Acredita-se que diferenças hodológicas e diferente padrão de expressão gênica ao longo do eixo dorso/ventral do hipocampo seriam responsáveis pela distinta função entre a porção dorsal (HD) e ventral do mesmo (HV). HD seria responsável por processos cognitivos, tais como memória e aprendizagem espacial, e o HV pelas respostas neuroendócrinas e emocional-motivacionais ao estresse. No entanto, não há muitos estudos acerca de diferenças entre HD e HV na modulação de comportamentos relacionados à neurobiologia da depressão. Há, contudo, dados indicando que o bloqueio de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA ou da síntese de NO no HD induz efeito semelhante ao dos antidepressivos (i.e. do tipo antidepressivo) no teste do nado forçado (TNF). Quanto ao HV, a função da neurotransmissão glutamatérgica/nitrérgica na neurobiologia da depressão permanece não investigado. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi realizar o bloqueio reversível do HD ou do HV, em diferentes momentos, em animais submetidos ao TNF. O próximo passo foi realizar a micro-injeção intra-HD ou intraHV do antagonista NMDA AP-7 ou do inibidor da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), N-PLA, ou do inibidor da guanilato ciclase solúvel (sGC), ODQ. Os resultados mostram que o bloqueio do HD ou do HV com cloreto de cobalto (CoCl2, bloqueador da neurotransmissão sináptica dependente de cálcio) não modificou o comportamento dos animais no TNF. No entanto a administração de AP-7 ou N-PLA ou ODQ no HV antes do teste, reduziu o tempo de imobilidade no TNF. Por outro lado, a injeção dessas drogas no HD foi capaz de reduzir o tempo de imobilidade quando administradas tanto depois do pré-teste quanto antes do teste. Estes resultados sugerem que as vias NMDA-NO do HD e do HV, estariam envolvidas na modulação da resposta comportamental frente ao estresse do nado forçado. Além disso, os dados indicam que a participação dessas estruturas é importante em diferentes momentos após a exposição ao estresse. / It is believed that hodological and genetic pattern of expression differences along dorsal/ventral hippocampal axis would be responsible for distinct functions attributed to its dorsal (DH) and ventral (VH) poles. DH would be responsible for cognitive process, such as spatial memory and learning, whereas the VH would be responsible for neuroendocrine and emotional-motivation responses to stress. However, there is no many studies about possible differences between DH and VH in the modulation of behavioral responses related to the neurobiology of depression. Though, there are data showing that the blockade of glutamatergic NMDA receptors blockers or NO synthesis inhibition within the DH induces similar effect to that of antidepressant drugs (like antidepressant effect) in the forced swimming test (FST). On the VH, The role of the glutamatergic/nitrergic neurotransmission remains to be investigated. Thus, the aim of this work was to perform the reversible blockade of DH or VH, at different times, in animals subjected to FST. Additionally, the next step was to perform a microinjections into the DH or the VH of NMDA antagonist (AP-7), inhibitor of neuronal nitric oxide synthase (nNOS, N-PLA), or the inhibitor of soluble guanylate cyclase (sGC, ODQ). The results show that blocking the VH or the DH (cobalt chloride, calcium dependent neurotransmission inhibitor) did not modify the behavior of animals during the TNF. However administration of AP-7, N-PLA or ODQ intra-HV, before testing, caused antidepressant-like effects. Moreover, injection of such drugs, intra-HD, was able to induce similar results when administered both after the pre-test and before testing. These results suggest that NMDA-NO pathway of both VH and DH is involved in the modulation of emotional responses to the forced swim stress, although there may be an interest differential participation of these structures at different times after exposure to stress.

