Lipases são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em ácidos graxos, mono e diacilgliceróis e glicerol. Em contraste com as esterases, lipases são ativadas apenas quando estão adsorvidas a uma interface óleo-água. Lipases têm sido amplamente utilizadas em muitos processos industriais, tais como química orgânica, formulações de detergentes e de produtos como cosméticos e farmacêuticos. A principal preocupação na produção de enzimas comerciais é a proteção da sua estabilidade em solução aquosa. A água facilita ou medeia uma variedade de vias de degradação física e química, durante as etapas de purificação, transporte e armazenamento. Por conseguinte, formulações sólidas são desenvolvidas para alcançar uma vida útil aceitável para essas substâncias. Spray drying é comumente usado como uma técnica de desidratação na indústria farmacêutica para fabricação de produtos em pó diretamente do estado líquido. No presente trabalho, a purificação e caracterização bioquímica de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii, bem como os efeitos de adjuvantes no processo de secagem destas enzimas foram estudados. A lipase bruta foi purificada à homogeneidade através de cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. A lipase foi purificada 5,54 vezes, com rendimento de 9% e a atividade específica de 223,6 U/mg. O peso molecular da enzima foi estimado em 65,1 kDa por SDS-PAGE e 73,5 kDa utilizando cromatografia de gel filtração, indicando que provavelmente trata-se de um monômero. A lipase mostrou um pH ótimo em 4,6 e uma temperatura ótima de 35°C. Cerca de 80,2% de sua atividade foi mantida após incubação a 40°C durante 2 horas. A Vmax e Km foram 10,28 mmol/min/mg de proteína e 0,03240 mM, respectivamente, utilizando pNPP como substrato. As lipases presentes no extrato bruto e as lipases ligadas ao micélio foram caracterizadas para avaliar o potencial de utilização em biocatálise. A lipases no extrato bruto apresentaram atividade máxima a 60ºC e pH 6,2, enquanto que as lipases ligadas ao micélio apresentaram atividade máxima a 50ºC e pH 5,4. Nos estudos de efeito da temperatura sobre a atividade enzimática, as lipases no extrato bruto mantiveram-se estáveis a 50°C, com 85,3% de atividade residual após 2 horas de incubação. As lipases ligadas ao micélio mantiveram pelo menos 75,1% de atividade residual após 2 horas de incubação a 80°C. Estes resultados mostram que as lipases de C. kikuchii têm propriedades cinéticas e termoestabilidade desejáveis para aplicações em biocatálise. As lipases presentes no extrato bruto foram secas em spray dryer com diferentes adjuvantes, e sua estabilidade foi avaliada. A recuperação da atividade enzimática após a secagem, com a adição de 10% de lactose, -ciclodextrina, maltodextrina, manitol, goma arábica, e trealose variou de 63 a 100%. A atividade da enzima foi totalmente perdida durante a secagem do extrato bruto na ausência de adjuvantes. A maioria dos adjuvantes utilizados manteve pelo menos 50% da atividade enzimática a 5°C e 40% a 25°C, após 8 meses de armazenagem. As lipases secas com 10% de - ciclodextrina mantiveram 72% da atividade a 5°C no mesmo período. A partir destes resultados preliminares foi realizada a otimização do processo de secagem utilizando -ciclodextrina, maltodextrina e lactose como adjuvantes. A análise estatística dos resultados experimentais permitiu a determinação das condições ótimas para a retenção da atividade enzimática (RAE), a saber: concentração de adjuvantes de secagem de 12,05%, temperatura de entrada do gás de secagem em 153,6oC e vazão do extrato enzimático alimentado de 9,36 g/min, para - ciclodextrina e maltodextrina como adjuvantes. Para lactose, o estudo mostrou que o aumento da quantidade de adjuvante de secagem e/ou diminuindo a temperatura do gás de entrada tem um efeito positivo sobre a retenção da atividade enzimática do produto seco. Após o processo de purificação foi realizada a secagem da enzima parcialmente purificada e da lipase pura, com estes três adjuvantes. A manutenção da atividade enzimática variou 90,6-100% quando foram utilizadas as condições ótimas para cada adjuvante de secagem. Concluindo, as lipases produzidas por C. kikuchii podem ser eficientemente secas por spray dryer, uma vez que a atividade enzimática foi mantida no extrato bruto, na lipase pura e na lipase semi-purificada submetidas à secagem. / Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to fatty acids, mono and diacylglycerols, and glycerol. In contrast to esterases, lipases are activated only when they are adsorbed to an oilwater interface. They have been widely used in many industrial processes such as organic chemical, detergent and cleaning formulations and in products like cosmetics and pharmaceutical products. The main concern in the production of commercial enzymes is to protect their stability in aqueous solution. Water facilitates or mediates a variety of physical and chemical degradation pathways, active during protein purification, shipping and storage. Consequently, dry solid formulations are developed to achieve an acceptable protein shelf life. Spray drying is commonly used as a dehydration technique in the pharmaceutical industry for making powdery products directly from the liquid. In the present work, the purification and biochemical