L’émergence de nouvelles technologies basées sur la microfluidique de gouttes offre l’espoir de développer des immuno-essais complexes consommant peu d’échantillon. Cette thèse est dédiée d’une part au développement d’une plateforme d’analyse qui consiste au fractionnement d’un mélange de peptides amyloïdes par focalisation isoélectrique (IEF) pour ensuite procéder à l’immuno-détection en gouttes des différentes fractions. Une méthode d’IEF en capillaire a été développée et a permis la séparation des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 ainsi que leur collecte dans des solutions individuelles. Ces solutions de collectes ont été analysées par Elisa sur particules magnétiques. L’immuno-essais a permis de déterminer la distribution des peptides dans les différentes collectes. Ces analyses ont d’abord été réalisées en « batch » où les particules magnétiques sont en suspension dans une solution non-confinée. Ensuite, un dispositif permettant de réaliser des immuno-essais en gouttes a été utilisé. Cette plateforme a été adaptée et optimisée pour le dosage des peptides Aβ 1-40 et Aβ 1-42 standard en vue de doser ces peptides dans le LCR et d’étendre l’analyse aux autres peptides (Aβ 2-40 et Aβ 5-40). D’autre part, une partie de la thèse a été dédiée à un travail sur micro-puce en vue de la conception d’un microsystème d’analyse totale intégrant en ligne les trois étapes majeures (séparation, compartimentalisation, immuno-détection en gouttes) de la plateforme d’analyse recherchée. Pour cette partie nous avons choisi le THV Dyneon qui a déjà servi au transport de bio-molécules en gouttes. Une première étude a consisté pour la première fois à réaliser des séparations électrocinétiques de protéines et de fluorophores hydrophobes dans les puces en THV Dyneon en utilisant deux modes de séparation (ECZ et NACE, respectivement). Ceci a permis de démontrer que ce nouveau matériau constitue un candidat prometteur pour le futur microsystème couplant séparation et compartimentalisation en gouttes. Une dernière étude a consisté au développement d’une méthode de marquage des peptides amyloïdes par un nouvel agent fluorescent, le Chromeo P540, particulièrement adapté pour des analyses IEF. Cet agent de marquage permettra de détecter les peptides durant la conception de l’interface de couplage (IEF/gouttes). / Emerging droplet-based microfluidic platform provide new opportunities to develop complex immunoassay with low sample consumption. This manuscript is dedicated on the development of an analytical platform for isoelectric focusing of amyloid peptides followed by their detection by immunoassay droplet-based microfluidic platform. A capillary isoeletric focusing method was developed first and allowed separation and collection of Aβ 1-40, Aβ 2-40 and Aβ 5-40 peptides in individual solutions. The fractions collected were analyzed off-line by Elisa on magnetic beads in batch-wise. This immune-detection allows the determination of peptide distribution in the different fractions collected. Then, we used a droplet-based microfluidic platform for immunoassay on magnetic beads. This platform was adapted and optimized to quantify standard Aβ 1-40 and Aβ 1-42 peptides. The next step will rely on the quantification of amyloid peptides on cerebrospinal fluid. In parallel, a study dedicated on microchip analyses to design a total-analysis-system has been performed. The final purpose is to integrate on-line three main steps; separation, compartmentalization and immune-detection in droplet. For this study, THV Dyneon has been chosen since this material was also used for the droplet-based microfluidic platform. A first study demonstrated for the first time electrokinetic separation, of biomolecules (proteins) and hydrophobic dyes in Dyneon THV chip using two separations modes (CZE and NACE respectively). This work highlighted the THV Dyneon micro-chip versatility. We can concluded that this new material is promising for further development dedicated to micro system combining separation and compartmentalization in droplet. A last work aimed to develop a labeling method for amyloid peptides with a new dye, the Chromeo P540, which is adapted for isoeletric focusing (IEF) analysis. This dye will allow peptides monitoring during the development of IEF/droplet interface.