Acredita-se que diferenças hodológicas e diferente padrão de expressão gênica ao longo do eixo dorso/ventral do hipocampo seriam responsáveis pela distinta função entre a porção dorsal (HD) e ventral do mesmo (HV). HD seria responsável por processos cognitivos, tais como memória e aprendizagem espacial, e o HV pelas respostas neuroendócrinas e emocional-motivacionais ao estresse. No entanto, não há muitos estudos acerca de diferenças entre HD e HV na modulação de comportamentos relacionados à neurobiologia da depressão. Há, contudo, dados indicando que o bloqueio de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA ou da síntese de NO no HD induz efeito semelhante ao dos antidepressivos (i.e. do tipo antidepressivo) no teste do nado forçado (TNF). Quanto ao HV, a função da neurotransmissão glutamatérgica/nitrérgica na neurobiologia da depressão permanece não investigado. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi realizar o bloqueio reversível do HD ou do HV, em diferentes momentos, em animais submetidos ao TNF. O próximo passo foi realizar a micro-injeção intra-HD ou intraHV do antagonista NMDA AP-7 ou do inibidor da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), N-PLA, ou do inibidor da guanilato ciclase solúvel (sGC), ODQ. Os resultados mostram que o bloqueio do HD ou do HV com cloreto de cobalto (CoCl2, bloqueador da neurotransmissão sináptica dependente de cálcio) não modificou o comportamento dos animais no TNF. No entanto a administração de AP-7 ou N-PLA ou ODQ no HV antes do teste, reduziu o tempo de imobilidade no TNF. Por outro lado, a injeção dessas drogas no HD foi capaz de reduzir o tempo de imobilidade quando administradas tanto depois do pré-teste quanto antes do teste. Estes resultados sugerem que as vias NMDA-NO do HD e do HV, estariam envolvidas na modulação da resposta comportamental frente ao estresse do nado forçado. Além disso, os dados indicam que a participação dessas estruturas é importante em diferentes momentos após a exposição ao estresse. / It is believed that hodological and genetic pattern of expression differences along dorsal/ventral hippocampal axis would be responsible for distinct functions attributed to its dorsal (DH) and ventral (VH) poles. DH would be responsible for cognitive process, such as spatial memory and learning, whereas the VH would be responsible for neuroendocrine and emotional-motivation responses to stress. However, there is no many studies about possible differences between DH and VH in the modulation of behavioral responses related to the neurobiology of depression. Though, there are data showing that the blockade of glutamatergic NMDA receptors blockers or NO synthesis inhibition within the DH induces similar effect to that of antidepressant drugs (like antidepressant effect) in the forced swimming test (FST). On the VH, The role of the glutamatergic/nitrergic neurotransmission remains to be investigated. Thus, the aim of this work was to perform the reversible blockade of DH or VH, at different times, in animals subjected to FST. Additionally, the next step was to perform a microinjections into the DH or the VH of NMDA antagonist (AP-7), inhibitor of neuronal nitric oxide synthase (nNOS, N-PLA), or the inhibitor of soluble guanylate cyclase (sGC, ODQ). The results show that blocking the VH or the DH (cobalt chloride, calcium dependent neurotransmission inhibitor) did not modify the behavior of animals during the TNF. However administration of AP-7, N-PLA or ODQ intra-HV, before testing, caused antidepressant-like effects. Moreover, injection of such drugs, intra-HD, was able to induce similar results when administered both after the pre-test and before testing. These results suggest that NMDA-NO pathway of both VH and DH is involved in the modulation of emotional responses to the forced swim stress, although there may be an interest differential participation of these structures at different times after exposure to stress.

The Group III metabotropic glutamate receptors (mGluR) are located presynaptically on axon terminals and act as autoreceptors and heteroreceptors by inhibiting neurotransmitter release. Much has been learned about these receptors through exogenous application of L-serine-O-phosphate (L-SOP), an endogenous amino acid derivative and known activator of the Group III mGluRs. We hypothesized that L-SOP is the endogenous co-agonist at the high affinity Group III mGluR, mGluR4. We found the EC50 of L-SOP at mGluR4 was 0.5 μM, and determined that the concentration of L-SOP in whole brain was approximately 5 μM. An immunocytochemical survey revealed that cells containing the enzymatic machinery necessary for L-SOP synthesis and metabolism were observed in two brain regions known to express mGluR4, namely, cerebellum and hippocampus. In the cerebellum, the L-SOP synthetic and metabolic enzymes were found in Bergmann glia and Purkinje cells, two cells which form a tripartite synapse with parallel fiber axon terminals where the mGluR4 subtype is exclusively expressed at high levels. In the hippocampus, the L-SOP metabolic enzyme was detected in young neurons emanating from the neurogenic subventricular zone. Attempts to raise endogenous levels of L-SOP by crippling the L-SOP metabolizing enzyme (phosphoserine phosphatase), over-expressing the L-SOP synthesizing enzyme (phosphoserine aminotransferase), or through dietary protein restriction, to study the effects on neurotransmission and neurodevelopment in the central nervous system (CNS) were unsuccessful, suggesting that the production of L-SOP remains stable despite manipulation of the synthetic and metabolic enzymes. Finally, the ability of L-SOP to modulate glutamate release from presynaptic terminals was examined in cerebellar synaptosomes. Co-incident activation of presynaptic mGluR4 and presynaptic GABAA receptors facilitated glutamate release, suggesting that simultaneous activation of parallel fibers and Bergmann glia may serve to enhance synaptic transmission. This observation expands the traditional view of Group III mGluRs acting solely as inhibitory autoreceptors. Taken together, these results provide compelling evidence to support the hypothesis that L-SOP is the endogenous agonist at mGluR4, and possibly other Group III mGluRs.

