Orientador: Nelson Horacio Pezoa Garcia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T13:00:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Efraim_Priscilla_D.pdf: 3005113 bytes, checksum: 644805cbb4b729e262d0a9e849b572b8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho buscou contribuir com o Programa Brasileiro de Melhoramento Genético de Cacau por meio do processamento e caracterização dos principais derivados de nove clones estudados e utilizados comercialmente na Bahia por sua resistência à vassoura-de-bruxa: CEPEC 42, EET 397, TSA 654, TSA 656, TSAN 792, TSH 516, TSH 565, TSH 774, TSH 1188 e do cacau Comum, tradicional na região e suscetível à doença. Os frutos foram colhidos em um mesmo período, fermentados simultaneamente em lotes de 50 Kg e secos naturalmente ao sol. As amêndoas obtidas foram quebradas em nibs, que foram torrados em 3 diferentes tempos em forno elétrico rotativo a 150 ºC e moídos até 25 µm para obtenção dos liquors. A análise sensorial de preferência definiu o tempo de torração de cada material. A manteiga de cacau foi obtida por prensagem hidráulica dos liquors. Chocolates amargos foram produzidos pelo método convencional. A caracterização física dos frutos e sementes demonstrou diferenças entre os materiais quanto ao peso total dos frutos e rendimento de sementes com polpa por fruto. O monitoramento de temperatura e pH da massa em fermentação e a avaliação dos teores de umidade, atividade de água, pH, acidez total titulável, açúcares, ácidos orgânicos, proteínas, compostos fenólicos totais e da contagem microbiológica, durante a fermentação e ao término da secagem, demonstraram que a evolução do processo fermentativo foi distinta para cada material. A caracterização da manteiga de cacau quanto à composição em triacilgliceróis e curva de sólidos indicou que os todos os cultivares estudados, exceto o TSH 774, apresentaram melhorias em relação ao cacau Comum. A análise sensorial descritiva quantitativa dos liquors por duas equipes treinadas e de aceitação dos chocolates, por painel não treinado de consumidores, indicaram diferenças entre os materiais para alguns atributos avaliados de acordo com sua ascendência genética, sendo que os materiais descendentes dos grupos Trinitário e Forastero apresentaram maior preferência em relação aos descendentes apenas do grupo Forastero. Apesar das diferenças físicas e químicas verificadas nos liquors e chocolates, observou-se a viabilidade industrial de todos dos materiais estudados. Estudou-se ainda a influência da mistura de 0, 30, 50 e 100% de sementes danificadas pela vassoura-de-bruxa com sementes sadias na fermentação às características de amêndoas, liquors, manteiga e pó de cacau obtidos. Os perfis de temperatura e pH da massa em fermentação, os teores de açúcares e ácidos orgânicos e a análise da fração volátil demonstraram que reações que normalmente ocorrem na fermentação podem ter se iniciado nos frutos, antes da colheita. O teor de polifenóis totais das sementes danificadas foi maior que o de sementes sadias, porém, as perdas na fermentação foram maiores. Os teores de lipídios e proteínas das amêndoas e liquors foram menores quanto maior a proporção de sementes danificadas. A vassoura-de-bruxa não causou alterações nas propriedades físicas e químicas avaliadas nas manteigas de cacau. A análise da fração volátil das sementes, amêndoas e liquors indicou que o aumento do teor de sementes danificadas levou à diminuição ou ausência de importantes alquilpirazinas, indicando que o uso destas, nas porcentagens estudadas, pode prejudicar a qualidade sensorial dos derivados de cacau / Abstract: The aim of this study was to contribute with the Brazilian Genetic Improvement Program of cocoa by processing and characterizing the main cocoa-derived products from nine clones studied and used commercially in Bahia due to their resistance to ¿witches¿ broom¿: CEPEC 42, EET 397, TSA 654, TSA 656, TSAN 792, TSH 516, TSH 565, TSH 774, TSH 1188 and Comum cocoa, traditional in the area and susceptible to the disease. The fruits were harvested in the same period, fermented in 50 kg batches and sun-dried. The cocoa beans obtained were broken into nibs, roasted during 3 different times in a rotative electric oven at 150ºC and milled to 25 µm to obtain the liquors. A preference sensory evaluation defined the specific roasting time for each material. Cocoa butter was obtained by hydraulic pressing of the liquors. Bitter chocolates were produced by the conventional method. The physical characterization of the fruits and seeds demonstrated differences among the materials regarding total weight of the fruits and yield of seeds with pulp per fruit. Temperature and pH monitoring of the mass during fermentation and evaluation of moisture content, water activity, pH, total acidity, sugars, organic acids, proteins, total phenolic compounds and microbiological count during fermentation and at the end of drying demonstrated that the evolution of the fermentation process was different for each material. The triacylglycerol composition and the solid fat content of the cocoa butters from all the cultivars studied, except TSH 774, presented improvements compared to Comum cocoa. The quantitative descriptive analysis of the liquors carried out by two trained panels and the acceptance of the chocolates by an untrained consumer panel indicated differences for some of the parameters evaluated among the materials studied according to their genetic ascendance. The cultivars descending from Trinitario and Forastero groups presented greater preference in relation to the descendants of the Forastero group only. The physical and chemical characterization of the liquors and chocolates demonstrated differences among the materials studied; however, it also showed their industrial viability. The influence of the mixture of 0, 30, 50 and 100% of seeds damaged by ¿witches¿ broom¿ with healthy seeds during the fermentation process on the characteristics of cocoa beans, liquors, cocoa butter and powder was also studied. The temperature and pH profiles of the mass during fermentation, the amounts of sugars and organic acids and the analysis of volatile compounds demonstrated that some reactions that usually occur during