351 |
Visualisierung und Charakterisierung der S-Protein vermittelten Fusion von CoronavirenEifart, Patricia 28 February 2008 (has links)
Die Fusionsreaktion des Coronavirus MHV wird vom S-Protein vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Eintrittsweg von MHV-A59 in Mauszellen untersucht. Die Infektivität kann durch lysosomotrope Substanzen und Inhibitoren der Clathrin-abhängigen Endozytose gehemmt werden. Der Eintritt von MHV-A59 in Mauszellen erfolgt über die Clathrin-abhängige Endozytose und setzt die anschließende Fusion der viralen und zellulären Membran bei niedrigem pH-Wert voraus. Fluoreszenzmikroskopische Studien zur Interaktion fluoreszenzmarkierter MHV-A59 Partikel mit Mauszellen bestätigen, dass MHV-A59 über Endozytose aufgenommen wird. Nach Bindung der Viren an die Zellen und anschließende Erniedrigung des pH-Wertes kommt es zur Färbung der Plasmamembran. Die Erniedrigung des pH-Wertes in Abwesenheit des Rezeptors führt zu einer irreversiblen Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein, die die Inaktivierung der Fusionsaktivität und den Verlust der Infektivität zur Folge hat. Die Ergebnisse deuten auf die Beteiligung des endozytotischen Weges für den viralen Eintritt von MHV-A59 hin. Ein niedriger pH-Wert eines zellulären endosomalen Kompartiments induziert vermutlich die Konformationsänderung im S-Protein und löst die Fusionsreaktion aus. Ein vorläufiges 3D-Modell des S-Proteins von MHV-A59 konnte erstellt werden. Darüber hinaus wurde die Struktur und Fusionsfähigkeit des S-Proteins von SARS-CoV analysiert. Ein Zell-Zell-Fusionsassay konnte nachweisen, dass die Fusion zwischen S-Protein und ACE2-exprimierenden Zellen sowohl abhängig vom pH-Wert als auch von der proteolytischen Spaltung in S1- und S2-Untereinheit ist und durch Erniedrigung des pH-Wertes zusätzlich verstärkt werden kann. Im abschließenden Teil der Arbeit wurde auf Basis theoretischer Untersuchungen eine Vorhersage des mutmaßlichen Fusionspeptids des S-Proteins von MHV-A59, welches alle wesentlichen Merkmale eines internen Fusionspeptids aufweist, vorgenommen. Es liegt nahe der "Heptad-Repeat" (HR) Domäne HR1. / Fusion of the Coronavirus MHV-A59 is mediated by the viral S-protein. The entry pathway of MHV-A59 into murine cells was studied in this work. Infection was strongly inhibited by lysosomotropic compounds and substances interfering with clathrin-dependent endocytosis, suggesting that MHV-A59 is taken up via endocytosis and delivered to acidic compartments. Fluorescence microscopy of labeled MHV-A59 confirmed that the virus is taken up via endocytosis. When the virus was bound to cells and the pH was lowered to 5.0, we observed a strong labeling of the plasma membrane. Electron microscopy revealed low pH triggered conformational alterations of the S-ectodomain. These alterations are likely to be irreversible because low pH-treatment of viruses caused an irreversible loss of fusion activity. The results imply that endocytosis plays a major role in MHV-A59 infection and that the acidic pH of the endosomal compartment triggers a conformational change of the S-protein mediating fusion. Furthermore the conformation of the trimeric spike protein of the murine hepatitis virus A59 was characterized by cryoelectron microscopy. A preliminary 3D-reconsruction of the native structure could be accomplished. Besides we studied the structure and fusion capability of the spike protein expressed by SARS-CoV. The cell-based fusion assay revealed that fusion of spike protein and ACE2-receptor expressing cells was strongly dependent on low pH and on proteolytic cleavage of the S-protein into S1 and S2 subunit. Additionally fusion could be significantly increased by lowering of the pH. The theoretical part of the thesis allowed the identification of the putative fusion peptide, which showed main characteristics of internal fusion peptides. It allows the heptad regions of the spike protein to assemble in the six-helix bundle structure (6HB). This structure is of great importance to initiate the approximation of viral and cellular membrane and thus to induce fusion.
