Describe fagos específicos para Pseudomonas aeruginosa resistentes a antibióticos y productoras de biopelícula. Se aisló P. aeruginosa a partir de muestras de pacientes hospitalizados de dos centros de salud. Se determinó, su nivel de resistencia antibiótica, producción de biopelícula y presencia de profagos. Posteriormente se aislaron fagos nativos a partir de efluentes hospitalarios y se determinó su rango de hospedero (capacidad de infectar a cepas MDR y productoras de biopelícula). Debido a sus características morfológicas en la formación de placa y su amplio rango de hospedero, se seleccionó el fago ФMARC-GA para una caracterización microbiológica. Éste presentó un periodo de latencia de 40 minutos y un tamaño de explosión aproximado de 100 fagos, con morfotipo C1 perteneciente a la Familia Podoviridae del Orden Caudovirales. Las características del bacteriófago lo presentan como un candidato con gran potencial para fagoterapia en infecciones recalcitrantes ocasionadas por P. aeruginosa MDR y productora de biopelícul. / Tesis

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-13Bitstream added on 2014-08-13T18:00:51Z : No. of bitstreams: 1 000753071_20141210.pdf: 467641 bytes, checksum: 3558c6a799d74b315490c4c1c6a84e10 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-12-12T11:34:16Z: 000753071_20141210.pdf,Bitstream added on 2014-12-12T11:34:47Z : No. of bitstreams: 1 000753071.pdf: 2884224 bytes, checksum: a67ab29ad51d31786e60184230c3b1b2 (MD5) / Staphylococcus aureus é considerado o agente etiológico mais importante da artrite séptica. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi investigar o potencial artritogênico de cepas padrão de S. aureus produtoras de superantígenos (SAgs) e testar a eficácia terapêutica da associação entre antibiótico e imunomodulador neste modelo. Camundongos C57BL/6 machos foram inicialmente infectados pelo plexo retro-orbital com as diferentes cepas. O desenvolvimento de artrite e sua gravidade foram acompanhados por 14 dias, através das seguintes determinações: peso corporal, escore clínico e incidência de artrite, alterações histopatológicas, número de unidades formadoras de colônias, expressão local de citocinas e subpopulação células por PCR em tempo real e produção de citocinas por células esplênicas. Os resultados foram organizados em 3 manuscritos. No primeiro, comparamos a capacidade artritogênica de 5 cepas produtoras de SAgs. Constatamos que as cepas ATCC 19095 SEC+, N315 ST5 TSST-1+ e S-70 TSST-1+ determinaram artrite grave, intermediária e discreta, respectivamente. No segundo trabalho caracterizamos a artrite causada pela cepa ATCC 19095 SEC+. Este tipo de artrite se caracterizou por elevado escore clínico associado à proliferação sinovial, inflamação intensa, formação de “pannus”, destruição da cartilagem e erosão óssea. A análise da expressão local de fatores de transcrição indicou expansão acentuada de células Th1 e Th17 nas lesões. No último manuscrito, avaliamos o efeito terapêutico da combinação do antibiótico bactericida cloxacilina com o imunomodulador tacrolimus. A administração destas duas drogas foi nemos eficaz no controle da doença do que o antibiótico administrado isoladamente / Staphylococcus aureus is considered the more important etiological agent of septic arthritis. In this context, the main objective of this work was to investigate the arthritogenic capacity of standard S. aureus strains, producer of superantigens (SAgs). We also tested the therapeutic effectiveness of an association antibiotic and an immunomodulatory drug in this model. C57BL/6 male mice were initially infected by retro-orbital plexus with different strains. Development and severity of arthritis were followed during 14 days, through determination of body weight, clinical score and incidence of arthritis, histopathological changes, determination of colony forming units, evaluation of local infiltration of Th subsets by real time PCR and cytokine production by spleen cells. The results were organized in three manuscripts. In the first one we compared the arthritogenic ability of 5 S. aureus strains. We found that the strains ATCC 19095 SEC+, N315 ST5 TSST-1+ and S-70 TSST-1+ determined severe, intermediate and discrete arthritis, respectively. In the second study we characterized the arthritis caused by the ATCC 19095 SEC+ strain. This type of arthritis was characterized by high clinical scores associated with synovial proliferation, intense inflammation, pannus formation, cartilage destruction and bone erosion. In the final manuscript we evaluated the therapeutic potential of the combination bewteen cloxacilin (bactericidal antibiotic) with tacrolimus (immunomodulator). The administration of these two drugs was less effective in controlling the disease than the antibiotic alone