Proteins secreted or shed by tumors can be found in serum. Detecting these proteins by mass spectrometry (MS) is difficult, due to the wide dynamic range of protein concentrations in serum. To circumvent this issue, we mined the conditioned media of epithelial ovarian cancer (EOC) cell lines which is a less complex fluid to work with. We hypothesize that some of the proteins shed or secreted by EOC cell lines are similar to those secreted or shed by EOC tumors and that some of these proteins can be used as biomarkers. We mined the conditioned medium of four ovarian cancer cell lines (HTB75, TOV-112D, TOV-21G and RMUG-S) by two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry. Our study identified 1208, 1252, 885, and 463 proteins from the HTB-75, TOV-112D, TOV-21G, and RMUG-S cell lines respectively. In all, we identified 2039 proteins from which we focused on 420 extracellular and plasma membrane proteins. High abundance proteins such as albumin and immunoglobulins, which are problematic for serum proteomics, did not interfere with our study. Several known markers of EOC including CA-125, HE4, Mesothelin, and KLK6, were identified in this study. The list of 420 extracellular and membrane proteins was cross-referenced with the proteome of ascites fluid to generate a final list of 51 potential candidates. According to Ingenuity Pathway Analysis, two of the top 10 diseases associated with our list of 51 proteins were cancer and reproductive diseases. Of the 51 candidates, 10 proteins were selected for verification in sera from ovarian cancer patients and healthy individuals. Clusterin showed a significant difference between cancer patients and normal, with sera from cancer patients showing higher levels. Another protein, NPC2, did not show a difference in sera between cancer and normals. Protein expression studies using immunohistochemistry showed that NPC2 is highly expressed in ovarian cancer tissue and absent in normal ovarian surface epithelium. In summary, clusterin and NPC2 appear to play a role in ovarian cancer pathobiology and their role in EOC need to be studied further.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El diagnóstico definitivo y específico de la brucelosis en caninos, causada por Brucella canis (B. canis), se realiza mediante el aislamiento de la bacteria desde muestras patológicas o fluidos. Sin embargo, como la enfermedad se caracteriza por presentar periodos abacterémicos, un cultivo negativo no excluye la posibilidad de infección. Debido a que se utiliza ampliamente la detección de anticuerpos frente a la infección y que tanto B. ovis y B. canis comparten componentes antigénicos con la cepa vacuna Brucella abortus RB51 (B. abortus CRB51), ésta podría ser usada como antígeno en el diagnóstico serológico de la enfermedad. En el presente estudio, se describe un enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA-I) para el serodiagnóstico de brucelosis canina utilizando un extracto altamente purificado de lipopolisacárido rugoso (LPS-R) de Brucella abortus CRB51, cuyos resultados fueron comparados con la técnica contrainmunoelectroforesis (CIEF) que utiliza un antígeno extraído de una cepa rugosa de B. ovis, con diferentes componentes, incluyendo al LPS-R. En este estudio se incluyeron 156 sueros de perro, muestras para diagnóstico de brucelosis canina mediante CIEF, que fueron recibidas en el laboratorio de Microbiología de FAVET. El análisis de los resultados indicó asociación estadística entre ambas pruebas (p>0,05) para el diagnóstico de brucelosis canina. Además, ambas pruebas obtuvieron un alto índice de concordancia (K= 0,961). Estos resultados hacen del ELISA-I propuesto una prueba promisoria al utilizar un antígeno más purificado y entregar resultados cuantitativos