|
352 |
Microscopy techniques for studying polymer-polymer blendsMattsson, Sandra January 2019 (has links)
Semiconductors are used in many electronic applications, for example diodes, solar cells and transistors. Typically, semiconductors are inorganic materials, such as silicon and gallium arsenide, but lately more research and development has been devoted to organic semiconductors, for example semiconducting polymers. One of the reasons is that polymers can be customized, to a greater extent than inorganic semiconductors, to create a material with desired properties. Often, two polymers are blended to obtain the desired function, but two polymers do not usually result in an even blend. Instead they tend to separate from each other to varying degrees. The morphology of the blend affects the material properties, for example how efficiently it can convert electricity to light. In this project, thin films consisting of polymer blends were examined using microscopy techniques for the purpose of increasing our understanding of the morphology of such blends. One goal was to investigate whether a technique called correlative light and electron microscopy can be useful for examining the morphology of these films. In correlative light and electron microscopy, a light microscope and an electron microscope are used in the same location in order to be able to correlate the information from the two microscopes. The second goal was to learn about the morphology of the thin films using various microscopy techniques. The polymers used were Super Yellow and poly(ethylene oxide) with large molecular weight. Super Yellow is a semiconducting and light-emitting polymer while poly(ethylene oxide) is an isolating and non-emitting polymer that can crystallize. In the blend films, large, seemingly crystalline structures appeared. The structures could be up to 1 mm in the lateral direction, while the films were only approximately 170 nm thick. These structures could grow after the films had dried and their shapes were similar to those of poly(ethylene oxide) crystals. Consequently, there is reason to believe that it is the poly(ethylene oxide) that makes up the seemingly crystalline structures, but the structures also emitted more light than the rest of the film, and Raman spectroscopy showed that there was Super Yellow in the same location as the crystals. Among the microscopy techniques used, phase contrast microscopy was particularly interesting. This method visualizes differences in optical path length and was useful for studying polymer blends when the polymers have different indices of refraction. Correlating light and electron microscopy showed that there was a pronounced topographical difference between the seemingly crystalline regions and the rest of the thin film. Light microscopy has a limited resolution due to diffraction, but as long as the resolution of the light microscope is sufficient for seeing phase separation, correlative light and electron microscopy