Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Ministerio de Planificación de Chile (MIDEPLAN) / Em nosso laboratório foi isolado um clone recombinante de T. cruzi, denominado H49, que codifica repetições de 68 aminoácidos (aa) dispostas em tandem. Estas repetições são encontradas em um antígeno imunodominante de aproximadamente 240 kDa que está envolvido na ligação do flagelo ao corpo do parasita, conhecida como zona FAZ. Este trabalho relata a caracterização da estrutura do gene e da proteína H49. Buscas no banco de dados de T. cruzi utilizando o algoritmo BLAST revelaram que as repetições de 68 aa são encontradas em uma região central de oito calpaínas-like cisteínas peptidases. Em duas dessas, as repetições H49 são altamente conservadas e organizadas em tandem. Nas outras seis calpaínas-like encontradas, as repetições eram degeneradas e podem ser separadas por pequenas seqüências não repetitivas. Essas proteínas apresentaram domínios característicos de cisteínas proteinases cálciodependente, como Cys-Pc e Calpain_III. A associação entre as seqüências H49 e calpaína foi confirmada por amplificação por PCR e análises de clones de YAC utilizando oligonucleotídeos específicos para amplificar regiões especificas de calpaína e repetições H49. O locus H49 foi mapeado no clone CL Brener utilizando uma sobreposição de clones de YAC. A associação da repetição H49 e calpaínas nos YACs foi demonstrada por PCR e por análise de restrição. Corroborando com dados obtidos, a análise por “chromoblot” revelou que as sondas H49 e calpaína hibridizam com as mesmas bandas cromossômicas. Nossos dados indicam que as repetições H49 fazem parte de um subgrupo de genes da calpaína e, portanto, denominados H49/calpaína. Recentemente uma nova família de proteínas associadas ao citoesqueleto foi descrita em Trypanosoma brucei e Leishmania. Estas proteínas são caracterizadas por sua similaridade com a região catalítica da calpaína, assim como pela presença de seqüências de aminoácidos repetidas em tandem que apresentam similaridade de 30-40% com a repetição H49. Esses resultados sugerem que a aquisição da calpaína, contendo repetições pelos tripanossomatídeos (talvez por fusão de genes) foi um evento tardio na evolução dessa família de proteínas. Para avaliar a ocorrência e a distribuição subcelular da proteína H49/calpaína em epimastigotas, diferentes domínios da calpaína e da repetição de 68 aa foram expressas em bactérias, as proteínas foram purificadas e utilizadas na imunização de coelhos e camundongos. Os anticorpos policlonais purificados foram utilizados para estudar a organização e distribuição subcelular das repetiçãos de 68 aa e calpaína em T. cruzi. Em “immunoblotting”, anticorpos contra o domínio calpaína e contra as repetições de 68 aa reagiram com uma proteína de 240 kDa presente no extrato total de epimastigotas. Anticorpos anti-calpaína reagiram com bandas adicionais de aproximadamente 170, 60 e 56 kDa que correspondem a calpaínas sem as repetições de 68 aa. Análise de imunofluorescência revelou que a proteína H49/calpaína está localizada apenas na região de adesão entre o corpo celular e o flagelo. A calpaína, além de ser encontrada no flagelo, também é encontrada no citoplasma. Além disso, a H49/calpaína associada ao citoesqueleto colocalizou com marcadores da zona de adesão flagelar (FAZ). Domínios repetitivos da H49/calpaína contem alfa hélices (“helix-turn-helix”) que poderiam estar organizadas em uma estrutura enovelada em uma estrutura “coiled-coil”. Sugerimos que as proteínas H49/calpaína formariam um homodímero que poderia ligar a membrana do flagelo à membrana do corpo celular na zona de adesão flagelar. / We have previously isolated a T. cruzi recombinant clone, termed H49, that encodes tandemly arranged repeats of 68-amino acids (aa). The repeats are found in an immunodominant antigen (~240 kDa) which is involved in the attachment of the flagellum to the cell body in the FAZ region of the parasite. Here we present further characterization of the structure of H49 gene and protein. Blast search of T. cruzi databases showed that the 68-aa repeats can be found in the central domain of 8 calpain-like cysteine peptidases. In two of them, the H49 repeats are highly conserved and arranged in tandem arrays, whereas in other calpains the repeats are degenerated and can be separated by short nonrepeat sequences. These proteins show the domains Cys-Pc and calpain_III, characteristics of calcium-dependent cysteine proteinases. The association between H49 and calpain sequences was further confirmed by PCR amplification and analysis of YAC clones using primers designed to amplify specific regions of calpain and H49 repeat. We mapped the H49 locus in clone CL Brener using YAC overlapping clones. The association of H49 and calpain in these YACs was demonstrated by PCR and restriction analysis. Consistent with this, chromoblot analysis revealed that H49 and calpain probes hybridized with the same chromosomal bands. Our data indicate that the H49 repeats are part of a subset of calpain genes, and they were termed H49/calpains. Recently, a novel family of cytoskeleton-associated proteins was described in Trypanosoma brucei and Leishmania. These proteins are characterized by their similarity to the catalytic region of calpain, and also by the presence of tandemly arranged amino acid repeats that share 30-40% similarity with H49. These results suggest that the acquisition by trypanosomatids of calpain containing repeats (maybe by gene fusion) was a relatively late event in the evolution of this family of proteins. To study the occurrence and subcellular distribution of H49/calpain protein in epimastigotes, we have expressed different domains of the calpain and the 68-aa repeats in bacteria, purified the proteins, and employed them to immunize rabbits and mice. The affinity purified polyclonal antibodies were used as probes to study the organization and subcellular distribution of 68-aa repeats and calpain in T. cruzi. Antibodies raised against the calpain domains and 68-aa repeats reacted, by immunoblot analysis, with a ~240 kDa protein in the whole epimastigote extracts. Anti-calpain antibodies reacted with additional bands of ~170, 60 and ~56 kDa which correspond to the calpain proteins without 68-aa repeats. Immunofluorescence analysis showed that H49/calpain-like protein is only localized in the region of adhesion between the cell body and flagellum. Calpain was present not only in the flagella, but it was also localized in the cytoplasm. Further, the cytoskeleton-associated H49/calpain was colocalized with markers of the flagellar attachment zone (FAZ). Repetitive domain of H49/calpains contain alpha-helices (helix-turn-helix) that could be arranged in a coiled-coil rope-like structure. We suggest that H49/calpain proteins form a homodimer that could link the flagellar membrane to the cell body membrane at the flagellar attachment zone. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2008. / Made available in DSpace on 2012-10-23T18:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 260132.pdf: 10785256 bytes, checksum: 912ddddb476f30986d78b06f3e710074 (MD5) / A Síndrome do X Frágil (SXF) é a forma de retardo mental herdado mais comum encontrada, afetando um entre 4000 homens e uma entre 8000 mulheres. Ela é causada devido a alterações do nível de transcrição e tradução do gene FMR1, que nos humanos e em vários outros mamíferos se encontra na região Xq27.3 do cromossomo X humano. Este gene codifica a proteína FMRP, cuja falta de expressão está associada ao retardo mental e a outros fenótipos característicos da SXF. A função da proteína FMRP no organismo ainda não é totalmente conhecida, porém acredita-se que ela esteja intimamente ligada ao transporte de mRNA do núcleo para o citoplasma dos neurônios e na sua condução até os ribossomos, onde faz parte dos complexos de ribonucleoproteínas (RNP) e controla a tradução de determinados mRNA. Diante deste contexto, este trabalho tem o objetivo de contribuir para a compreensão dos elementos reguladores da expressão do gene FMR1 e também incrementar os estudos sobre as funções desempenhadas pela proteína FMRP. Uma análise da região à montante do códon de início do gene FMR1, utilizando técnicas de genômica comparativa, gel shift e espectrometria de massa mostrou potenciais sítios de interação para proteínas de transcrição. Foram identificadas várias proteínas que interagiram com os segmentos de DNA conservados estudados in vitro, com especial significância para as proteínas Pur-a, Pur-b e as ribonucleoproteínas heterogêneas A2/B1 (hnRNP A2/hnRNP B1). O papel da Pur-a e Pur-b como elemento na regulação da transcrição do gene FMR1 nunca foi demonstrado, sendo esse o primeiro trabalho que propõe esta relação. No estudo sobre a função da proteína FMRP utilizou-se análise de fluxos metabólicos para calcular os fluxos intracelulares dos complexos envolvidos na regulação da tradução de mRNA nos dendritos neuronais, onde a FMRP é uma proteína chave. O uso de modelos estequiométricos das reações ou interações e a aplicação de balanços de massa permitiram a estimativa de alguns fluxos importantes no papel biológico da FMRP em nível celular. Esses resultados poderão auxiliar no diagnóstico e tratamento da Síndrome do X-Frágil e doenças relacionadas. / Fragile X Syndrome (FXS) is the most common form of inherited mental retardation with the incidence of 1:4000 in males and 1:8000 in females. The syndrome occurs as an effect of the lack of expression of the fragile X mental retardation protein (FMRP) codified by the FMR1 gene located in the q27.3 region of the X chromosome. Absence of the FMRP results in mental retardation and other characteristics of the Fragile X phenotypes. Some FMRP functions in the organism are still unknown; however, structural evidences of the protein suggest that it is involved in nuclear export, cytoplasmic transport, and/or translation control of target mRNA. In this work, we combined in silico comparative genomics tools with proteomic analysis to investigate regulatory elements in the upstream region of the FMR1 gene transcription start site. We identified proteins that interact with studied DNA conserved sequences, particularly Pur-a, Pur-b and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 (hnRNP A2/hnRNP B1). To our acknowledge this is the first work that correlate those proteins to the FMR1 gene transcription. We used Metabolic Flux Analysis (MFA) to estimate turnovers of molecules and complexes involved in mRNA transport to dendrites and its translation at synapses. Stoichiometric models of biochemical reactions or interactions and mass balances may be useful in diagnosis and future treatment of the Fragile X Syndrome and related diseases.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:57:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Este trabalho apresenta os resultados do desenvolvimento e caracterização de marcadores microssatélites para Araucaria angustifolia a partir de bibliotecas genômicas enriquecidas para seqüências microssatélites (SSR). O trabalho envolveu clonagem de segmentos genômicos, transformação bacteriana, sequenciamento de clones, desenho de iniciadores específicos e otimização de marcadores. A triagem dos iniciadores foi feita utilizando-se inicialmente quatro indivíduos em gel de agarose 2%. Para a otimização foram utilizados 16 indivíduos de 5 diferentes populações em gel de poliacrilamida 4%, com detecção em nitrato de prata. Foram obtidos 29 marcadores microssatélites inéditos para Araucaria angustifolia, com a possibilidade de utilização imediata. Os marcadores desenvolvidos revelaram elevada heterozigosidade esperada para os locos, com uma detecção média de 8,1 alelos por loco. Os marcadores microssatélites demonstraram elevado conteúdo informativo para os estudos de diversidade genética e discriminação genotípica de indivíduos. As sequências originais contendo regiões microssatélites foram depositadas no GenBank (NCBI - National Center for Biotechnology Information). Um estudo de diversidade genética e estrutura de duas populações naturais de Araucaria angustifolia foi desenvolvido utilizando-se locos microssatélites específicos desenvolvidos para a espécie. Para realizar a genotipagem das duas populações: Guamirim Gateado e Parque Ecológico de Lages, foram utilizados dois sistemas de detecção alélica colorimétrico baseado em nitrato de prata, aplicado a sete locos microssatélites e outro com detecção por fluorescência aplicado a nove locos microssatélites. Os resultados mostram que, grande parte da variabilidade genética observada nas duas