fermentation might have been initiated in the fruits before harvesting. The total content of polyphenols in the damaged seeds was higher than in the healthy seeds; however, losses during fermentation were also greater. Lipid and protein contents of cocoa beans and liquors decreased with the increase of the proportion of damaged seeds. ¿Witches¿ broom¿ did not cause changes in the physical and chemical properties evaluated in the cocoa butters. The analysis of the volatile compounds of the seeds, beans and liquors showed that the increase of the content of damaged seeds led to the decrease or absence of the main alkylpyrazines, indicating that their use in the percentages studied may negatively affect the sensory quality of cocoa-derived products / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_PauloJosePereiraLima_D.pdf: 96794209 bytes, checksum: ecb31f47caf999afd03d8b9da31315f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O cacaueiro se destaca como uma das principais culturas perenes na agricultura, sendo economicamente relevante por fornecer a matéria prima para a fabricação do chocolate, um produto que movimenta bilhões de dólares no mercado mundial a cada ano. Apesar de sua importância, o cacaueiro é drasticamente atacado por diversas doenças que diminuem sua produtividade e reduzem a qualidade das amêndoas do cacau. Dentre estas, a vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, é um importante fator limitante da produção cacaueira nas Américas. Utilizando tecnologias de sequenciamento de DNA de nova geração, realizamos uma abrangente análise transcriptômica da vassoura de bruxa neste trabalho. Um banco de dados denominado Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa foi construído, o qual compreende aproximadamente 60 bibliotecas de RNA-seq representativas dos mais variados estágios de desenvolvimento, condições de crescimento e respostas a estresse do fungo M. perniciosa sob condições in vitro e in planta. O primeiro capítulo desta tese apresenta uma análise global do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa. Este conjunto de dados tem suportado uma série de estudos específicos relacionados a variados aspectos da doença, os quais são apresentados e detalhados nos demais capítulos da tese. Notavelmente, uma análise detalhada da interação biotrófica entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa (Capítulo II) revelou a ocorrência de intensa reprogramação transcricional e importantes alterações fisiológicas em plantas infectadas, incluindo a ativação de respostas de defesa ineficientes e a ocorrência de privação de carbono. Curiosamente, um processo de senescência prematura se estabelece no tecido infectado e parece ser um evento central no desenvolvimento da doença, possivelmente disparando o início da fase necrotrófica desta interação planta-patógeno. Ainda, nossos dados também permitiram a identificação de potenciais efetores de virulência em M. perniciosa, como também a caracterização do status metabólico do fungo durante a infecção do cacaueiro. Um modelo detalhado que sumariza os aspectos moleculares da vassoura de bruxa foi elaborado. De maneira geral, o Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa representa um importante avanço no estudo desta doença e tem servido como ponto de partida para uma série de estudos adicionais. A utilização destes dados na identificação e caracterização de potenciais fatores de patogenicidade de M. perniciosa (Capítulos III, IV e VI) e de mecanismos de defesa do cacaueiro (Capítulo V) também é apresentada nesta tese / Abstract: Cacao stands out as one of the major perennial crops in the world, being economically relevant as the source of chocolate, a multi-billion dollar product appreciated worldwide. Despite its importance, cacao is seriously affected by several diseases that reduce crop yield and decrease the quality of cocoa beans. Among them, the witches' broom disease (WBD), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, is a major constraint for cacao production in the Americas. Using next generation sequencing technologies, a comprehensive transcriptomic analysis of WBD was performed. We developed a database named "WBD Transcriptome Atlas", which comprises approximately 60 RNA-seq libraries that represent a wide range of developmental stages, growth conditions and stress responses of the fungus, either under in vitro or in planta conditions. The first chapter of this thesis presents a global analysis of the WBD Transcriptome Atlas. This data set has supported a number of specific analyses related to several aspects of WBD, which are presented and detailed in the other chapters of the thesis. Strikingly, a detailed analysis of the biotrophic interaction between M. perniciosa and cacao (Chapter I) revealed the occurrence of intense transcriptional reprogramming and remarkable physiological alterations in infected plants, including the activation of ineffective defense responses and the occurrence of carbon deprivation. Curiously, a premature senescence process is established in infected tissues and appears to be a central event in WBD, possibly triggering the onset of the necrotrophic stage of this plant-pathogen interaction. Additionally, our data also allowed the identification of potential virulence effectors in M. perniciosa, as well as the characterization of the metabolic status of the fungus during cacao infection. A detailed model summarizing the molecular aspects of WBD is presented. Overall, the WBD Transcriptome Atlas represents an important advance in the study of this disease and constitutes a starting point for a number of additional studies. The use of these data in the identification and characterization of potential pathogenicity factors of M. perniciosa (Chapters III, IV and VI) and defense mechanisms of cacao (Chapter V) will also be presented in this thesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T10:25:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarez_Javier_D.pdf: 13138837 bytes, checksum: 410e11bd8ba7df37c003fae0919eec2e (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A doença vassoura de bruxa do cacaueiro, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa tem sido um dos maiores problemas