characterization of lipases produced by endophytic fungus Cercospora kikuchii as well as the effects of adjuvants on the spray drying process of theses enzymes were studied. The crude lipase was purified to homogeneity by hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. The lipase purified was 5.54-fold with 9% recovery and the specific activity was 223.6. The molecular mass of the lipase was estimated to be 65.1 kDa using SDS-PAGE and 73.5 using gel filtration chromatography, indicating that the lipase is a monomer. The lipase demonstrated an optimum pH at 4.6, an optimum temperature of 35°C. About 80.2% of its activity was retained after incubation at 40°C for 2 hours. The Vmax and Km were 10.28 mol/min/mg protein and 0.03240 mM, respectively, using pNPP as substrate. The lipases present in crude extract and the mycelium-bound lipases were characterized in order to evaluate the potential for use in biocatalysis. The crude extract showed maximum activity at 60ºC and pH 6.2 while the myceliumbound lipases showed maximum activity at 50ºC and pH 5.4. In tests of the temperature effect on the enzymatic activity, the lipases in the crude extract was stable at 50°C, with 85.3% residual activity after 2 hours of incubation. The mycelium-bound lipases maintained at least 75.1% of residual activity after 2 h incubation at 80°C. These results show that the lipases of C. kikuchii have kinetic properties and stability characteristics suitable to applications in biocatalysis. The lipases present in crude extract were spray dried with different adjuvants, and their stability was evaluated. The recovery of the enzyme after drying with 10% of lactose, -cyclodextrin, maltodextrin, mannitol, gum arabic, and trehalose ranged from 63% to 100%; but the enzyme activity was lost in the absence of adjuvants. Most of the adjuvants used kept up at least 50% of the enzymatic activity at 5°C and 40% at 25°C after 8 months. The lipase dried with 10% of -cyclodextrin retained 72% of activity at 5°C. From these preliminary results the optimization of drying process using -cyclodextrin, maltodextrin and lactose as adjuvants was carried out. Statistical optimization of the experimental results allowed the determination of the processing conditions that maximized the retention of the enzymatic activity (RAE), namely: concentration of drying adjuvants of 12.05 %, inlet temperature of the drying gas of 153.6oC, and flow rate of the enzymatic extract fed to the dryer of 9.36 g/min, for the b-cyclodextrin and maltodextrin as adjuvants. For lactose as adjuvant the study showed that increasing the amount of drying adjuvant and/or decreasing the inlet gas temperature has positive effect on the retention of enzymatic activity of the dried product. After the purification process was carried out the drying of the partially purified enzyme and pure lipase, using these three adjuvants. The retention of enzymatic activity ranged from 90.6 to 100% when was used the optimal conditions for each drying adjuvant. Concluding, the lipases produced by C. kikuchii may be efficiently spray dried since its activity enzimatic was retained in crude extract, pure lipase and in semi-purified lipase after drying.

Bactérias endofíticas provavelmente desenvolveram uma relação com planta hospedeira através de processos coevolucionários, podendo influenciar de alguma forma na fisiologia da planta. Na literatura, há muitos relatos sobre espécies de Bacillus endofíticos, no entanto, poucos se referem a espécie B. thuringiensis (Bt). Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi isolar, identificar e caracterizar Bt de mandioca. Todos os isolados identificados como Bt produziram cristais pontuais e apenas um isolado, IIRAC22, produziu cristais amorfos maiores. Esse isolado apresentou genes cry4A, cry4B e cry10 e toxicidade a larvas de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, evidenciando ser Bt var. israelensis. Todos os isolados produziram quitinase, sugerindo que elas podem ter ação controladora sobre fungos fitopatogênicos e insetos. Houve também produção de pectinase, enzimas envolvidas na penetração de planta hospedeira e estabelecimento como endófito. Esses Bt endofíticos podem levar ao desenvolvimento de produtos biotecnológicos para controle de insetos. / Endophytic bacteria probably developed a relationship with their plant host through coevoltionary processes what could influence in the physiology of the plant. In the literature, there are many reports about endophytic Bacillus species, however, few reports cite endophytic B. thuringiensis (Bt). Thus, the aim of the present work was to isolate, identify and characterize Bt from cassava. All the isolates identified as Bt were able to produce punctual crystals, but only one isolate, IIRAC22, produced large amorphous crystals. This isolate presented cry4A, cry4B and cry10 genes and toxicity against larvae of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus, evidencing to be Bt var. israelensis. All the isolates produced quitinase, suggesting that they can control phytopathogeni fungi and insects. There was also pectinase production, enzyme involved in the penetration of plant hosts and establishment as endophytes. These endophytic Bt can take to the development of biotechnological products for the control of insect.