populações encontra-se dentro das populações e não entre as populações. As análises feitas a partir de genotipagens em sistema com nitrato de prata, superestimaram os valores de heterozigosidade. O sistema de detecção fluorescente mostrou-se necessário quando os marcadores microssatélites são baseados em seqüências de di-nucleotídeo, pois facilitam a análise em sistema "multiplex" utilizados na mesma reação de amplificação e/ou analisados conjuntamente na mesma eletroforese, propiciando redução de gastos e maior confiabilidade nos resultados devido à leitura automática do sistema, baseado no marcador de tamanho de fragmento conhecido. As comparações das análises populacionais feitas nos distintos sistemas de detecção revelaram que o sistema de detecção com fluorescência, é significativamente mais preciso devido à presença de bandas fantasmas, formadas pela separação das duas fitas de DNA durante a eletroforese, detectadas nas análises com nitrato de prata. Diferenças estatisticamente significativas entre os valores de heterozigosidade das duas populações estudadas foram obtidas com marcadores isoenzimáticos, fato este que não foi confirmado com o uso de marcadores microssatélites (0,87 e 0,86 para He e de 0,59 e 0,58 para Ho, respectivamente). Marcadores isoenzimáticos revelaram diferença estatística na estrutura genética entre as duas populações. No estudo com marcadores microssatélites não foi detectada divergência significativa entre as duas populações estudadas (FST=0,023). (Instituição financiadora: FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations/Ministério do Meio Ambiente).

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-07T16:46:59Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-07T16:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico. / A metagenomic library harboring around 3,5 Gpb was constructed from a thermophilic microbial consortium. The aim of this library was to identify genes coding lignocellulolytic enzymes that could be expressed in the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). In total, 6,720 clones (5% of all clones) were analysed and 182 positive hits were found for cellulases, xylanases and β-glucosidases. The sequencing of 30 selected fosmids resulted in the identification of 34 putative open reading frames (ORFs) coding glycoside hydrolases involved with cellulose and hemicellulose degradation. Simultaneously, a defective mutant strain of K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) for gene ura3 was obtained. The gene was deleted by using, for the first time in this yeast, the split- marker technique that consisted in a first selection of mutants in solid medium with the antibiotic geneticin followed by a second selection in the presence of 5- Fluoroorotic Acid. The results presented here demonstrated the efficiency of the split-marker technique in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), even though this is a diploid strain. Once the ura3 - was obtained, the vector pKmLPG was constructed using the URA3 as a marker gene in order to have an expression system for the ura3 - mutant strain. The differential and promising feature of this vector lies in the presence of the promoter sequence of the gene coding an endo-polygalacturonase enzyme from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). The confirmation of the correct vector construction will be performed by sequencing. In order to express genes isolated from the metagenomic library in the yeast K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) three genes coding β-glucosidase were cloned onto the vector pKMCL. This vector is derived from pKLAC2 of Kluyveromyces lactis and it uses the resistance gene for the antibiotic geneticin as a marker. Extracellular activity of endogenous β- glucosidase from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) was detected by enzymatic assay in solid medium during the analyses of transformants, and based in the annotated genome of this yeast, was possible to identify the β-glucosidase gene. The three dimensional structure of the endogenous protein as well from those codified by the β-glucosidase genes (P3Gli, P8Gli and P9Gli) were predicted. The confirmation of transformants for the cloned genes P3Gli, P8Gli and P9Gli was done by PCR, and the β-glucosidase activity was detected in both extracelllular supernatant and periplasm region in eight of nine transformants analysed. Results of heterologous expression of β-glucosidase in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) demonstrated that this strain can be used as a host for expression of various lignocellulolytic genes, with the expectation to use recombinant yeast strains capable to secret celulases targeting the production of cellulosic etanol. / Tese liberada do Sigilo pelo departamento em 04-04-2017, ver arquivo

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-25T17:27:15Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 886003 bytes, checksum: c69002eae8113ea24d4bedd4735dda69 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-25T17:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 886003 bytes, checksum: c69002eae8113ea24d4bedd4735dda69 (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A seleção genômica ampla (Genome Wide Selection – GWS) consiste na análise de um grande número de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) amplamente distribuídos no genoma. As principais metodologias propostas e utilizadas na GWS se dividem em metodologias paramétricas, semi-paramétricas ou metodologias de redução de dimensionalidade. Dessa forma, um dos objetivos desse trabalho foi avaliar metodologias não paramétricas, denominadas Delta-p e Regressão Categórica Tripla (TCR), além de compará-las com métodos tradicionalmente aplicados a GWS, tais como G-BLUP (Genomic Best Linear Unbiased Predictor) e BLASSO (Bayesian Least Absolute Shrinkage and Selection Operator). O primeiro capítulo deste trabalho consiste em uma revisão de literatura sobre a GWS apresentando sua definição e importância no melhoramento genético, abordando sobre o desenvolvimento dos métodos propostos e avaliados e também retratando sobre o processo de validação utilizado para a comparação das metodologias. No segundo capítulo, foi proposto e analisado o método Delta-p e um índice de