fitopatológicos do hemisfério sul. O fungo tem uma fase biotrófica longa, pouco comum entre fungos com o estilo de vida hemibiotrófico. Este fato sugere que M. perniciosa deve dispor de importantes mecanismos de evasão do sistema de defesa da planta e que estes teriam um papel fundamental para o sucesso da infecção. Assim sendo, o objetivo deste trabalho é entender os mecanismos de supressão envolvidos na resposta de defesa basal da planta. Especificamente, aqueles mecanismos mediados por hormônios que poderiam influenciar na suscetibilidade da planta ao patógeno durante a invasão do M. perniciosa. Com este fim, foram construídas bibliotecas de RNAseq da interação cacau-M. perniciosa durante o inicio da fase assintomática da doença. As bibliotecas representantes desta interação mostraram expressão diferencial de genes relacionados com a sinalização de auxina, mas não foi observado indução de genes da biossíntese planta. Estes dados sugerem a presença de auxina "exógena" produzida provavelmente pelo patógeno. Adicionalmente, foram encontrados genes relacionados com o ácido jasmônico e etileno. Com o intuito de identificar se M. perniciosa era capaz de secretar um composto com função de auxina, sementes de Arabidopsis thaliana foram crescidas em amostras de sobrenadante do fungo. Estes experimentos mostraram alteração da morfologia das raízes semelhantes à adição de auxina exógena. Amostras de sobrenadantes do fungo foram submetidas às técnicas de RMN, LC MS/MS e GC-MS e mostraram a presença de um composto com estrutura semelhante ao indol-3-acetoácido sendo produzido pelo fungo. Estudos do time course de produção deste composto mostraram que a auxina produzida é rapidamente metabolizada formando diferentes derivados indólicos com provável função na patogênese do fungo. Finalmente, encontramos um novo composto com estrutura parecida à auxina e capacidade de indução de genes de resposta a este hormônio. Este trabalho é o primeiro relato a mostrar o time course da síntese de auxina por M. perniciosa e a indução de respostas de sinalização de auxina nos tecidos de cacau infectados pelo fungo. A intervenção nas vias de síntese de auxina pelo fungo seria um caminho plausível na tentativa por conter a doença vassoura de bruxa / Abstract: The witches' broom disease in Cacao is caused by the fungus Moniliophthora perniciosa has been one of the most important problems phytopathological in the southern hemisphere. The fungus has an unusual long biotrophic phase with the lifestyle hemibiotrofic suggesting that M. perniciosa must have important evasion mechanisms for breaking of the plant defense system and it would have a key role to success in the infection. Therefore, the aim of this work is to understand some of the mechanisms involved in the suppression of basal defense response of the plant. Specifically, hormones-mediated mechanisms that could influence plant susceptibility to pathogens during the infection of M. perniciosa. For this purpose, RNAseq libraries were constructed of the interaction cacao - M. perniciosa during the asymptomatic phase of the disease. Genes related with the auxin and jasmonic acid signaling and ethylene production were differential expressed during the initial stage of the disease. Furthermore, auxin-responsive genes were induced, but not observed induction of plant biosynthesis genes for this hormone. These data suggest presence of auxin "exogenous" probably produced by the pathogen. In order to identify whether M. perniciosa was able to secrete a compound like an auxin, Arabidopsis thaliana seedlings were grown in mediums with supernatant of the fungus. These experiments showed alterations on the roots morphology, similar to the addition of exogenous auxin. Samples of supernatants were subjected to the techniques of NMR, LC-MS/MS and GCMS and showed the presence of a compound with a similar structure of Indole-3- Acetic Acid (IAA) being produced by the fungus. A time course of the production of this compound was examinated by LC-MS/MS and showed that the auxin is produced by M. perniciosa, but is rapidly metabolized forming different indole derivatives, some of them with a probable role in the pathogenesis. Finally, we found a new compound with a structure similar to auxin and with the ability to induce gene response to this hormone / Doutorado / Genetica Vegetal / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Peres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T06:30:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barau_JoanGrande_D.pdf: 15458099 bytes, checksum: 72a1f6ed8ef42544b91f989494fb4ce2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A introdução da doença vassoura de bruxa do cacaueiro no Sul da Bahia representa um dos maiores exemplos da magnitude de impacto sócio econômico que uma fitopatologia pode aflingir a uma região ou país com um predominante perfil agroexportador. Com a execução do projeto genoma do fungo causador da vassoura de bruxa, o Basidiomiceto Moniliopthora perniciosa, uma série de trabalhos de caracterização morfológica, fisiológica e genética da doença foram inciados. Em um primeiro momento, em paralelo com a caracterização das alterações bioquímicas da doença, buscamos entender as diferenças de expressão gênica através de microarranjos de DNA e bibliotecas ESTs comparando as duas fases morfo-genéticas do fungo reproduzidas in vitro. Apesar de esse esforço pioneiro ter permitido a formação de um modelo panorâmico das alterações genéticas do fungo e fornecido importantes diretrizes para a pesquisa futura, ficou claro a necessidade de se explorar em maior detalhe a interação in vivo. Dentre os aspectos importantes investigados, o estudo do metabolismo do glicerol durante a fase biotrófica da interação através de marcadores de expressão mostrou que essa fonte de carbono em potencial pode ter um papel importante no início da infecção e participar da sinalização de stress através da modulação do shuttle mitocondrial de glicerol 3-fosfato. No entanto, a necessidade de se entender melhor o panorama das fontes de carbono disponíveis no apoplasto, o microambiente ocupado pelo fungo nas fases iniciais da interação, nos motivou a caracterizar as alterações nutricionais desse espaço ao longo da doença. Foi