Submitted by Carolina Neves (carolinapon@uefs.br) on 2017-02-17T23:59:52Z No. of bitstreams: 1 Disserta??oJoseneideAlves.pdf: 3612959 bytes, checksum: a4ba8033510286e66a0d4453ad52d71d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-17T23:59:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??oJoseneideAlves.pdf: 3612959 bytes, checksum: a4ba8033510286e66a0d4453ad52d71d (MD5) Previous issue date: 2009-08-31 / The biorreduction has great importance in the production of optically pure substances and is widely used for asymmetric synthesis. Bioconversions occur with high specificity and efficiency because they are catalyzed by enzymes, forming one of the isomers from a pro-chiral substrate. This work had as main objective to evaluate the potential reduction of micro-organisms (yeasts, bacteria and fungi) isolated in the state of Bahia using as carbonyl substrate the acetophenone, analyzing its conversion into alcohol and identifying the enantiomeric excess produced. Strains of Saccharomyces cerevisiae isolated from sugar cane brandy distilleries of Bahia state, rhizobacteria isolated from Arachis pintoi (forage peanut) in southern Bahia and endophytic fungi isolated Hevea brasiliensis. The products were analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry to verify the conversion of the substrate in alcohol and enantiomeric excess was determined by gas chromatography with chiral stationary phase. Of the 28 microorganisms evaluated 18 acted as biocatalysts. Products of reduction of acetophenone were obtained with yields between 6 and 79% and enantiomeric excess from 41 to 100%. Fungi CDC026, CDC086 and MDF077 converted acetophenone into (R)-alcohol, with ee of 54, 56, and 84%, while the other strains that showed positive results for acetophenone yielded the (S)-alcohol. Whereas 64% of test organisms were able to act as catalysts in the enantioseletive reduction of acetophenone, it was observed that the microbial diversity of the state of Bahia is a source of new catalysts for the production of enantiomeric pure compounds. / A Biorredu??o tem grande import?ncia na produ??o de subst?ncias opticamente puras, sendo amplamente utilizada para s?nteses assim?tricas. As bioconvers?es ocorrem com alta especificidade e efici?ncia por serem catalisadas por enzimas, formando um dos is?meros a partir de um substrato pr?-quiral. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o potencial redutor dos microrganismos (leveduras, bact?rias e fungos) isolados no territ?rio baiano frente ao substrato carbon?lico acetofenona; verificando a convers?o do substrato (acetofenona) em ?lcool quiral e identificando o excesso enantiom?rico com que as rea??es biocatal?ticas ocorreram. Foram utilizadas culturas de Saccharomyces cerevisiae isoladas em cacha?arias do estado da Bahia, rizobact?rias isoladas no sul da Bahia e fungos endof?ticos. Foi testada a a??o desses microrganismos sobre o substrato acetofenona. Os produtos foram analisados por Cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa, para verificar a convers?o do substrato em ?lcool; o excesso enantiom?rico foi obtido em cromat?grafo gasoso equipado com coluna quiral obtendo-se separa??o para os is?meros da acetofenona com um excesso enantiom?rico de at? 100%, para a cepa bacteriana I68. Os fungos CDC026 e CDC086 converteram a acetofenona em (R)-?lcool, as demais cepas que apresentaram resultados positivos para aceofenona produziram o (S)-?lcool em excesso. Conclui-se que em geral os microrganismos testados apresentaram boa capacidade de redu??o da acetofenona em experimentos de biotransforma??o, constituindo-se fontes de compostos enantiomericamente puros.

Os microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis. Essa interação planta-microrganismo é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Nas últimas décadas os estudos de microrganismos endofíticos têm sido realizados em diversas plantas hospedeiras, sendo esses estudos direcionados, principalmente, para a diversidade e características benéficas induzidas, como o controle biológico de doenças. As doenças com sintomas de murcha e cancro são consideradas emergentes no setor florestal. O Brasil está entre os maiores produtores mundiais de Eucalyptus e a expansão do setor, juntamente com o cultivo clonal, tem acarretado o aumento da incidência de patógenos. O surgimento de novas doenças exige estudos relacionados tanto a interação do agente patogênico com hospedeiro quanto de todos os componentes do patossistema. Neste contexto, os microrganismos endofíticos e do rizoplano têm sido descritos como potenciais controladores biológicos de doenças. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivos avaliar a interação da comunidade bacteriana associada a Eucalyptus sp. com fungos causadores de murcha e cancro. Foi também estudada a diversidade e colonização desses endófitos em sementes e o efeito da germinação nessa interação. Adicionalmente, foi realizada uma busca por bactérias associadas a Eucalypus sp. com capacidade de controlar fungos causadores de murcha e cancro. Foi observado que a densidade bacteriana endofítica não difere entre as espécies de Eucalyptus citriodora, E. urophylla e E. globulus x E. grandis avaliadas e que esta comunidade cultivada é composta por bactérias pertencentes às classes Actinobacteria, Proteobacteria e Firmicutes. Com uso de diferentes ferramentas de estudo foi observado que a quantidade de bactérias endofíticas nas sementes aumenta proporcionalmente ao tempo de germinação. Foi observado também que os sintomas de murcha e cancro causados, principalmente, por Ceratocystis fimbriata podem ser causados por outros fungos patogênicos. Foram identificados 41 isolados bacterianos endofíticos e do rizoplano com capacidade de controlar fungos patogênicos causadores de murcha e cancro em Eucalyptus sp. Adicionalmente ao potencial para uso no controle biológico do cancro e da murcha de Eucalyptus, as bactérias de sementes aqui relatadas, podem ter papel importante de proteção das plantas no campo. Futuros estudos devem ser direcionados para identificação de genes associados a essa inibição, bem com análise dos fatores responsáveis por este controle biológico no campo. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages or visible external structures. This interaction plant-microorganism is specific to certain species of plants and/or bacteria. In the last few years studies of endophytic microorganisms have been carried out for several plant hosts, which are focused mainly to diversity and biotechnological potential, such as biological control of disease. Brazil is one of the largest world Eucalyptus producers and the increasing of the Eucalyptus production associated to clonally reproduction has allowed an increasing incidence of some pathogens. These new disease demands on studies related to causal agent and biotic and abiotic factors associated to the diseases. The canker of Eucalyptus is considered an emerging disease by several reforestation companies. In that way, the rhizoplane and endophytic microorganisms has been described as potential diseases biological control agents. In this context, the aims of the present work were to assess the bacterial community associated to Eucalyptus sp. plants and seeds, besides the interaction with the wilt and canker pathogenic fungi. We also assessed the diversity and colonization effect of seed germination on bacterial community. Additionally, was carried out a screening of the Eucalypus sp. associated bacteria against pathogenic fungi that cause wilt and canker. We observed that endophytic bacterial density doesn\'t differ among the species of Eucalyptus citriodora, E. urophylla and E. globulus x E. grandis and that this cultivated community is composed by follow bacterial classes Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. Using different study approaches was observed that the amount of endophytic bacteria in the seeds increases proportionally at the germination time. We also observed that the symptoms of wilt and canker caused, mainly, by Ceratocystis fimbriata may be caused by other pathogenic fungi too. Additionally, were identified 41 endophytic and rhizoplane bacterial isolates able to control pathogenic fungi that cause Eucalyptus wilt and canker. Besides to the wilt and canker biological control potential of that bacteria, the seed endophyte identified in the present work can have important function on plant protection in the field. New studies should be addressed for identification of genes related to antagonism, besides of factors responsible for biological control occurrence in the field.