seleção, denominado índice Delta-p/G-BLUP que combina os valores genômicos provenientes do método G-BLUP com os valores genômicos estimados via Delta-p. Sob o contexto Bayesiano, foi incorporado ao LASSO Bayesiano, por meio de uma distribuição a priori altamente informativa, os valores genômicos estimados via G-BLUP, essa abordagem foi denominada método Bayes Híbrido. Para avaliar a eficiência dos métodos estatísticos, no que se refere à estimação dos valores genômicos aditivos e devidos à dominância, foram utilizados dados simulados, sendo estabelecidos oito cenários (dois níveis de herdabilidade × duas arquiteturas genéticas × ausência de dominância e dominância completa) sendo cada cenário simulado dez vezes. Os resultados do segundo capítulo indicaram que o índice Delta-p/G-BLUP e o Bayes Híbrido se mostraram eficientes para predição dos valores genômicos podendo ser usados vantajosamente na GWS. Ademais, no terceiro capítulo, foi avaliada a eficiência do método TCR em comparação com os métodos G-BLUP e BLASSO utilizando quatro cenários (dois níveis de herdabilidade × modelo infinitesimal × ausência de dominância e dominância completa) sendo cada cenário simulado dez vezes. Os resultados indicaram que o método TCR mostrou-se adequado para a estimação dos componentes de variação genômica e da herdabilidade. Em vista disso, uma metodologia baseada em uma modificação do método G-BLUP, denominada TCR/G-BLUP, foi proposta e consiste em estimar a herdabilidade via TCR e fixá-la nas equações de modelos mistos do método G-BLUP. A eficiência dos métodos G- BLUP e TCR/G-BLUP foram comparadas utilizando dados reais, seis caracteristicas avaliadas em mandioca (Manihot esculenta). O experimento foi instalado segundo um delineamento em blocos casualizados com três repetições e 10 plantas por parcela. Os resultados indicaram que o método TCR/G-BLUP foi capaz de aumentar a acurácia e fornecer valores genômicos não viesados se comparados ao método G-BLUP, sendo, portanto recomendado para a aplicação na GWS. / The genomic wide selection (GWS) consists in analyzing of a large number of single nucleotide polymorphisms (SNPs) markers widely distributed in the genome. The main methodologies proposed and used in GWS are divided into parametric methodologies, semi-parametric methodologies or dimensionality reduction methodologies. Thus, one of the objectives of this work was to evaluate non- parametric methodologies, called Delta-p and Triple Categorical Regression (TCR), and to compare them with methods traditionally applied to GWS, such as G-BLUP (Genomic Best Linear Unbiased Predictor) and Bayesian LASSO (Bayesian Least Absolute Shrinkage and Selection Operator). The first chapter of this work consists of a literature review about GWS presenting its definition and importance in genetic improvement, discussing the development of the proposed and evaluated methods and also describing the validation process used to compare the methodologies. In the second chapter, were proposed and analyzed the Delta-p method and a selection index, called the Delta-p / G-BLUP index, combining the genomic values derived from the G-BLUP method with the estimated genomic values via Delta-p. Under the Bayesian context, it was incorporated into the Bayesian LASSO, by means of a highly informative a priori distribution, the genomic values estimated by G-BLUP, this approach was called the Hybrid Bayes method. In order to evaluate the efficiency of the statistical methods, in the estimation of the additive and dominance genomic values, simulated data were used, being established eight scenarios (two levels of heritability × two genetic architectures × absence of dominance and complete dominance) each scenario being simulated ten times. The results of the second chapter indicated that the Delta-p/G-BLUP index and the Hybrid Bayes proved to be efficient for predicting the genomic values and could be advantageously used in GWS. In addition, in the third chapter, the efficiency of the TCR method was evaluated in comparison to the G-BLUP and BLASSO methods using four scenarios (two levels of heritability × infinitesimal model × absence of dominance and complete dominance), each scenario being simulated ten times. The results indicated that the TCR method proved adequate for the estimation of the components of genotype variation and heritability. Therefore, a methodology based on a modification of the G-BLUP method, called TCR/G-BLUP, was proposed and consists of estimating the heritability by means of TCR and fixing it in the mixed model equations of the G-BLUP method. The efficiency of the G-BLUP and TCR/G-BLUP methods were compared using real data, six characteristics evaluated in cassava (Manihot esculenta). The experiment was installed according to a randomized block design with three replicates and 10 plants per plot. The results indicated that the TCR / G-BLUP method was able to increase accuracy and provide non-biased genomic values when compared to the G-BLUP method and is therefore recommended for GWS application.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-09-01T17:30:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3347372 bytes, checksum: 29b1c4c45aac9b219efa13738df0ccd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T17:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3347372 bytes, checksum: 29b1c4c45aac9b219efa13738df0ccd4 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Embora os estudos de associação genômica (GWAS) forneçam informações valiosas na descodificação das relações entre a variação gênica e os fenótipos complexos, esta técnica explica uma pequena fração da herdabilidade. O mapeamento de herdabilidades regionais (RHM) fornece estimativas de herdabilidade para segmentos genômicos que contêm efeitos alélicos raros e que contribuem individualmente com baixa variação ao ponto de serem detectados pela GWAS. Neste estudo foi realizado a GWAS e o RHM para sete características de crescimento, madeira e resistência à doenças em uma população 768 árvores híbridas de Eucalyptus usando o moderno Chip Illumina EuCHIP60K. As herdabilidades genômicas totais representaram grandes proporções (64-89%) de herdabilidades baseadas em pedigree, fornecendo evidências adicionais de que características complexas em eucaliptos são controlados por muitas