The Group III metabotropic glutamate receptors (mGluR) are located presynaptically on axon terminals and act as autoreceptors and heteroreceptors by inhibiting neurotransmitter release. Much has been learned about these receptors through exogenous application of L-serine-O-phosphate (L-SOP), an endogenous amino acid derivative and known activator of the Group III mGluRs. We hypothesized that L-SOP is the endogenous co-agonist at the high affinity Group III mGluR, mGluR4. We found the EC50 of L-SOP at mGluR4 was 0.5 μM, and determined that the concentration of L-SOP in whole brain was approximately 5 μM. An immunocytochemical survey revealed that cells containing the enzymatic machinery necessary for L-SOP synthesis and metabolism were observed in two brain regions known to express mGluR4, namely, cerebellum and hippocampus. In the cerebellum, the L-SOP synthetic and metabolic enzymes were found in Bergmann glia and Purkinje cells, two cells which form a tripartite synapse with parallel fiber axon terminals where the mGluR4 subtype is exclusively expressed at high levels. In the hippocampus, the L-SOP metabolic enzyme was detected in young neurons emanating from the neurogenic subventricular zone. Attempts to raise endogenous levels of L-SOP by crippling the L-SOP metabolizing enzyme (phosphoserine phosphatase), over-expressing the L-SOP synthesizing enzyme (phosphoserine aminotransferase), or through dietary protein restriction, to study the effects on neurotransmission and neurodevelopment in the central nervous system (CNS) were unsuccessful, suggesting that the production of L-SOP remains stable despite manipulation of the synthetic and metabolic enzymes. Finally, the ability of L-SOP to modulate glutamate release from presynaptic terminals was examined in cerebellar synaptosomes. Co-incident activation of presynaptic mGluR4 and presynaptic GABAA receptors facilitated glutamate release, suggesting that simultaneous activation of parallel fibers and Bergmann glia may serve to enhance synaptic transmission. This observation expands the traditional view of Group III mGluRs acting solely as inhibitory autoreceptors. Taken together, these results provide compelling evidence to support the hypothesis that L-SOP is the endogenous agonist at mGluR4, and possibly other Group III mGluRs.

Research strategies have been developed to characterize parameters in peripheral tissues that might easily be measured in humans as surrogate markers of damage, dysfunction or interactions involving neural targets of toxicants. Human platelets have been repeatedly suggested as an excellent model for various aspects of the synaptic apparatus and these cells have been shown to accumulate glutamate in a manner similar to that in as synaptosomal preparations. In fact, blood cells such as platelets are ideally suited for monitoring a chemical s neurotoxic effects because of their easy accessibility and because they share a number of functions similar to those of central nervous system neurons. The increasing number of chemicals present in the habitational and occupational environment elevates the risk of toxic human exposure. Heavy metals have become one of many contaminants found in our environment. These metals may react with free protein cysteine thiol groups, which are involved in the function of many enzymes, structural proteins and receptors. Organoselenium (diphenyl diselenide and ebselen) and organotellurium (diphenyl ditelluride) are known to disturb cellular functions by oxidizing -SH groups of biomolecules. Considering that -SH groups are important constituents of receptors and transporters, the effects of heavy metals (Hg2+, Pb2+and Cd2+) as well as diphenyl diselenide, diphenyl ditelluride and ebselen on glutamatergic system in human platelets were examined. The results clearly demonstrated that Hg2+, Cd2+ and Pb2+ inhibited [3H]-glutamate uptake in human platelets. Hg2+ inhibited [3H]-glutamate binding, while Cd2+ and Pb2+ stimulated [3H]-glutamate binding in human platelets. Heavy metals caused an increase on lipid peroxidation and reactive oxygen species measurement in platelets, suggesting that oxidative stress, at least in part, could be one of the mechanisms involved in heavy metals-induced neurotoxicity. The use of 2,3-dimercaptopropanol (BAL), a dithiol chelating agent therapeutically used for the treatment of heavy metals poisoning, was able to protect and restoring [3H]-glutamate binding against effects caused by Pb2+, Cd2+ and Hg2+. 