Orientador : Prof. Dr. Roberto Andreatini / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 30/03/2017 / Inclui referências / Resumo: A ansiedade está relacionada a alteração nas vias de neurotransmissão. Tem-se que substâncias disponíveis para o tratamento apresentam múltiplos efeitos adversos. Assim, busca-se alternativas para o tratamento. Destacando os óleos essenciais do gênero Citrus, como o óleo de Citrus sinensis. O objetivo deste estudo foi examinar o efeito ansiolítico da inalação do óleo essencial de laranja doce (Citrus sinensis) em modelos de ansiedade. Bem como, a relação deste efeito com os sistemas de neurotransmissão. Foram utilizados camundongos machos Swiss. Os animais foram submetidos a 15 minutos de inalação, com óleo essencial (Citrus sinensis), antes dos testes Esconder Esferas, Hipofagia Induzida por Neofobia, Caixa Claro-Escuro, Labirinto em Cruz Elevado, Campo Aberto e Caixa de Movimentação Espontânea. Posteriormente, foram realizados desafios farmacológicos para testar a influência dos sistemas de neurotransmissão (noradrenérgico, gabaérgico, canabinóide, serotonérgico e nitrinérgico) no efeito tipo ansiolítico do óleo essencial. Adicionalmente foi realizada a análise NADPH-diaforase, no córtex cerebral dos animais. As conclusões acerca do estudo demonstram que o óleo essencial de Citrus sinensis apresentou efeito ansiolítico, no modelo de Esconder Esferas, na concentração de 5% e 10%. O teste da Caixa Claro-Escuro indicou que o tratamento com o óleo essencial aumentou significativamente o tempo de permanência no lado claro. Parâmetro consistentemente relacionado, neste modelo, a um efeito tipo ansiolítico. O teste de Hipofagia Induzida por Neofobia demonstrou uma diminuição do tempo de latência para iniciar a ingesta, sendo este um indicativo de efeito ansiolítico. No teste do Campo Aberto os animais, não apresentaram alteração da atividade locomotora, sendo, entretanto, observada alteração da emocionalidade (diminuição significativa do número de bolos fecais). Sugerindo um efeito tipo ansiolítico do óleo essencial de C. sinensis no campo aberto. E no teste do Labirinto em Cruz Elevado os animais demonstraram um aumento do número de entradas e da porcentagem de entradas nos braços abertos. Novamente, não foi observada alteração da atividade locomotora na caixa de movimentação o que é coerente com ausência de alteração do número de entradas nos braços fechados neste modelo, parâmetro considerado índice de atividade locomotora no modelo. Neste modelo, este perfil é condizente com um efeito tipo ansiolítico. O pré-tratamento com picrotoxina não influenciou o efeito do óleo essencial de C. sinensis no modelo esconder esferas, indicando a não participação GABAérgica neste efeito. O resultado do sistema noradrenérgico pode ser considerado inconclusivo. O pré-tratamento com WAY100635 bloqueou o efeito tipo ansiolítico apresentado pelo óleo essencial de C. sinensis, indicando que o sistema serotonérgico mediaria o efeito ansiolítico do óleo essencial de C. sinensis. O antagonista AM251 reverteu o efeito tipo ansiolítico do óleo essencial. Este resultado sugere que o sistema canabinóide participe do efeito tipo ansiolítico do óleo essencial de C. sinensis. Novamente, o óleo essencial de C. sinensis a 5% e o 7-NI apresentaram efeito tipo ansiolítico no modelo esconder esferas, sem alterar significativamente a atividade locomotora. Observou-se que camundongos que receberam inalação de óleo essencial de C. sinensis apresentaram menor expressão de NADPH-diaforase no córtex cerebral. Este resultado é coerente com os resultados encontrados no modelo esconder esferas. Finalmente, a compilação de todos os resultados deste estudo permite sugerir que o óleo essencial de Citrus sinensis (laranja doce), administrado por via inalatória, apresentou efeito tipo ansiolítico em vários modelos de ansiedade, e tal efeito, possivelmente, parece estar sendo mediado pelos sistemas de neurotransmissão nitrinérgico, serotonérgico e canabinóide. Palavras-chave: Ansiedade. Óleo essencial. Citrus sinensis. Esconder Esferas. / Abstract: Anxiety is related to changes in neurotransmission pathways. It has been found that substances available for treatment have multiple adverse effects. Thus, alternatives to treatment are sought. Highlighting the essential oils of the genus Citrus, such as Citrus sinensis oil. The objective of this study was to examine the anxiolytic effect of inhalation of sweet orange essential oil (Citrus sinensis) on anxiety models. As well, the relationship of this effect with neurotransmission systems. Swiss male mice were used. The animals were submitted to 15 minutes of inhalation with essential oil (Citrus sinensis), before the tests Marble burying, Neophobia-Induced Hypophagia, Light-Dark Box, Elevated plus maze, Open Field and Spontaneous Movement Box. Subsequently, pharmacological challenges were performed to test the influence of neurotransmission systems (noradrenergic, gabaergic, cannabinoid, serotonergic and nitrinergic) on the anxiolytic of essential oil. In addition, NADPH-diaphorase analysis was performed in the cerebral cortex of the animals. The conclusions about the study showed that the essential oil of Citrus sinensis showed an anxiolytic effect, in the test of Hide Spheres, in the concentration of 5% and 10%. The Light-Dark Box test indicated that the treatment with the essential oil significantly increased the residence time on the light side. Parameter more consistently related to an anxiolytic effect. The Neophobia-Induced Hypophagia test demonstrated a decrease in the latency time to start the intake, which is indicative of an anxiolytic effect. In the open field test, the animals showed no alteration of the locomotor activity, but an alteration on emotional (significant decrease in the number of stool) was observed. Suggesting an anxiolytic effect of C. sinensis essential oil in the open field. And in the Elevated plus maze test the animals showed an increase in the number of entries and the percentage of entries in the open arms. Again, no change in the locomotor activity was observed in the movement box, which is consistent with the absence of a change in the number of entries in the closed arms in this model, a parameter considered as an index of locomotor activity in the model. In this model, this profile is consistent with an anxiolytic effect. Pretreatment with picrotoxin did not influence the effect of the essential oil of C. sinensis on the test of Marble burying, indicating the GABAergic non-participation in this effect. The outcome of the noradrenergic system may be considered inconclusive. Pre-treatment with WAY100635 blocked the anxiolytic effect of C. sinensis essential oil, indicating that the serotonergic system would mediate the anxiolytic effect of the essential oil of C. sinensis. The AM251 antagonist reversed the anxiolytic effect of the essential oil. This result suggests that the cannabinoid system participates in the anxiolytic effect of the essential oil of C. sinensis. Again, the essential oil of 5% C. sinensis and 7-NI presented an anxiolytic effect in the test of Marble burying, without significantly altering the locomotor activity. It was observed that mice receiving inhalation of C. sinensis essential oil showed lower expression of NADPH-diaphorase in the cerebral cortex. This result is consistent with the results found in the test of Marble burying. Finally, the compilation of all the results of this study suggests that the essential oil of Citrus sinensis (sweet orange), inhalation, presented an anxiolytic effect in several anxiety models, and this effect possibly seems to be mediated by Nitrinergic, serotonergic and cannabinoid neurotransmission. Key words: Anxiety. Essential oil. Citrus sinensis. Marble burying.