Geólogo / La geología de la zona cordillerana de la 3ra Región de Atacama en el norte de Chile ha sido ampliamente estudiada y documentada por una multitud de autores permitiendo un buen entendimiento de la evolución estratigráfica y tectónica de esta zona del país, en gran parte gracias a la excelente preservación y exposición de los rasgos estratigráficos y estructurales que se han conservado y expuesto dado el particular clima que impera desde hace varios millones de años. Sin embargo, existen aún muchas inconsistencias y dudas respecto a algunas definiciones estratigráficas y temporalidades de eventos geológicos, de lo cual nace una necesidad de ahondar aún más en los estudios, aprovechando ciertas zonas de ejemplar y única exposición, que conservan registros privilegiados de la historia geológica de la parte norte del país. En virtud de lo anterior surge este estudio cuyo fin es aportar mediante un mapeo de detalle a escala 1:25.000 y un análisis de los rasgos estructurales, a una mayor comprensión de la evolución geológica del norte de Chile. El trabajo se centró en la Formación Hornitos, ubicada directamente al este de la falla Elisa de Bordos, con particular énfasis en las estructuras de carácter inverso y de rumbo sinestral observadas en la zona. La descripción detallada de la secuencia estratigráfica de la Formación Hornitos ubicada al noreste de Vallenar, arroja nuevas luces sobre las relaciones entre formaciones y definiciones estratigráficas de las secuencias del Cretácico Superior, ayudando a su vez a dilucidar, con apoyo de los datos geocronológicos existentes, a una mejor acotación del rango de edades en las que se depositó la secuencia. Por otra parte, el análisis detallado de las estructuras presentes aporta información interesante sobre los diferentes eventos tectónicos y regímenes de esfuerzo que operaron durante y posteriormente a la deposición de la secuencia estratificada, tectónica que estará dominada por un régimen transpresivo a nivel regional que se verá reflejado tanto a escala local como regional, con presencia importante de eventos compresivos asociados a una zona de transferencia condicionada por la geometría a gran escala de la falla Elisa de Bordos. Estas estructuras tienen una geometría consecuente con la morfología de las fallas mayores y con los patrones de rotación identificados mediante estudios paleomagnéticos.

Determination of the concentration of α1 - antitrypsin in the stool is a diagnostic indicator of inflammatory diseases of the small and the large intestine, especially malabsorption syndrome. α1 - antitrypsin belongs to the family of plasma proteins with antiproteinase effect. α1 - antitrypsin is synthesized in liver, in small amount in macrophage and is a protease inhibitor of serine proteases sercected from neutrophils. α1 - antitrypsin is acute phase protein. Higher α1 - antitrypsin values are in early phase of inflammation associated with raised CRP and other pozitive acute phase proteins. Fecal α1 - antitrypsin clearance is a sensitive and specific marker of protein loss. For α1 - antitrypsin determination in stool samples ELISA method can be used. ELISA is noncompetetive immunoassay used to detect presence of antibody or an antigen in a sample. The aim of this work was to compare two ELISA sets (Immundiagnostik and Ridascreen) used for determination α1 - antitrypsin in the stool. Then examine stability of α1 - antitrypsin in the stool and in extract prepared from stool in various storing conditions temperature and time. After this establish this method as routine in laboratory. 20 patient stool samples were examined to compare ELISA sets. Samples were suggested to be α1 - antitrypsin...