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-26Bitstream added on 2014-08-13T18:00:42Z : No. of bitstreams: 1 000755552_20150226.pdf: 184124 bytes, checksum: bb2e201b69490f217c49869c796c4d73 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-27T13:20:32Z: 000755552_20150226.pdf,Bitstream added on 2015-02-27T13:21:09Z : No. of bitstreams: 1 000755552.pdf: 1392942 bytes, checksum: 12832e3bab25a912a8be2d25c558be8a (MD5) / S. aureus é, sem duvida, o patógeno humano mais importante entre os estafilococos. O surgimento e a disseminação progressiva da resistência a meticilina tiveram grande impacto na terapia das infecções estafilocócicas. O mecanismo de resistência a meticilina desenvolvido por S. aureus está relacionado com a alteração das proteínas ligadoras de penicilinas, as PBPs. Os Staphylococcus. aureus produzem 5 tipos de PBPs: 1,2,3,3´, e 4. As cepas de S. aureus resistentes a meticilina produzem uma nova PBP, a PBP2a, adquirida de outras cepas de estafilococos. Diversos métodos são utilizados para detecção da resistência a meticilina no S. aureus. Dentre eles, a detecção da PBP2a por meio de métodos de aglutinação em látex utilizando anticorpo monoclonal específico dirigido para o antígeno PBP2a. Na presente pesquisa, anticorpos monoclonais murinos dirigidos contra a PP2a do S. aureus resistente a meticilina foram produzidos através de fusão celular utilizando-se células de baço de camundongos BALB/c imunizados.Cinco fusões MRSA foram realizadas e os sobrenadantes de cultura foram triados por testes Elisa indireto . Foram construídos e testados 1236 híbridos e nove híbridos se mostraram reativos após o 4º. teste de Elisa indireto. Os nove híbridos foram testados frente a diferentes bactérias para observar inibição do crescimento. Este trabalho teve como foco, a produção de anticorpo monoclonal murino para uso em testes de detecção rápida / S. aureus is, without doubt, the most important human pathogen among staphylococci. The emergence and dissemination of progressive resistance to methicillin had great impact on therapy of staphylococcal infections. The mechanism of resistance to methicillin developed by S. aureus is related to the alteration of penicillin binding proteins, the PBPs. Staphylococcus. aureus produces five types of PBPs: 1,2,3,3 ', and 4. Strains of S. aureus resistant to methicillin produce a new PBP, PBP2a the acquired from other strains of staphylococci. Several methods are used for detection of methicillin resistance in S. aureus. Among them, the detection of PBP2a by latex agglutination methods using monoclonal antibody specific for the antigen directed PBP2a. In the present study, murine monoclonal antibodies directed against the PP2A methicillin resistant S. aureus were produced by cell fusion using spleen cells from immunized BALB / c mice. Five MRSA fusions were performed and the culture supernatants were screened by testing indirect ELISA. Were built and tested in 1236 hybrids and nine of them were reactive after the 4th indirect ELISA test. The nine hybrids were tested against different bacteria to observe inhibition of growth. This work focused on the production of murine monoclonal antibody for use in rapid detection tests

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Banca: Hélio Langoni / Banca: Renata Bonini Pardo / Resumo: O presente estudo teve como objetivo o isolamento de Staphylococcus aureus e estafilococos coagulase negativos (ECN), associados com casos de mastite subclínica, a partir de amostras de leite de 134 vacas, em dez pequenas propriedades leiteiras familiares, da região de Bauru - SP, determinar a susceptibilidade a antimicrobianos e investigar a presença de genes de enterotoxinas e do gene mecA de resistência à oxacilina, dos casos de mastite subclínica, a partir das cepas bacterianas isoladas do leite dos animais, e dos tanques de resfriamento. Isolaram se 105 amostras de Staphylococcus spp, sendo 55 (52,4%) estafilococos coagulase positivos (ECP) e 50 (47,6%) ECN. Entre os ECP, S.aureus foi isolado em 48 (87,3%) dos casos. Das 12 espécies de ECN isoladas, as mais freqüentes foram S. warneri, S. hyicus, e S. xylosus. Os maiores níveis de resistência, foram observados frente ao grupo dos beta-lactâmicos tanto para os ECP - 92,7% para penicilina e 90,9% para ampicilina, como para os ECN - 56% e 52% de resistência, respectivamente. Todas amostras de ECP foram sensíveis a cefalexina, e 96% dos isolados de ECN a enrofloxacina. Em relação a presença de genes codificadores de enterotoxinas, dos casos de mastite subclínica, 17/142 (12%) foi positiva para algum dos genes estudados. O gene sea foi o mais prevalente, sendo detectado em 11 (7,7%). O gene seb em 05 (3,5%) e o sec em 01 (0,7%) das amostras. Todas foram negativas para o gene sed. Dos Staphylococcus spp isolados das mastites subclínicas, houve detecção do gene sec em 8/105 (7,6%), sendo que cinco (4,7%) eram ECP, e três (2,8%) ECN. Das 10 amostras de leite dos tanques, duas (20%) foram positivas para sea e uma (10%) para seb. O gene mecA foi detectado em três cepas de S. aureus, (6,2%). A identificação de genes codificadores de enterotoxinas em casos de mastite subclínica e em tanques comunitários, sinalizam a importância do monitoramento destes agentes visando a... / Abstract: This study aimed at the isolation of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci, from bovine milk samples, associated with cases of subclinical mastitis detected in ten small properties from Bauru - SP. Also, determine the antimicrobial susceptibility of the agents isolated and to investigate the presence of enterotoxin gene and the mecA gene of oxacillin resistance from the bacterial strains, and milk samples from bulk tanks . Of 105 samples obtained, 55 ( 52.4 %) were coagulase positive staphylococcus (CPS) and 50 (47.6%) coagulase negative staphylococcus (CNS). Among the CPS, S. aureus was isolated in most cases, 48 ( 87.3 %). Of the 12 CNS species isolated, the most frequent were S. warneri, S. hyicus, both with 8 (16%) and S. xylosus 7 (14%) . The