possível demonstrar que a vassoura de bruxa quebra o ciclo de carbono normal do apoplasto e que induz o corte da comunicação vascular com as partes sadias da planta ao final da fase biotrófica. Uma correlação entre a sinalização por carbono e a expressão de genes de patogenicidade secundária foi explorada. Com a expansão dos dados de genoma e transcriptoma utilizando sequenciamento de DNA de terceira geração (Illumina e 454 Life Sciences), dezenas de genes-alvo com potencial participação em vias de patogenicidade e desenvolvimento da doença foram identificados. Nesse contexto, dentre as ferramentas para análises de genômica funcional nesse modelo, a inativação ou nocaute de genes por gene targeting e o estudo da atividade de proteínas através de fusões com genes repórteres são essenciais ao teste das hipóteses geradas como fruto da pesquisa genômica da Vassoura-de-bruxa. Transformantes de M. perniciosa carregando uma cópia do gene marcador de autofagia MpATG8 fusionado ao marcador GFP apresentaram um padrão de fluorescência característico da biologia celular de ATG8, permitindo acompanhar o processo de autofagia sob condições de deprivação de nutrientes, demonstrando a possibilidade da aplicação de fusões com repórteres fluorescentes para experimentos de localização subcelular de proteínas desse fitopatógeno. Por fim, uma estratégia baseada na seleção de recombinantes através da técnica split marker em conjunto com um silenciamento transiente do sistema de reparo NHEJ por RNAi foi traçada e executada de modo a obter o nocaute do gene MpKu70, essencial a essa via de reparo, cuja inativação está associada a um aumento da eficiência de recombinação homóloga e gene targeting / Abstract: Cocoa's Witches Broom Disease (WBD) is caused by the hemibiotrophic interaction between the Basidiomycete fungus Moniliopthora perniciosa and plants of Theobroma cacao. One remarkable feature of WBD is its unusual long biotrophic phase in which the fungal growth is restricted to the apoplastic space of plants. We compared differential gene expression between biotrophic and saprotrophic-like hyphae in vitro and proposed based on microarray and EST results that the maintenance of biotrophic-like cultures of M. perniciosa in vitro is subject to Carbon source regulation, especially regarding the use of glycerol as a preferential carbon source for biotrophy. To further gain insight into the carbon source regulation of WBD biotrophic phase in vivo, we characterized glycerol utilization using fungal expression markers during the initial phases of infection. We also characterized the carbon source fluctuations in the apoplast of healthy and infected cocoa seedlings. We showed that healthy cocoa plants possess a rhythmic carbon cycle in the apoplast that is in fine tune with periodical leaf flushing, expansion and photosynthetic maturation. WBD completely disrupts the carbon cycle in the apoplast of infected plants and also arrests leaf photosynthesis at pre sink-to-source transition levels. It was also possible to distinguish two different phases of carbon availability in the apoplast. The two phases correlated with fungal growth rates, the expression of a characterized necrosis inducing gene and the development of a tumor-like callus at the base of infected stems that completely disrupted normal vascular communication between healthy and diseased parts of the plant. A possible correlation between carbon starvation and phase switch from biotrophic to necrotrophic was explored and the evolution of the vascular-disrupting callus was discussed in the view of the tradeoff between the physiological behavior of infected tissues as sinks and the avoidance of nutrient remobilization during infected tissue senescence. Finally, we focused on the development of functional genomic tools for the study of gene function in this pathogen. As a proof-of-concept, we successfully obtained fungal strains expressing the autophagy related gene MpATG8 fused with GFP reporter, in which was possible to visualize the autophagy process in vivo by fluorescence imaging. In addition we also obtained the first successful gene targeting knockout of MpKu70, an M. perniciosa homologous of a gene essential to NHEJ in Eukaryotes. MpKu70 knockouts strains have reported phenotypes of increased homologous recombination, and the M. perniciosa strain may be an important platform for future functional studies of genes important in witches broom disease pathogenesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Pérez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:47:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_BrunoVazde_D.pdf: 5827031 bytes, checksum: c9ff7bf065563150ef6ea14b5630ca52 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro, doença que se tornou um dos principais problemas fitopatológicos do Brasil. O fungo possui duas fases de vida, biotrófica e necrotrófica, as quais estão associadas aos sintomas de vassoura-verde e vassoura-seca, respectivamente, durante a progressão da doença. Em vista dos grandes prejuízos econômicos causados pela vassoura-de-bruxa, foi iniciado o Projeto Genoma Vassoura-de-Bruxa, cujo objetivo é a decodificação genética do fungo com o intuito de identificar genes candidatos que possam estar relacionados ao estabelecimento e à progressão da doença para serem caracterizados. M. perniciosa é capaz de utilizar metanol como fonte única de carbono. Na maioria dos organismos estudados, a enzima metanol oxidase (MOX) é a responsável pelo metabolismo de metanol através do metabolismo peroxissomal, à qual também está associada uma catalase (CAT). Em plantas, uma das principais fontes de metanol é a pectina presente na estrutura da parede celular vegetal. Algumas espécies de fungos fitopatogênicos tem a capacidade de secretar oxalato como produto da enzima oxaloacetato acetilhidrolase (OAH), o qual é capaz de quelar íons cálcio da estrutura das pectinas, deixando-as vulneráveis ao ataque de enzimas que degradam a parede celular vegetal. Dentre essas enzimas, encontra-se a pectina metilesterase (PME), a qual é capaz de desmetilar as pectinas, liberando metanol. Como M. perniciosa possui em seu genoma sequências com similaridade a mox, cat, pme e oah, formulamos uma hipótese, segundo