Infecções causadas por STEC constituem problema de saúde pública, pois estão associadas à síndrome hemolítica urêmica e colite hemorrágica. A detecção de isolados STEC depende de um ensaio diagnóstico sensível, específico e de baixo custo. Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de um ELISA de captura utilizando anticorpos policlonais e monoclonais. Primeiramente definiu-se um meio de cultivo para maior expressão de Stx e produziu-se anticorpos monoclonais anti-Stx1 e anti-Stx2. Os resultados mostraram que o cultivo de isolados por 4h em caldo EC com ciprofloxacina induziu maior produção de Stx no sobrenadante bacteriano, e o anticorpo monoclonal anti-Stx1 produzido reconheceu a subunidade A de ambas as toxinas, além de apresentar maior constante de afinidade que o anti-Stx2. Desta forma, o ELISA de captura foi padronizado com 250 mg/ml da fração IgG do soro policlonal anti-Stx1 e anti-Stx2 na sensibilização e 2,5 mg/ml de anticorpo monoclonal anti-Stx1 na captura da toxina, apresentando 80,7% de sensibilidade e 100% de especificidade. / STEC infection is a public health problem, causing hemolytic-uremic syndrome and haemorrhagic colitis. The detection of STEC isolates depends on a sensitive, specific and low cost diagnostic method. Thus, the aim of this study was to develop a capture ELISA using polyclonal and monoclonal antibodies. For this purpose, first of all a growth media that induce better expression and production of Stx was defined and monoclonals anti-Stx1 e anti-Stx2 antibodies were produced. The results show that the growth of the isolates for 4hs in EC broth with ciprofloxacin increased the production of Stx in the bacterial supernantant, and the monoclonal anti-Stx1antibody produced was able to recognize the A subunit of both toxins, besides showing higher affinity constant than anti-Stx2. Thus, the capture ELISA was standardized using 250 mg/ml of the IgG enriched fraction of rabbit anti-Stx1 sera and anti-Stx2 for coating and 2,5 mg/ml of monoclonal anti-Stx1 antibody for the capture of the toxin, showing 80,7% of sensibility and e 100% de specificity.

A toxoplasmose afeta cerca de um bilhão de pessoa em todo mundo, é geralmente assintomática, apesar de doença ocular ou doenças grave e letal em fetos, pacientes com HIV e transplantados. A sorologia é a principal ferramenta para o diagnóstico e determinação de incidência, que é uma tarefa difícil, devido à alta prevalência na maioria dos países. Estudos de incidência são ideais em crianças, mas este grupo é protegido pela sociedade e de difícil abordagem por métodos invasivos como a punção venosa. A saliva pode ser uma ótima alternativa por sua coleta não ser invasiva, aceitável para crianças, e conter pequenas quantidades de IgG, eliminada através da mucosa gengival e fluido crevicular. Métodos de detcção de anticorpos disponíveis no mercado estão focados em amostras de soro, com baixa sensibilidade e são raros os relatos de pesquisas com material biológico alternativo, como a saliva. Sendo assim, padronizamos imunoensaios com alta sensibilidade para detecção de anticorpos anti- T. gondii na saliva frente a amostras de soro de 20 voluntários adultos. A sensibilidade e especificidade dos nossos dot-ELISA e ELISA de captura com proteína A foram semelhantes entre soro e saliva. Também testamos 100 amostras de saliva de universitários em nossos ensaios, onde mostramos uma frequência da toxoplasmose de 19% (IC 95% 12-28%). Imunoensaios para detecção de IgG anti-T. gondii em saliva são uma ferramenta muito promissora para estudos epidemiológicos da toxoplasmose em crianças ou outros grupos protegidos. / Toxoplasmosis that affects about one billion people worldwide is usually asymptomatic, despite ocular disease and severe and lethal disease in fetuses, AIDS patients and transplant recipients. Serology is the main approach for diagnosis and incidence determination is a difficult task due to high prevalence in most countries. Incidence studies are feasible in children but this age group is protected and difficult to approach by invasive methods as venipuncture. Saliva could be obtained by non-invasive procedure, acceptable for children, and it contains small amounts of IgG from mucosal and gingival crevicular fluid. Available antibody detection methods are focused in serum samples, with low sensitivity and few reports of alternative biological material, like saliva. Here, we standardized immunoassays with high sensitivity for detection of anti-T. gondii IgG in paired saliva and serum sample from 20 adult volunteers, which allows DOT-ELISA and a Protein A IgG capture assay. The sensitivity and specificity of the saliva DOT-ELISA were similar to sera ELISA. We also tested 100 saliva samples from university graduates in all assays, showing 19% (95%CI 12-28%) frequency of toxoplasmosis in this group, lower than reported for our area. Protein A IgG capture saliva assay was also efficient with similar results. Immunoassay with saliva IgG for toxoplasmosis is a very promising tool for use for the epidemiology of toxoplasmosis in children or other protected groups.