turned out to be a good method for studying the morphology of thin films of polymer blends. / Halvledare är viktiga för många elektroniska ändamål eftersom de kan användas till exempelvis dioder, solceller och transistorer. Traditionellt används inorganiska halvledande material som kisel eller galliumarsenid, men på senare tid har allt mer forskning och utveckling inriktat sig mot organiska (kolbaserade) halvledare, såsom halvledande polymerer, bland annat eftersom det i högre utsträckning går att skräddarsy de organiska materialen så att de får önskvärda egenskaper. Ofta blandas två polymerer med varandra för att skapa ett material med nya egenskaper som är önskvärda, men två polymerer brukar inte blandas jämnt utan tenderar att separera från varandra i olika utsträckning. Hur blandningen ser ut (morfologin) påverkar materialets egenskaper, till exempel hur effektivt det omvandlar ström till ljus. Med syfte att öka förståelsen för hur morfologin ser ut hos en blandning av två polymerer, har detta projekt gått ut på att undersöka tunna filmer av polymer-blandningar med hjälp av mikroskopiska tekniker. Ett delmål var att ta reda på om en teknik som heter korrelativ ljus- och elektronmikroskopi är en bra metod för att undersöka morfologin hos dessa filmer. Vid korrelativ ljus- och elektronmikroskopi används både ett ljusmikroskop och ett elektronmikroskop på samma plats för att kunna korrelera informationen som de båda mikroskopen ger. Det andra delmålet var att undersöka vad de olika mikroskopi-teknikerna kan säga om morfologin hos de tunna filmerna. De polymerer som använts är Super Yellow och poly(etylenoxid) med hög molekylmassa. Super Yellow är en oordnad halvledande och ljusemitterande polymer medan poly(etylenoxid) är en isolerande och icke-emitterande polymer som kan kristallisera. I de blandade filmerna uppstod stora kristall-liknande strukturer som kunde vara upp emot 1 mm breda trots att filmerna bara var ungefär 170 nm tunna. Dessa strukturer kunde växa fram efter det att filmerna redan hade torkat och påminde i form om kristaller som kan bildas av poly(etylenoxid). Det finns alltså skäl att tro att det är poly(etylenoxid) som kristalliserats, men de kristall-liknande strukturerna visade sig emittera mer ljus än vad resten av filmen gjorde, och Raman-spektroskopi visade att det även fanns Super Yellow på samma plats som kristallerna. Bland de mikroskopitekniker som testades utmärker sig faskontrastmikroskopi, som visar skillnader i den optiska vägskillnaden (det vill säga faktisk vägskillnad multiplicerat med brytningsindex). Det visade sig vara en intressant teknik för att studera polymerblandningar när de båda polymererna har olika brytningsindex. Genom att korrelera ljus- och elektronmikroskopi visade det sig att det fanns en tydlig skillnad i struktur mellan de kristall-liknande områdena och resten av den tunna filmen. Ljusmikroskopi har begränsad upplösning på grund av ett fenomen som heter diffraktion, men så länge som ljusmikroskopets upplösning är tillräcklig för att se fasseparation visade det sig att korrelativ ljus- och elektronmikroskopi är en bra metod för att studera morfologin hos tunna filmer av polymerblandningar.