highest levels of antibiotics resistance were observed for the group of β - lactam antibiotics - penicillin 92.7% and ampicillin 90.9% CPS and ECN - 56 % and 52 % respectively. The greatest sensitivity of the CPS strains was to cephalexin, and for CNS isolates to enrofloxacin. From the cases of subclinical mastitis, genes encoding enterotoxins were found in, 17/142 (12%) . The sea gene was the most prevalent being detected in 11 ( 7.7 %). The seb gene was detected in five (3.5%) samples, and in one sec (0.7%). All were negative for sed gene. When we consider the results directly from cultures of Staphylococcus spp. isolated from subclinical mastitis, there was only the gene sec in 8/105 (7.6%).From these isolates of Staphylococcus spp., positive for sec 05/105 (4.8%) were CPS, (03 S. aureus and 02 S.intermedius) and 03/105 (2.8%) CNS, (01 S. xylosus, 01 S.hyicus and 01 S.lugdunensis). To sea, seb and sed samples were negative. Of the ten samples from the bulk tanks, 02/10 (20%) were positive for sea and 01/10 (10%) to seb. The mecA gene was detected in three strains of S. aureus, representing 6.2% of the total of 48 S. aureus strains isolated. The identification ... / Mestre

Orientador: Helio Langoni / Banca: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: Nilson Robeti Benites / Resumo: Alguns dos agentes patogênicos de mastite bovina são relevantes em relação à qualidade do leite, bem como, para a saúde pública. Foram estudadas dez fazendas localizadas em cinco regiões do estado de São Paulo. Foram examinadas 1.148 vacas, correspondentes a 4.592 glândulas mamárias avaliadas pelos testes de tamis e CMT. Foram colhidas 1.318 amostras de leite, das vacas positivas na triagem para avaliação microbiológica e contagem de células somáticas (CCS). A frequência dos agentes variou de 0,3 a 36,4%. Do total de isolados de Staphylococcus spp (36,4%), 48,7% corresponderam a estafilococos coagulase negativa (SCN), 34,2% S. aureus e 15,9% outros estafilococos coagulase positiva (SCP). Streptococcus spp foram isolados de 23,3% das amostras, dos quais 41,7% Streptococcus. agalactiae, 41,1% Streptococcus dysgalactiae e 17,3% Streptococcus uberis. Corynebacterium spp. foram isolados em 31,8% dos casos de mastite. As amostras de leite das glândulas mamárias infectadas apresentaram CCS significativamente mais elevada que as negativas. Dos 48,7% de SCN foram identificadas 18 espécies: S. warneri, S. epidermidis, S. hyicus, S. xylosus, S. haemolyticus, S. auriculares, S. cohnii subsp cohnii, S. lugdunensis, S. pasteuri, S. saccharolyticus, S. saprophyticus subsp bovis, S. schleiferi subsp scheleiferi, S. simulans, S. saccharolyticus, S. capitis, S. saprophyticus subsp saprophyticus, S. sciuri subsp sciuri e S. chromogenes. As fazendas, II (27,3%) e III (26,7%) apresentaram maior frequência de SCN, enquanto as fazendas I (13,3%) e X (44,4%) revelaram maior prevalência de SCP sendo as diferenças significantes. Foram avaliados por PCR 263 estafilococos para detecção de gene codificadores das enterotoxinas clássicas. Entre os SCN foram detectados: sea (35,5%) seb (7,1%), sec (6,5%), sed (1,8%) e associações destes genes. Em SCP foram detectados: sea (9,5%) seb (4,4%)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The purpose of this study was to assess the occurrence of mastitis cases in ten Brazilian dairy herds located in five regions in São Paulo state, to characterize the main etiological agents and, to proceed staphylococcal isolates identification to species level, to perform detection by PCR assays of enterotoxin encoded genes aiming the awareness of their potential capability in producing the classical enterotoxins and, mecA a methicilin resistance gene and, evaluated resistance toward antimicrobials. A total of 4,592 mammary glands of 1,148 dairy cows were examined by strip cup and CMT. From these 1,318 milk samples were collected for microbiological exams. It was isolated 263 (19.9%) staphylococci from mastitis cases and they were identified, as being: S.aureus (34.2%), other CPS (15.9%) respectively, S. intermedius (15.2%), S.hyicus(12.9%) and, S. schleiferi subsp coagulans(3.8%), and CNS (48.7%). Among these 128 CNS isolates eighteen species were identified: S. xylosus, S. haemolyticus, S. auriculares; S. cohnii subsp cohnii, S. lugdunensis, S. pasteuri, S. saccharolyticus, S. saprophyticus subsp bovis, S. schleiferi subsp scheleiferi, S. simulans, S. capitis, S. saprophyticus subsp saprophyticus, S. sciuri subsp sciuri and, S. chromogenes. The more frequently isolated species were: S.warneri (31.3%), S. epidermidis (14.8%) and S.hyicus (12.5%). The milk samples from infected mammary glands showed higher CCS than the negatives. PCR assay was used to determine the presence of classical enterotoxin codifying genes (sea, seb, sec and sed). Among CNS the occurrence of enterotoxin classical genes was determined as: 35.1% for sea, 7.1% for seb, 6.5% for sec, 1.8% for sed) 5.3% for both sea and seb, 3.6% for both sea, sec and sed, 1.8% for both sec and sed. Whereas among CPS isolates the occurrence of enterotoxin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-23T21:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 263770.pdf: 3998274 bytes, checksum: 425226ccd7df05c5e380b6db8a2580d6 (MD5) / Staphylococcus xylosus é um microrganismo envolvido na fermentação de produtos cárneos e produtor de lipases extracelulares, que catalisam a hidrólise