Introdução: A relevância clínica da presença de anticorpos anti-HLA após o transplante renal tem sido foco de recente atenção para os estudiosos da histocompatibilidade. Pacientes que possuem anticorpos anti-HLA no póstransplante apresentam maior incidência de rejeição aguda (RA) e de nefropatia crônica do enxerto (NCE). Como conseqüência, alguns perdem o órgão transplantado ou sofrem com as reações imunopatológicas correspondentes. Entretanto, existem algumas controvérsias sobre o grau de valorização da presença desses anticorpos na etiopatogenia da RA e da NCE, pois nem todos os pacientes com anticorpos evoluem mal. Objetivo: Avaliar a presença de anticorpos anti-HLA no primeiro ano do transplante renal e verificar sua associação com a ocorrência de RA e NCE. Pacientes e Método: Este estudo incluiu consecutivamente 88 pacientes submetidos a transplante renal no Serviço de Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, entre outubro de 2002 a outubro de 2004. Amostras de sangue foram colhidas no 1º, 3º, 6º e 12º meses pós-transplante renal, visando à pesquisa de anticorpos IgG anti-HLA de classes I e II. Nos pacientes que consentiram, biópsias renais de protocolo foram realizadas entre o 2º e o 3º mês e no 12º mês póstransplante. A detecção dos anticorpos foi realizada através de ensaio ELISA (LATM e LAT-1240, One Lambda Inc., USA). Rejeição aguda e a NCE foram diagnosticadas por critérios clínicos, laboratoriais e histopatológicos. Resultados: Oitenta e oito pacientes foram avaliados, sendo 40 (45,5%) do sexo feminino e setenta e dois (81,8%) de etnia caucasóide. Setenta e um (80,6%) receberam rins de doador falecido. Foi detectada a presença de anticorpos anti-HLA em vinte pacientes (22,7%). Desses, somente 3 (4,4%) desenvolveram anticorpos anti-HLA (classe I) no período pós-transplante; os demais (17) já os apresentavam no período prétransplante. No seguimento até um ano, 23 pacientes (26,1%) apresentaram RA e 43 (51,2%) desenvolveram NCE. Nove (45%) pacientes com anticorpos no póstransplante desenvolveram RA contra 14 (20,6%) dos sem anticorpos (P=0,058). Entre os pacientes com anticorpos no pós-transplante, 11 (64,7%) desenvolveram NCE contra 32 (47,8%) dos sem anticorpos (P=0,329). Na análise histológica, os anticorpos anti-HLA foram associados à RA IIA (P=0,001) e à NCE grau II (P= 0,012). As variáveis preditoras para a RA e NCE foram, respectivamente, presença de anticorpos anti-HLA de classe I no 1º mês pós-transplante (OR= 4,30; IC 95%= 1,32-14,1; P= 0,016) e transplante com órgão de doador-limítrofe (OR= 4,81; IC 95%= 1,18-20,3; P= 0,028). Setenta por cento (70%) dos pacientes com RA desenvolveram NCE, contra 45,3% dos pacientes sem RA (P= 0,054). Conclusão: Os anticorpos anti-HLA presentes no primeiro ano do transplante renal foram associados a RA e NCE. A pesquisa de anticorpos anti-HLA no pós-transplante renal realizada por outros pesquisadores e aqui também avaliada, se adotada como rotina, possibilitaria a identificação de casos de mau prognóstico e a escolha de planos terapêuticos mais adequados. A correlação entre anticorpos anti-HLA e rejeição deverá se tornar mais evidente com o passar dos anos, sendo que nossos resultados fortalecem a convicção da necessidade de continuidade desses estudos. / Introduction: The clinical relevance of the presence of anti-HLA antibodies following kidney transplant has been the recent focus of attention of histocompatibility researchers. Patients who present anti-HLA antibodies in the post-transplant period have shown higher incidence of acute rejection (AR) and of chronic allograft nephropathy (CAN). As a result, some lose the transplanted organ or suffer from the corresponding immunopathological reactions. However, there has been some controversy as to the importance of the presence of these antibodies in the ethiopathology of AR and CAN, since not all patients who have these antibodies present the same outcome. Objective: To evaluate the presence of anti-HLA antibodies during the first year of kidney transplantation and to check its association with the occurrence of AR and CAN. Patients and Method: This research included consecutively 88 patients who had undergone kidney transplants in the Hospital de Clínicas de Porto Alegre Nephrology Service between October 2002 and October 2004. Blood samples were taken during the 1st, 3rd, 6th and 12th months post kidney transplant, aiming at researching for Class I and II IgG anti-HLA antibodies. In consenting patients, protocol kidney biopsies were carried out between the 2nd and 3rd months and in the 12th month after the transplant. Detection of antibodies was done through ELISA test (LAT-M and LAT-1240, One Lambda Inc., USA). Acute rejection and CAN were diagnosed through clinical, laboratorial and histopathological criteria. Results: Eighty-eight patients were evaluated, among which 40 (45.5%) were female and seventy-two (81.8%) were Caucasian. Seventy-one (80.6%) received kidneys from deceased donors. The presence of anti-HLA antibodies was found in 20 patients (22.7%). Among these, only 3 (4.4%) developed anti-HLA antibodies (class I) during the post-transplant period; the remaining (17) already presented these antibodies during the pre-transplant period. In the follow-up up to one year, 23 patients (26.1%) presented AR and 43 (51.2%) developed CAN. Nine patients (45%) with antibodies in the post-transplant period developed AR as opposed to 14 (20.6%) patients without antibodies (P=0.058). Among the patients with antibodies in the post-transplant period, 11 (64.7%) developed CAN as opposed to 32 (47.8%) of those without antibodies (P=0.329). In the histological analysis, the anti-HLA antibodies were associated to AR IIA (P=0.001) and to CAN degree II (P= 0.012). The predictive variables for AR and CAN were, respectively, the presence of Class I anti-HLA antibodies in the first month post-transplant (OR= 4.30; IC 95%= 1.32-14.1; P= 0.016) and transplant with expanded criteria donors (OR= 4.81; IC 95%= 1.18-20.3; P= 0.028). Seventy per cent of the patients presenting AR developed CAN, as opposed to 45.3% of the patients without AR (P= 0.054). Conclusion: The anti-HLA antibodies present in the first year of the kidney transplant were associated to AR and CAN. The research of anti-HLA antibodies in the kidney post-transplant period carried by other researchers, as well as in this study, if done routinely, would allow the identification of cases with a poor prognosis and the choice of more adequate treatments. The correlation of anti-HLA antibodies and rejection will become more evident with time, and our results reinforce the certainty that these studies must continue.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T11:15:03Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vivaldo Gomes da Costa - 2015.pdf: 2069412 bytes, checksum: 8451333c0969ae734748f50c7e57e0f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T11:16:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vivaldo Gomes da Costa - 2015.pdf: 2069412 bytes, checksum: 8451333c0969ae734748f50c7e57e0f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T11:16:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vivaldo Gomes da Costa - 2015.pdf: 2069412 bytes, checksum: 8451333c0969ae734748f50c7e57e0f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-01-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The diagnosis of dengue virus (DENV) infection still remains a challenge, due to cross-reactivity between serological tests and to traditional methods that capture IgM, which is a late marker of infection. However, NS1 antigen is an early marker. Accordingly, several studies have evaluated the performance of tests that utilize NS1 capture, but the results of individual studies may be limited due to the restricted sample size of the patients recruited. Therefore, our objective was to perform a meta-analysis of the diagnostic accuracy of two commercial NS1 ELISAs (Panbio® and Platelia™). Methods and Results: Studies of interest were found in PubMed, Embase and Google Scholar databases using defined inclusion/exclusion criteria. A total of 30 studies containing 12.105 total enrolled patients were included. The overall estimated sensitivity, specificity, positive and negative likelihood ratios, diagnostic odds ratio were as follows: 66% (95% confidence interval (CI) 61-71), 99% (95% CI 96 -100), 98 (95% CI 20-464) 0.3 (95% CI 0.2-0.4) and 289 (95% CI 59-1412), respectively, for Panbio®, and 74% (95% CI 63-82 ), 99% (95% CI 97-100), 175 (95% CI 28-1099), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) and 663 (95% CI 98-4478), respectively, for Platelia™. The lowest sensitivity values were for secondary infections (57% [95% CI 47-67] and 66% [95% CI 53-77] for Panbio® and Platelia™, respectively) and for the detection of DENV4. Regarding clinical manifestations, the sensitivity of Platelia™ was 69% (95% CI 43-86) and 60% (95% CI 48-70) for fever and dengue hemorrhagic fever, respectively. In addition, the sensitivity of both tests was slightly lower for samples from Southeast Asia and Oceania. Conclusion: DENV1 samples gave higher sensitivity results for both tests. We observed that factors negatively influencing the tests, such as the type of infection and viral serotype, require further investigation to optimize the diagnostic accuracy. / O diagnóstico das infecções pelo dengue vírus (DENV) continua um desafio, principalmente devido a ocorrência de reações cruzadas entre os testes sorológicos e devido aos tradicionais métodos para captura de IgM constituírem marcadores tardio da infecção. Todavia, o antígeno NS1 é um marcador precoce. Nesse contexto vários estudos tem avaliado a performance dos testes para a captura do NS1, porém os resultados dos estudos individuais podem ser limitados, por causa do restrito tamanho amostral dos pacientes recrutados. Portanto, nosso objetivo foi realizar uma meta-análise da acurácia diagnóstica de dois ensaios comerciais ELISA NS1 (Panbio® e Platelia™). Métodos e Resultados: Os estudos de interesse foram extraídos das bases de dados PubMed, Embase e Google Acadêmico, com definidos critérios de inclusão e exclusão. Um total de 30 estudos, perfazendo 12.105 pacientes recrutados, foram incluídos na análise estatística. A estimativa global da sensibilidade, especificidade, razão de verossimilhança positiva e negativa, razão de chance diagnóstica foram: 66% (95% intervalo de confiança (CI) 61-71), 99% (95% CI 96-100), 98 (95% CI 20-464), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) e 289 (95% CI 59-1412), respectivamente para o kit da Panbio®. Enquanto