a qual M. perniciosa seria capaz de degradar o metanol proveniente das pectinas, através de um metabolismo peroxissomal, durante sua interação com o cacau na vassoura-de-bruxa. De fato, M. perniciosa é capaz de secretar oxalato, formando cristais de oxalato de cálcio. Nossos resultados sugerem fortemente que M. perniciosa utiliza o metanol proveniente das pectinas durante a vassoura-de-bruxa; no entanto, esse processo se daria através de um metabolismo extracelular, visto que M. perniciosa produz uma MOX e CAT extracelulares, e não através do metabolismo peroxissomal como inicialmente proposto. Além disso, M. perniciosa possui outras catalases, as quais se apresentam diferencialmente expressas nas diferentes fases do ciclo de vida do fungo e em diferentes estágios da progressão da vassoura-de-bruxa. Por fim, apresentamos uma análise preliminar do secretoma de M. perniciosa / Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches' broom disease (WBD) in cacao. M. perniciosa is classified as a hemibiotrophic pathogen and presents two morphologically distinct life phases, biotrophic and necrotrophic, that are correlated with the green broom and dry broom symptoms, respectively, during the progression of WBD. The introduction of WBD in Bahia, the main Brazilian cacao-producing state, reduced the cacao production drastically and Brazil has become a net importer of cacao in order to supply the national chocolate industry. Due to the extreme losses in cacao production, the Witches' Broom Genome Project was initiated to decode the M. perniciosa genome and, based on the data acquired, select genes that could be relevant during the progression of WBD for characterization. M. perniciosa is able to grow in methanol as the sole carbon source. In methylotrophic yeasts and other methanol-degrading organisms, a methanol oxidase (MOX) is the key enzyme in methanol metabolism and it is also related to a catalase (CAT); both MOX and CAT characterize a peroxisomal metabolism. In plants, one of the main sources of methanol is the pectin present in the plant cell walls. Many phytopathogenic fungal species produce oxalate, a product of the enzyme oxaloacetate acetyl hydrolase (OAH), which removes calcium ions bound to pectin to produce calcium oxalate crystals, thus exposing the host cell walls to plant cell wall-degrading enzymes (PCWD) of fungal origin. One of the main PCWDs is pectin methylesterase (PME), an enzyme that removes the methyl ester radicals from esterified pectin, releasing methanol. As M. perniciosa possesses mox, cat, oah and pme on its genome, we hypothesized that M. perniciosa would utilize a peroxisomal metabolism to metabolize the methanol released from the pectin demethylation in WBD. Indeed, M. perniciosa secretes oxalate, thus producing calcium oxalate crystals. Our data strongly suggest that M. perniciosa able to utilize the methanol released from pectin demethylation; however, this metabolism is probably extracellular due to the presence of secreted MOX and CAT. Moreover, M. perniciosa possesses other cats, which are differentially expressed in vitro and in planta. Finally, we present a preliminary analysis of M. perniciosa secretome / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Maria Carolina Scatolin do Rio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:38:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_GleidsonSilva_D.pdf: 5340667 bytes, checksum: a5eb7198bd79e4c57ea6ac55d5742b85 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo hemibiotrofico Moniliophthora perniciosa, e uma das principais doenças que acometem o cacaueiro (Theobroma cacao L.). Durante a fase biotrófica, o patôgeno coloniza o espaço intercelular e estimula a formação de ramos hipertróficos denominados vassoura verde. No estagio avançado da doença, o fungo passa a colonizar também o interior das células e observa-se a morte do tecido originando a vassoura seca. A semelhança destes sintomas aos observados em outras fitopatologias sugere um desequilíbrio hormonal em resposta a infecção. Neste contexto, este trabalho apresenta um estudo integrado dos genes relacionados a diferentes hormônios vegetais e uma caracterização dos genes relacionados às citocininas. A possível participação dos hormônios no estabelecimento e na progressão da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro e discutida. Dados de RNA-seq foram gerados durante as diferentes fases da interação. Em seguida, genes diferencialmente expressos foram classificados de acordo com a terminologia do Gene Ontology. Além disso, a capacidade de biossíntese de citocininas pelo fungo M. perniciosa foi avaliada através do teste de complementação utilizando a levedura TM128 sln1?. Em paralelo, foi realizada uma caracterização detalhada dos genes que constituem o mecanismo de percepção de citocininas em cacau, sistema denominado two-component. Genes relacionados às respostas hormonais e de defesa foram os mais representados entre o grupo de diferencialmente expressos. Durante a fase assintomática, e observada a indução de genes relacionados a auxinas e etileno. Por outro lado, no estagio avançado, foram identificados genes relacionados à degradação de citocininas e as respostas de defesa mediadas por acido salicílico e jasmonato/etileno. Paralelamente, foi identificado no M. perniciosa um gene para a síntese de citocininas, entretanto, a funcionalidade deste não foi confirmada. Em T. cacau, a arquitetura do sistema two-component e similar a encontrada em Arabidopsis sp., porem, nenhuma alteração significativa na expressão dos genes que constituem este sistema foi identificada. Por essa razão, não foi possível estabelecer uma relação clara entre as citocininas e os sintomas da Vassoura-de-bruxa. Contudo, o padrão de expressão de genes relacionados à homeostase de auxinas, sugere uma regulação negativa das respostas de defesa contra patogenos biotroficos durante fase inicial da doença / Abstract: The Witches' Broom disease, caused by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, is the major disease affecting cacao (Theobroma cacao L.). During its biotrophic phase, the pathogen colonizes the intercellular space and stimulates the formation of hypertrophic branches called green broom. In the