Orientador : Prof. Dr. Roberto Andreatini / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 24/11/2016 / Inclui referências : f. 52-70 / Área de concentração / Resumo: O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma desordem psiquiátrica que leva a sérios problemas de saúde para o paciente. Ele é caracterizado por oscilações cíclicas de humor manifestada por diversos sintomas (recorrências de mania, depressão e estados mistos), dificultando o desenvolvimento de um modelo animal adequado. Existem poucos modelos animais para o estudo da mania, sendo a indução do aumento da atividade locomotora pelo uso de substâncias estimulantes do sistema nervoso central (ex. anfetamina (AMP), um dos mais utilizados. Outros modelos já descrito na literatura para indução de mania são através de administrações sistêmicas de lisdexanfetamina (LDX) e quetamina; injeções de ouabaína agudamente via intracerebroventricular (ICV) e pelo modelo não farmacológico de privação de sono, todos esses modelos induzem hiperatividade que é revertida por drogas antimaníacas. Porém, avaliar somente a atividade locomotora nesses modelos já descritos teria suas limitações. As vocalizações ultrassônicas (USV) são emitidas por ratos em situações recompensadoras (ex. acasalamento, abuso de drogas), na frequência de 50-kHz e também em situações aversivas (ex. medo, dor), na frequência de 22-kHz. Foi demonstrado na literatura que animais tratados com AMP, além do aumento da atividade locomotora, esses animais aumentaram também a emissão de USV de 50 kHz e os tratamentos com lítio e tamoxifeno foram capazes de inibir essa vocalização. Sendo assim, nesse trabalho avaliamos as USV em outros modelos animais de mania. No presente estudo, no modelo de mania induzido por LDX, observamos um aumento significativo das USV de 50-kHz, que foram revertidas por tratamento com lítio. Os animais tratados com quetamina não apresentaram aumento significativo nas USV comparado ao seus controles. Quando o modelo de mania foi induzido por ouabaína ICV, observamos um estado misto na emissão das USV. Esses animais apresentaram um aumentos nas USV de 50-kHz e também na emissão das USV de 22-kHz. No modelo de mania induzido por privação de sono, os animais privados de sono por 24 horas (P24) quanto por 72 horas apresentaram um aumento na emissão das USV de 50-kHz. Esse aumento das vocalizações dos animais P24 foi revertida após o tratamento com lítio. Os resultados reportados sugerem que as USV podem ser uma variável de valor comportamental a ser adicionada em modelos animais de mania em ratos, refinando e aprofundando esses modelos e aumentando seus valor translacional. / Abstract: The Bipolar Disease (BD) is a psychiatry disorder that leads to several health problems and have great impact in the patient's life. The BD is characterized by cyclic humor oscillations manifested by several symptoms (manic recurrences, depression and mixed states), making difficult to develop a suitable animal model. There are few animal models to study mania, and the increase of locomotor activity induction by stimulants of the central nervous system, like amphetamine (AMP), is one of the most used. Other mania models already described on literatures are induced by systemic administration of lisdexamfetamine (LDX) and ketamine; injections of ouabain via intracerebroventricular (ICV) and the non pharmacological mania model induced by sleep deprivation, all these models induce hyperactivity and it is reverted by anti-manic drugs. However, to evaluate only the locomotor activity on these models would have some limitations. The ultrasonic vocalization (USV) are emitted by rats in rewarded situation (i.e. mating, drug abuse), on 50-kHz frequency, as well on aversive situation (i.e fear, pain), on 22-kHz frequency. Have been shown in literature that animals treated by AMP, besides the hyperactivity, increased the total number of USV of 50- kHz and treatments by lithium and tamoxifen were able to inhibit the USV. Therefore, in this work we evaluated the USV in other mania animal models. In the present study, on LDX induced model we observed a significant increase on 50-kHz USV, where was reverted by lithium treatment. Animals treated by ketamine did not showed signifcant increse on the number of USV compared to control group. When induced by ouabain ICV, we observed a mixed state on USV emission. These animals showed an increase on 50-kHz USV and also on 22-kHz USV. On mania model induced by sleep deprivation, the animals deprived for 24 hours (P24) and for 72 hours presented and increase on 50-kHz USV. The increase of the USV induced by P24 were reverted by lithium treatment. The results reported suggest that USV can be a valuable behavioral variable to be added in mania animal models in rats, refining and increasing the translational value.