2,3 dimercaptopropane-1-sulfonic acid (DMPS), another dithiol chelating agent, was able protecting and restoring against the effects caused by heavy metals in [3H]-glutamate binding in platelets. Similar results were obtained with ditiothreitol (DTT), a sulfhydryl agent commonly used as a -SH groups reductor. The dithiol agents alone did not alter [3H]-glutamate binding. In contrast, reduced glutathione (GSH), a monothiol reducing agent, inhibited [3H]-glutamate binding in all tested concentrations. In addition, this compound did not protect the effect caused by heavy metals. These results suggest that dithiol agents (BAL, DMPS and DTT) could act by chelating heavy metals or/and by reducing SH groups of glutamatergic receptors. Diphenyl diselenide and diphenyl ditelluride inhibited [3H]-glutamate binding, but ebselen did not alter this parameter. All organochalcogens tested inhibited [3H]-glutamate uptake in human platelets. The inhibition caused by organochalcogens in glutamatergic system, was not recovered by the addition of reducing agents (DTT and GSH), indicating that toxicological properties of these compounds an not exclusively related to oxidation of SH groups. Considering the results obtained, could be suggested that platelets to be a suitable biomarker for exposure by toxic compounds and represented a good model for investigated the mechanism involved in changes caused by these compounds. / Recentes pesquisas têm sido desenvolvidas para caracterizar biomarcadores em tecidos periféricos que possam ser utilizados em casos de dano, disfunção ou interações envolvendo alvos de agentes tóxicos. As plaquetas têm sido amplamente sugeridas como um excelente modelo do aparato sináptico e, ainda tem sido demonstrado que estas células acumulam glutamato de maneira similar a sinaptossomas de cérebro de ratos. De fato, as células sanguíneas são ideais para monitorar os efeitos neurotóxicos causados por agentes químicos, por serem de fácil acesso e devido a estas apresentarem funções similares às encontradas em neurônios do sistema nervoso central. O aumentado número de agentes químicos presentes no meio ambiente tem elevado o risco de intoxicação ocupacional. Os metais pesados são alguns dos principais contaminantes encontrados no meio ambiente. Estes metais podem interagir com grupos -SH, os quais são necessários para a função de muitas enzimas, proteínas estruturais e receptores. Os compostos de organoselênio (disseleneto de difenila e ebselen) e de organotelúrio (ditelureto de difenila) também foram alvo deste estudo, visto que também possuem a capacidade de oxidar grupos SH de moléculas biologicamente ativas. Assim como os metais pesados, os mecanismos pelos quais os organocalcogênios desencadeiam ações tóxicas não são bem descritos. Levando em consideração que grupos SH estão presentes em receptores e transportadores, investigou-se os efeitos dos metais pesados (Hg2+, Pb2+ e Cd2+), bem como do disseleneto de difenila, ditelureto de difenila e ebselen sobre o sistema glutamatérgico em plaquetas humanas. Os resultados obtidos demonstraram que o Hg2+, o Cd2+ e o Pb2+ inibem a captação de [3H]-glutamato em plaquetas. O Hg2+ inibiu a união específica de [3H]-glutamato, enquanto o Cd2+ e o Pb2+ estimularam a união específica de [3H]-glutamato em plaquetas. Os metais pesados testados causaram um aumento na peroxidação lipídica e nos níveis de espécies reativas de oxigênio em plaquetas, sugerindo que o estresse oxidativo, pelo menos em parte, pode estar envolvido na neurotoxicidade induzida por estes metais. O 2,3-dimercaptopropanol (BAL), um agente quelante ditiólico usado terapeuticamente no tratamento de intoxicações por metais pesados, foi capaz de proteger e restaurar os efeitos causados por Pb2+, Cd2+ e Hg2+ sobre a união específica de [3H]-glutamato. Outro agente quelante ditiólico testado, o ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfônico (DMPS), foi capaz de proteger e restaurar os efeitos causados pelos metais pesados sobre a união específica de [3H]-glutamato em plaquetas. Resultados similares foram obtidos com o ditiotreitol (DTT), um agente utilizado como redutor de grupos -SH. Os agentes ditiólicos sozinhos não alteraram a união específica de [3H]-glutamato. Em contraste, a glutationa reduzida (GSH), um agente redutor monotiol, causou inibição sobre a união específica de [3H]-glutamato em todas as concentrações testadas. Esse composto não foi capaz de proteger do efeito causado pelos metais. Esses resultados sugerem que os agentes ditiólicos (BAL, DMPS e DTT) podem atuar quelando os metais pesados e/ou como redutores de grupos SH dos receptores glutamatérgicos. O disseleneto de difenila e ditelureto de difenila inibiram a união específica de [3H]-glutamato, mas o ebselen não interferiu nesse parâmetro. Além disso, todos os organocalcogênios testados inibiram a captação de [3H]-glutamato em -plaquetas. A inibição causada por estes compostos sobre a captação e união específica de [3H]-glutamato, não foi revertida pela adição de agentes redutores (DTT e GSH), indicando que os efeitos tóxicos dos organocalcogênios não está exclusivamente relacionado com à oxidação de grupos SH. Considerando os resultados obtidos neste estudo, é possível sugerir que as plaquetas podem servir como marcadores periféricos em casos de exposição por agentes tóxicos e, ainda representam um bom modelo para investigar os mecanismos envolvidos nas alterações causadas por estes compostos.