A natureza sempre constituiu uma fonte extremamente rica de compostos e substâncias utilizados pelo homem para diferentes fins, principalmente na área médica, pois os produtos naturais abrangem uma variedade de agentes terapêuticos para diversas doenças, como moléstias infecciosas, câncer, desordens lipídicas e imunológicas. Com a necessidade de se encontrar novos fármacos, tanto para doenças bem definidas, quanto para novas doenças, a pesquisa de substâncias com atividades biológicas torna-se fundamental. Fontes exóticas como o ambiente marinho e, recentemente o universo dos micro-organismos, ganharam grande interesse no meio científico devido ao fato de terem sido pouco conhecidas e exploradas. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi avaliar se diferentes frações da macroalga marinha Bostrychia tenella e extratos de micro-organismos endofíticos isolados dessa mesma espécie possuíam atividade imunomoduladora sobre o sistema complemento (SC) humano, que é reconhecido como um dos maiores efetores do processo inflamatório. Iniciado por três vias distintas (clássica, alternativa e das lectinas), ele leva à formação de produtos de clivagem e complexos de ativação que exercem diferentes funções biológicas importantes, como quimiotaxia, ativação de fagócitos, desgranulação de mastócitos, citólise, ativação celular e apoptose. Sendo assim, este sistema desempenha papel importante em várias reações inflamatórias, bem como em diferentes mecanismos patogênicos de dano tecidual. Através do ensaio de atividade hemolítica, 10 das 20 amostras iniciais foram selecionadas por modularem esta atividade do SC no pool de soro humano normal (SHN). As 10 amostras (dentre frações, subfrações e extratos de B. tenella e seus micro-organismos endofíticos) foram capazes de induzir a geração de fragmentos de C3, componente central do SC, observados tanto em técnicas imunoeletroforéticas, quanto em Western blotting. Também, observou-se a formação do complexo de ataque à membrana (MAC) em ensaio imunoenzimático, indicando que houve ativação total do SC. Através dos resultados obtidos no Western blotting para fragmentos de C4 e Fator B foi possível identificar quais vias do SC são ativadas, quando correlacionados com os resultados dos ensaios hemolíticos para via clássica/das lectinas (VC/VL) e via alternativa (VA). Desse modo, foi possível concluir que as 10 amostras selecionadas possuem efeito imunomodulador sobre o SC humano por serem capazes de ativá-lo, seja pela VC/VL ou pela VA. Conclui-se, também, que o ensaio hemolítico cinético constitui uma importante ferramenta de triagem, assim como o Western blotting do SHN para detecção de fragmentos do SC. / Nature has always provided an extremely rich source of compounds and substances used by man for various purposes, mainly in the medical field because natural products include a variety of therapeutic agents for various diseases such as infectious diseases, cancer, lipid and immune disorders. With the need to find new drugs for either well defined diseases as for new ones, the search for substances with biological activities becomes essential. Exotic sources such as marine environment, and recently the world of micro-organisms have gained great interest in the scientific community due to the fact that they were little known and explored. In this context, the objective of this study was to assess whether different fractions of marine macroalgae Bostrychia tenella and extracts of endophytic micro-organisms isolated from this species possess immunomodulatory activity on the human complement system (CS), which is recognized as one of the major effectors of the inflammatory process. Started by three distinct pathways (classical, alternative and lectin), it leads to the formation of cleavage products and activation complexes which have various important biological functions such as chemotaxis, activation of phagocytes, mast cell degranulation, cytolysis, cellular activation and apoptosis. Thereby, this system plays an important role in various inflammatory reactions, as well as various pathogenic mechanisms of tissue damage. Through the hemolytic activity assays, 10 of the initial 20 samples were selected because they were able to modulate this activity of the CS in the pool of normal human serum (NHS). The 10 samples (among fractions, subfractions and extracts of B. tenella and its endophytic micro-organisms) were able to induce the generation of fragments from C3, a central component of the CS, which was observed both in immuno electrophoresis technique and Western blotting. Also, we observed the formation of the membrane attack complex (MAC) in enzyme immunoassay, indicating that there was total activation of the CS. By the results obtained in Western blotting for fragments of C4 and Factor B was possible to identify which pathways are activated in CS, when correlated with the results of hemolytic assays for the classical/lectin (VC/VL) and alternative pathway (VA). Thus, we conclude that the 10 selected samples have immunomodulatory effects in human CS because they were able to activate it either by VC/VL or VA. It follows also that the hemolytic assay by the kinetic method is an important tool for screening, as well as Western blotting of NHS to detect fragments of the CS.