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present study examined the antinociceptive effects of Geissospermum vellosii in chemical behavioral models of nociception. G. vellosii crude extract, dichloromethane fraction (1-100 mg/kg), or aspidospermine (0.001-1 mg/kg), were administered by p.o. route, 60 min earlier tests. Crude extract produced inhibition of formalin-induced inflammatory nociception and acetic acid-induced visceral nociception. Dichloromethane fraction was able to produce significant antinociception in both phases of formalin and acetic acid-induced nociception. The antinociception caused by dichloromethane fraction in the acetic acid test was significantly attenuated by i.p. pre-treatment of mice with p-chlorophenylalanine methyl ester (PCPA, an inhibitor of serotonin synthesis, 100 mg/kg once a day for 4 consecutive days), or WAY-100635 (5-HT1A receptor antagonist, 0.3 mg/kg). In contrast, G. vellosii antinociception was not affected by i.p. pre-treatment of animals with ketanserin (5-HT2A receptor antagonist, 0.3 mg/kg) or ondansetron (5-HT3 receptor antagonist, 0.5 mg/kg). The isolated compound aspidospermine also was able to reduce the nociception in acetic acid test. Together, these results indicate that G. vellosii produces antinociception in models of chemical nociception through mechanisms that involve an interaction with 5-HT1A receptor of serotonergic system. / O presente estudo examinou o efeito antinociceptivo de Geissospermum vellosii em modelos comportamentais de nocicepção. Geissospermum vellosii - extrato bruto, frações ou compostos foram administrada por via oral, 60 minutos antes dos testes. O extrato bruto produziu inibição da nocicepção inflamatória (segunda fase) induzida por formalina, o que também foi percebido na no teste de contorções induzidas por ácido acético. De todas as frações testadas, a fração diclorometano foi escolhida para a realização da curva doseresposta, sendo capaz de produzir antinocicepção significativa em ambas as fases de formalina e no modelo de nocicepção induzida por ácido acético. A antinocicepção causada pela fração diclorometano no teste do ácido acético foi significativamente atenuada pelo pré-tratamento dos animais com p-chlorophenilalanina-metil-éster (PCPA, um inibidor da síntese da serotonina, 100 mg/kg uma vez por dia durante 4 dias consecutivos, i.p.) ou com WAY- 100635 (antagonista seletivo do receptor 5-HT1A, 0,3 mg/kg, s.c.). Em contrapartida, a antinocicepção produzida pela fração diclorometano não foi afetada pelo pré-tratamento dos animais com cetanserina (antagonista de receptor 5-HT2, 0,3 mg/kg, i.p.) ou ondansetrona (antagonista de receptor 5-HT3, 0,5 mg/kg). O composto isolado aspidospermina também foi capaz de reduzir a nocicepção no teste de contorções induzidas por ácido acético. Em conjunto, estes resultados indicam que G. vellosii produz antinocicepção em modelos de nocicepção através de mecanismos que envolvem uma interação com receptores 5-HT1A do sistema serotoninérgico.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Protium heptaphyllum March (Burseraceae) populary known as âalmÃcegaâ is a popular medicinal plant largely encountered in the Amazon region, various States of Brazil and in several South American Countries. The oily amorphous exudate obtained from this plant is widely used in skin diseases, healing of ulcers, and as an analgesic and anti-inflamatory agent. Phytochemical studies reveled the presence of several monoterpenes and pentacyclic triterpenes such as a mixture of α- e β â amyrin, maniladilol and breine. The present study aimed to investigate the general toxicity and to establish the pharmacological activity of resin and is major triterpenoid mixture, the α and β â amyrin. In toxicity tests, both the resin and triterpene mixture exhibited low toxicity to mice. Resin at doses up 5 g/kg, (p.o.) or 2 g/kg (i.p.) and triterpene mixture up to 3 g/kg, (p.o.) or 2 g/kg (i.p.) failed to induce any mortality in mice. In Artemia-lethality test, the calculated (probit analysis) CL50 values for resin and triterpenes were in the order of 42,54  19,96 and 400  27,85 μg/mL, respectively. In pharmacological tests, the resin was analysed for anti-inflamatory (carrageenan-induced edema, cotton pellet-induced granuloma, and vascular permeability increase induced by i.p. acetic acid) and gastroprotective (absolute ethanol and acidified ethanol) effects, whereas the triterpene mixture was examined in assays that demostrate gastroprotective (against lesions induced by absolute ethanol), antipruritus (against pruritus induced by Dextran T40 and compound 48/80), acute and visceral antinociceptive (test of subplantar and intracolonic capsaicin) and hepatoprotective (against acetaminophen- and Ga1N/LPS-induced models of hepatitis) effects. In anti-inflammatory test, the resin (200 e 400 mg/kg, p.o.) although failed to modify the carrageenan-induced acute rat paw-edema response, it caused signficant inhibitions at a dose of 400mg/kg on the formation of cotton pellet-induced granulomas and on the vascular permeability increase induced by i.p. acetic acid in mice. In addition, the (200 e 400 mg/kg) showed gastroprotective potential against absolute- and acidified ethanol- induced gastric lesions as evidenced from siginificant diminution in lesion scores, restoration of the ethanol-induced depletion of non-protein sulfhydryl content More