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Fundamentos: Parvovirus B19 (PV-B19) pertenece a la familia Parvoviridae, género Eritrovirus. Es un virus ADN de hebra simple que presenta secuencias palindrómicas en sus extremos. Es muy prevalente en la población general, llegando a detectarse anticuerpos anti PV-B19 en más del 85% de la población geriátrica. Este virus es el agente causal de una amplia gama de manifestaciones clínicas, cuya severidad depende del estado inmunológico y hematológico del hospedero, e incluye el eritema infeccioso, problemas hematológicos y reumatológicos e hidrops fetal, entre otras. Objetivo: Se determinó la presencia de Parvovirus B19 en pacientes con manifestaciones clínicas asociadas a este virus. Materiales y Métodos: Se analizaron 262 muestras de sangre de pacientes provenientes de distintos centros hospitalarios de la Región Metropolitana y del Servicio de Diagnóstico del Programa de Virología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. De estas muestras, 211 fueron analizadas mediante la técnica de ELISA para la pesquisa de IgM anti PV-B19, 244 con PCR anidado (PCR-Nested), para detectar genoma viral y 185 muestras con ambas técnicas. Resultados: De las muestras analizadas mediante la técnica de PCR anidado, se detectó genoma viral en un 25% de éstas y de las muestras analizadas mediante la técnica de ELISA, se localizó IgM anti PV-B19 en un 19%. Considerando sólo las 185 muestras que fueron analizadas con ambas técnicas, se detectó un 31.9% de positividad. En los casos positivos para el virus, las manifestaciones clínicas prevalentes fueron síndrome febril y eritema infeccioso

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se describe la evolución de anticuerpos caninos contra Brucella canis, de dos perras inoculadas experimentalmente, mediante un ensayo inmunoenzimático indirecto (ELISA-I) usando como antígenos el lipopolisacárido rugoso (LPS-R) y proteínas citosólicas de Brucella abortus Cepa RB51. El objetivo fue discriminar el momento en que se hacen detectables los anticuerpos para cada ELISA-I y describir la evolución de éstos en el tiempo. Se utilizaron sueros de dos perras infectadas con B. canis, A y B, con un total de 20 y 16 muestras de sueros seriados, respectivamente. Para ambos ELISA-I se usaron líneas de corte obtenidas por metodología “Receiver-Operator Characteristic” (ROC), que determinaron la positividad o negatividad a la prueba. Ambos ELISA-I fueron capaces de detectar anticuerpos tempranamente y fue posible constatar su permanencia en el tiempo. La detección de anticuerpos mediante ELISA-I, tanto con antígeno de proteínas citosólicas como con antígeno LPS-R de B. abortus Cepa RB51, se mantuvo detectable, al menos, hasta la semana 38 post infección

Flukes of the genus Trichobilharzia are typical parasites using aquatic gastropods as intermediate hosts and birds as definitive hosts. However, infectious stages in open water are able to penetrate the skin of a mammal, including humans, and thereby induce a hypersensitivity reaction known as swimmer's itch. Infection with neurotropic species T. regenti in ducks induces an increase in level of IgY antibody which recognize certain parasitic antigens. In this work, these parameters in two other relative but visceral species, T. szidati and T. franki, and cross-reactivity of antibodies in serum of infected duck against heterologous parasitic antigen by ELISA and Western blot were characterized. Antibodies of ducks infected with T. szidati showed very low reactivity with all three parasitic antigens in compare to ducks infected with T. franki or T. regenti. The previously identified strongly immunogenic T. regenti antigens have been evaluated as species non-specific for all trichobilharzia species studied, but useful for avian fluke infection in wild individuals diagnosis.

Immunoassays basieren auf der Anwendung von Antikörpern, welche selektiv den zu messenden Analyten binden. Die Richtigkeit der erhaltenen Ergebnisse hängt maßgeblich von der Selektivität der Antikörper ab und kann durch Interferenzen gestört werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der die Probe mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (LC) in Fraktionen aufgetrennt wird und diese Fraktionen anschließend mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) vermessen werden. Dieses Verfahren wurde als LC-ELISA bezeichnet. Das erhaltene Profil aus im ELISA gemessener Analytkonzentration in Abhängigkeit von der Elutionszeit wurde als LC-ELISAgramm bezeichnet