e a síntese de ésteres formados por glicerol e ácidos graxos e são ferramentas valiosas em biotecnolgia. O objetivo deste trabalho foi clonar, expressar e purificar lipase recombinante de uma linhagem de Staphylococcus xylosus isolada de lingüiça colonial produzida no sul do Brasil. A extração de DNA foi realizada a partir de linhagens de S. xylosus isoladas de lingüiça colonial e de uma linhagem padrão de S. xylosus (ATCC 29971). Os fragmentos correspondentes a região madura da lipase (AF208229) foram amplificados (1,1 kb) e clonados em plasmídio pGEM-T Easy. As seqüências obtidas apresentaram homologia de 99% com o gene de lipase de S. xylosus AF208229. Estes fragmentos que correspondem à região de codificação da lipase madura foram inseridos em um plasmídeo pET14b para construir as proteínas-fusão. As proteínasfusão foram expressas em E. coli e purificadas em coluna de afinidade por metal imobilizado de níquel. As proteínas purificadas apresentaram atividade de lipase usando ésteres de p-nitrofenilpalmitato e p-nitrofenilbutirato como substratos. Desta forma, a lipase obtida a partir de Staphylococcus xylosus apresenta potencial de aplicabilidade na indústria de embutidos cárneos fermentados. Entre as bactérias predominantes envolvidas em doenças transmitidas por alimentos está a bactéria Staphylococcus aureus que produz enterotoxinas nos alimentos provocando intoxicação gastrintestinal. Os objetivos da pesquisa foram avaliar a contaminação por estafilococos coagulase positiva (ECP) em produtos cárneos e derivados de leite comercializados em Santa Catarina e detectar por PCR multiplex a presença dos genes que codificam as enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE e gene específico para espécie S. aureus. Foram coletadas 72 amostras de alimentos entre queijos tipo mussarella (15), prato (15) e colonial (15), lingüiça colonial (18) e salaminho (09) em estabelecimentos comerciais na região do Alto Uruguai Catarinense em Santa Catarina. Foram realizadas a contagem de estafilococos coagulase positiva (ECP) e a detecção por PCR dos genes específicos para S. aureus (femA) e para os genes (sea, seb, sec, sed e see) das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE, a partir do DNA extraído de 102 cepas isoladas das amostras. A presença de ECP foi detectada em 33 amostras (45,8%) de produtos de origem animal analisadas e as contagens de ECP estavam acima do valor máximo permitido pela legislação (103 UFC.g-1) em 22 amostras (30,5%). De 102 cepas isoladas ECP, para 91 (89,2%) cepas ocorreu a amplificação do gene femA. A amplificação dos genes sea, sed e see que codificam as enterotoxinas, ocorreu em 10, 12 e 4 cepas, respectivamente. Os resultados do presente trabalho confirmam que a PCR multiplex é um método rápido e sensível para análise de varredura de Staphylococcus coagulase positiva interotoxigênico, sendo altamente específica. Este trabalho sugere que os produtos analisados podem conter as enterotoxinas SEA, SED e SEE e aponta a necessidade de melhoria na produção e nos sistemas de fiscalização dos produtos analisados. Staphylococcus xylosus causes fermentation in meat products and produces extracellular lipases which catalyze hydrolysis and synthesis from esters formed by glycerol and fatty acids. These lipases are also valuable tools to biotechnolgy. The aim of this work was cloning, sequencing and express a S. xylosus recombinant lipase. The DNA extraction was made from S. xylosus strains isolated from artisanal salami and from a S. xylosus standard strain (ATCC 29971). Fragments corresponding to a mature lipase (AF208229) were amplified (1.1 kb) and cloned into pGEM-T Easy plasmid. The sequences obtained showed 99% homology with the lipase gene of S. xylosus AF208229. Fragments corresponding to the mature region of lipase were inserted into a pET14b plasmid to build fusion proteins containing histidine tail. Fusion-proteins were expressed into E. coli and then purified with nickel affinity column. Purified proteins showed lipase activity using p-nitrophenilpalmitate and p-nitrophenilbutirate esters as substrates. The lipase obtained from Staphylococcus xylosus has a potential applicability in the fermented meat industry. The other organism studied was Staphylococcus aureus which is involved in food diseases and produce enterotoxins in food causing gastrointestinal poisoning. Contamination by coagulase-positive Staphylococci (CPS) in meat and milk-derived products commercialized in Santa Catarina, Brazil was evaluated and the presence of genes for classical staphylococcal enterotoxins A, B, C, D and E (sea, seb, sec, sed and see) and for gene femA, specific por S. aureus species, by multiplex PCR, detected. A total of 72 food samples including mozzarella (15 samples), American cheese (15 samples), colonial cheese (15 samples), colonial sausage (18 samples) and salaminho (09 samples) were analised. Of 102 strains isolated CPS, for 91 (89.2%) strains of gene amplification occurred at fema. The amplification of genes sea, sed and see coding for enterotoxins, occurred in 10, 12 and 4 strains, respectively. Results of the present work confirm that multiplex PCR is a rapid and sensitive method for screening of enterotoxigenic coagulase-positive Staphylococci, being highly specific. Results also indicate that better hygiene practices and better inspection are required in the production of the foods included in the study.