over, the resin demonstrated an antisecretory effect on gastric acid secretion induced in 4-h pylorus ligated rats. The triterpene mixture also produced similar gastroprotection against ethanol-induced lesions in a manner similar to capsaicin, a pungent principle from hot peppers. This protection possibly involves capsaicin-sencitive primary afferents since it was abolished in mice pretreated with a neurotoxic dose of capsaicin. The α and β â amyrin mixture (100 mg/kg) manifested antipruritus effect as evidenced from suppression of scratching behaviour in the mouse model of prurits induced by s.c. injections of dextran T40 and compound 48/80. Besides, it also produced an antiedematogenic effect in model of hind paw edema induced by histamine, compound 48/80 and dextran T40 and markedly depressed the compound 48/80-elicited rat mast cell degranulation (ex vivo). An antinociceptive effect of triterpenoid mixture (3-100 mg/kg) was observed in capsaicin-evoked somatic (1.6 μg/site, suplantar) and visceral (149 μg, intracolonic) models of nociception in mice. Greater suppression of nociceptive behaviors were evidenced at a dose of 10 mg/kg α and β â amyrin mixture, which mimicked the effect produced by ruthenium red, a non-competitive capsaicin antagonist. The antinociceptive effect of triterpenoid mixture was found to be naloxone (2 mg/kg)- sensitive, suggesting an opioid mechanism. A blockade by triterpene mixture was also evidenced on the hyperthermic but not the hypothermic response of subcutaneously administered capsaicin (10 mg/kg) suggesting possible incolvement of TRPV1 receptor. In open-field and rota-rod tests, the triterpene mixture did not manifest signs of either sedation or motor abnormality in mice that could account for the observed antinociception. In the model of acetaminophen (500 mg/kg)-induced hepatotoxicity, the triterpenoid mixture (50 and 100 mg/kg) effectively reduced the elevated serum AST and ALT levels, restored the depleted GSH and markedly diminished the histopathological alterations. Potentation of pentobarbital-sleeping time was, however observed at these doses of triterpenoid, incidating a probable suppression of cytochrome P450 and thus a diminished metabolite formation that may account for reduced acetaminophen toxicity. The α- and β â amyrin mixture offered complete protection against the mortality associated with Ga1N/LPS , but caused only a moderate diminution of serum enzymes and histopathological alterations. Taken together, these findings show that the resin and α- and β â amyrin mixture possess low toxicity and have a wide therapeutic potential with anti-inflammatory, antinociceptive, antipruritus, and gastro- and hepato-protective actions. Most of the effects of triterpenoid mixture appear to involve in part the participation of primary sensory afferents in their actions. / A espÃcie Protium heptaphyllum (Aubl.) March (Burseraceae) popularmente conhecida como almÃcega, à encontrada na regiÃo AmazÃnica, em vÃrios Estados do Brasil e paÃses da AmÃrica do Sul. Esta espÃcie exsuda uma resina oleosa e amorfa, usada na medicina popular como analgÃsico, cicatrizante e expectorante. Estudos fitoquÃmicos demonstraram a presenÃa de monoterpenos e triterpenos pentacÃclicos, tais como α - amirina e β - amirina, maniladilol e breina. O presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos tÃxicos e farmacolÃgicos da resina e de seus constituintes majoritÃrios, a mistura de triterpenos α e β â amirina. Na avaliaÃÃo dos efeitos tÃxicos observamos a toxicidade aguda destes produtos em camundongos e Artemia sp. Analisando os efeitos sistÃmicos, avaliamos a atividade antiinflamatÃria da resina (edema de pata induzido por carragenina, granuloma induzido por âpelletsâ de algodÃo e permeabilidade vascular induzida por Ãcido acÃtico) e da mistura de α e β â amirina (edema induzido por histamina, serotonina, dextrana T40 e composto 48/80). Examinamos ainda as atividades gastroprotetora e antisecretÃria da resina (lesÃes gÃstricas induzidas pelo etanol absoluto e etanol acidificado e secreÃÃo Ãcida induzida pela ligaÃÃo pilÃrica) e as atividades gastroprotetora (lesÃes gÃstricas induzidas pelo etanol absoluto, com animais dessensibilizados por capsaicina), antipruriginosa (prurido induzido pelo dextrana T40 e composto 448/80 e desgranulaÃÃo de mastÃcitos ex vivo) antinociceptiva (nocicepÃÃo induzida pela administraÃÃo subplantar e intracolÃnica de capsaicina, resposta hipotÃrmica induzida por capsaicina) e hepatoprotetora (lesÃes hepÃticas induzidas por acetaminofeno e Ga1N/LPS) da mistura de α e β â amirinas. NÃo foi possÃvel estabelecer as DL50 da resina (atà 5 g/kg, v.o. e 1 g/kg, i.p.) e da mistura de α e β â amirina (atà 3 g/kg, v.o. e atà 2 g/kg, i.p.) em camundongos. A mistura de α e β â amirina, mas nÃo a resina, mostrou toxicidade para Artemisa sp, sendo as CL50 de 42,54  19,96 e 400  27,85 μg/mL, respectivamente. Nos modelos de permeabilidade vascular induzido por Ãcido acÃtico (camundongo) e granuloma induzido por âpelletâ de algodÃo (ratos), a resina demonstrou efeito antiinflamatÃrio significativo na dose de 