variantes ao longo do genoma, cada uma com pequenas contribuições para a variância fenotípica. O RHM detectou 26 QTLs (Quantitative Trait Loci) abrangendo 2.191 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), enquanto que a GWAS detectou 13 associações. Os QTLs detectados via RHM e GWAS explicaram individualmente 5 a 15% e 4 a 6% da herdabilidade genômica, respectivamente. O RHM foi superior à GWAS na captura de maiores proporções de herdabilidade genômica. Semelhantemente a QTLs previamente mapeados, os resultados destacaram as regiões genômicas que podem ser utilizadas em estudos mais aprofundados para descoberta de genes. Os RHM-QTLs contendo uma combinação de variantes comuns e raras representam um avanço para incorporar conhecimento prévio da arquitetura genética subjacente em modelos de predição genômica. / Although genome-wide association studies (GWAS) have provided valuable insights into the decoding of the relationships between sequence variation and complex phenotypes, they have explained little heritability. Regional heritability mapping (RHM) provides heritability estimates for genomic segments containing both common and rare allelic effects that individually contribute too little variance to be detected by GWAS. We carried out GWAS and RHM for seven growths, wood and disease resistance traits in a breeding population of 768 Eucalyptus hybrid trees using EuCHIP60K. Total genomic heritabilities accounted for large proportions (64 89%) of pedigree-based trait heritabilities, providing additional evidence that complex traits in eucalypts are controlled by many sequence variants across the frequency spectrum, each with small contributions to the phenotypic variance. RHM detected 26 quantitative trait loci (QTLs) encompassing 2,191 single nucleotide polymorphisms (SNPs), whereas GWAS detected 13 single SNP trait associations. RHM and GWAS QTLs individually explained 5 15% and 4 6% of the genomic heritability, respectively. RHM was superior to GWAS in capturing larger proportions of genomic heritability. Equated to previously mapped QTLs, our results highlighted genomic regions for further examination towards gene discovery. RHM-QTLs bearing a combination of common and rare variants could be useful enhancements to incorporate prior knowledge of the underlying genetic architecture in genomic prediction models.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-01-15T16:24:47Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 962345 bytes, checksum: 5a6d6072db690a2bf84a5142262e8313 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-15T16:24:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 962345 bytes, checksum: 5a6d6072db690a2bf84a5142262e8313 (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A presença de variabilidade genética associada a estratégias mais eficientes de seleção são imprescindíveis para se obter sucesso nos programas de melhoramento. Nesse sentido, o uso de marcadores moleculares em estudos de diversidade, bem como a seleção baseada em dados fenotípicos por meio do uso de procedimentos genético-estatísticos mais refinados têm se mostrado ferramentas úteis nos programas de melhoramento. Além disso, com o avanço das plataformas de NGS (Next Generation Sequencing), um novo método de seleção, que visa utilizar dados fenótipos e moleculares, denominado Seleção Genômica Ampla foi proposto. O objetivo do trabalho foi identificar marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphism) e validá-los em estudos de diversidade genética; estimar os parâmetros genéticos e os ganhos com a seleção utilizando a metodologia de modelos mistos (REML/BLUP); aplicar o princípio da GWS (Genome Wide Selection) e avaliar sua eficiência em população de C. canephora. A população em estudo, inicialmente, foi composta por 72 genótipos nos quais os marcadores SNP foram identificados e validados. A seleção fenotípica, por meio do procedimento REML/BLUP, foi realizada em 192 genótipos de cafeeiros. Por fim, a população avaliada por meio da GWS foi composta por 165 genótipos. Utilizando a plataforma de sequenciamento da empresa RAPiD Genomics foram identificados 117.450 SNP em 72 indivíduos de C. canephora. Após análises de qualidade, 33.485 SNP foram selecionados e validados em análises de diversidade e estrutura genética de populações. Os marcadores foram eficientes na avaliação da diversidade e estrutura genética de C. canephora e com base em nessas análises foi possível selecionar possíveis cruzamentos promissores dentro e entre os grupos varietais e Híbridos geneticamente mais distantes. Com base nas análises utilizando o método REML/BLUP foi possível selecionar genótipos Conilon e Robusta promissores por serem geneticamente divergentes pela análise de agrupamento e por proporcionarem ganhos elevados com a seleção. Estes podem ser intercruzados para obter cultivares dentro de cada grupo varietal e/ou como genitores em cruzamentos interpopulacionais. Além disso, foi possível selecionar famílias híbridas que se destacaram nas análises. Estas podem ser testadas em diferentes regiões e as promissoras utilizadas como variedade propagada por semente. As famílias híbridas selecionadas podem também ser intercruzadas (cruzamento intrapopulacional) para avanço da seleção recorrente. Por fim, a GWS mostrou-se ferramenta útil para o melhoramento de C. canephora, por predizer com alta acurácia os valores genéticos genômicos dos indivíduos e possibilitar a redução no tempo necessário para completar o ciclo de seleção, proporcionando ganhos significativos em eficiência seletiva por unidade de tempo. / The presence of genetic variability associated with more efficient selection strategies is essential for success in breeding programs. In this sense, the use of molecular markers in diversity studies, as well as selection based on phenotypic data through the use of more refined genetic-statistical procedures have been shown to be useful tools in breeding programs. In addition, with the advancement of NGS (Next Generation Sequencing) platforms, a new selection method, which aims to use phenotype and molecular data, called the Genome Wide Selection was proposed. The objective of this work was to identify SNP markers (Single Nucleotide Polymorphism) and to validate them in studies of genetic diversity; to estimate genetic