|
353 |
Beta-Peptide Helices As Transmembrane Domains: Aggregation, Recognition and Lipid-Peptide InteractionBanerjee, Amartya 21 September 2018 (has links)
প্লাজমা ঝিল্লি একটি প্রাথমিক কার্যকরী ইউনিট হিসাবে একটি কোষ দক্ষ কার্যকরী জন্য অপরিহার্য হিসাবে গণ্য করা হয়। এই ঝিল্লিগুলি বহিরাগত কোষের কোষের ভিতরের অংশটিকে পৃথক করে এবং পাশাপাশি এটি জুড়ে চলমান নিয়ন্ত্রনের বাধা হিসাবে কাজ করে। প্লাজমা ঝিল্লিগুলি বিভিন্ন বিভিন্ন উপাদানের সাথে গঠিত, তবে সবার মধ্যে, ঝিল্লি প্রোটিনগুলিকে বৈজ্ঞানিক সম্প্রদায়ের দ্বারা প্লাজমা ঝিল্লির প্রধান কাঠামোগত এবং কার্যকরী স্তম্ভগুলির মধ্যে সর্বসম্মতিক্রমে গ্রহণ করা হয়। বৈজ্ঞানিক গবেষণায়, ঝিল্লী প্রোটিনগুলির কার্যকারিতা গুরুতর রোগের জন্য দায়ী বলে মনে করা হয়েছে। সুতরাং, এটি কৃত্রিম ট্রান্সমেম্রেন প্রোটিন ডোমেনগুলি ডিজাইন এবং বিকাশের জন্য একটি দুর্দান্ত বৈজ্ঞানিক আগ্রহ রয়েছে যা স্বাভাবিকের ত্রুটিগুলির সমাধান করতে সক্ষম। এই প্রোটিন ডোমেনগুলির ভাঁজ গঠন এবং ট্রান্সমেমব্রেন গতিবিদ্যা পিছনে আণবিক শক্তি এবং অন্যান্য পদার্থ-রাসায়নিক প্রক্রিয়াগুলি বোঝা হালনাগাদকৃত কৃত্রিম ট্রান্সমিম্ব্রেন প্রোটিন ডোমেনগুলি বিকাশের প্রক্রিয়ার অবিচ্ছেদ্য অংশ।
গত দুই দশক ধরে, বিটা-পেপটাইডগুলি আরও প্রতিশ্রুতিশীল পেপটিডোমিম্যাটিক মোটিফগুলির মধ্যে একটি হিসাবে বিবর্তন হয়েছে। প্রোটিলাইটিক হ্রাসের বিরুদ্ধে অসাধারণ স্থিতিশীলতা এবং স্থিতিশীল হেলিকাল সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার যেমন 14 -12- এবং বিকল্প 10 / 1২-হেলিসেসগুলি 4-6 এমিনো এসিডগুলি তৈরি করার ক্ষমতা, এর পিছনে দুটি প্রধান কারণ peptidomimetics মধ্যে β-peptides এর বিমোচন এন্ট্রি। অন্যান্য গুরুত্বপূর্ণ প্যারামিটারগুলির পাশাপাশি পেপটাইডের হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তটি ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ এবং বিস্তারের ক্ষেত্রে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা বলে মনে করা হয়। পেপটাইডগুলির হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের সরাসরি পরীক্ষামূলক সিদ্ধান্ত অত্যন্ত চ্যালেঞ্জিং হচ্ছে, হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের সম্ভাব্য প্রভাবগুলি কেবলমাত্র তাত্ত্বিকভাবে প্রস্তাবিত। অতএব, এই থিসিসের প্রধান উদ্দেশ্যগুলি ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ এবং বিস্তারের পাশাপাশি পরোক্ষ পরীক্ষার মাধ্যমে সেলুলার উপসর্গের মধ্যে হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের সম্ভাব্য ভূমিকা পালন করা।
সাধারণভাবে, β-peptides নির্দিষ্ট হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্ত থাকে তবে প্রাকৃতিকভাবে ঘটমান α-peptide analogues এর তুলনায় বিপরীত দিকে থাকে। ধারণাটি হল বিটা-পেপটাইডের একটি ধরণের সনাক্তকরণ এবং সংশ্লেষ করা যার প্রায় মোট কোনও হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্ত নেই এবং β-peptides সহ এবং হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল ছাড়া ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশ স্টাডিজগুলি অন্যান্য সমস্ত পরামিতিগুলিকে ধ্রুবক রাখে। ক্ষেত্রে, তারা ঝিল্লি সন্নিবেশের জন্য কোন ডিফারেনশিয়াল ক্ষমতা