400mg/kg, reduzindo a permeabilidade vascular e o peso seco do granuloma. Contudo, a reina nÃo apresentou atividade sobre edema induzido por carragenina (ratos). Adicionalmente, a resina preveniu as lesÃes gÃstricas induzidas por etanol absoluto e etanol acidificado, alÃm de impedir a depleÃÃo dos grupos sulfidrilas produzida pelo etanol absoluto nas doses de 200 e 400 mg/kg. Um efeito antisecretÃrio da resina (200 e 400mg/kg) foi observado no modelo de secreÃÃo Ãcida induzida pela ligaÃÃo pilÃrica em ratos. A mistura de α e β â amirina tambÃm exibiu atividade gastroprotetora inibindo as lesÃes gÃstricas por etanol absoluto, cujo mecanismo parece envolver os neurÃnios sensoriais primÃrios sensÃveis à capsaicina. A administraÃÃo oral dos triterpenos α e β â amirina (100 mg/kg), apresentou atividade antiedematogÃnica, nos modelos de edema de pata induzidos por histamina, composto 48/80 e dextrana T40, mas nÃo sobre o edema induzido por serotonina. A atividade antipruriginosa tambÃm foi observada com as α e β â amirina nas doses variando de 50 a 200 mg/kg, em modelos de prurido induzido por dextrana T40 e pelo composto 48/80 e na reduÃÃo (100 mg/kg) da degranulaÃÃo de mastÃcitos peritoneais ex vivo pelo composto 48/80. O efeito antinociceptivo da mistura, nas doses de 3 a 100 mg/kg, foi verificado atravÃs da inibiÃÃo dos comportamentos de nocicepÃÃo induzidos pela administraÃÃo subplantar ou intracolÃnica de capsaicina em camundongos. A antinocicepÃÃo produzida por estes triterpenos (10 mg/kg) sobre o tempo de lambedura induzido pela capsaicina (1,6 μg/20 μL) nÃo foi potencializada nem revestida pelo vermelho de rutÃnio (1,5 mg/kg), mas foi significativamente inibida pela naloxona (2 mg/kg), sugerindo mecanismo opiÃide. A participaÃÃo dos receptores α2 - adrenÃrgicos neste efeito tambÃm foi eliminada, tendo em vista que a ioimbina nÃo reverteu o efeito antinociceptivo das amirinas no modelo de nocicepÃÃo visceral induzida pela capsaicina. Estes triterpenos bloquearam ainda a hipertermia induzida pela capsaicina (10 mg/kg), mas nÃo reverteram a resposta hipotÃrmica induzida por este agente, sugerindo a participaÃÃo do receptor vanilÃide (TRPV1) no efeito antinociceptivo das amirinas. Nos modelos de hepatoxidade, a mistura de α e β â amirina (50 e 100 mg/kg) reduziu o aumento dos nÃveis sÃricos de ALT e AST e restabeleceu os nÃveis de GSH hepÃticos, diminuindo as alteraÃÃes histopatolÃgicas induzidas pelo acetaminofeno (500 mg/kg), alÃm de potencializar o tempo de sono induzido por pentobarbital sÃdico (50 mg/kg), indicando que este efeito hepatoprotetor envolve a inibiÃÃo do citocromo P â 450. A mistura ofereceu ainda completa proteÃÃo contra a mortalidade induzida por Ga1N/LPS, reduzindo as lesÃes hepÃticas em camundongos e reduzindo os nÃveis sÃricos de ALT, mas nÃo de AST ou GSH hepÃticos, sugerindo um possÃvel feito neuroimunomodulatÃrio neste modelo. Os triterpenos α e β â amirina nas doses variando de 3 a 30 mg/kg, nÃo manifestam efeitos sedativos ou incoordenaÃÃo motora em camundongos. A resina e mistura de α e β â amirina possuem baixa toxicidade e atividades antiinflamatÃria e gastroprotetora. Os triterpenos α e β â amirina exibiram atividade antipruriginosa, antinociceptiva e hepatoprotetora, cujos efeitos envolvem, pelo menos em parte, a participaÃÃo dos neurÃnios aferentes sensoriais primÃrios.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A mucosite à caracterizada por Ãlceras e sintomas orais e intestinais causados por drogas citotÃxicas, onde prostaglandinas (PG) e citocinas podem exercer efeitos prÃ-inflamatÃrios. O objetivo desse estudo foi verificar os efeitos do celecoxib (CLX) e indometacina (IND), inibidores da sÃntese de PG, e de pentoxifilina (PTX) e talidomida (TLD), inibidores da sÃntese de citocinas, em mucosites induzidas por antineoplÃsicos. Injetou-se 5-fluorouracil (FU 60 e 40 mg/kg-ip) em hamsters Golden machos, para a mucosite oral (MO); e metotrexato (MTX 2,5 mg/kg-sc) em ratos Wistar e em camundongos C57 machos, para a mucosite intestinal (MI). Grupos de hamsters com MO foram tratados sc com CLX (7,5, 15 ou 30 mg/kg), IND (0,25, 0,5 ou 1 mg/kg), PTX (5, 15 ou 45 mg/kg) ou TLD (10, 30 ou 90 mg/kg) diariamente durante 10 d e avaliados os seguintes parÃmetros: anÃlises macroscÃpica e histopatolÃgica, atividade da mieloperoxidase (MPO), leucograma e variaÃÃo de massa corpÃrea. O FU causou pico das ulceraÃÃes e abscessos no 10 dia (P<0,05), sendo confirmado pela anÃlise histolÃgica e atividade da MPO. Observou-se leucocitose, Ãs custas de neutrÃfilos, e perda acentuada de massa corpÃrea. CLX (7,5 e 15 mg/kg), mas nÃo IND, reduziu as Ãlceras e abscessos (66,6%), a leucocitose e a perda de peso. No entanto, CLX 30 mg/kg apresentou perda de eficÃcia antiinflamatÃria, causando aumento da mucosite oral. PTX (45 mg/kg) e TLD (90 mg/kg) reduziram a intensidade dos achados (66,6%), diminuindo as ulceraÃÃes e abscessos no 10 dia. Apenas PTX reduziu a leucositose induzida pela mucosite oral induzida. Na mucosite intestinal, ratos foram tratados ip com CLX (7,5, 15 ou 30 mg/kg), PTX (15, 30 ou 60 mg/kg) ou TLD (10, 30 ou 90 mg/kg) durante 