para o kit da Platelia™, os resultados obtidos foram, respectivamente: 74% (95% CI 63-82), 99% (95% CI 97-100), 175 (95% CI 28-1099), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) e 663 (95% CI 98-4478). A menor performance dos testes ocorreram nas infecções secundárias e na detecção do DENV4. Quanto às formas clínicas da dengue, a sensibilidade do Platelia™ foi de 69% (95% CI 43-86) e 60% (95% CI 48-70), para a febre da dengue e febre hemorrágica, respetivamente. A sensibilidade de ambos os testes foram discretamente menores para as amostras provenientes da Ásia e Oceania. Conclusão: As amostras de DENV1 forneceram maior sensibilidade para ambos os testes. Observamos que os fatores influenciando negativamente os testes, tais como o tipo de infecção e o sorotipo viral necessitam de maiores investigações no intuito de melhor aperfeiçoamento da acurácia diagnóstica

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A Esquistossomose MansÃnica à uma doenÃa endÃmica em 76 paÃses e territÃrios. Em meados de 2003, calculou-se que 779 milhÃes de pessoas estavam dentro da populaÃÃo de risco para esquistossomose, e 207 milhÃes de pessoas estavam infectadas. O diagnÃstico laboratorial dessa parasitose pode ser realizado atravÃs de mÃtodos parasitolÃgicos de fezes, desde os mais clÃssicos (Kato-Katz), a alguns que ainda estÃo em fase de validaÃÃo. Este estudo foi realizado para avaliar dois novos mÃtodos coproscÃpicos para diagnÃstico da Esquistossomose MansÃnica, em moradores de uma Ãrea de baixa endemicidade no MunicÃpio de Maranguape, no Estado do CearÃ, utilizando o mÃtodo de Kato-Katz como referÃncia e a sorologia (ELISA) para a triagem dos pacientes. Foram desenvolvidas as seguintes etapas: Reconhecimento da Ãrea e divulgaÃÃo do projeto junto aos residentes na localidade; Visita domiciliar para assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido e entrevista para coleta de dados epidemiolÃgicos; Coleta de sangue para realizaÃÃo do mÃtodo sorolÃgico; DistribuiÃÃo dos frascos para coleta de fezes, somente para os participantes que foram reativos no teste sorolÃgico; recebimento das amostras de fezes e realizaÃÃo dos mÃtodos coproscÃpicos e por fim, entrega dos resultados dos exames e tratamento dos indivÃduos positivos. Comparando-se os resultados obtidos pelo mÃtodo do Kato-Katz e do Gradiente SalÃnico viu-se que dos 13 positivos (23,2%) encontrados por ambos, 10 (76,9%) foram diagnosticados apenas atravÃs do Gradiente SalÃnico. Jà quando comparou-se o mÃtodo do Kato-Katz e do Helmintex, das 32 amostras analisadas, 16 foram positivos (50%) por ambos, porÃm, 12 (75%) destes indivÃduos foram diagnosticados apenas pelo Helmintex. E ao comparamos o mÃtodo do Gradiente SalÃnico com o Helmintex, nos 32 indivÃduos que realizaram estes, 17 (53%) foram positivos em ambas as tÃcnicas, sendo 11 (64,7%) positivos sà no Helmintex. Assim, os mÃtodos do Gradiente SalÃnico e Helmintex mostraram-se mais efetivos no diagnÃstico da esquistossomose mansÃnica na localidade em estudo, quando comparados ao Kato-Katz, porÃm diante da forma de execuÃÃo das tÃcnicas, as mesmas podem nÃo ser adequadas para grandes inquÃritos epidemiolÃgicos, mas para estudos pontuais em Ãreas onde o programa de controle nÃo consegue atingir os objetivos. / The Schistosomiasis is endemic in 76 countries and territories. In mid 2003, it was estimated that 779 million people were within the population at risk for schistosomiasis, 207 million people were infected. The laboratory diagnosis of schistosomiasis can be accomplished through methods for parasites, ranging from classics (Kato-Katz), a few that are still undergoing validation. This study was conducted to evaluate two coproscopic new methods for diagnosis of Schistosomiasis in residents of an area of low endemicity in Maranguape-CearÃ, using the Kato-Katz as a reference and serology (ELISA) for screening of patients. We developed the following steps: knowing the area and dissemination of the project with residents in the locality; Home visit to signing the consent form and interview to collect epidemiologic data, blood collection for performing the serological method, distribution of the bottles for feces, only for participants who were reactive in serological testing, collection of stool samples and carrying out the methods coproscopic and finally, delivery of results of examinations and treatment of positive individuals. Comparing the results obtained by the Kato-Katz method and salt gradient was seen that the 13 positive (23.2%) found by both, 10 (76.9%) were diagnosed only by the saline gradient. Even when we compared the method of Kato-Katz and Helmintex of the 32 samples analyzed, 16 were positive (50%) for both, however, 12 (75%) of these individuals were diagnosed only by Helmintex. And when comparing the method the saline gradient with Helmintex in 32 individuals who completed these, 17 (53%) were positive by both techniques, 11 (64.7%) positive only in Helmintex. Thus, the methods of the Saline Gradiente and Helmintex were more effective in the diagnosis of schistosomiasis in locus study, when compared to the Kato-Katz, but on the way of implementing the techniques, they may not be suitable for large surveys epidemiological, but for specific studies in areas where the driver fails to achieve the goals.