প্রদর্শন করে, এটি পরীক্ষামূলকভাবে নিজ নিজ পদার্থ-রাসায়নিক ঘটনায় হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোলের ভূমিকা নির্দেশ করবে। ব্যাপক গবেষণার পরে, বিকল্প β3 / β2-amino অ্যাসিডের সংযোজিত বিকল্প 10/12-হেলিকাল β-peptides তাদের অনন্য রূপান্তরিত অভিযোজন কারণে সামগ্রিক অলঙ্কৃত হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল পাওয়া যায় নি। অতএব, বিভিন্ন ধরণের β-peptides সহ 14-, 12- এবং বিকল্প 10/12-হেলিক্যাল পেপটাইড তুলনীয় ট্রান্সমেম্রেন দৈর্ঘ্য এবং ক্রম সহ বিভিন্ন সিন্থেটিক কৌশল মিশ্রিত করে সংশ্লেষিত করার পরিকল্পনা করা হয়েছে, যেমন মাইক্রোওয়েভ সহায়তায় ম্যানুয়াল SPPS, অ- মাইক্রোওয়েভ সহায়তায় ম্যানুয়াল SPPS, এবং ফ্লুরোস-ট্যাগ সংযুক্ত তরল ফেজ পেপটাইড সংশ্লেষণ। পরের ধাপে, পেপাইডাইডগুলির ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশ হাইড্রোফোবিক মাইক্রো-এনভায়রনমেন্ট সংবেদনশীল ট্রপ-ফ্লোরেসেন্স স্পেকট্রোস্কপি দ্বারা পরীক্ষা করা হবে। তিনটি ভিন্ন লিপিড, ডিএলপিসি / ডিএমপিসি / পিওপিসি এর একই গোষ্ঠীটি বিভিন্ন 14-, 12-এবং বিকল্প 10/12-হেলিক্যাল পেপাইডাইডের জন্য তুলনামূলক দৈর্ঘ্যের সাথে এইভাবে নির্বাচিত হয় যে নেতিবাচক হাইড্রোফোবিক মেলেম্যাচ ধীরে ধীরে একটি প্রায় পুরোপুরি hydrophobic ম্যাচিং পরিস্থিতি। এটি ভালভাবে জানা গেছে যে নেতিবাচক হাইড্রোফোবিক মেলেম্যাচের থ্রেশহোল্ড মানের উপরে ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশ সম্ভব নয়। অন্য দিকে, ইথানল মত শর্ট চেইন অ্যালকোহল, অ্যাসিড চেইন interdigitating দ্বারা লিপিড ঝিল্লি বেধ কমানোর একটি উচ্চারণ প্রভাব ভোগ করতে পরিচিত। অতএব, ETOH এর ক্রমবর্ধমান বৃদ্ধি ঘনত্বটি বিভিন্ন পেপটাইডের জন্য ব্যবহার করা হবে এবং একই লিপিডের জন্য একই পেপাইডাইডগুলির জন্য প্রতিটি পেপাইডাইডের জন্য প্রয়োজনীয় ন্যূনতম থ্রেশহোল্ড ঘনত্বের অনুরূপ নেতিবাচক হাইড্রোফোবিক মেলেম্যাচটি সাবধানে ন্যূনতম ক্ষতিপূরণ নেতিবাচক ক্ষতিপূরণ হিসাবে পর্যবেক্ষণ করা হবে। Trp-fluorescence বর্ণালী ক্রিয়ার সাহায্যে সফল ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশের জন্য অপরিসীম প্রয়োজন। এই পরীক্ষামূলক ফলাফল থেকে, এই সিদ্ধান্তে পৌঁছানো সম্ভব হবে যে পেপাইডাইডটি ETOH- এর আরো কম ঘনত্বের প্রয়োজন, যা নেতিবাচক মেলামেশের উচ্চতর ক্ষতিপূরণ, লিপিড ঝিল্লিতে পুনর্গঠন করতে সফলভাবে, ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ এবং বিস্তারের দিকে কম প্রবণ। ক্ষেত্রে, হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের সাথে এবং পেপাইডাইডগুলি এই আচরণের প্রতি কোনও ডিফারেনশিয়াল প্রবণতা প্রদর্শন করে, এটি পরোক্ষভাবে নির্দেশ করে এবং পরীক্ষামূলকভাবে ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ এবং স্প্যানিংয়ের মধ্যে হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের উল্লেখযোগ্য ভূমিকা যাচাই করবে (যেহেতু পেপাইডাইডগুলির মধ্যে প্রধান পার্থক্য হল হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের উপস্থিতি এবং অনুপস্থিতি)।
তাছাড়া, লিপিড পরিবেশের অভ্যন্তরে যখন চারিত্রিক হেলিক্যাল প্যাটার্নটি রক্ষণাবেক্ষণ করা হয় কিনা তা ব্যাখ্যা করার জন্য, বিভিন্ন পেপাইডাইডগুলির দ্বিতীয় হেলিক্যাল কাঠামো সমাধান এবং পাশাপাশি অভ্যন্তরীণ লিপিড ভিসিক্যালগুলিতে নির্ধারণ করা হবে। তাপমাত্রা নির্ভর সিডি-স্পেকট্রসকপি দ্বারা সমাধান হিসাবে তুলনায় লিপিড vesicles ভিতরে যখন 14- এবং 10/12-হেলিক্যাল পেপটাইড স্থিতিশীলতা পরিবর্তন করা হয় কিনা তা পরীক্ষা করা হবে। হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তটি সমাধান বা অভ্যন্তরীণ লিপিড vesicles মধ্যে সেকেন্ডারি হেলিকাল কাঠামো স্থিতিশীল করতে কোনো প্রভাব আছে কিনা তাও ইঙ্গিত করে।