Orientador: Oswaldo Durival Rossi Júnior / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago / Resumo: Com o objetivo de avaliar as condições higiênicas e sanitárias de carcaças congeladas de perus, temperadas, foram colhidas 63 amostras no comércio varejista da região nordeste do Estado de São Paulo, levadas ao Laboratório de Análise de Alimentos de Origem Animal e Água, Campus de Jaboticabal, SP, e submetidas à determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais, coliformes termotolerantes e Escherichia coli, à quantificação de microrganismos heterotróficos mesófilos, psicrotróficos, Staphylococcus spp., Staphylococcus coagulase positivo e Staphylococcus aureus, e também à pesquisa e tipificação de bactérias do gênero Salmonella, bem como identificar, in vitro, os antimicrobianos mais eficazes contra os microrganismos isolados. Todas as 63 amostras analisadas mostraram-se de acordo com os padrões microbiológicos estabelecidos na RDC 12/2001 da ANVISA, com limite de 104NMP/g para população de coliformes termotolerantes. Em nenhuma das 63 amostras analisadas foi identificado Staphylococcus aureus e também não foram encontrados microrganismos do gênero Salmonella. Os resultados atribuem condições higiênicas e sanitárias satisfatórias às carcaças congeladas de peru, temperadas, comercializadas no varejo da região nordeste do Estado de São Paulo. Entretanto, cuidados devem ser tomados pelo consumidor no sentido de garantir que os produtos não sejam expostos a temperaturas acima da refrigeração que permitam a multiplicação dos microrganismos presentes, especialmente dos Staphylococcus coagulase positivo, que apesar de não serem estabelecidos limites populacionais para estes microrganismos na legislação vigente para este produto, se apresentaram em populações moderadamente elevadas, constituindo risco caso sejam mantidos em condições de refrigeração inadequadas / Abstract: This research aims to evaluate the hygienic and sanitary conditions of frozen carcasses of turkeys, temperated, 63 samples were taken at retail in the northeastern region of São Paulo, brought to the Food Analysis Laboratory of Animal Origin and Water, Jaboticabal, SP, and the samples were submitted to different determinations: populations of mesophilic aerobic bacteria and psychotropics, Staphylococcus spp., coagulase positive Staphylococcus and Staphylococcus aureus enumeration, Most Probable Number (MPN) of total coliforms, thermotolerant coliforms and Escherichia coli, as well as to research and typing bacteria of the genus Salmonella, and identify, in vitro, the most effective antibiotics against the isolated microorganisms. All 63 samples were found according to the microbiological standards established in the RDC 12/2001 ANVISA, on limit 104NMP/g for thermotolerant coliform population. In the 63 samples were not identified Staphylococcus aureus and also microorganisms of the genus Salmonella. The results gave satisfactory sanitary conditions to frozen carcasses of turkey, temperated, sold in outlets in the northeastern region of São Paulo. However, cares must be taken by the consumers to ensure that the products are not exposed to temperatures above refrigeration that allow the multiplication of microorganisms, especially Staphylococcus coagulase positive, although there isn't population limits for these microorganisms in the current legislation for this product, presented at moderately high populations, constituting a risk if they are kept in conditions of inadequate cooling / Mestre

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:29:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 291568.pdf: 1333481 bytes, checksum: f8c41a5a2b2bda0cd5784e17c15d7081 (MD5) / O aumento crescente de bactérias resistentes devido a múltiplos fatores, incentiva à busca por novas substâncias farmacologicamente ativas contra estes patógenos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade ntimicrobiana de 34 chalconas e de 10 hidrazonas contra 14 cepas de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), coletadas em mbiente hospitalar da Grande Florianópolis. Como controle, foi utilizada a cepa de S. aureus ATCC 25923. Inicialmente, a resistência à meticilina foi verificada através do método de difusão radial em ágar, no qual todas as cepas recebidas foram testadas frente aos antimicrobianos oxacilina (6µg) e cefoxitina (30µg). Foi realizada a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), a fim de detectar a presença do gene mecA, o estudo molecular foi complementado com o uso da amplificação randômica do DNA (RAPD), a fim de determinar o grau de correlação entre as cepas. As cepas confirmadas como sendo MRSA, juntamente com as cepas referência de S. aureus (ATCC 25923) e E. coli (ATCC 25922) foram avaliadas frente às chalconas e às hidrazonas através da determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM), pelo método de microdiluição em caldo. A CIM e a CBM foram consideradas as menores concentrações das substâncias-teste necessárias para inibir o crescimento ou provocar a morte bacteriana, respectivamente. Ambas