advanced stage of the disease, the fungus starts also to colonize the interior of the cells and it is noted the death of tissue originating the dry broom. The similarity of these symptoms to those observed in other plant diseases suggests a hormonal imbalance in response to the infection. In this context, this work presents an integrated study of plant hormone-related genes and a characterization of cytokinin-related genes. The possible participation of these genes in the establishment and progression of Witches' Broom in cacao is discussed. RNA-seq data regarding different phases of the interaction were generated. After this, differentially expressed genes were classified according to Gene Ontology terminology. Furthermore, the ability of cytokinin biosynthesis by M. perniciosa was assessed by a complementation test using the yeast TM128 sln1?. In parallel, we performed a detailed characterization of genes that constitute the mechanism of perception of cytokinins in cacao, the two-component system. For these, the gene expression values have been accessed through the previously generated RNA-seq data. Defense and hormone-related genes were the most represented among the differentially expressed genes. During asymptomatic phase, we observe the induction of auxin and ethylene-related genes. During the symptomatic stage, genes related to the degradation of cytokinins and defense responses mediated by salicylic acid and jasmonate/ethylene was identified. Simultaneously, a putative gene for the synthesis of cytokinins was identified in M. perniciosa genome; however, the participation of this gene in cytokinin synthesis was not confirmed. In T. cocoa, the architecture of two-component system is similar to that one found in Arabidopsis sp.; however, no significant change in the expression of genes that constitute this system was identified. For this reason, it was not possible to establish a clear relationship between cytokinins and the symptoms of the Witches' Broom disease. Moreover, the expression pattern of homeostasis auxin-related genes suggests a negative regulation of defense responses against biotrophic pathogens during the initial stage of the disease / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

This study was conducted in the semiarid region of Alagoas between 2007 and 2010 with the aim of studying the foundations of biotechnology obtain goat's milk and its environment. Were isolated and identified microorganisms from goat milk in two settlements, we studied the chemical characteristics of forage plants local and deepened in the study of Trap (Crataeva tapia L.), identified the prevalence of endoparasites goats in several counties semi-arid Alagoas and tested the Garlic (Allium cepa L) in the alternative control of endoparasites. We also studied the influence of the supply of mineral Selenium mineral salt recommended for goats and interrelation with other minerals, calcium, phosphorus and soluble iron and also, Fat, Lactose, Protein, Somatic Cell Count and Colony Forming Units of Milk goats in the experiment. It was concluded that among the pathogens found in fresh goat milk, the most prevalent was Staphylococcus sp. Forages analyzed compositions presented in nutritive value satisfactory dry matter, crude protein, neutral detergent fiber, acid detergent fiber. All species, the chemical composition, have a potential to be used as fodder, especially Crataeva tapia L. The endoparasites most often found in dairy goats in the study area are Trichostrongyloidea superfamily and members of the genus Eimeria sp, which is also found others as Strongyloides sp, Trichuris sp and Moniezia, these being found with a lower frequency. The use of Allium sativum L. as antiparasitic OPG showed a reduction of 50.38%, 70.22%, 79.38% and 73.28% for treatments with 0 g (control group), 2g, 4g, 6g and 8g of Allium sativum L . respectively, compared to the average OPG treatment T0 (control group). The supply of mineral proved to be essential in the response of essential minerals present in milk of goats, such as soluble Ca and Fe with significant increases, the P did not respond to even increase its value decreasing with increasing selenium. Milk does not transfer directly increased the levels of selenium in animal nutrition studies are suggested dosages of selenium via venal to analyze their transfer. There was a decrease in SCC with increasing dosage of selenium demonstrating their antioxidant activity and an increase in lactose and fat. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O presente trabalho foi desenvolvido no semi-árido alagoano entre 2007 e 2010 com o objetivo de estudar as bases biotecnológicas de obtenção de leite de cabra e seu meio ambiente. Foram isolados e identificados os microrganismos do leite de cabra em dois assentamentos, estudou-se as características químicas das plantas forrageiras locais e aprofundou-se no estudo do Trapiá (Crataeva tapia L.), identificou-se a prevalência de endoparasitas caprinos em varios municipios do semi-arido alagoano e testou-se o Alho (Allium cepa L) no controle alternativo desses endoparasitas. Também estudou-se a influencia do fornecimento do mineral Selenio no sal mineral recomendado para caprinos e a interrelação com os demais minerais Calcio, Fósforo e Ferro solúvel e também, Gordura, Lactose, Proteína, Contagem de Celulas Somaticas e Unidades Formadoras de Colonias do Leite de cabras em experimento. Concluiu-se que entre os microrganismos patogênicos encontrados no leite de cabra in natura,o mais prevalentefoi o Staphylococcus sp.As espécies forrageiras analisadas, apresentaram composições bromatológicas satisfatórias em teores de matéria seca, proteína bruta, fibra em detergente neutro, fibra em detergente acido. Todas as espécies analisadas, quanto à composição bromatologica, apresentam potencial para serem utilizadas como forrageiras, com destaque paraCrataeva tapia L.Os endoparasitos encontrados com mais freqüência em caprinos leiteiros na área estudada são os da superfamília Trichostrongyloidea e os do gênero Eimeria sp, tendo também encontrado outros como Strongyloides sp, Trichuris, e Moniezia sp, sendo esses encontrados com uma menor freqüência. A utilização de Allium sativum L. como antiparasitário apresentou uma redução de OPG de 50,38%, 70,22%, 79,38% e 73,28%, para os tratamentos; 0 g (grupo controle), 2g, 4g, 6g e 8g de Allium sativum L. respectivamente, em relação à média de OPG do tratamento T0 (grupo controle).O fornecimento de sal mineral mostrou-se imprescindível na resposta de minerais essenciais presentes no leite de cabras, tal como Ca e Fe solúvelcom aumentos significativos, o P não respondeu ao aumento inclusive diminuindo seu valor com o aumento de Selênio.O leite não transfere diretamente as dosagens de selênio aumentadas na alimentação animal, sugerem-se estudos com dosagens de selênio via venal para analisar sua transferência.Houve uma redução na CCS com o aumento da dosagem do selênio demonstrando sua ação antioxidante e um aumento nos teores de lactose e gordura.