Tecidos vegetais, incluindo as sementes, são habitados por microrganismos denominados endofíticos, cuja interação com a planta pode conferir características vantajosas ao hospedeiro. Sabe-se que o crescimento de plantas é influenciado por fatores como a síntese de ácido-indolacético (AIA), solubilização de fosfato, fixação de nitrogênio e controle de fungos fitopatogênicos. Antes da comercialização, as condições de armazenamento de sementes de soja podem restringir o desenvolvimento de microrganismos devido à baixa temperatura e umidade. Esse fato leva ao interesse de exploração de microrganismos endofíticos resistentes a essas condições. O estudo e a caracterização dessas comunidades são de grande interesse agronômico e biotecnológico, sendo possível sua aplicação em sementes, introduzindo no campo plantas com superior potencial de produção. Com os objetivos de comparar a comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja geneticamente modificadas e convencionais; e de isolar e caracterizar essas comunidades, sementes de 12 cultivares de soja foram amostradas, de onde 3504 isolados bacterianos foram obtidos. Os isolados foram agrupados morfologicamente de acordo com a coloração e taxa de crescimento das colônias, sendo representantes de cada grupo morfológico (no total 176 isolados) agrupados pela técnica de ARDRA (Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado). Um total de 12 ribotipos foi observado compondo a comunidade cultivada de bactérias endofíticas de sementes de soja. Representantes destes ribotipos tiveram seus genes 16S rDNA parcialmente sequenciados, identificando os integrantes desta comunidade como: Acinetobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Curtobacterium sp., Enterobacter sp., Methylobacterium sp., Microbacterium sp., Micromonospora sp., Pantoea sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Ochrobactrum sp., Streptomyces sp. e Tsukamurella sp. A comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja provenientes de plantas genticamente modificadas apresentou uma diversidade maior comparada à comunidade bacteriana de plantas convencionais. Em relação ao potencial biotecnológico desta comunidade, os resultados demonstraram que os isolados foram capazes de controlar o crescimento de fungos fitopatogênicos por antagonismo (18%), sintetizar AIA (100%), solubilizar fosfato (39%) e fixar nitrogênio (18%). Os isolados com os melhores resultados nas análises in vitro foram inoculados em sementes de soja e avaliados em casa de vegetação quanto à habilidade de promover o crescimento das plantas. As plantas apresentaram diferentes respostas à inoculação das bactérias. A maior parte dos tratamentos mostrou influência negativa das bactéria nas plantas, enquanto que um isolado de Enterobacter sp. aumentou a massa da matéria seca de raiz. Mesmo não diferindo estatisticamente, alguns isolados mostraram tendência de aumento e outros de diminuição de biomassa da planta. / Plant tissues, including seeds, are inhabited by microorganisms called endophytes, whose interaction with the plant can offer advantages to the host. It is known that plants growth promotion is induced by indole acetic acid (IAA) synthesis, phosphate solubilization and nitrogen fixation, among others. The control of phytopathogenic fungi is also related to a good plant development. Before commercialization, the seed storage conditions can restrict the development of microorganism, due to the low temperature and humidity. This fact leads to the interest of exploring resistant microorganisms to those conditions. The study and the characterization of these communities are of great agronomic and biotechnological interest, being possible its application onto seeds, introducing in the field plants with a greater production potential. In this context, the aim of this study was to isolate and identify the endophytic bacteria community in soybean seeds and study the capacity of these isolates to promote growth in the host plant, including: phosphate solubilization, nitrogen fixation, IAA synthesize and antagonism against phytopathogenic fungi. From seeds of 12 cultivars, 3504 bacteria were isolated. The isolates were morphologically grouped according to the coloration and growth rate of the colony. Representatives of each morph group, totalizing 176, were analyzed using the Amplified Ribosomal Restriction Analysis (ARDRA) technique. A total of 12 ARDRA ribotypes were observed in the cultivable endophytic community of soybean seeds. Representatives of each ribotype had their 16S rDNA gene partially sequenced, allowing to the identification of the members of this community as: Acinetobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Curtobacterium sp., Enterobacter sp., Methylobacterium sp., Microbacterium sp., Micromonospora sp., Pantoea sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Ochrobactrum sp., Streptomyces sp. and Tsukamurella sp. The endophytic bacterial community of soybean seeds from genetically modified plants showed a greater diversity compared to the bacterial community of conventional seeds. In relation to the biotechnological potential of the community, the outcomes demonstrate that the isolates were able to antagonist phytopathogenic fungi (18%), synthesize IAA (100%), solubilize phosphate (39%) and fix nitrogen (18%). The isolates with best in vitro outcomes were inoculated onto seeds and tested in greenhouse for their ability to promote growth in soybean. The plants answered differently to the inoculation of each bacterial isolate. The major part of the treatments demonstrated a negative influence of bacteria onto plants, while one Enterobacter sp. isolate increased the dry mass weight of roots. Even not differing statistically, some isolates showed a tendency to increase, meanwhile others to decrease the biomass of the plant.