foram expressas em µg/mL. Além disso, os compostos bioativos foram avaliados quanto à sua citotoxicidade in vitro. A análise do potencial citotóxico foi realizada em culturas de células da linhagem celular VERO, através do método colorimétrico com sal de tetrazólio (MTT). Os resultados foram expressos como a concentração de cada amostra, que reduziu em 50% a viabilidade celular (CC50). O cálculo de índice de seletividade (IS) foi realizado para que pudesse ser observado se os compostos foram tóxicos nas concentrações mínimas de inibição. Com isso, foi possível concluir que as hidrazonas apresentam melhor IS do que as chalconas, o que indica que são compostos com maior perspectiva de virem a se tornar futuros fármacos. De todos os compostos testados, as hidrazonas G6 e F29 apresentaram os menores valores de CIM, bem como os melhores índices de seletividade. Com relação a caracterização genotípica das cepas estudadas, ficou evidente que o gene mecA foi encontrado na maioria das cepas de MRSA, e enquanto que o RAPD revelou que a maioria das cepas utilizadas são correlacionadas evolutivamente. Conclui-se, portanto, que das 44 substâncias testadas, cinco são substâncias promissoras como novos antimicrobianos e os estudos químicos e microbiológicos com as mesmas devem ser continuados. / Increase in antibiotic resistance due to multiple factors encourages the search for new compounds active against multiresistant pathogens. The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial activity of thirty-four chalcones and ten hydrazones against fourteen strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), obtained in hospitals of the Great Florianópolis area (Southern Brazil). S. aureus strain ATCC 25923 was used as control. Initially, the resistance to methicillin was detected by the method of radial diffusion in agar, in which all strains were tested against the antimicrobials oxacillin (6µg) and cefoxitin (30µg). Polymerase chain reaction (PCR) was employed to detect the mecA gene. The molecular analysis was completed using the Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) technique. Strains confirmed as MRSA, along with reference strains of S. aureus (ATCC 25923) and E. coli (ATCC 25922) were evaluated against the hydrazones and chalcones by determining the minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) by the broth microdilution method. The MIC and MBC were considered the lowest concentrations necessary to inhibit the growth or destroy the bacteria, respectively. Both measurements were expressed in µg/mL. Furthermore, the bioactive compounds were evaluated for their cytotoxicity in vitro. The analysis of the cytotoxic potential was performed in Vero cell cultures using a colorimetric method with tetrazolium (MTT). The results were expressed as the concentration of each sample, which reduced cell viability by 50% (CC50). Afterward, the selectivity index (IS) was calculated to determine if the compounds were toxic at minimal inhibitory concentrations. Based on this result it was possible to conclude that the hydrazones have better IS than the chalcones. This suggests that these compounds are more prominent than the chalcones to become potential therapeutical drugs. The hydrazones G6 and F29 had the lowest values for CIM and were also among the compounds that showed the highest levels of selectivity. Furthermore, the genotypic characterization of the strains revealed that the mecA gene was found in the majority of the strains of MRSA and RAPD, suggesting that most of the strains studied are evolutionarily related. It can be concluded that from the 44 compounds testes, five are potentially promising, including antibiotic-like substances and new chemical, and that microbiological studies to better evaluate these compounds should be continued.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-09T17:34:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 600983 bytes, checksum: 57f40ff8db17591f365dcca60f5db080 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-09T17:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 600983 bytes, checksum: 57f40ff8db17591f365dcca60f5db080 (MD5) Previous issue date: 2005-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi determinar a ocorrência de S taphylococcus spp. no ar, nas superfícies de equipamentos e nas mãos de manipuladores de ambientes de recepção, pasteurização, embalagem e produção de doce de leite, manteiga, queijos e iogurtes de um laticínio. A técnica de impressão em ágar foi empregada para quantificar o grau de contaminação do ar. A técnica de swab foi empregada para a contagem desses microrganismos nas superfícies e nas mãos dos manipuladores. Estafilococos isolados dos ambientes foram identificados e submetidos ao teste de produção e identificação de enterotoxinas SET-RPLA (OXOID ®) dos tipos A, B, C e D. A capacidade de adesão de quatro espécies de estafilococos produtores e pauciprodutores de enterotoxinas foi avaliada em superfícies de polipropileno, polietileno de baixa densidade, aço inoxidável AISI 304 #4 e vidro, por meio