Desde a primeira síntese, isolamento e caracterização dos andrógenos, particularmente da testosterona em 1935, diversos homólogos sintéticos foram desenvolvidos com os objetivos de prolongar a atividade biológica, desenvolver administração parenteral e diminuir a atividade androgênica, classe denominada de esteróides anabólicos-andrógenos (EAA). Desde 1940, os EAA são utilizados na clínica para diversos tipos de doenças, destacando-se o hipogonadismo masculino e em terapias para promoção de crescimento. Também são amplamente utilizados para fins estéticos, principalmente para manutenção e promoção do ganho de massa magra corpórea. Devido ao grande aumento do consumo destes fármacos, tanto para fins esportivos como estéticos, há uma necessidade de investigar efeitos comportamentais relacionados ao seu uso exacerbado. Milhares de pessoas se auto-administram EAA em superdoses, o que gera um problema de saúde pública. Os Resultados do presente trabalho demonstram que o uso crônico dos EAA aumento do comportamento de agressivo, e sutil prejuízo da memória espacial e memória aversiva de curta duração, e na atividade exploratória em camundongos machos da linhagem CF1. Os Resultados metabólicos demonstraram que o tratamento crônico com decanoato de nandrolona (DN) não afeta a função hepática e renal, não altera a homeostasia da glicose e nem o peso corporal, mas diminui os níveis séricos de colesterol total, HDL e triglicerídeos. Os resultados neuroquímicos apontam para uma ruptura da homeostase glutamatérgica, através da alteração da captação de glutamato e do imunoconteúdo do transportador GLT 1. Em conclusão, o uso crônico com altas doses de DN causa o aumento do comportamento agressivo e diminuição na memória aversiva de curta duração. O desequilíbrio da função glutamatérgica evidenciado pela diminuição da captação de glutamato no córtex e hipocampo e do transportador GLT-1- pode ser um dos mecanismos neuroquímicos envolvidos nas alterações comportamentais induzidas pelo tratamento com o DN. / Since the first synthesis, isolation and characterization of androgens, particularly testosterone in 1935, several synthetic counterparts were developed with the objective of prolonging the biological activity, parenteral administration and decrease the androgen activity, called the class of anabolic-androgenic (AAS). Since 1940, AAS are used in the clinic for several types of diseases, especially in male hypogonadism and therapies to promote growth. Additionally, they are widely used for esthetic purposes, mainly for maintenance and promotion of lean body mass gain. Due to the large increase in consumption of these drugs, both for aesthetic purposes and sports, the investigation of behavioral effects related to its overuse is imperative. Thousands of people self-administer AAS in overdoses, a fact that creates a public health problem. The results of this study demonstrate that chronic administration of AAS cause an increase in aggressive behavior, and subtle impairment of spatial memory and short-term aversive memory in male mice strain CF1. The metabolic results showed that chronic treatment with Nandrolone Decanoate (DN) neither affect hepatic and kidney function, nor glucose homeostasis and body weight but decreased serum levels of total cholesterol, HDL and triglycerides. The neurochemical results suggest a disruption of glutamatergic homeostasis through changes in glutamate uptake and GLT1 immunocontent. In conclusion, the chronic use at high doses of DN causes increase of aggressive behavior impairs short-term avoidance memory. The imbalance of glutamatergic function evidenced by the decreased glutamate uptake in cortex and hippocampus as well as decreased immunocontent of GLT-1 may participate in the mechanisms underlying behavioral changes induced by chronic treatment with DN.

A tentativa de compreender as consequências do tratamento precoce crônico com metilfenidato é muito importante uma vez que este psicoestimulante tem sido amplamente utilizado em crianças de idade pré-escolar. Além disso, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nas alterações persistentes no comportamento e no funcionamento neuronal associada à sua utilização. Neste estudo, nós inicialmente investigamos o efeito do tratamento precoce crônico com metilfenidato sobre o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano. Além disso, foram também avaliados a homeostase glutamatérgica, a Na+,K+-ATPase e o equilíbrio redox no córtex pré-frontal de ratos jovens. Ratos Wistar receberam injeções intraperitoneais de metilfenidato (2,0 mg/kg) ou um volume equivalente de solução salina 0,9% (controles), uma vez por dia, do 15º ao 45º dia de vida. Vinte e quatro horas após a última administração de metilfenidato, os animais foram decapitados e o líquido cefalorraquidiano e o córtex pré-frontal foram obtidos e processados conforme o protocolo para cada uma das análises. Os resultados mostraram