A presença de bactérias na base de microplantas estabelecidas in vitro, acarreta o descarte da cultura, tornando a técnica onerosa. Entretanto, há de se considerar que nem sempre a presença dos microrganismos afeta o desenvolvimento das plantas em diferentes fases da micropropagação, inferindo que essas colônias são resultantes de exsudações de endófitos da espécie cultivada. Neste contexto, o presente trabalho visou verificar as possíveis influências da manifestação bacteriana endofítica no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii. Para tanto, foram útilizados quatro clones (BP101; BP115, BP118 e BP120), em duas etapas de desenvolvimento: multiplicação e alongamento e, embora o processo in vitro fosse o principal foco da pesquisa, as análises estenderam-se para a fase de aclimatização, ou seja, desenvolvimento ex vitro. As microcepas foram mantidas in vitro sob dois tipos de manifestações bacterianas, as quais por sua vez, foram distintas quanto à coloração em: manifestação de colônias amarelas e manifestação de colônias brancas e, o controle, sem manifestação. Para compreender o desenvolvimento das microplantas na presença dos microrganismos, foram avaliados os parâmetros referentes ao incremento em massa seca, número de brotações, brotações alongadas e enraizamento, bem como características anatômicas e bioquímicas (produção de malondealdeído e teor de nitrogênio) das mesmas. Por meio da identificação molecular por BOX-PCR os isolados bacterianos foram agrupados e posteriormente identificados por sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. As linhagens bacterianas identificadas foram analisadas quanto à produção de AIA e fixação de nitrogênio, sendo as linhagens com os melhores resultados utilizadas na bacterização de microcepas de duas diferentes espécies de eucalipto (E. benthamii e E. cloeziana). Os resultados evidenciaram que nem toda presença microbiana in vitro é prejudicial às plantas micropropagadas, pelo contrário, observou-se que na maioria dos casos em E. benthamii, as manifestações possuem efeito neutro ou benéfico, promovendo o desenvolvimento das microplantas. As manifestações brancas e/ou amarelas constituíam uma associação de bactérias, com alta especificidade na interação endófito/microplanta. As análises moleculares identificaram similaridade com seis gêneros bacterianos: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus e Aneurinibacillus (Firmicutes), Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium, e Novosphingobium (Alphaproteobacteria), onde alguns deles mostraram-se comuns nos diferentes clones, sendo a Curtobacterium presente em todas as manifestações de todos os clones de E. benthamii analisados. Os resultados obtidos com a bacterização de diferentes espécies de eucalipto reforçam a especificidade da microbiota endofítica manifestada com seu hospedeiro, uma vez que a introdução de um isolado (inóculo) pode ocasionar alteração no equilíbrio do sistema de interação estabelecido, acarretando na redução ou simplesmente mantendo estável a taxa de crescimento das microplantas. Dessa forma, diante do atual panorama das biofábricas, as quais descartam inúmeras microplantas cultivadas in vitro em decorrência das manifestações bacterianas, evitar o descarte das microcepas e controlar sua manifestação, representa minimizar consideravelmente os prejuízos para as empresas e setores de pesquisas. / The occurrence of bacteria growing together with microplants in vitro conditions frequently lead to discard of the material, increasing the costs on the micropropagation techniques. However, the microorganisms presence on the bacterial cultures do not always affect the plant development during the different phases of micropropagation because the bacteria colony probability are originated from self microplants as endophytic manifestations. This study evaluated the possible influences of the endophytic bacterian manifestation in the development of Eucalyptus benthamii growing on in vitro conditions. To access the evaluations were used four clones (BP101, BP115, BP118 e BP120) in two phases of microplants in vitro development: multiplication and elongation. The microstumps were grown under two different kinds of bacterial manifestations, distinguishable by colors in: white colony manifestations, yellow colony manifestations and no manifestations (control). To elucidate the microstumps development under the microorganisms presence, were evaluated referent parameters to the dry mass increasing, number of shoots, elongated shoots and rooting, as well as anatomical and biochemical characteristics alterations (malondialdehyde and nitrogen content). After bacterial isolation, they were grouped and identified by BOX-PCR, using partial sequencing of 16S rRNA gene. On the sets of the identified bacteria were analyzed for the AIA production and the nitrogen fixation, and those with better results were used to bacterizate another microstumps of two different Eucalyptus species (E. benthamii and E. cloeziana). The results indicate that the presence of in vitro microrganisms and microstumps together not always affect negatively the plant development. In opposite, bacterial manifestations brought benefits, stimulating the microstumps growth or do not affecting the growth of E. benthamii in vitro conditions. Actually, the white and yellow manifestations represents clusters of different bacteria, with high specificity in the interaction microstumps and endophytic. Molecular approaches identified through similarity analysis, six bacterial genus: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus and Aneurinibacillus (Firmicutes); Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium and Novosphingobium (Alphaproteobacteria). The occurrences of several of the bacteria were common among some clones, and Curtobacterium was present in all clones of E. benthamii analyzed. The results obtained by bacterization of two different Eucalyptus species confirmed that there is a high specificity between endophytic microorganisms\" manifestations and its host plants, because the artificial bacteria introduction can causes alterations on the equilibrium of the establishment system of plant-microorganism interactions, reducing or stabilizing growth rates on microstumps. Considering the current situation about the biofactories, which usually discard great amount of cultivate microplants in vitro because of the bacterial manifestation, it´s possible avoid these plant discard and make a control of their manifestations, with the intention to minimize substantially the losses in biofactories and also in research laboratories.