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Joao Freitas de Almeida.pdf: 224070 bytes, checksum: e823447b5af3454f3861d310f6e1d693 (MD5) Previous issue date: 2006-05-19 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The Vila Nova town located in the municipality of Raposa, Maranhão, has been reported as endemic area for visceral leishmaniasis. Knowing the importance of dogs as reservoir household, this study aimed to identify the dogs for leishmaniasis infected through test immunoassay (ELISA). Collections of blood of all dogs resident in the locality were held in the period of February to April 2005, giving a sample of 233 dogs. The results of the ELISA showed that 69 dogs showed positive results, corresponding to a seroprevalence of approximately 29.6% of the dogs of the town. / A localidade Vila Nova situada no município de Raposa, Maranhão, tem sido relatada como área endêmica para a leishmaniose visceral. Sabendo da importância dos cães como reservatório doméstico, este trabalho teve como objetivo identificar os cães infectados para leishmaniose por meio de teste imunoenzimático (ELISA). Coletas de sangue de todos os cães domiciliados na localidade foram realizadas no período de fevereiro a abril de 2005, perfazendo uma amostra de 233 cães. Os resultados do ELISA demonstraram que 69 cães apresentaram resultados positivos, correspondendo a uma soroprevalência de aproximadamente 29,6% dos cães da localidade.

A toxoplasmose é uma protozoose de alta prevalência no Brasil, causada pelo Toxoplasma gondii, sendo transmitida pela ingestão de alimentos contaminados com oocistos, excretados em fezes de felinos, ou cistos, em carnes cruas ou mal cozidas. A doença é usualmente assintomática, mas em fetos ou pacientes com imunodepressão, pode ser devastadora. Neste trabalho, estudamos a prevalência sorológica da infecção em animais de diferentes regiões do estado de São Paulo, tanto de vida livre, cães (200/ABC) como indicadores ambientais, e gatos (100/São Paulo) como hospedeiros definitivos, e em animais de produção, bovinos (200/Taquarituba), suínos (200/Osasco), caprinos( 200/Botucatu), ovinos (200/São Manuel) e frangos de corte(185/Botucatu), além de estudos parasitológicos em gatos e águas sob suspeita. Foram padronizados ELISA para cada espécie animal, utilizando índices adequados e reprodutíveis, com confirmação por Western Blotting e determinação da avidez em amostras positivas. A prevalência da toxoplasmose animal foi determinada sendo crescente em suínos (8.5%), bovinos (11%), caprinos (17%), ovinos (31%), felinos (40%) e cães (50,5%), não sendo encontrada em frangos de corte. Em suínos, caprinos, cães e gatos, a freqüência de anticorpos de baixa avidez sugere que a transmissão da infecção é constante durante a vida do animal, mas em bovinos e ovinos não foram encontrados anticorpos de baixa avidez, sugerindo infecção precoce ou sazonal na vida do animal. Pela alta taxa de infecção recente em felinos, é possível prever uma fração significativa de animais excretando oocistos, embora sem comprovação parasitológica. A avaliação da presença de anticorpos anti-T.gondii deve ser criteriosa, sendo que os reagentes de hemaglutinação para uso humano fornecem resultados erráticos nesta medida. A pesquisa de oocistos na água é de baixa sensibilidade, devendo ser feita em materiais colhidos no período de suspeita da transmissão. Em São Paulo, o risco de transmissão da toxoplasmose está relacionado a quase todas as fontes de infecção pesquisadas, tornando necessários estudos para o melhor manejo dos animais de consumo humano e tratamento de água, com eliminação de gatos errantes. / Toxoplasmosis, caused by Toxoplasma gondii and highly prevalent protozoan disease in Brazil, is mainly transmitted by ingestion of contaminated food and water, both by oocysts, excreted in cat feces, or cysts from undercooked meat from warm-blooded animals. Usually asymptomatic, it is extremely severe in the fetus or immunosuppressed patients. In this work, we studied the serological prevalence of toxoplasmosis in animals from several regions of the São Paulo State, both free living, as dogs (ABC) as environmental contamination index, and cats (São Paulo, as definitive hosts, or livestock as cattle (Taquarituba), swine (Osasco), goats (Botucatu), sheep (São Manuel) and fowls (São Paulo), with parasitological studies in cats and suspicious drinking water. We standardized ELISA for each species, using reproducible and adequate indexes, with Western blot confirmation and avidity assays in positive samples. Toxoplasmosis prevalence was increasing in swine (8.5%), cattle (11%), goats (17%), sheep (31%), cats (40%) and dogs (50.5%), without positive sample in fowls. Goats, pigs, dogs and cats presented 5-20% low avidity antibody samples, suggesting sustained transmission during animal life, but cattle and sheep presented only high avidity samples, suggesting an seasonal or early in life infection. Due to the high recent infection rate in cats, it is possible to preview a significant oocyst excreting cat frequency, despite parasitological evidence. Antibody determination must be carefully evaluated, as human hemagglutination reagents give erratic information. Oocyst detection in drinking water presented very low sensitivity and must be performed only in water collected at the period of the infection. In São Paulo, almost all of tested sources are able of toxoplasmosis transmission, reinforcing the need of better management of livestock, adequate water treatment and elimination of free living cats.