5 dias, e avaliados pela anÃlise morfomÃtrica, permeabilidade intestinal via teste da lactulose e manitol, imunohistoquÃmica para detecÃÃo de TNF-&#945;, leucograma e variaÃÃes de massa corpÃrea, de ingestÃes de lÃquidos e alimentos dos animais. O MTX causou encurtamento dos vilos, aumento da profundidade das criptas, e perda da integridade do epitÃlio, com conseqÃente reduÃÃo da Ãrea absortiva intestinal, principalmente no duodeno, seguido pelo jejuno e em menor grau, no Ãleo. Observou-se leucopenia no 5 dia, alÃm de reduÃÃo de massa corpÃrea e das ingestÃes de lÃquidos e alimentos. CLX (30 mg/kg) preveniu a reduÃÃo da Ãrea absortiva duodenal em 37%, alÃm de diminuir a leucopenia. NÃo reduziu, porÃm, a perda de peso, nem alterou as ingestÃes de lÃquidos ou alimentos. PTX (15 mg/kg) foi capaz de inibir a reduÃÃo da relaÃÃo vilos/criptas em 38% no duodeno, com diminuiÃÃo da soluÃÃo de continuidade do epitÃlio, do infiltrado inflamatÃrio e conseqÃente proteÃÃo da Ãrea absortiva. Apesar de nÃo ter prevenido a leucopenia ou as baixas ingestÃes de lÃquidos e alimentos, PTX foi capaz de reduzir a perda de massa corpÃrea significantemente. TLD (30 e 90 mg/kg) reduziu em 37% e 29%, respectivamente, a relaÃÃo vilos/criptas duodenais induzida por MTX. TLD (90 mg/kg) causou reduÃÃo significativa da marcaÃÃo de TNF-&#945; tanto ao nÃvel de epitÃlio como na lÃmina prÃpria, quando comparado a mucosite nÃo tratada. Entretanto, TLD nÃo reduziu a leucopenia vista no 5 dia, nem preveniu a reduÃÃo de massa corpÃrea e ingestÃes de lÃquidos ou alimentos. Camundongos C57BL/6 knockout para receptor R1 de TNF-&#945; (TNF-R1-/-) apresentam relaÃÃo vilos/criptas reduzida em relaÃÃo a animais normais. Estes foram submetidos a MI por MTX e mostraram menores alteraÃÃes ao nÃvel de jejuno e Ãleo. Assim, os resultados demonstraram que os modelos animais de mucosites oral e intestinal reproduziram importantes aspectos dessa patologia em humanos. PTX e TLD e em menor grau, CLX, reduziram a inflamaÃÃo nas mucosas induzidas por antineoplÃsicos, sugerindo-se que o TNF-&#945; possa ser um mediador importante nas mucosites, enquanto que as prostaglandinas possuam uma funÃÃo dependente de sua concentraÃÃo

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Estudos anteriores demonstraram que uma fraÃÃo rica (F(3-5)) em alcalÃides indÃlicos extraÃda das cascas da raiz de Aspidosperma ulei Markgr. exibe funÃÃo prÃ-eretil in vivo e relaxamento em corpos cavernosos de coelhos in vitro. Um estudo recente demonstrou que 17-nor-subincanadina E (SEC), um alcalÃide extraÃdo das cascas do caule da mesma planta, apresentou atividade prÃ-eretil in vivo. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito desse alcalÃide sobre o tÃnus de diferentes tipos de musculatura lisa de coelhos e investigar o mecanismo de aÃÃo da substancia sobre o mÃsculo liso cavernoso in vitro. Os tecidos foram montados em banhos de 5 ml contendo soluÃÃo de Krebs-Henseleit (CO2 5% - O2 95%; 37ÂC). A resposta relaxante mÃxima induzida por SEC (1 â 100 Âg/ml) em segmentos de corpos cavernosos de coelhos contraÃdos com fenilefrina (PHE-10&#956;M) foi de 100%, e apresentou um efeito relaxante preferencial para esse tecido, IC50[7, 174 (3,155 - 16,31) &#956;g/ml]. SEC promoveu tambÃm relaxamento em anÃis de aorta na presenÃa e na ausÃncia de endotÃlio, IC50[29,76 (90,32 â 115,6) &#956;g/ml] e IC50[26,13 (75,83 â 119,9) &#956;g/ml], respectivamente, anÃis de traquÃia IC50[60,25 (0,330 â 109,8) &#956;g/ml] e em segmentos de duodeno IC50[76,78 (33,09 â 178,2) &#956;g/ml]. O relaxamento induzido por SEC (1 â 100 Âg/ml) nÃo foi afetado por bloqueadores adrenÃrgicos (fentolamina e guanetidina), muscarÃnicos (atropina), ou bloqueadores dos canais de potÃssio dependentes de ATP (KATP)(glibenclamida) e ativados por cÃlcio (Kca) (apamina e iberiotoxina) e nem na presenÃa de L-NAME; a adiÃÃo de ODQ (30 ÂM) bloqueou o relaxamento induzido por SEC (79,1%  4,5%; p<0,05). Observou-se tambÃm um aumento dos nÃveis teciduais de AMPc (331,95%  26,1%; p<0,05) e GMPc (21,5%  4,2%; p<0,05). SEC (10 Âg/ml e 30 Âg/ml) potencializou o relaxamento induzido por gliceriltrinitrato (GTN) e forskolina (FK) e foi capaz de diminuir o relaxamento induzido pela estimulaÃÃo por campo elÃtrico (ECE) (65,0%  10,9%; p< 0,05). SEC 15 &#956;g/ml bloqueou a contraÃÃo induzida por CaCl2 1 - 300 mM em corpos cavernosos de coelhos prÃ-contraÃdos com K+ (40 mM), 0 Ca++. Nossos resultados indicam que SEC manifesta atividade relaxante preferencial no mÃsculo liso cavernoso a nÃvel perifÃrico e que esse efeito està aparentemente relacionado com um aumento dos nÃveis de AMPc e GMPc e um possÃvel bloqueio do fluxo de cÃlcio. Estes dados sugerem que Aspidosperma ulei Markgf. pode ser explorada como uma alternativa para o tratamento da disfunÃÃo erÃtil. / Past studies have shown that the indole alkaloidal rich fraction (F(3-5)) from Aspidosperma ulei Markgr. root bark displays pro-erectile function in vivo and a relaxant effect on isolated rabbit corpus cavernosum in vitro. Also, a recent study demonstrated the in vivo pro-erectile like activity of 17-nor-subincanadina E (SEC), an alkaloid isolated from stem bark of this plant. This study aimed to assess further the effect of SEC on the smooth muscle tone (spontaneous or induced) in vitro, utilizing the strips of tracheal, intestinal, vascular and corpus cavernosal tissues of rabbits. An attempt was also made to study the possible mechanism of SEC on rabbit corpus cavernosum (RbCC). RbCC strips, were mounted in organ baths containing Krebs solution. After equilibration, the tissues were precontracted with phenylephrine (10 ÂM) or potassium (40mM). SEC (1-100 &#956;g/ml) caused a concentration dependent relaxation in the isolated rabbit corpus cavernosum precontracted with phenylephrine and displayed comparatively greater relaxant effect on corpus cavernosum IC50 [7,174 (3,155-16,31) &#956;g/ml], SEC produced concentration-dependent relaxations of the aortic rings in endothelium intact and denuded IC50[29,76 (90,32â115,6) &#956;g/ml] and IC50[ 26,13 (75,83â119,9) &#956;g/ml], respectively, trachea rings IC50[60,25 (0,330-109,8) &#956;g/ml], and of spontaneous motility in segments of duodenum IC50[76,78 (33,09â178,2) &#956;g/ml]. The relaxant effect of SEC (1-100 Âg/ml) on phenylephrine contraction was unaffected in the presence of adrenergic blockers (phentolamine and guanethidine), muscarinic blocker (atropine), KATP channel blocker (glibenclamide), Ca2+-dependent K+ channel blockers (apamin and iberiotoxin), and in the presence of N-omega-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME 100 ÂM)). However, the SEC relaxation was significantly attenuated by ODQ (30 &#956; M) (79.1%Â4.5%, p <0.05). Incubations of RbCC with SEC (10 and 30 Âg/mL) caused significant increases of cGMP (21.5%Â4.2%, p <0.05) and cAMP (331.95%Â26.1%, p <0.05) levels. Preincubation with SEC (10 and 30 ÂM) also significantly enhanced the relaxation response to the exogenous NO-donor (GTN) and an activator of adenyl cyclase (forskolin). the relaxations evoked by electrical stimulation was significantly decreased by SEC (10 Âg/mL) (65.0%Â10.9%, p <0.05). The phasic component of the contraction induced by K+ 40 mM as well as the maximal contraction elicited by increasing external Ca2+ concentrations in depolarized corpora cavernosa was inhibited by SEC (15 Âg/mL). Our results indicate that SEC can induce comparatively a greater relaxant effect on rabbit cavernosal tissue in vitro via a mechanism that involves an increase of cAMP and cGMP levels and a blocking effect on calcium flux. These data suggest that Aspidiosperma ulei Markgr. can be explored as an alternative for the treatment of erectile dysfunction.

Hemostasis is a complex process that involves equilibrium between the coagulation and fibrinolytic systems. Furthermore, the spatial and temporal expression of NTPDases in the vasculature appears to control platelet activation, thrombus size and stability, by regulating phosphohydrolytic activity and consequent P2 receptor signaling. Here we show the activity of ectonucleotidases on the platelet surface of normal pregnant women and pregnant women with complications. The activities of the enzymes, NTPDase and 5 - nucleotidase, were analyzed in the platelets of four patient groups composed of women divided into the following way: nonpregnant (NP), pregnant without complications (P), pregnant with hypertension (HP) (preeclampsia) and pregnant with gestational diabetes mellitus (GDP). Increased NTPDase and 5 -nucleotidase activities were observed in the groups of P, HP and GDP when compared to control (p<0.01). Ectonucleotidase activity in platelets from group P, HP and GDP were enhanced, showing that pregnancy with and without complications enhanced ATP, ADP and AMP hydrolysis. This fact is very important to corroborate with the thromboregulatory role of this enzyme in physiological and pathological conditions. / Hemostasia é um processo complexo que envolve o equilíbrio entre a coagulação e o sistema fibrinolítico. Além disso, a expressão espacial e temporal da NTPDase na vasculatura parece controlar a ativação plaquetária, tamanho do trombo e estabilidade, por regular a atividade fosfohidrolítica e a conseqüente sinalização através de receptores P2. Este trabalho teve por objetivo estudar a atividade das ectonucleotidases na superfície plaquetária de mulheres grávidas normais e mulheres grávidas com complicações (alto risco). A atividade das enzimas NTPDase e 5 -nucleotidase foi analisada em plaquetas de quatro grupos de pacientes compostos de mulheres distribuidas da seguinte maneira: não grávidas (NP), grávidas sem complicações (P), grávidas com hipertensão (HP) (preeclampsia) e grávidas com diabete mellitus gestacional (GDP). A atividade da NTPDase e 5 -nucleotidase encontrou-se aumentada nos grupos P, HP e GDP quando comparados com o grupo controle (NP) com um valor de p<0.01. A atividade das ectonucleotidases em plaquetas dos grupos P, HP e GDP encontraram-se aumentadas, mostrando que a gravidez sem e com complicações aumenta a hidrólise de ATP, ADP e AMP. Este fato é muito importante, pois reforça o papel tromboregulatório destas enzimas em condições fisiológicas e patológicas.

