ambos ELISA-I fueron capaces de detectar anticuerpos tempranamente y fue posible constatar su permanencia en el tiempo. La detección de anticuerpos mediante ELISA-I, tanto con antígeno de proteínas citosólicas como con antígeno LPS-R de B. abortus Cepa RB51, se mantuvo detectable, al menos, hasta la semana 38 post infección