O Neospora caninum é um protozoário filogeneticamente relacionado a vários coccídeos de importância em medicina veterinária e humana, além de ser um parasita intracelular obrigatório capaz de causar abortamentos em bovinos e paralisia neuromuscular em cães. O estudo de antígenos e proteínas recombinantes de N. caninum gerou uma série de informações para um melhor diagnóstico e diferenciação deste protozoário e demais agentes a ele relacionados. No presente trabalho, propomos a expressão do clone do gene da proteína interna Nc56 de N. caninum em sistema procarioto (Escherichia coli), para avaliar sua antigenicidade frente a soros de bovinos imunoreativos contra Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Para tanto, estabelecemos as condições ideais de expressão da proteína (indução por 4 horas e concentração de L-arabinose de 0,2%) e posteriormente avaliamos duas formas de purificação do produto recombinante (cromatografia de afinidade por metal imobilizado e eluição direta do gel de SDS-PAGE), constatando que a eluição de proteínas recombinantes diretamente do gel de SDS-PAGE mostrou-se o procedimento mais adequado para evitar a presença de proteínas contaminantes advindas do sistema procarioto de expressão. Foi selecionado um painel de soros bovinos (animais de campo), previamente testados pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para avaliar sua reatividade para Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Utilizamos o soro de um bezerro macho da raça Holandesa recém-nascido, colhido antes da administração de colostro materno (mãe soronegativa pela RIFI-Nc e RIFI-Tg) como controle negativo. O controle positivo foi obtido do mesmo bezerro após inoculação experimental de taquizoítos viáveis de N. caninum, quando este animal já apresentava seis meses de idade. O ELISA indireto foi realizado com microplacas de poliestireno com 96 cavidades de fundo chato sensibilizadas com 10 μg/mL de proteína recombinante purificada Nc56 e apresentou altas densidades ópticas tanto para soros bovinos positivos na RIFI para N. caninum quanto para T. gondii, quando comparadas com a densidade óptica do soro controle negativo. A proteína recombinante purificada e o extrato bruto de proteínas solúveis em tampão desnaturante foram submetidos ao teste de Western-blotting, para avaliação de antigenicidade frente a soros de animais positivos e negativos para N. caninum e T. gondii, previamente testados por RIFI. Os resultados apresentados nas duas técnicas (ELISA e Western-blotting) demonstram que a proteína recombinante purificada Nc56 de N. caninum possui reatividade cruzada entre os dois coccídeos, não se prestando, portanto, para uso em sorodiagnóstico da neosporose. / Neospora caninum, a protozoa phylogenetically related to other coccidea, is an obligatory intracellular parasite, able to cause abortions in bovine and neuromuscular paralysis in dogs. Researches with Neospora caninum antigens and recombinant proteins leads to numerous information to a better diagnosis and differentiation of several coccidea. The purposes of this study were expressing the Neospora caninum inner protein Nc56 in a prokaryotic system (Escherichia coli) and evaluate its antigenicity with i>Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive bovine sera. It was established the ideal conditions to express the protein (4 hour induction and 0,2% L-arabinose concentration) and, after that, two protein purification systems were assayed (immobilized metal affinity chromatography and elution from polyacrylamide gel) resulting in a better protein recuperation the elution method. A panel of previous RIFI-tested bovine sera was selected to evaluate the immune reactivity of Nc56 protein with Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera. The negative control was obtained from a Neospora caninum and Toxoplasma gondii negative newborn male bovine and the positive control was obtained from the same animal (6 month old), after the inoculation of live Neospora caninum tachyzoits. The indirect ELISA assay was performed in 96-wells microtiters plates, coated with purified Nc56 recombinant protein (10 µg/mL), resulting in higher optical densities for Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera, when compared with negative control. The purified recombinant protein and the crude extract of soluble proteins in denaturing binding buffer were submitted to Western-blotting to evaluate its antigenicity with Neospora caninum and Toxoplasma gondii/i> positive sera. The results obtained in both techniques shown that Nc56 purified recombinant protein has cross reactivity between both coccidea, therefore, it is not indicated to be used as antigen in neosporosis serodiagnosis.