Safety concerns are one of the main causes of drug attrition. In these events, the moment at which the drug toxic effects are discovered changes dramatically the importance of the finding; discarding a valuable candidate at clinical testing stages means wasting years of efforts and huge economicinvestments. Even more dramatic is the discovery of toxic effect at post marketing stages, when the drug could have already produced severe side effects on a number of patients. For these reason there is a pushing need of developing methods able to assess the safety of drug candidates at early stages of development. Among these, in silico methods have many advantages, like not even requiring the availability of the compound, not wasting any quantity of it in case it has been already synthesized, being fast, cheap and make no use of animal testing. Unfortunately, in silico prediction methods of toxicity endpoints do not perform always as expected. The reasons are still under debate, but likely reasons are the complexity of the biological phenomena under study and the large structural diversity of the drug candidates, among others. The aim of this thesis is to improve currently used in silico prediction methods for their application to biological endpoints of interest in drug development, with a special emphasis to toxicological endpoints. Here, we report a novel general methodology called ADAN (Applicability Domain Analysis) for assessing the reliability of drug property predictions obtained by in silico methods. Furthermore, we proposed a unifying strategy for the use of in silico predictive methods in this field, defining rational criteria for the application of a whole spectrum of methods; from structural alerts to global QSAR models, including read across and local models. The usefulness of all the proposed methodologies is tested using a systematic analysis on representative datasets, obtaining good results that confirm their validity. / La manca de seguretat és una de les raons principals per la qual els candidats a fàrmacs són descartats. La fase en què els possibles efectes tòxics són identificats és crítica: descartar un candidat en fase clínica implica la pèrdua d'anys d'esforços i enormes inversions econòmiques. Encara pitjor és identificar efectes tòxics un cop el fàrmac està comercialitzat, quan es poden haver produït greus efectes secundaris en pacients. Per aquestes raons hi ha la necessitat de desenvolupar mètodes capaços d'avaluar la seguretat dels candidats a fàrmacs en les primeres etapes. Entre aquests, els mètodes in silico tenen molts avantatges, com no requerir la disponibilitat del compost, no perdre cap quantitat en cas que ja s'hagi sintetitzat, ser ràpid, econòmic i no fer ús de l'experimentació amb animals. Per desgràcia, els mètodes de predicció in silico aplicats a criteris d'avaluació de toxicitat no produeixen els resultats adequats. Les raons són objecte de debat, però raons probables són la complexitat dels fenòmens biològics en estudi i la gran diversitat estructural els fàrmacs candidats, entre d'altres. L'objectiu d'aquesta tesi és millorar els mètodes de predicció in silico emprats en l’avaluació de criteris d'interès en el desenvolupament de fàrmacs amb especial èmfasi en els de toxicitat. Presentem una nova metodologia general anomenada ADAN (Applicability Domain Analysis) per avaluar la fiabilitat de les prediccions obtingudes amb mètodes in silico. A més, proposem una estratègia unificada de l’ús de mètodes de predicció in silico emprats en aquest camp; com alertes estructurals, read-across, QSAR local i global. La estratègia incorpora criteris racionals per la seva utilització. Els bons resultats obtinguts amb dades representatives confirmen la validesa de les metodologies.

Positron emission tomography (PET) has been well established the last years as a powerfull tool in research and clinical applications. Advances in technology have enabled the use of small animal PET imaging in preclinical applications although the size differences in humans and rodents create many challenges to this imaging modality. In this thesis, the performance evaluation ofsmall animal PET systems through specific standards and Monte Carlo simulation codes are investigated using the microPET R4 system. In the first part, the performance evaluation of the microPET R4 scanner according to the new NEMA NU 4-2008 standards for small animal positron emission tomography is assessed and a comparison against its previous evaluation according to the adapted clinical NEMA NU 2-2001 standards is presented. In the second part, dedicated Monte Caro simulation models (using GATE and PeneloPET) of the performance of the R4 system is compared against experimental data. / La tomografia per emissió de positrons (PET) és una poderosa eina per a la investigació translacional adreçada constantment al repte de les noves tecnologies. Per tant, els aspectes tècnics són cada vegada més rellevants en el disseny i desenvolupament de nous sistemes de PET. El coneixement de les característiques físiques és el punt clau especialment en el cas de les tècniques d'imatge de petits animals. Per a la optimització de les capacitats dels sistemes de PET per animals de laboratori, el seu rendiment ha de ser avaluat mitjançant protocols específics i codis de simulació de MonteCarlo. En aquesta tesi, en la primera part, es presenta l'avaluació del rendiment de l'escàner microPET R4 d'acord amb les normes NEMA NU 4-2008 de la tomografia per emissió de positrons petit animal és compara amb l'avaluació anterior realitzada d'acord amb la clínica adaptada NEMA NU 2-2001. Es van obtenir diferències en els resultats entre NEMA NU 4-2008 i NEMA NU 2-2001 associat a la utilització de diferents fantoms i finestres d'energia. A la segona part, es compara l’ exactitud de diferents codis de simulació Monte Carlo (utilitzant GATE i PeneloPET) per avaluar el rendiment del sistema de R4 en relació a les dades experimentals. Tots dos codis van proporcionar resultats exactes si bé PeneloPET va demostrar ser més ràpid que GATE

Los contaminantes ambientales difenil éteres polibromados (PBDEs) se encuentran en altas concentraciones en mujeres. El propósito de la presente tesis es el estudio de la toxicidad ocasionada por el traspaso materno de BDE-99 sobre la descendencia. Entre los resultados más destacables, se encontró que la exposición materna al BDE-99 induce toxicidad en fetos de rata causando retraso en la formación de los huesos, ligera hipertrofia de corazón e hígado y fomentando el aumento de producción de substancias reactivas de oxigeno (ROS) en el hígado de los fetos debido a una mayor actividad de las enzimas p450 (CYP). Por otra parte, las crías de rata mostraron un retraso en la tarea de aprendizaje espacial y un efecto ansiolítico de forma dosis-dependiente después de la lactancia. También se encontró que los niveles en suero de hormonas tiroideas disminuyeron y mostraron signos de hapatoxicidad. Estos resultados indican que realmente existe un efecto toxico del contaminante BDE-99 sobre la descendencia de rata a concentraciones encontradas en humanos. / The main human concern about the environmental pollutants polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are the rising concentrations accumulated in women. The aim of the present thesis is the study of the toxicity by maternal transference of BDE-99 in the offspring. Among highlights of the results, we found that exposure to BDE-99 during the gestational period produced a delayed ossification, slight hypertrophy of the heart, and enlargement of the liver in rat fetuses. A transplacental effect of BDE-99, evidenced by the activation of nuclear hormones receptors that induce the upregulation of P450 isoforms, was also found in fetal liver correlated with an increase of reactive oxygen substances. Maternal transference of BDE-99 also produced a delay in the spatial learning task and a significant dose-response anxiolytic effect when rat pups were weaned. It was also found that the serum levels of thyroid hormones decreased and signs of hepatoxicity were observed. These results indicate a clear signal of toxicity in rat offspring by BDE-99 at levels comparable to those found in humans.