de microscopia de epifluorescência. Não foi verificada diferença significativa (p>0,05) entre as médias do logaritmo do número médio de Staphylococcus spp. para o ar dos ambientes, cujo número atingiu 0,6 log UFC.m-3. Essa diferença também não foi constatada para superfícies (1,01 log UFC.cm-2) e para mãos dos manipuladores (1,83 log UFC.mão-1). Dos 137 isolados de Staphylococcus spp., 46 foram provenientes do ar, 40 das superfícies e 51 das mãos dos manipuladores. As espécies mais freqüentes, acima de 10% do total de isolados, no ar e nas superfícies foram S. xylosus, S. lentus e S. aureus. Os isolados das mãos dos manipuladores, de S. epidermidis, além de S. aureus e S. xylosus, foram também identificados com porcentual acima de 10%. Dezessete isolados (12,4%) produziram pelo menos um dos tipos de enterotoxina. Isolados coagulase negativa de S. haemolyticus, S. sciuri e S. saprophyticus provenientes do ar produziram toxinas A, B C e D; entretanto, S. epidermidis produziu os tipos A e D, e uma outra estirpe produziu os tipos A, C e D. As espécies S. lugdunenensis, S. capitis e S. xylosus, isoladas de equipamentos, também coagulase negativa, produziram todos os tipos de toxina. S. hominis, isolado das mãos dos manipuladores, produziu as toxinas A, B e C, enquanto o isolado de S. capitis produziu os quatro tipos. Dentre os três isolados de S. epidermidis, um não produziu a toxina tipo C, e as demais produziram os tipos A, B, C e D. Para os estudos de adesão selecionaram-se S. epidermidis, isolado do ar do ambiente , e S. xylosus, isolado da superfície dos equipamentos, ambos produtores das quatro enterotoxinas, além de dois isolados das mãos dos manipuladores; um deles, S. saprophyticus, produtor de quatro enterotoxinas, e o outro, S. aureus, não-produtor de toxina. Observou-se que os isolados aderiram a todas as superfícies avaliadas. Não houve diferença significativa (p>0,05) no grau de adesão para as superfícies, constatando-se médias de 5,75 log UFC.cm-2 e 5,68 log UFC.cm-2, 5,87 log UFC.cm-2 e 5,84 log UFC.cm-2 para polipropileno, polietileno de baixa densidade, aço inoxidável ASI 304 #4 e vidro, respectivamente. Houve diferença significativa (p<0,05) quanto ao grau de adesão dos microrganismos avaliados. S. epidermidis apresentou menor capacidade de adesão em polietileno de baixa densidade (5,16 log UFC.cm-2) e os isolados S. aureus (5,88 log UFC.cm-2), S. xylosus (5,97 log UFC.cm-2) e S. saprophyticus (5,72 log UFC.cm-2) não diferiram entre si. / Staphylococcus spp. isolated in the air, in the food contact surfaces and in the manipulators at processing areas in a dairy plant, including milk reception, packaging, and pasteurization rooms, rooms where cheese, yogurt, butter and “doce de leite” (Latin American typical treat made of concentrated milk and sugar), were evaluated. The impression technique in agar using air sampler was used to quantify the degree of contamination of the air, in UFC.m-3. For the swab technique was determined the counting of those microorganisms in the surfaces, expressed in UFC.cm-2 and in the manipulators expressed in UFC/hand. The staphylococci isolated of air were submitted the biochemical identification by the system API Staph (BIOMERIEUX®) and the to the production and identification of enterotoxins test SET-RPLA (OXOID®), that it detects the types A, B, C and D of the enterotoxins. Also, It was evaluated the ability of adhesion of four species of producing staphylococci and low- enterotoxin-producing, based in their identification with biochemical characteristics, above 90% degree of identification, in polypropylene, low density polyethylene, stainless steel AISI 304 #4 and glass surfaces, by using epifluorecence microscopy (LEICA DC 300F). There were not differences (p>0.05) between the averages of the logarithm of the number of Staphylococcus spp. for the air, with average of 0.6 log UFC.m-3. That difference, also, was not significant for surfaces (1.01 log UFC.cm-2) and for manipulators (1.83 log UFC.mão-1). For the 137 isolated of Staphylococcus spp., only 46 were from the air, 40 of the surfaces and 51 of the manipulators. Above 10%, the most frequent species, in the air and in the surfaces they were S. xylosus, S. lentus and S. aureus. For manipulators, the species S. epidermidis, besides S. aureus and S. xylosus were also identified with percentage above 10%. Seventeen isolated (12.4%) produced at least one of the enterotoxin types. In the air, the isolated negative coagulase S. haemolyticus, S. sciuri and S. saprophyticus produced toxins A, B C and D. The S. epidermidis produced the types A and D and another strains produced the types A, C, D. For the surfaces of equipments, the species S. lugdunenensis, S. capitis and S. xylosus also negative coagulase produced all of the toxin types. In the manipulators' hands, to the isolated identified like S. hominis produced three types of toxins A, B, C while isolated S. capitis produced the four identified types for the method. By the way three of the isolated of S. epidermidis, only one did not produce the toxin type C, while the