que o metilfenidato alterou o perfil de aminoácidos no líquido cefalorraquidiano, aumentando os níveis de glutamato. A captação de glutamato foi diminuída pelo tratamento crônico com metilfenidato, mas o conteúdo dos transportadores, GLAST e GLT-1, não foram alterados por esse tratamento. A atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas (α1, α2 e α3) da Na+,K+-ATPase foram diminuídos em córtex pré-frontal de ratos submetidos ao metilfenidato. Alterações na expressão gênica das subunidades α1 e α2 da Na+,K+-ATPase também foram observadas. O conteúdo de sulfidrilas, um marcador inversamente correlacionado com dano proteíco, foi diminuído. A atividade da CAT foi aumentada e a razão SOD/CAT foi diminuída em córtex pré-frontal de ratos. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças significativas quando comparado aos controles. Os nossos resultados, tomados em conjunto, sugerem que o tratamento precoce crônico com metilfenidato promove excitotoxicidade devido, pelo menos em parte, à inibição da captação de glutamato provavelmente causada por perturbações na função da Na+,K+-ATPase e/ou pelo dano à proteína observados no córtex pré-frontal. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas alterações bioquímicas e comportamentais associadas ao uso crônico de metilfenidato durante o desenvolvimento do sistema nervoso central. / Understanding the consequences of chronic treatment with methylphenidate is very important since this psychostimulant is extensively in preschool age children. Additionaly to this, little is known about the mechanisms involved in persistent changes in behavior and neuronal function related with use of methylphenidate. In this study, we initially investigate the effect of chronic treatment with methylphenidate in juvenile rats on the amino acids profile in cerebrospinal fluid, as well as on glutamatergic homeostasis, Na+,K+-ATPase function and redox balance in prefrontal cortex. Wistar rats at early age received intraperitoneal injections of methylphenidate (2.0 mg/kg) or an equivalent volume of 0.9% saline solution (controls), once a day, from the 15th to the 45th day of life. Twenty-four hours after the last administration of methylphenidate, the animals were decapitated and the cerebrospinal fluid and the prefrontal cortex were obtained and processed according to the protocol for each analysis. Our results showed that methylphenidate altered amino acid profile in cerebrospinal fluid, increasing the levels of glutamate. In the prefrontal cortex, methylphenidate administration was able to decrease the glutamate uptake, with no changes in GLAST and GLT-1; and the activity and immunocontent of catalytic subunits (α1, α2 and α3) of Na+,K+-ATPase. We also observe changes in α1 and α2 gene expression of catalytic α subunits of Na+,K+-ATPase, decrease in sulfhydryl content, CAT activity and SOD/CAT ratio in juvenile rat prefrontal cortex treated with methylphenidate. Taken together, our results suggest that chronic treatment with methylphenidate at early age induces excitotoxicity, at least in part, due to inhibition of glutamate uptake probably caused by disturbances in the Na+,K+-ATPase function and/or protein damage observed in the prefrontal cortex. These findings may contribute, at least in part, to a better understanding of mechanisms involved in the biochemical and behavioral changes associated with chronic use of methylphenidate during the development of the central nervous system.

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Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:55Z : No. of bitstreams: 2 Publico-11764a.pdf: 1760987 bytes, checksum: 26371946d909a5525c0bd6c7cc6d7c33 (MD5) Publico-11764b.pdf: 969495 bytes, checksum: d87ae7194b036aaff67581e32d434f64 (MD5) / Objetivo: Verificar se indivíduos susceptíveis e não-susceptíveis às convulsões clônicas induzidas pelo DMCM, um agonista inverso benzodiazepínico, diferem: 1) na sensibilidade ao efeito hipnótico induzido pelo diazepam e por outros moduladores alostéricos positivos do receptor GABAA; 2) na marcação auto-radiográfica com o [3H]- flunitrazepam ao longo do encéfalo; 3) na marcação de [3H]-L-glutamato e do [3H]-MK 801 em membranas de regiões encefálicas; e 4) na atividade da enzima Na+/K+- ATPase, bem como na marcação da [3H]-ouabaína às isoenzimas Na+/K+- ATPase de alta e de baixa afinidade ao radioligante em membranas de regiões encefálicas. Métodos: Ratos Wistar, machos, adultos foram administrados intraperitonealmente duas vezes com uma DC50 de DMCM (com intervalo de uma semana entre as administrações), obtendo-se dois grupos distintos: o grupo susceptível às convulsões (SC), que apresentou convulsões clônicas em ambas as exposições à droga, e o grupo não-susceptível às convulsões (NSC), que não apresentou alterações motoras em ambas as exposições. Após cerca de 25 dias da segunda administração de DMCM, os grupos selecionados foram submetidos aos