O milho (Zea mays) é um cereal amplamente cultivado no Brasil e no mundo. Sua produtividade pode ser afetada por diversos fatores incluindo a colonização fúngica. Em Fitopatologia, grãos afetados por fungos são denominados grãos ardidos e os gêneros mais encontrados em milho são Stenocarpella e Fusarium. Espécies de Fusarium podem causar podridões nas espigas e também podem produzir fumonisinas, toxina esta tóxica para animais e humanos e associadas ao desenvolvimento de diversas doenças. O presente trabalho teve como objetivo analisar a incidência de Fusarium ssp. com potencial toxigênico em amostras de grãos ardidos através da identificação da presença do gene fum5, responsável pela produção de fumonisinas pelo fungo, bem como quantificar os níveis de fumonisinas encontrados nessas amostras e comparação com os resultados obtidos de grãos assintomáticos. Um total de 100 amostras dos anos de 2006 e 2007 provenientes das principais regiões produtoras do Brasil foram submetidas à três análises. A primeira avaliou a incidência de Fusarium spp. nos grãos através do método do papel de filtro com congelamento e em 100% das amostras foi encontrado o fungo em níveis que variaram de 34 a 91%. A segunda análise utilizou a PCR para confirmação do gênero, identificação de espécies (F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans) e identificação da presença do gene fum5. A PCR confirmou 93% dos isolados como pertencentes ao gênero Fusarium. Os isolados negativos passaram por análise morfológica e todos foram confirmados. As PCRs para espécies identificaram 82% dos isolados como F. verticillioides, 3% como F. subglutinans e nenhum como F. proliferatum. A PCR para potencial toxigênico foi positiva para 81% dos isolados. A terceira análise consistiu na quantificação de fumonisinas (B1, B2 e B3 na proporção 5:3:1) através do método de ELISA e os níveis variaram de 4,4 a mais de 90 µg/g. Grãos assintomáticos da segunda safra de 2007 foram analisados separadamente para comparação. Em 100% das amostras houve incidência de Fusarium spp, variando de 74 a 87%. A PCR para confirmação do gênero foi positiva para 87% dos isolados e os demais passaram por análise morfológica e então confirmados. As PCRs para identificação de espécies mostrou 60% dos isolados como sendo F. verticillioides, 3% como F. subglutinans e nenhum como F. proliferatum. A maior concentração de fumonisinas nos grãos assintomáticos foi de 2,1 µg/g e em 53% das amostras não foram detectadas fumonisinas. Os resultados mostraram que há uma alta incidência de Fusarium spp. em grãos ardidos e assintomáticos. Grãos ardidos e assintomáticos têm Fusarium spp. com potencial toxigênico mas os níveis de fumonisinas encontrados nos grãos assintomáticos foram muito baixos em comparação com os encontrados nos grãos ardidos mostrando que, em condições adversas, esse fungo deixa de ser endofítico e passa a ser patogênico, podendo causar doenças na planta e produzir toxinas. Pelo fato das fumonisinas estarem concentradas nos grãos ardidos, a redução dessas toxinas da dieta deve ser baseada na eliminação dos mesmos através do controle do beneficiamento. / Maize is a cereal widely cultivated in Brazil and worldwide. Its productivity can be affected by numerous factors including fungal colonization. In pathological terms, affected grains by fungi are denominated rot grains and the two most prevalent genera found in maize are Stenocarpella and Fusarium. Species of Fusarium can cause rotting in the stalks and also produce fumonisins, which are toxic both for animals and humans since their occurrence is associated to many diseases. The present work aimed to analyse the incidence of Fusarium ssp. with toxigenic potential in rot grains samples through the identification of the presence of the gene fum5, responsible for the production of fumonisins, as well as to quantify the levels of fumonisins found in these samples and compare with the results obtained in asymptomatic grains. A total of 100 samples from the 2006 and 2007 harvests were collected from the main producing regions of Brazil and were submitted to three analyses. The first evaluated the incidence of Fusarium ssp. in the grains through the method of filter paper and freezing, which revealed incidences that varied from 34 to 91%. The second analysis used specific primers and PCR to confirm the genus and species (F. verticillioides, F. proliferatum and F. subglutinans) and to detect the presence of the fum5 gene. The results indicated that 93% of the isolates belonged to the genus Fusarium. The PCR - negative isolates were confirmed as Fusarium after morphological analysis. Eigthy two percent of the isolates were classified as F. verticillioides, 3% as F. subglutinans and none as F. proliferatum using speciesspecific PCR. The fum5 gene was detected in eighty one percent of the isolates. The third analysis consisted in the quantification of the fumonisins (B1, B2 e B3 in the proportion of 5:3:1) through the ELISA method and the levels varied from 4,4 to more than 90 µg/g. Asymptomatic grains from the second cropping season of 2007 were analyzed separately for comparison purposes. The incidence of Fusarium spp. in these varied from 74 to 87%. The PCR for confirmation of the genus was positive for 87% of the isolates. The PCRs for species identification showed 60% of the isolated as being F. verticillioides, 3% as F. subglutinans and none as F. proliferatum. The greater concentration of fumonisins in the asymptomatic grains was of 2,1 µg/g and in 53% of the samples fumonisins were not detected. Rot and asymptomatic grains presented Fusarium spp. with toxigenic potential but the levels of fumonisins found in the asymptomatic grains were much lower compared with rot grains, showing that, in adverse conditions, this fungus changes from endophytic to pathogenic, being able to parasitize the plant and to produce toxins. The fact that fumonisins levels are much higher in rot grains, a simple measure to reduce the levels of these toxins in the animal diet would be to eliminate them during processing.