অবশেষে, 6-অ্যামিনো অ্যাসিড দীর্ঘ শৃঙ্খল চেইন 14-হেলিকাল এবং 10 / 1২-হেলিকাল 5 (6) -ফ্যাম সংযুক্ত পেপটাইডগুলি মানব ব্রোঞ্চিয়াল এডেনোকার্কিনোমা সেল লাইন A549 ব্যবহার করে সেলুলার আপটেক স্টাডিজের জন্য সংশ্লেষিত হয়। প্রথমটি ক্লোজোজেনিক অ্যাস এবং এমটিটি-অ্যাস দ্বারা একই কোষ লাইনে সাইটোটক্সিসটিটি পরীক্ষা করা হয়। যদি 1 μM ঘনত্ব না হওয়া পর্যন্ত অ-সাইটোটক্সিক পাওয়া যায়, তাহলে ফ্লোরোসেন্স অ্যাক্টিভেটেড সেল সোর্সিং (FACS) দ্বারা পরিমাণগত সেলুলার উত্তোলনের দক্ষতার দিকে আরও গবেষণা 14- এবং বিকল্প 10/12-হেলিক্যাল পেপাইডাইডগুলি হয়। একটি সুপরিচিত কোষ তীক্ষ্ণ পেপটাইড, এইচআইভি -1 ট্যাট, একটি রেফারেন্স মান হিসাবে ব্যবহৃত হয়। দুটি লক্ষ্য পেপটাইডগুলির মধ্যে সেলুলার আপটেক কার্যকারিতাগুলির মধ্যে কোন পার্থক্য পরীক্ষামূলকভাবে নির্দেশ করবে যে হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তটি ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশ এবং বিস্তারকে প্রভাবিত করে না তবে সেলুলার অ্যাকটেককেও নিয়ন্ত্রণ করে। FACS ফলাফলগুলি নিশ্চিত এবং সমর্থন করার জন্য, পেপাইডাইডগুলি কন confocal লেজার স্ক্যানিং ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কপি অধীনে দৃশ্যমান হবে। মাইক্রোস্কোপি ইমেজিং প্রদর্শন করবে যে টার্গেট পেপাইডগুলি প্রকৃতপক্ষে সেল অনুপ্রবেশের মাধ্যমে অভ্যন্তরীণ হয় কিনা বা শুধুমাত্র ঝিল্লিতে আটকা পড়ে। উপরন্তু, যদি কোন লক্ষ্য β-peptides উল্লেখযোগ্য কোষ অনুপ্রবেশ ক্ষমতা পাওয়া যায়, এটি নতুনত্ব, হাইড্রোফোবিক, uncharged সেল ভেতরে পেপটাইড (সিপিপি) প্রার্থী যারা proteases উপস্থিতি স্থিতিশীল স্থিতিশীল দিকে একটি নতুন বর্ণমালা খুলতে হবে।
অবশেষে, এই সমস্ত গবেষণাগুলি পরীক্ষামূলকভাবে ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ, বিস্তার এবং সেলুলার উপসাগরীয় অঞ্চলে ঝিল্লি প্রোটিন ডোমেনের হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের নিয়ন্ত্রক প্রভাবের উপর আলোকপাত করবে। এই তথ্যটি এই গুরুত্বপূর্ণ পদার্থ-রাসায়নিক ঘটনাগুলিতে পেপটাইড হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের প্রভাবকে মোকাবেলা করবে এবং β-পেপটাইড ভিত্তিক মডেল ট্রান্সমেম্রেন ডোমেন সিস্টেমগুলি পাশাপাশি β-পেপটাইড-ভিত্তিক নতুন প্রজন্মের কোষ তীব্র পেপটাইডগুলি ডিজাইনে সহায়তা করবে।
|
354 |
Entwicklung molekularer Werkzeuge zur Erforschung des LipidstoffwechselsPinkert, Thomas 11 July 2017 (has links)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden fluoreszierende Sphingomyelin-Analoga zu Studium der sauren Sphingomyelinase (ASM) synthetisiert. Ausgehend von L-Serin wurde ein Sphingosin-Derivat mit natürlicher Stereochemie dargestellt. Anschließend wurde mittels Phosphorodichloridat-Chemie eine Aminoethylphosphat-Gruppe installiert. Zweifache Fluoreszenzmarkierung ergab Sonden mit der Fähigkeit zu Förster-Resonanzenergietransfer (FRET). Diese wurden als Substrate der ASM akzeptiert und erlaubten die Verfolgung der Enzymaktivität in vitro. Durch die Analyse der photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore wurde das allgemeine Konzept der