parameters and selection gains using the mixed model methodology (REML/BLUP); to apply the principle of GWS (Genome Wide Selection) and to evaluate its efficiency in C. canephora population. The study population was initially composed of 72 genotypes in which the SNP markers were identified and validated. Phenotypic selection, using the REML/BLUP procedure, was performed on 192 coffee genotypes. Finally, the population evaluated through GWS consisted of 165 genotypes. Using the RAPiD Genomics company sequencing platform, 117,450 SNPs were identified in 72 C. canephora individuals. After quality analyzes, 33,485 SNPs were selected and validated in analyzes of diversity and genetic structure of populations. The markers were efficient in evaluating the genetic diversity and structure of C. canephora and based on these analyzes, it was possible to select possible promising crosses within and among the genetically distant varietal and hybrid groups. Based on the analyzes using the REML/BLUP method, it was possible to select promising Conilon and Robusta genotypes because they are genetically divergent by cluster analysis and because they provide high gains with selection. These can be cross-linked to obtain cultivars within each varietal group and/or as parents at interpopulation crossings. In addition, it was possible to select hybrid families that stood out in the analyzes. These can be tested in different regions and the promising ones used as seed propagated variety. Selected hybrid families can also be cross-linked (intrapopulation cross) to advance recurrent selection. Finally, the GWS proved to be a useful tool for the improvement of C. canephora, by accurately predicting the genomic genetic values of the individuals and allowing the reduction in the time needed to complete the selection cycle, providing significant gains in selective efficiency by unit of time.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-02-27T12:55:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1014245 bytes, checksum: bc632c2f8df9dc848814b664d9b50984 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-27T12:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1014245 bytes, checksum: bc632c2f8df9dc848814b664d9b50984 (MD5) Previous issue date: 2018-02-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A principal contribuição da genética molecular no melhoramento é a utilização direta das informações de DNA no processo de identificação de indivíduos geneticamente superiores. Sob esse enfoque, idealizou-se a seleção genômica ampla (Genome Wide Selection – GWS), a qual consiste no uso de um grande número de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) amplamente distribuídos no genoma para predizer o mérito genético de indivíduos. Diversas abordagens estatísticas foram propostas para a predição de valores genéticos permitindo estimar os efeitos dos marcadores com base apenas na média condicional da variável dependente. Uma metodologia ainda pouco explorada em GWS é a regressão quantilica (RQ). Diferentemente das outras metodologias, a RQ permite avaliar os fenótipos de interesse em diferentes níveis da distribuição. Desta forma, este trabalho tem como objetivo apresentar duas aplicações de GWS utilizando a RQ. Na primeira aplicação foi proposto e avaliado o uso da Regressão Quantílica Regularizada (RQR) para estimar os efeitos marcadores SNPs para curvas de crescimento em suínos. O modelo proposto permitiu a descoberta, em diferentes níveis de interesse (quantils), de marcadores relevantes para cada característica e suas respectivas posições cromossômicas. Além disso, RQR permitiu a construção de curvas de crescimento genômico, que identificaram indivíduos geneticamente superiores em relação à eficiência de crescimento. Na segunda aplicação utilizou-se a RQR para predizer valores genéticos de conjuntos de dados simulados com diferentes proporções de epistasia na variância genética e valores fenótipos com distribuições simétrica e assimétrica a direita. Neste trabalho verificou-se que a RQR teve, em geral, maiores acurácias do que as outras metodologias avaliadas quando a característica é de baixa herdabilidade. Além disso, quando tem-se 100% da variância genética como sendo epistática, a RQR foi, na maioria dos casos, melhor do que os métodos tradicionais. Desta forma, avaliando as duas aplicações apresentadas, tem-se que a RQR é uma alternativa interessante em estudos de GWS, uma vez que possibilita a descoberta do modelo que melhor representa a relação entre as variáveis dependentes (fenótipos) e independentes (efeitos dos marcadores) aumentando o desempenho preditivo do modelo. / The main contribution of molecular genetics in breeding is the direct use of DNA information in the process of identifying genetically superior individuals. Under this approach, Genome Wide Selection (GWS) was idealized and consists of the use of a large number of single nucleotide polymorphisms (SNPs) widely distributed in the genome to predict the genetic merit of individuals. Several statistical approaches have been proposed for the prediction of genetic values, however they allow estimating the effects of the markers based only on the conditional mean of the dependent variable. A methodology not yet explored in GWS is quantile regression (QR). Differently from the other methodologies, the QR allows to evaluate the phenotypes of interest in different levels of the distribution. In this way, this work aims to present two applications of GWS using QR. In the first application, the Regulated Quantile Regression (RQR) was proposed and evaluated to estimate the marker effects SNPs for growth curves in pigs. The proposed model allowed the discovery, in different levels of interest (quantiles), of more relevant markers for each trait and their respective chromosomal positions. In addition, RQR allowed the construction of genomic growth curves, which identified genetically superior individuals in relation to growth efficiency. In the second application, the RQR was used to predict genetic values of simulated datasets with different proportions of epistasis in genetic variance and phenotype values with symmetric and positive asymmetric distributions. In this work it was verified that the RQR had, in general, greater accuracies than the other methodologies evaluated when the trait is low heritability. Furthermore, when 100% of the genetic variance is epistatic, RQR was, in most cases, better than traditional methods. Thus, RQR is an interesting alternative in GWS studies, since RQR allows the discovery of the model that best represents the relationship between the dependent (phenotype) and independent (markers effects) increasing the predictive performance of the model.