others produced the types A, B, C and D. For the adhesion studies they were selected isolated S. epidermidis obtained of the atmosphere air, S. xylosus originating from surface of equipments, both producing four enterotoxinas types, besides isolated from manipulators; one was S. saprophyticus, producing of four enterotoxins and another was S. aureus no toxin producer. All the isolated adhered to the surfaces evaluated. There was not difference (p>0.05) for the adhesion in the surface e evaluated with averages of 5.75 log UFC.cm-2 and 5.68 log UFC.cm-2, 5.87 log UFC.cm-2 and 5.84 log UFC.cm-2 for polypropylene, polyethylene of low density, stainless steel ASI 304 #4 and glass, respectively. There was difference (p<0.05) in the adhesion of the microorganisms evaluated. S. epidermidis presented lower adhesion capacity in polyethylene of low density (5.16 log UFC.cm-2), isolated S. aureus (5.88 log UFC.cm-2) and S. xylosus (5.97 log UFC.cm-2) and S. saprophyticus (5.72 log UFC.cm-2), they did not differ amongst themselves.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:28:56Z : No. of bitstreams: 1 000849670.pdf: 1421991 bytes, checksum: 5b10092e2a2350f4d4a5b9c0411c1341 (MD5) / O presente estudo teve como objetivo o isolamento de Staphylococcus aureus e estafilococos coagulase negativos (ECN), associados com casos de mastite subclínica, a partir de amostras de leite de 134 vacas, em dez pequenas propriedades leiteiras familiares, da região de Bauru - SP, determinar a susceptibilidade a antimicrobianos e investigar a presença de genes de enterotoxinas e do gene mecA de resistência à oxacilina, dos casos de mastite subclínica, a partir das cepas bacterianas isoladas do leite dos animais, e dos tanques de resfriamento. Isolaram se 105 amostras de Staphylococcus spp, sendo 55 (52,4%) estafilococos coagulase positivos (ECP) e 50 (47,6%) ECN. Entre os ECP, S.aureus foi isolado em 48 (87,3%) dos casos. Das 12 espécies de ECN isoladas, as mais freqüentes foram S. warneri, S. hyicus, e S. xylosus. Os maiores níveis de resistência, foram observados frente ao grupo dos beta-lactâmicos tanto para os ECP - 92,7% para penicilina e 90,9% para ampicilina, como para os ECN - 56% e 52% de resistência, respectivamente. Todas amostras de ECP foram sensíveis a cefalexina, e 96% dos isolados de ECN a enrofloxacina. Em relação a presença de genes codificadores de enterotoxinas, dos casos de mastite subclínica, 17/142 (12%) foi positiva para algum dos genes estudados. O gene sea foi o mais prevalente, sendo detectado em 11 (7,7%). O gene seb em 05 (3,5%) e o sec em 01 (0,7%) das amostras. Todas foram negativas para o gene sed. Dos Staphylococcus spp isolados das mastites subclínicas, houve detecção do gene sec em 8/105 (7,6%), sendo que cinco (4,7%) eram ECP, e três (2,8%) ECN. Das 10 amostras de leite dos tanques, duas (20%) foram positivas para sea e uma (10%) para seb. O gene mecA foi detectado em três cepas de S. aureus, (6,2%). A identificação de genes codificadores de enterotoxinas em casos de mastite subclínica e em tanques comunitários, sinalizam a importância do monitoramento destes agentes visando a... / This study aimed at the isolation of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci, from bovine milk samples, associated with cases of subclinical mastitis detected in ten small properties from Bauru - SP. Also, determine the antimicrobial susceptibility of the agents isolated and to investigate the presence of enterotoxin gene and the mecA gene of oxacillin resistance from the bacterial strains, and milk samples from bulk tanks . Of 105 samples obtained, 55 ( 52.4 %) were coagulase positive staphylococcus (CPS) and 50 (47.6%) coagulase negative staphylococcus (CNS). Among the CPS, S. aureus was isolated in most cases, 48 ( 87.3 %). Of the 12 CNS species isolated, the most frequent were S. warneri, S. hyicus, both with 8 (16%) and S. xylosus 7 (14%) . The highest levels of antibiotics resistance were observed for the group of β - lactam antibiotics - penicillin 92.7% and ampicillin 90.9% CPS and ECN - 56 % and 52 % respectively. The greatest sensitivity of the CPS strains was to cephalexin, and for CNS isolates to enrofloxacin. From the cases of subclinical mastitis, genes encoding enterotoxins were found in, 17/142 (12%) . The sea gene was the most prevalent being detected in 11 ( 7.7 %). The seb gene was detected in five (3.5%) samples, and in one sec (0.7%). All were negative for sed gene. When we consider the results directly from cultures of Staphylococcus spp. isolated from subclinical mastitis, there was only the gene sec in 8/105 (7.6%).From these isolates of Staphylococcus spp., positive for sec 05/105 (4.8%) were CPS, (03 S. aureus and 02 S.intermedius) and 03/105 (2.8%) CNS, (01 S. xylosus, 01 S.hyicus and 01 S.lugdunensis). To sea, seb and sed samples were negative. Of the ten samples from the bulk tanks, 02/10 (20%) were positive for sea and 01/10 (10%) to seb. The mecA gene was detected in three strains of S. aureus, representing 6.2% of the total of 48 S. aureus strains isolated. The identification ...