Os micro-organismos que habitam o interior das plantas (endofíticos ou endófitos) tornaram-se foco de interesse por estarem envolvidos na produção de compostos químicos como enzimas, alcalóides, antibióticos, anticancerígenas e diferentes metabólitos. Os ecossistemas de regiões tropicais tem sido alvo de busca de compostos naturais por causa da riqueza de espécies e nichos ecológicos presentes nestas comunidades. O objetivo deste trabalho o isolamento, identificação e a bioprospecção de fungos endofíticos obtidos de Combretum leprosum e a detecção nos extratos de planta e micro-organismos da presença do composto combretastatin (CA4). Folhas, galhos, frutos e raízes de C. leprosum foram coletados de cinco estados dentro da zona de semiárido brasileiro: Bahia, Piauí, Ceará, Paraíba, Rio Grande do Norte. Partes das amostras foram triturados e submetidos à maceração primeiramente em diclorometano, seguidos de tetrahidrofurano e acetona de acordo com Pettit et al.(1987) para possível extração da CA4. Além disso, para avaliação in vitro da atividade citotóxica e antimicrobiana foram realizadas extrações em acetato de etila, clorofórmio e metanol. Foram detectados a possível presença da CA4 em todos os órgãos das plantas extraídos com tetrahidrofurano e as maiores concentrações foram observadas nas folhas. A atividade antitumoral dos extratos vegetais apresentaram as maiores inibições contra carcinoma (ovário IC50 10µg/mL-1, rim IC50 8,7µg/mL-1 e mama IC50 14,1µg/mL-1) e glioma.IC50 13,5µg/mL-1. A outra parte das amostras (folhas, caules e raízes) foram desinfetadas, fragmentadas e colocadas em meios de cultivo (Martin, BDA, Agar água) por 60 dias, 28°C. Foram isolados 405 fungos endofíticos e 159 apresentaram atividade contra fitopatogênicos, 72% para Rhizoctonia solani e 28% para Pythium aphanidermatum. As vinte e três linhagens que apresentaram as melhores atividades antifitopatogênicas foram submetidas a crescimento em Czapec em cultura estacionaria, por 30 dias, a 28°C, os respectivos metabólitos foram obtidos em múltiplo (3.0 e 11.0) e avaliados a atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas e fungos. Quatro linhagens foram selecionadas, identificadas pelo sequenciamento da região 18S, CFE177 como Fusarium oxysporum, CFE03 como Hypocrea koningii, linhagem CFE108 como Aspesgillus oryzae e CFE391 como Fusarium solani e avaliadas in vitro pelos testes biológicos: atividade antitumoral, antioxidante e antimicobactéria. Os compostos produzidos por A. oryzae CFE108 apresentaram potencial para bioprospecção, e de acordo com as atividade citotóxicas as maiores ações foram contra as linhagens linfoma histiocística (J744), mieloma murino (B16F10) e baixa citotóxidade para carcinoma de bexiga (ECV304) e leucemia eritroblástica humana (k562) na concentração de 1mg/mL-1. Foram isolados dois compostos: SS-XL-32-01 identificado como bis-(2-etilhexil) ftalato (DEHP) e SS-XL-20-1 identificado como fenol, 2.2 metilenobis[6-(1,1-dimetiletil)-4- etil], ambos com atividade anticâncer para células HeLa com percentual de ate 98% e 71%, de morte, respectivamente. Alem disso, a modificação através da reação de metilação do composto SS-XL-32-1 resultou na quebra do anel aromático, formação de 4 subprodutos e perda da atividade, sendo um indicativo do sitio ativo da molécula responsável pela atividade observada. Portanto, fungos endofíticos de 18 plantas do semiárido brasileiro podem ser considerados fonte de bioprospecção para novas moléculas bioativas com atividade antitumoral. / The micro-organisms that reside in the aerial tissues and roots of plants (endophytic or endophyte) became the focus of interest for being involved in the chemical production such as enzymes, alkaloids, antibiotics, anticancer and different metabolites. The ecosystems of tropical region have been targeted search of natural compounds because of the richness of species and ecological niches present in these communities. The aim of this work was the isolation, identification and bioprospection for endophytic fungi from Combretum leprosum and detection in extracts of the plant and micro-organisms for the presence of the combretastatin (CA4). Leaves, stems, fruits and roots of C. leprosum were collected from five states within the semi-arid zone of Brazil: Bahia, Piaui, Ceara, Paraiba, Rio Grande do Norte. Part of the samples were crushed and subjected to maceration in dichloromethane, followed by tetrahydrofuran and acetone according to Pettit et al. (1987) for extracting the possible CA4. Moreover, for in vitro evaluation of the cytotoxic and antimicrobial activity extractions were carried out in ethyl acetate, chloroform and methanol. Were detected the possible presence of CA4 all plant organs extracted with tetrahydrofuran and the highest concentrations were observed on the leaves. The antitumor activity of plant extracts showed the highest inhibition against carcinoma (ovary IC50 10µg/mL-1, kidney IC50 8.7 µg/mL-1 and breast IC50 14.1 µg/mL-1) glioma IC50 and 13.5 mg-/mL-1. The other part of the samples (leaves, stems and roots) were disinfected, fragmented and placed in culture media (Martin, PDA, water agar) for 60 days, 28°C. 405 Endophytic fungi were isolated and 159 showed activity against phytopathogenic, 72% for Rhizoctonia solani and 28% for Pythium aphanidermatum. Twenty-three strains that showed good activities antiphytopathogenic, were grow on medium Czapec in static culture, for 30 days at 28°C, the respective metabolites were obtained in multiples pH (3.0 and 11.0) and evaluated the antimicrobial activity against pathogenic bacteria and fungi. Four strains were selected, identified by sequencing the 18S region, CFE177 as Fusarium oxysporum, CFE03 as Hypocrea koningii, strain CFE108 as Aspesgillus oryzae and CFE391 Fusarium solani, and evaluated by in vitro biological tests: antitumor, antioxidant and antimicobactérium activity. The compounds produced by A. oryzae CFE108 had biological potential and in accordance with the cytotoxic activity, showed the