A doença celíaca (DC) é uma doença inflamatória induzida pela ingestão de glúten em indivíduos geneticamente predispostos e seu tratamento é baseado em uma dieta sem glúten por toda a vida. A doença celíaca refratária é um problema comum que afeta de 10% a 19% dos pacientes célicos tratados. Provavelmente, a contaminação da dieta por glúten é uma das razões principais para a persistência de sintomas em pacientes celíacos tratados, assim como a ingestão inadvertida de glúten, devido a rotulagem incorreta. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a confiabilidade dos rótulos dos alimentos brasileiros processados, através de testes de contaminação de glúten nos seguintes grupos (a) produtos \"livres de glúten\" - preparados especificamente para a população celíaca; (b) produtos \"naturalmente sem glúten\" feitos com arroz, milho, soja e mandioca, utilizados por toda a população e (c) produtos rotulados com \"contém glúten\", mas que não apresentam glúten em sua composição no rótulo. Foram analisados 213 produtos alimentícios agrupados em: 115 produtos do grupo \"sem glúten\"; 86 produtos do grupo \"naturalmente sem glúten\" e 12 produtos do grupo rotulados com \"contém glúten\". O teor de glúten foi detectado e quantificado por ELISA-R5 (Ridascreen®gliadin) e os resultados foram expressos em ppm e mg/100 g de alimento. A linha de corte foi estabelecida em 20 ppm para a contaminação de glúten. Todas as contaminações por glúten foram confirmadas por Western-blotting. Resultados: (a) alimentos livres de glúten 15 das 115 (13%) apresentaram contaminação por glúten (20 ppm), (b) grupo de alimentos naturalmente sem glúten - 8 de 86 (9,3%) apresentaram contaminação por glúten (20 ppm); (c) grupo de alimentos rotulados com contem glúten - somente 2 de 12 (16,7%) apresentaram contaminação por glúten (20 ppm). A análise de Western-blotting confirmou 36 das 38 (95%) contaminações encontradas no ELISA-R5. CONCLUSÕES: Ambos os grupos de alimentos \"sem glúten\" e \"naturalmente sem glúten\" comercializados no Brasil apresentaram razoável porcentagem de contaminação por glúten, o que dificulta a realização de uma dieta adequada ao paciente celíaco. O grupo de alimentos rotulado \"com glúten\" não apresentou 100% de contaminação, o que revela que a rotulagem desses produtos deve ser feita como uma medida preventiva. Uma maior chance de contaminação pelo glúten foi observada para os produtos a base de arroz (13,6x), soja (13,3x) e milho (9,3x), mas não naqueles à base de mandioca. Em média, encontramos 10,8% (23 de 213) de contaminação de glúten para os alimentos analisados, um panorama positivo para a população brasileira celíaca, principalmente devido ao uso da mandioca, uma alternativa para a farinha de trigo. No entanto, a contaminação de glúten encontrada mostra a importância da quantificação de glúten em todos os alimentos industrializados. / Celiac disease (CD) is an inflammatory disorder induced by ingestion of gluten in genetically predisposed individuals and its treatment is based on a life-time gluten-free diet. Nonresponsive celiac disease is a common problem affecting from 10% to 19% of treated celiac patients. Probably a gluten contamination in diet is one of the major reasons for symptoms persistence in celiac patients as well as an inadvertent gluten intake due to a misleading nutritional label. The aim of this study was to evaluate the reliability of Brazilian processed food labels by testing gluten contamination in (a) gluten-free products - prepared specifically for the celiac population; (b) in naturally gluten-free products made with rice, corn, soy bean and cassava and used by all population and (c) in not gluten-free products labeled to contain gluten but not having it in their composition. We analyzed 213 food samples grouped accordingly to its type: 115 samples of \"gluten-free food, 86 samples of \"naturally gluten-free food and 12 samples of not-gluten free labeled products. The gluten content was detected and quantified by ELISA-R5 (Ridascreen® Gliadin) and the results were expressed in ppm and mg/100 g of food. A cut-off line was established in 20 ppm for gluten contamination. All gluten contaminations were confirmed by Western-blotting. Results: (a) Gluten-free foods - we found 100 of 115 samples (87%) with no contamination (< 20 ppm) and 15 of 115 (13%) showed gluten contamination 20 ppm; (b) Naturally Gluten-free foods - we found 78 of 86 samples (90,7%) showing no contamination (< 20 ppm) and 8 of 86 (9,3%) with gluten levels 20 ppm; (c) Not gluten-free foods - we found 10 of 12 samples (83,3%) showing no contamination (< 20 ppm) and 2 of 12 (16,7%) with gluten contamination 20 ppm. The Western-blotting analysis confirmed 36 of 38 (95%) contaminations found in the ELISA-R5. CONCLUSIONS: Both \"gluten-free and \"naturally gluten-free foods commercialized in Brazil have presented some gluten contamination making a restricted gluten-free diet hard to be achieved by the celiac population. Unexpectedly the not gluten-free group was not entirely contaminated showing a preventive measure in labeling by food companies. A higher odds ratio for gluten contamination was observed for products made with rice (13.6), soy bean (13.3) and corn (9.3) but not to cassava products (not significant). In general, we found a 10.8% (23 of 213) of gluten contamination for all food products analyzed, a positive panorama for the Brazilian celiac population mainly due to cassava products, an alternative for wheat starch. Nevertheless the gluten contamination found here leads us to the importance for a gluten quantification in all industrialized food to guarantee an appropriated diet to the Brazilian celiac group