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-12-09T13:32:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 648716 bytes, checksum: 998a5adbf282be7e7a76dd4e96f64f9d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-09T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 648716 bytes, checksum: 998a5adbf282be7e7a76dd4e96f64f9d (MD5) Previous issue date: 2015-02-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Um grande número de locus de características quantitativas (QTLs) para qualidade de carne e carcaça tem sido identificado em diversos estudos, mas a arquitetura genética envolvida nessas características ainda é pouco compreendida. Dessa forma, uma metodologia que permite estudar genes e vias que afetam essas características oferece vantagens e aumenta o conhecimento dos mecanismos fisiológicos. Com esta finalidade, uma metodologia chamada Matriz de Pesos de Associação (AWM) foi utilizado para investigar a base genética dessas características e gerar redes gênicas com base na co- associação de pares de SNPs através dos fenótipos. Foi realizado estudos de associação genômica para 12 características e 144 SNPs foram significativos. Uma meta-análise foi realizada para validar os resultados obtidos no estudo de associação genômica do presente estudo. Alguns SNPs significativos encontrados nos estudos de associação genômica deste trabalho estão perto de QTLs achados nos estudos usados na meta-análise. Portanto, os resultados da meta-análise corroboram os resultados do estudo de associação genômica do presente trabalho. Os SNPs considerados significativos nos estudos de associação genômica foram selecionados para a construção da AWM. Através dessa metodologia, foi possível encontrar 45 genes e estes foram usados para a construção de uma rede com base na correlação entre eles. Além disso, foram identificados 25 fatores de transcrição (FT) fortemente relacionados (p <0,001) com os genes dessa rede. Os três top FT (Sox5, NKX2-5 e T) foram escolhidos para a construção de uma rede com suas vias e ontologia gênica. Os genes da rede e associado com os FT estão envolvidos no metabolismo do tecido adiposo e do músculo esquelético. Nossos resultados sugerem que os genes e FT identificados aqui são importantes no controle de características de qualidade de carne e carcaça. No entanto, esforços devem ser feitos a fim de estudar mais detalhadamente as novas interações gene-gene aqui identificados, bem como, os fatores de transcrição chave e vias envolvidas nestas características. / A large number of quantitative trait loci (QTLs) for meat quality and carcass traits has been identified in several studies, but the genetic architecture remains poorly understood. Thus, a methodology that allows study genes and pathways that affect these traits would offers many advantages and increase the knowledge of physiological mechanisms. With this purpose, a methodology named Association Weight Matrix (AWM) was used to investigate the genetic basis of these traits and generate gene network based on the co-association of pair-wise SNPs across phenotypes. We performed genome association studies for 12 traits and 144 SNPs was found to be significant. A meta-analysis was performed to validate the results obtained in the genome association study in this present study. Some significant SNPs found in the genome association studies of this work are close to QTLs findings in the studies from meta-analysis. Therefore the results from meta-analysis corroborated those of the genome association studies of the present work. The significant SNPs from genome association studies were selected to build the AWM. Through this methodology, we could found 45 genes, these genes were used to build a gene network based on pairwise correlations between them. Besides, we identified 25 transcription factors (TF) strongly related (p-value<0.001) with genes in the network. The top three TF (Sox5, Nkx2- 5 and T) were choosing for construction of a network with their pathways and gene ontology. The genes from network and associated with this TF were involved in metabolism of adipose tissue and skeletal muscle. Our results suggest that genes and TF identified here are important in the control of meat quality and carcass traits. However, further efforts should be made in order to study in more detail the new gene-gene interactions here identified, as well as, the key transcription factors and pathways involved in these traits.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-11-03T14:18:27Z No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-12-30T11:53:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-30T11:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / O crescente número de casos de infecções fúngicas sistêmicas tem sido motivo de grande preocupação em âmbito mundial. As opções terapêuticas disponíveis atualmente são limitadas, dividida em quatro grupos: os Polienos (anfotericina B), Fluoropirimidinas (flucitosina), Azólicos (cetoconazol, fluconazol, itraconazol, posaconazol e voriconazol) e Equinocandinas (caspofungina, micafungina e anidulafungina. Além disso, vem sendo observado há algum tempo o surgimento de resistência aos agentes antifúngicos como Anfotericina B e derivados azólicos, surgindo à necessidade do desenvolvimento de novos antifúngicos. Atualmente, a pesquisa e o desenvolvimento de drogas consomem muito tempo e apresentam altos riscos. O planejamento baseado na estrutura e no mecanismo de ação tem se mostrado uma estratégia eficiente e menos dispendiosa para desenvolvimento de novos fármacos. Neste contexto, em resultados preliminares obtidos pelo grupo, por meio de análise in silico, foram identificados quatro possíveis genes-alvos, que estão presentes em sete fungos patogênicos humanos relevantes e ausentes no genoma humano. Entre estes genes-alvo está o kre2 ou Mnt1, que codifica uma proteína de aproximadamente 49 kDa, a α - 1,2 manosiltransferase. Esta é uma proteína importante para viabilidade celular e virulência do patógeno no interior do hospedeiro. Além da seleção dos dez genes candidatos, nosso grupo identificou por métodos in silico de modelagem molecular e screening virtual, 17 compostos de baixa massa molecular (small molecules) que potencialmente têm capacidade de inibir a enzima α - 1,2- manosiltransferase (KRE2) de P. lutzii. Das 17 moléculas selecionadas, uma se destacou nos testes de susceptibilidade contra fungos de importância médica e foi denominada de molécula 3. Com testes de inibição in vitro promissores surgiu-se a necessidade de avaliar se de fato esta molécula é capaz de inibir especificamente o alvo molecular KRE2 de P. lutzii. Os resultados alcançados neste trabalho apontam para o sucesso na obtenção desta proteína no sistema de expressão heteróloga em Pichia pastoris. Uma vez que este sistema realiza glicosilação de proteínas, possibilita o dobramento correto da enzima alvo, e fornece as condições necessárias para continuidade dos experimentos. Quantidades razoáveis da proteína foram produzidas heterologamente, o que possibilitou a realização dos ensaios para determinação dos parâmetros cinéticos e testes de inibição enzimática usando a molécula 3 contra o alvo KRE2 de P. lutzii. Utilizando substrato marcado com [14C] nas reações, foi determinado o Km aparente de KRE2 de P. lutzii que atingiu 3,7 pM, demonstrando alta afinidade da enzima pelo substrato em relação aos dados descritos na literatura. De forma semelhante, os testes de inibição enzimática utilizaram o isótopo radioativo e a molécula 3 foi usada contra as enzimas KRE2 de P. lutzii e MNT1 de Cândida albicans. Os resultados obtidos para KRE2 de P. lutzii demonstram que na presença da molécula inibidora, foi observada uma redução da atividade enzimática de até 60%. No entanto, a redução da atividade enzimática de MNT1 de Cândida albicans ficou em 20%. Faz-se necessário destacar que a molécula 3 apresenta problemas de solubilidade e que novos ensaios de susceptibilidade contra espécies de Cândida spp. utilizando Pluronic F-127 associados a molécula 3 foram realizados pelo nosso grupo e os resultados foram promissores. Desta forma, o melhoramento da solubilidade da molécula 3 representa um avanço nos testes de inibição in vitro, o que aumenta a expectativa de um MIC90 melhor para os outros fungos de importância médica. Os resultados apresentados neste trabalho representam um avanço na validação da molécula 3 como inibidor de KRE2 de P. lutzii, o que poderá contribuir com dados relevantes para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento de micoses de relevância mundial. / The occurrence of growth of systemic infections has been the cause of great concern worldwide. The therapeutic options currently available are limited, and are divided into four groups, Polyenes (amphotericin B), fluoropyrimidines (flucitosine), Azoles (ketoconazole, fluconazole, itraconazole, posaconazole and voriconazole) and Echinocandins (caspofungin, micafungin and anidulafungin. Furthermore, this is observed of resistance to antifungal agents such as amphotericin B and azoles, leading to the need of development of new antifungal agents. Currently, the research and drug development, consume much time and it have high risks. The planning based on structure and mechanism of action has proven to be an efficient and less expensive strategy for development of new drugs. In this context, in preliminar results obtained by the group using in silico analysis identified four possible target genes which are present in seven relevant human pathogenic fungi and absent in the human genome. Among these target genes Kre2 or Mnt1 is responsible to encode a protein of approximately 49 kDa, the α - 1,2 mannosyltransferase. This is an important protein for cell viability and virulence of the pathogen within the host. Besides the selection of ten candidate genes, our group identified using in silico methods of molecular modeling and virtual screening 17 compounds of low molecular weight (small molecules) that potentially have the ability to inhibit the enzyme α - 1,2 mannosyltransferase (KRE2) of P. lutzii. Of the 17 molecules selected, one highlighted out in susceptibility tests against fungi of medical importance and was called molecule 3. With in vitro inhibition tests promising, the need to evaluate if in fact this molecule is able to specifically inhibit the molecular target KRE2 of P. lutzii emerged. The results obtained in this study point to the success in getting this protein in heterologous expression system in Pichia pastoris. Once this system performs glycosylation of proteins, it allows the correct folding of the target enzyme, favoring the necessary conditions to continue the experiments. Reasonable amounts of protein were produced heterologously, allowing the tests to determine the kinetic parameters and enzyme inhibition tests using the molecule 3 against the target KRE2 P. lutzii. Using labeled substrate [14C] in the reactions, apparent Km of KRE2 of P. lutzii was determined, which reached 3.7 pM, demonstrating the high affinity of the enzyme for the substrate in comparison to data in the literature. Similarly, the enzymatic inhibition tests used the radioactive isotope and the molecule 3 was used against enzymes KRE2 of P. lutzii and MNT1 of Candida albicans. The results obtained for KRE2 of P. lutzii demonstrated that in the presence of the inhibitor molecule, was observed a reduction in the enzymatic activity by 60%. However, reduction of the enzymatic activity of MNT1 of Candida albicans was 20%. It is necessary to point out that the molecule 3 shows solubility issues, additional susceptibility testing against species of Candida spp. using Pluronic F-127 linked to molecule3 were carried out by our group with promising results. Thus, the improvement of the solubility of the molecule 3 represented an advance in vitro inhibition tests, which increases the expectation of better MIC90 for other fungi of medical importance. The results presented in this work represents an advancement in the validation of the molecule 3 as an inhibitor of KRE2 of P. lutzii, which may contribute to important data for the development of new drugs for the treatment of fungal infections of global relevance.