highest activities against lymphoma lines (J744), murine myeloma (B16F10) and low cytotoxicity for carcinoma of the bladder (ECV304) and leukemia erythroblastic human (K562) in 1mg/mL-1 concentration. Two compounds were isolated: SS-XL-32- 01 identified as bis-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP), and SS-XL-20-1 as phenol 2.2methylenobis [6-(1,1-dimethylethyl) - 4-ethyl], both with anticancer activity for HeLa cells with a percentage of up to 98% and 71%, of death, respectively. In addition, modified by methylation reaction of the compound SS-XL-32-1 resulted in the breaking of the aromatic ring and result in formation of four product and loss of activity being indicative of the active site of the molecule can be the aromatic ring. Therefore, endophytic fungi in semiarid Brazil plant can be considered a source of bioprospection for new bioactive molecules with anticancer activity.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

Bacteriocinas são proteínas antimicrobianas produzidas por bactérias com importante papel na ecologia microbiana. Neste trabalho foram avaliados a produção e os efeitos destas proteínas numa fração da comunidade bacteriana de citros, pertencente aos gêneros Methylobacterium e Curtobacterium, isolada de Citrus sinensis (laranjeiras - plantas saudáveis, sintomáticas para CVC, assintomáticas para CVC) e Citrus reticulata (tangerina). Foi observada, para ambos os gêneros, uma alta freqüência de isolados produtores de bacteriocinas na comunidade endofíticas avaliada. Foi observado que esta freqüência foi maior em populações provenientes de plantas assintomáticas para CVC e em plantas de tangerina. Em Methylobacterium, as populações obtidas de plantas de tangerina e de plantas sintomáticas para CVC apresentaram uma maior freqüência de isolados produtores de bacteriocinas. Por outro lado, a população de Curtobacterium provenientes de plantas sintomáticas para CVC, apresentou a menor freqüência de isolados produtores bacteriocina. Proteínas de 3 isolados de C. flaccumfaciens foram parcialmente caracterizadas bioquimicamente, permitindo a sua classificação como bacteriocinas que foram denominadas de endoficinas. Uma destas bacteriocinas, a endoficina L foi escolhida para ser melhor caracterizada. A endoficina L parcialmente purificada apresentou um peso molecular estimado de 14 kDa e atividade in gel, e atingiu seu nível máximo de produção na fase estacionária e foi ativa contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo patógenos humanos e de plantas. Para a caracterização do gene envolvido na produção desta bacteriocina uma biblioteca, em cosmídeo, de fragmentos de DNA com 40 kb foi construída e um clone exibindo atividade bacteriocinogênica foi subclonado e parcialmente seqüenciado. Esta análise revelou um operon de 2,0 kb consistindo de pelo menos três genes preditos envolvidos na produção desta bacteriocina. Análises in silico sugeriram que a endoficina L deva ser uma bacteriocina do tipo toxina que pode ser uma candidata em potencial como agente no controle biológico de X. fastidiosa e outros fitopatógenos. Os resultados obtidos sugerem que, quando C. flaccumfaciens produtores de bacteriocinas estão presentes em plantas de citros podem inibir X. fastidiosa. Por outro lado, o crescimento de X. fastidiosa parece ser favorecido pela presença de Methylobacterium a qual produz bacteriocinas contra Curtobacterium. A primeira interação poderia ser mediada por bacteriocinas como a endoficina L. Sugere-se uma interação cíclica entre tais microrganismos. O conhecimento da interação entre tais bactérias endofíticas representa um avanço no entendimento dos aspectos ecológicos da interação planta-microrganismo. / Bacteriocins are antimicrobial proteins produced by bacteria, which play a role in microbial ecology. In this work we examined the bacteriocin production and it effects under a citrus bacterial communities belonged to Curtobacterium and Methylobacterium genera isolated from Citrus sinensis (sweet orangeuninfected, symptomatic, CVC-asymptomatic) and Citrus reticulata (tangerine) . We found a high levels of bacteriocin production for both genera, these frequencies were higher in asymptomatic and tangerine plants. The highest production frequencies for Methylobacterium strains were from tangerine and symptomatic plants. C. flaccumfaciens strains from symptomatic plants presented the lowest bacteriocin frequency. Proteins from three strains of C. flaccumfaciens were partially biochemically characterized and further classified as bacteriocins termed endophycins. One of them the endophycin L, was picked for deep investigation. The endophycin L partially purified had a molecular weight estimated of 14 kDa and exhibited in gel activity. Endophycin L production started at the exponential phase and reached its highest point during the stationary phase. It was capable of inhibiting the growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria, incluiding several human and plant pathogens. In order to characterize the related to this bacteriocin production. One cosmid clone containing a 40-Kb fragment from a genomic library of C. flaccumfaciens was selected for its bacteriocinogenic ability The fragment was subcloned and DNA sequencing revealed a 2-kb operon consisting of at least three putative genes related to endophycin production. In silico analyses suggested that endophycin L is a toxin-like bacteriocin, this bacteriocin could be a potential candidate as biological control agent against X. fastidiosa and other plant pathogens. The data indicated that when C. flaccumfaciens producers are present it inhibits X. fastidiosa, conversely X. fastidiosa growth seems to be favored by Methylobacterium species and the first interaction could be mediated by endophycins, such as endophycin L. Thus, we suggest a cyclic interaction among these microorganisms. We demonstrated that knowledge of the interaction among those endophytic bacteria represent an advance about plantmicroorganism ecological aspects.