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:56:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 168225 bytes, checksum: 5446b44c9266240b990e9dcb92f20518 (MD5) Previous issue date: 2009-07-02 / This work aimed to evaluate the use of vinasse as a cultive medium for multiplication of Bacillus subtilis and the effect of your inoculation to control nematodes and growth of sugar cane grown in soil infested with the nematode galls (Meloidogyne spp.). Were developed in laboratory tests to define the best concentration of vinasse on the composition of culture medium to optimize the growth of B. subtilis. For the experiment with plants in the greenhouse soil used was collected in area of cultivation of sugarcane. Were established the following treatments: control, pure vinasse (50 m3 ha-1), Bacillus subtilis in aqueous suspension (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplied in vinasse (50 m3 ha-1), multiplied in B. subtilis vinasse (100 m3 ha-1). The multiplication of Bacillus subtilis in the culture-based stillage was considered satisfactory when compared to the culture pattern. The application of B. subtilis without multiplication in vinasse promoted the growth of sugarcane and reduced reproduction of the nematodes in the root during the experiment. The use of B. subtilis, multiplied in vinasse not achieved the benefits found in the application of bacteria in aqueous suspension, with the stimulus to growth and control of nematodes in sugar cane. / Este trabalho objetivou avaliar a utilização de vinhaça como meio de cultura para multiplicação de Bacillus subtilis e o efeito de sua aplicação no solo visando o controle de nematóides e promoção crescimento da cana-deaçúcar cultivada em solo infestado com nematóide de galhas (Meloidogyne spp.). Foram desenvolvidos ensaios em laboratório para definição da melhor concentração de vinhaça na composição do meio de cultura visando otimização do crescimento de B. subtilis. No experimento em casa de vegetação foi utilizado solo coletado em área de cultivo de cana. Foram estabelecidos os seguintes tratamentos: controle; vinhaça pura (50 m3 ha-1); Bacillus subtilis em suspensão aquosa (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplicado na vinhaça (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplicado na vinhaça (100 m3 ha-1). A multiplicação de Bacillus subtilis em meio de cultura a base de vinhaça foi considerada satisfatória em comparação ao meio de cultura padrão. A aplicação de B. subtilis não multiplicado na vinhaça promoveu o crescimento da cana e redução da reprodução dos nematóides na raiz durante o experimento. A utilização de B. subtilis, multiplicado na vinhaça, não alcança os benefícios encontrados na aplicação apenas da bactéria, com relação ao estímulo ao crescimento e controle de nematóides na cana-de-açúcar.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 168225 bytes, checksum: 5446b44c9266240b990e9dcb92f20518 (MD5) Previous issue date: 2009-07-02 / This work aimed to evaluate the use of vinasse as a cultive medium for multiplication of Bacillus subtilis and the effect of your inoculation to control nematodes and growth of sugar cane grown in soil infested with the nematode galls (Meloidogyne spp.). Were developed in laboratory tests to define the best concentration of vinasse on the composition of culture medium to optimize the growth of B. subtilis. For the experiment with plants in the greenhouse soil used was collected in area of cultivation of sugarcane. Were established the following treatments: control, pure vinasse (50 m3 ha-1), Bacillus subtilis in aqueous suspension (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplied in vinasse (50 m3 ha-1), multiplied in B. subtilis vinasse (100 m3 ha-1). The multiplication of Bacillus subtilis in the culture-based stillage was considered satisfactory when compared to the culture pattern. The application of B. subtilis without multiplication in vinasse promoted the growth of sugarcane and reduced reproduction of the nematodes in the root during the experiment. The use of B. subtilis, multiplied in vinasse not achieved the benefits found in the application of bacteria in aqueous suspension, with the stimulus to growth and control of nematodes in sugar cane. / Este trabalho objetivou avaliar a utilização de vinhaça como meio de cultura para multiplicação de Bacillus subtilis e o efeito de sua aplicação no solo visando o controle de nematóides e promoção crescimento da cana-deaçúcar cultivada em solo infestado com nematóide de galhas (Meloidogyne spp.). Foram desenvolvidos ensaios em laboratório para definição da melhor concentração de vinhaça na composição do meio de cultura visando otimização do crescimento de B. subtilis. No experimento em casa de vegetação foi utilizado solo coletado em área de cultivo de cana. Foram estabelecidos os seguintes tratamentos: controle; vinhaça pura (50 m3 ha-1); Bacillus subtilis em suspensão aquosa (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplicado na vinhaça (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplicado na vinhaça (100 m3 ha-1). A multiplicação de Bacillus subtilis em meio de cultura a base de vinhaça foi considerada satisfatória em comparação ao meio de cultura padrão. A aplicação de B. subtilis não multiplicado na vinhaça promoveu o crescimento da cana e redução da reprodução dos nematóides na raiz durante o experimento. A utilização de B. subtilis, multiplicado na vinhaça, não alcança os benefícios encontrados na aplicação apenas da bactéria, com relação ao estímulo ao crescimento e controle de nematóides na cana-de-açúcar.