Phasentrennungs-gestützten Signalverstärkung (PS) abgeleitet. Dieses Konzept wurde erfolgreich bestätigt durch die Synthese einer 30-mal leistungsfähigeren zweiten Generation der FRET-Sonde. Ein homogener Assay wurde entwickelt, der die Quantifizierung der ASM-Aktivität erlaubte. Unter Verwendung von gereinigter rekombinanter humaner ASM, HeLa-Zelllysaten oder Lysaten von murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Enzymquelle wurde ausschließlich unter den von der ASM bevorzugten Bedingungen eine vollständige und spezifische Hydrolyse der Sonde beobachtet. Des Weiteren erlaubte die Sonde die Detektion relativer Unterschiede der Aktivität der ASM in kultivierten MEFs mittels Fluoreszenzmikroskopie mit Zweiphotonenanregung (2PE). / Fluorescent sphingomyelin analogues have been synthesized to probe the acid sphingomyelinase (ASM). Starting from L-serine, a sphingosine with natural stereochemistry was synthesized. Subsequently, phosphorodichloridate chemistry was used to install an aminoethyl phosphate moiety. Dual fluorescent labeling afforded probes capable of Förster resonance energy transfer (FRET). They were recognized as substrates of ASM and allowed for monitoring of the enzyme’s activity in vitro. Through analysis of the fluorophores’ photophysical properties, the general concept of partition aided amplification of a FRET probe’s signal (PS) was developed. This concept was successfully confirmed by the synthesis of a second-generation probe with 30-fold improved response. A homogenous assay was developed, which allowed for a quantitation of ASM activity. Using either purified recombinant human ASM, or lysates of HeLa cells or mouse embryonic fibroblasts (MEFs) as an enzyme source, complete and specific cleavage was observed exclusively under conditions preferred by ASM. Furthermore, the probe enabled the detection of relative levels of ASM activity in cultivated MEFs using fluorescence microscopy with two-photon excitation (2PE).
|
355 |
Generation of Novel Photochromic GFPs: Fluorescent Probes for RESOLFT-type Microscopy at Low Light Intensities / Entwicklung neuartiger photochromer GFPs: fluoreszente Marker für die RESOLFT-basierte Mikroskopie bei geringen LichtintensitätenGrotjohann, Tim 18 April 2012 (has links)
No description available.
|
356 |
Laterale Organisation von Shiga Toxin gebunden an Gb3-haltige Modellmembranen / Lateral Organisation of Shiga Toxin Bound to Model Membranes Containing Gb3Windschiegl, Barbara 23 January 2009 (has links)
No description available.
|
357 |
Quantitation Strategies in Optically Sectioning Fluorescence Microscopy / Quantifizierungsstrategien in der optisch schnittbildenden FluoreszenzmikroskopieWeigel, Arwed 15 January 2009 (has links)
No description available.
|
358 |
Investigation of membrane fusion as a function of lateral membrane tension / Investigation of membrane fusion as a function of lateral membrane tensionKliesch, Torben-Tobias 07 June 2017 (has links)
No description available.