und bietet die Möglichkeit, Interferenzen zu erkennen, welche beim ELISA unentdeckt bleiben. Als Modellanalyten für die zu untersuchenden ELISAs dienten Sulfamethoxazol (SMX), Carbamazepin (CBZ) und Estron (E1). Dabei wurden verschiedene Umweltmatrices wie Oberflächenwasser und Abwässer mit dem jeweiligen ELISA vermessen. Es wurde ein Ansatz zur Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Interferenzen in Umweltproben aufgezeigt. Durch diesen Ansatz und Anwendung der sauren Hydrolyse der Probe war es möglich, einen bisher unbekannten SMX-Metaboliten zu detektieren und dessen wahrscheinliche Kreuzreaktivität mit 460 ± 150 % abzuschätzen. Es wurde zudem ein neuer Tracer in einer linearen 13-Stufen-Synthese entwickelt, wobei neuartig die Konjugation der Peroxidase an der N1-Position des SMX erfolgte. / Immunoassays are based on the use of antibodies that selectively bind the analyte. The trueness of the results obtained depends to a great extent on the selectivity of the antibodies and can be affected by interferences. In this study, a method was developed in which the sample is separated into fractions by using high-performance liquid chromatography (LC) and these fractions are measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This method was referred to as LC-ELISA. The profile obtained from the measured analyte concentration by ELISA as a function of the elution time was referred to as LC-ELISAgram and offers the possibility to detect interferences which otherwise remain undetected during the ELISA. Sulfamethoxazole (SMX), carbamazepine (CBZ) and estrone (E1) were used as model analytes for the ELISA and LC-ELISA measurements. Various environmental matrices such as surface water and wastewater were examined for their interference in the respective ELISA. The good quantification properties of the validated LC-ELISA have been used to demonstrate an approach to distinguish between specific and non-specific interferences from environmental samples. By this approach and application of acidic hydrolysis of the sample, it was possible to detect a previously unknown metabolite of SMX and estimate its cross-reactivity to probably 460 ± 150%. Furthermore, a new tracer was developed in a linear 13-step synthesis, which resulted in the novel conjugation of the peroxidase at the N1-position of SMX. The new hapten was also used for the synthesis of a novel immunogen.

Neste trabalho foi feito uma investigação sorológica em moradores na região amazônica e moradores rurais do sudeste brasileiro, através do teste de inibição da hemaglutinação (HI) para a cepa vacinal da Febre Amarela mais 17 sorotipos diferentes de arbovírus, sendo quatro do gênero Alphavirus (ALP), nove do gênero Flavivirus (FLA) e cinco do gênero Orthobunyavirus (ORT), para verificar qual desses vírus estão circulando nessas regiões. Os resultados do HI foram divididos em quatro áreas: na cidade Machadinho dOeste (Rondônia) (N=285) tivemos para ALP=50 (17,54%), FLA=270 (94,74%), ORT=58 (20,35%) e negativos (NEG)=12 (4,20%). Nas pessoas que moram ao longo do Rio Machado (Rondônia) (N=343) tivemos ALP=99 (28,86%), FLA=229 (66,76%), ORT=41 (11,95%) e NEG=93 (27,10%). Na cidade Teodoro Sampaio (São Paulo) (N=78) tivemos FLA=55 (70,51%) e NEG=23 (29,5%). Na cidade Jacupiranga (São Paulo) (N=149) tivemos ALP=7 (4,7%), FLA=50 (33,56%), ORT=20 (13,42%) e NEG=84 (56,4%). Concluímos que os resultados obtidos sugerem a circulação desses vírus nas regiões estudadas. / In this work we performed a serological investigation in residents of Amazon region and country people who lives in Southeastern of Brazil, by hemagglutination inhibition (HI) for Yellow fever vaccine and 17 different serotype of arboviruses: four from the genus Alphavirus (ALP), nine from the genus Flavivirus (FLA), and five from the genus Orthobunyavirus (ORT), to try to ascertain which of these arboviruses are circulating in these areas. The results of HI were divided into four areas: In Machadinho dOeste city (Rondônia) (N=285) we had to ALP=50 (17,54%), FLA=270 (94,74%), ORT=58 (20,35%) and negatives (NEG)=12 (4,20%). In people who live along the Machado River (Rondônia) (N=343) we had to ALP=99 (28,86%), FLA=229 (66,76%), ORT=41 (11,95%) and NEG=93 (27,10%). In Teodoro Sampaio City (São Paulo) (N=78) we had to FLA=55 (70,51%) and NEG=23 (29,5%). In Jacupiranga City (São Paulo) (N=149) we had to ALP=7 (4,70%), FLA=50 (33,56%), ORT=20 (13,42%) and NEG=84 (56,4%). In conclusion, the obtained data suggest the circulation of these viruses in these regions.