A leprose é uma das principais doenças na citricultura brasileira devido à sua ocorrência difundida nos pomares e aos altos custos para o controle químico do ácaro vetor. A doença compromete a produção da planta e sua vida útil, manifestando-se através de lesões locais cloróticas ou necróticas em folhas, ramos e frutos, levando à queda prematura destes órgãos e à seca de ramos. O patógeno, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recentemente classificado como espécie tipo de um novo gênero de vírus de planta, Cilevirus, é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Apesar de haver consenso de que a doença tem etiologia viral, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações vírus-planta-vetor, cujas soluções contribuirão para o controle integrado da doença. O presente trabalho teve como objetivo obter informações sobre a interação do vírus com células hospedeiras através de ensaios de imunolocalização das proteínas MP (putativa proteína de movimento), helicase (associada à replicação) e p29 (putativa proteína capsidial) do CiLV-C. Para tal, as sequências codificadoras das ORFs mp e hel foram amplificadas via RT-PCR e clonadas em vetor de expressão. Em seguida, promoveu-se a expressão in vitro das respectivas proteínas em células de E. coli e purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica. A proteína MP pura foi utilizada para produção de antissoro policlonal específico que foi testado quanto à especificidade por métodos sorológicos. Os resultados do ELISA mostraram que o antissoro apresentou reação positiva com extratos foliares de lesões lepróticas em todos os estágios de desenvolvimento da doença, quando utilizado em altas concentrações. Além disso, lesões maduras reagiram mais intensamente que lesões mais novas. Por Western Blot, detectou-se somente a proteína pura, não sendo possível obter reação positiva em extrato de lesões foliares. Também não foi possível detectar a MP por imunolocalização in situ. Os resultados em conjunto sugerem que ocorre baixo nível de expressão da MP nos tecidos do hospedeiro. Empregando-se anticorpo policlonal contra proteína p29 do CiLV-C, foi possível detectar o CiLV-C em extratos de lesões foliares de leprose por ambos os métodos sorológicos testados e também por Tissue Blotting. Ensaios de imunolocalização in situ permitiram confirmar que as partículas baciliformes presentes em cisternas do retículo endoplasmático de tecidos de lesões lepróticas em plantas representam de fato vírions do CiLV-C. Além disso, também demonstrou-se que o viroplasma que ocorre no citoplasma representa o sítio de acúmulo da proteína p29. Este mesmo ensaio revelou que partículas baciliformes que ocorrem entre membranas de células adjacentes (intestino médio, glândulas prosomais, músculos e epiderme) de B. phoenicis virulíferos são de fato do CiLV-C. A ausência de viroplasma no ácaro sugere que a relação vírus/vetor seria do tipo circulativo, sem replicação. Baseado neste fato discutem-se alternativas para explicar como o vírus trafegaria do lúmen do intestino até o duto salivar para causar infecção numa planta sadia. / Citrus leprosis is one of the most important diseases in the Brazilian citrus production due to the wide occurrence in orchards and also to the high costs involved in the chemical control of the mite vector. The disease affects the plant production and longevity and it is characterized by localized chlorotic and/or necrotic spots on the leaves, stems and fruits. Affected leaves and fruits may drop prematurely and dieback can be observed in stems. The pathogen, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recently considered as the type member of a new genus, Cilevirus, is transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis Geijskes. Despite the consensus that citrus leprosis has viral etiology, there are many pending questions regarding the viral interactions with the infected plant and the viruliferous mites. The solution of these questions may contribute to a better disease integrated management. This work aimed to obtain a better understanding about the virus-plant-vector relationship with the host cell by immunolocalization assays of the putative movement protein (MP), helicase (protein involved in the viral replication) and p29 (putative coat protein) of the CiLV-C. ORFs coding sequences of mp and hel was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector. Afterwards, in vitro expression of these proteins in E. coli and its purification by affinity chromatography were realized. The purified MP was used to produce specific polyclonal antibody that was tested for specificity by serological methods. The ELISA results showed that high concentration antibody reacted with the leaves extracts from lesions in all the disease stage of development. Furthermore, the old lesions reacted more intensely than the younger. Western blot (which detected only the pure protein) and in situ immunolocalization assays failed to detect the native MP in lesioned leave extracts. The results as a hole suggest the occurrence of low expression of MP in host tissue. The polyclonal antibody against p29 was able to detect the virus in lesioned plant extracts by PTA-ELISA, Western Blot, and Tissue Blotting. The viral nature of the putative viral particles, present within endoplasmic reticulum cisternae of infected leaf tissue, was confirmed by immunogold label. The labeling also occurred intensely in the viroplasmas, indicating that these structures represent p29 protein accumulation site. Putative virus particles, visualized in viruliferous B. phoenicis, between membranes of adjacent cells (midgut, prosomal glands, epidermis, muscles), was also immunogold labeled indicating that they represent CiLV-C. The absence of viroplasma in the mite tissues suggests that CiLV-C / B. phoenicis relationship is of the circulative type, without replication. Based on this finding, we search for possible alternatives for the viral circulation in the mite body from the midgut lumen to the salivary duct for the infection of a healthy plant to occur.