|
359 |
Theoretical and Numerical Analysis of Super-Resolution Without Grid / Analyse numérique et théorique de la super-résolution sans grilleDenoyelle, Quentin 09 July 2018 (has links)
Cette thèse porte sur l'utilisation du BLASSO, un problème d'optimisation convexe en dimension infinie généralisant le LASSO aux mesures, pour la super-résolution de sources ponctuelles. Nous montrons d'abord que la stabilité du support des solutions, pour N sources se regroupant, est contrôlée par un objet appelé pré-certificat aux 2N-1 dérivées nulles. Quand ce pré-certificat est non dégénéré, dans un régime de petit bruit dont la taille est contrôlée par la distance minimale séparant les sources, le BLASSO reconstruit exactement le support de la mesure initiale. Nous proposons ensuite l'algorithme Sliding Frank-Wolfe, une variante de l'algorithme de Frank-Wolfe avec déplacement continu des amplitudes et des positions, qui résout le BLASSO. Sous de faibles hypothèses, cet algorithme converge en un nombre fini d'itérations. Nous utilisons cet algorithme pour un problème 3D de microscopie par fluorescence en comparant trois modèles construits à partir des techniques PALM/STORM. / This thesis studies the noisy sparse spikes super-resolution problem for positive measures using the BLASSO, an infinite dimensional convex optimization problem generalizing the LASSO to measures. First, we show that the support stability of the BLASSO for N clustered spikes is governed by an object called the (2N-1)-vanishing derivatives pre-certificate. When it is non-degenerate, solving the BLASSO leads to exact support recovery of the initial measure, in a low noise regime whose size is controlled by the minimal separation distance of the spikes. In a second part, we propose the Sliding Frank-Wolfe algorithm, based on the Frank-Wolfe algorithm with an added step moving continuously the amplitudes and positions of the spikes, that solves the BLASSO. We show that, under mild assumptions, it converges in a finite number of iterations. We apply this algorithm to the 3D fluorescent microscopy problem by comparing three models based on the PALM/STORM technics.
|
360 |
In situ three-dimensional reconstruction of mouse heart sympathetic innervation by two-photon excitation fluorescence imagingFreeman, Kim Renee 25 February 2014 (has links)
Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The sympathetic nervous system strongly modulates the contractile and electrical function of the heart. The anatomical underpinnings that enable a spatially and temporally coordinated dissemination of sympathetic signals within the cardiac tissue are only incompletely characterized. In this work we took the first step of unraveling the in situ 3D microarchitecture of the cardiac sympathetic nervous system. Using a combination of two-photon excitation fluorescence microscopy and computer-assisted image analyses, we reconstructed the sympathetic network in a portion of the left ventricular epicardium from adult transgenic mice expressing a fluorescent reporter protein in all peripheral sympathetic neurons. The reconstruction revealed several organizational principles of the local sympathetic tree that synergize to enable a coordinated and efficient signal transfer to the target tissue. First, synaptic boutons are aligned with high density along much of axon-cell contacts. Second, axon segments are oriented parallel to the main, i.e., longitudinal, axes of their apposed cardiomyocytes, optimizing the frequency of transmitter release sites per axon/per cardiomyocyte. Third, the local network was partitioned into branched and/or looped sub-trees which extended both radially and tangentially through the image volume. Fourth, sub-trees arrange to not much overlap, giving rise to multiple annexed innervation domains of variable complexity and configuration. The sympathetic network in the epicardial border zone of a chronic myocardial infarction was observed to undergo substantive remodeling, which included almost complete loss of fibers at depths >10 µm from the surface, spatially heterogeneous gain of axons, irregularly shaped synaptic boutons, and formation of axonal plexuses composed of nested loops of variable length. In conclusion, we provide, to the best of our knowledge, the first in situ 3D reconstruction of the local cardiac sympathetic network in normal and injured mammalian myocardium. Mapping the sympathetic network connectivity will aid in elucidating its role in sympathetic signal transmisson and processing.
|
Page generated in 0.0467 seconds