experimentos com os hipnóticos diazepam, pentobarbital e etanol, nos quais foram registrados o tempo e a latência de sono ou foram sacrificados e seus encéfalos retirados para os seguintes ensaios bioquímicos: 1) auto-radiografia com o [3H]-flunitrazepam; 2) marcação de [3H]-L-glutamato e de [3H]- MK 801 em membranas neuronais; e 3) atividade enzimática da Na+/K+- ATPase e marcação de [3H]-ouabaína em enzimas de alta e baixa afinidade em membranas neuronais. Resultados: O grupo SC apresentou menor tempo de sono induzido pelo diazepam com relação ao grupo NSC, embora não tenham se distinguindo no tempo de sono induzido pelo pentobarbital e pelo etanol. Com relação aos experimentos bioquímicos, observou-se uma menor marcação de [3H]-flunitrazepam na região CA2 ventral do hipocampo no grupo SC. Quanto à ligação de [3H]-L-glutamato foi menor no grupo SC nas regiões do córtex frontal, amígdala + córtex límbico e hipocampo, enquanto que a ligação de [3H]-MK 801 foi menor no córtex frontal, hipocampo e estriado. Embora os grupos não tenham se diferenciado na atividade enzimática da Na+/K+- ATPase, o grupo SC apresentou uma menor marcação da [3H]-ouabaína em isoenzimas de alta afinidade nas regiões do tronco encefálico, córtex frontal e hipocampo, bem como uma menor marcação de [3H]-ouabaína nas regiões do tronco encefálico e córtex frontal em isoenzimas de baixa afinidade. Conclusão: As diferenças entre os grupos quanto à sensibilidade ao efeito convulsivante do DMCM, à ansiedade observada em experimentos anteriores, bem como à sensibilidade ao efeito hipnótico do diazepam podem estar associadas a uma diferença nos sítios benzodiazepínicos da região CA2 ventral do hipocampo, na ix atividade glutamatérgica e em isoformas específicas da Na+/K+- ATPase em determinadas regiões encefálicas. / Objective: The aim of this work was to verify if rats susceptible and non-susceptible to clonic convulsions induced by DMCM, a benzodiazepine inverse agonist, differ: 1) in the sensitivity to the hypnotic effect induced by diazepam and by others positive allosteric modulators of GABAA receptors; 2) in auto-radiographical analysis of [3H]-flunitrazepam binding along the brain; 3) in the binding of [3H]-L-glutamate and of [3H]-MK 801 in membranes from discrete brain regions; and 4) in the Na+/K+-ATPase activity, as well as in the binding of [3H]-ouabain to Na+/K+-ATPase isoenzimes with high and low affinity to the radioligand in membranes from discrete brain regions. Methods: Adult, male, Wistar rats were administered with two intraperitoneal injections of a convulsant dose 50% (CD50) of DMCM (one-week interval between them), resulting in two distinct groups: the group susceptible to clonic convulsions (SC), which presented clonic convulsions in both the expositions to the drug, and the group nonsusceptible to clonic convulsions (NSC), which did not present any motor disturbance in both the expositions. After 25 days from the second exposition to DMCM, the selected groups were submitted to the experiments with the hypnotics diazepam, pentobarbital and ethanol, in which were registered the latency and the time of sleep or they were sacrified and their brains were removed to carry out the following assays: 1) autoradiography with [3H]-flunitrazepam; 2) binding with the [3H]-L-glutamate and with the [3H]-MK 801 in neuronal membranes; 3) enzymatic activity of Na+/K+-ATPase and binding of [3H]-ouabain to the isoenzimes with high and low affinity in neuronal membranes. Results: The SC group presented a lower sleeping time induced by diazepam compared to the NSC group, and did not differ in the sleeping time induced by pentobarbital and ethanol. Concearning the biochemical experiments, it was observed a lower binding of [3H]-flunitrazepam in the CA2 subregion of ventral hippocampus in the SC group. A lower binding of [3H]-L-glutamate was also observed in the SC group in the frontal cortex, amygdala plus limbic cortex and hippocampus, whereas the binding of [3H]-MK 801 was lower in the frontal cortex, hippocampus and striatum compared to the NSC group. Althougt the groups did not differ in the enzymatic activity of Na+/K+- ATPase, the SC group presented a lower binding of [3H]-ouabain to the high-affinity isoenzimes in the brainstem, frontal cortex and hippocampus, as well as a lower binding of [3H]-ouabain to the low-affinity isoenzimes in the brainstem and in the frontal cortex compared to the NSC group. Conclusion: The differences between the groups concerning the sensitivity to the convulsant effect of DMCM, the level of anxiety previously observed, as well as the sensitivity to the hypnotic effect of diazepam may be associated with the GABAA/benzodiazepine site in CA2 subregion of ventral hippocampus, with glutamatergic activity and with specific isoforms of Na+/K+-ATPase in rat brain regions. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Neuralgia trigeminal (NT) é um tipo de dor neuropática orofacial intensa e debilitante sentida ao longo do nervo trigêmeo. Seu diagnóstico é meramente clínico, sem exames específicos, o que dificulta a presteza e eficácia do tratamento. O sintoma mais característico é alodínia mecânica relacionada à sensibilização central. Seu tratamento é farmacológico e/ou cirúrgico, no entanto pode trazer poucos benefícios e/ou importantes efeitos colaterais sem a garantia de remissão total dos sintomas. No tratamento farmacológico, os anticonvulsivantes são fármacos de primeira linha de tratamento, mas também são obtidas respostas de melhora com o uso de fármacos ansiolíticos e opioides. A dificuldade no tratamento da NT se deve, em parte, à falta de compreensão dos mecanismos envolvidos na geração da dor; sendo, desta forma, imprescindível a busca de um melhor entendimento da fisiopatologia da NT buscando identificar as vias envolvidas no processo de dor. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o possível envolvimento das vias gabaérgica, glutamatérgica e opioidérgica na fisiopatogenia de um modelo de neuralgia trigeminal em ratos. A resposta nociceptiva dos animais foi avaliada por meio do teste de von Frey eletrônicoantes e após a administração de agonistas gabaérgicos e opioidérgico e de antagonista glutamatérgico. Além da a resposta nociceptiva, foram avaliados os níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em gânglio trigeminal, tronco encefálico e córtex pré-frontal. Todos os procedimentos experimentais foram realizados na Unidade de Experimentação Animal (UEA), Unidade de Análises Moleculares e de Proteínas (UAMP) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). A indução da dor neuropática foi por constrição crônica do nervo infraorbitário (CCI-ION) proposto por Imamura em 1997 adaptado (Imamura Y., Kawamoto H., Nakanishi O. Charactherization of heat-hiperalgesia in experimental trigeminal neuropathy in rats. Exp Brain Res, 1997; 116: 97-103.). Para isso foram utilizados 112 ratos Wistar, machos divididos para o procedimento cirúrgico em 3 grupos: Controle Total, Dor e Sham. Quatorze dias após o procedimento cirúrgico, tempo necessário para o desenvolvimento da dor neuropática, realizamos dois protocolos e dividimos os grupos em: protocolo 1: controle veículo, cirurgia sham veículo, cirurgia sham agonista benzodiazepínico, cirurgia sham antagonista glutamatérgico, dor veículo, dor agonista benzodiazepínico, dor antagonista glutamatérgico; protocolo 2: controle veículo, cirurgia sham veículo, cirurgia sham agonista gabaérgico, cirurgia sham agonista opioidérgico, dor veículo, dor agonista gabaérgico, dor agonista opioidérgico. Os animais dos grupos sham sofreram apenas incisão cirúrgica, sem constrição do nervo. Durante o procedimento cirúrgico a indução anestésica foi feita com cetamina (50mg/kg) e xilazina (5mg/kg) e a manutenção, com isoflurano 2-3%. O controle da dor pós-operatória foi obtido com cloridrato de tramadol (10mg/kg) no intervalo de 12h por 48h. A resposta hiperalgésica mecânica (von Frey) foi avaliada antes da indução do modelo (medida basal), 7 e 14 dias após cirurgia, pré-administração dos fármacos, 15,30 e 60 minutos após administração dos fármacos: veículo - solução salina; agonista benzodiazepínico – diazepam (2 mg/kg); antagonista glutamatérgico - MK- 801 (0,25mg/Kg), agonista opioidérgico – morfina (5,0 mg/kg) e agonista gabaérgico – fenobarbital (100mg/kg). Os dados foram analisados por Equações Estimativas Generalizadas e expressos em média+EPM. Todos os procedimentos foram aprovados pelo CEUA/HCPA e CEUA/UFRGS sob número: 14-0604 e 29310, respectivamente. Inicialmente foram realizados testes para verificação do modelo de dor, foi observado que 14 dias após cirurgia de constrição do nervo infraorbitário, os animais do grupo dor apresentaram redução nos limiares de retirada da face no teste de von Frey facial comparado aos grupos controle e sham [GEE: interação grupo x tempo (Waldχ2=15,81; 2, P<0,05)]. Após o estabelecimento do modelo, foram realizados testes nociceptivos para avaliação das vias envolvidas na neuralgia trigeminal, observou-se interação grupo x tempo (Wald _2=175,74;18, P<0,01). No protocolo 1, os animais do grupo dor que receberam agonista benzodiazepínico (diazepam) apresentaram aumento no limiar nociceptivo a partir de 15 minutos após administração e este resultado permaneceu por até 60 minutos. Os animais do grupo dor que receberam antagonista glutamatérgico (MK-801) apresentaram aumento no limiar de retirada da face somente na avaliação realizada 60 minutos após a administração do fármaco. No protocolo 2, análise estatística mostrou interação entre as variáveis tempo x grupo (Wald χ2=657,53;18, P<0,01), os animais do grupo dor que receberam fenobarbital apresentaram aumento no limiar nociceptivo a partir de 15 minutos após administração e este resultado permaneceu por até 60 minutos. Por outro lado, os animais que receberam morfina apresentaram um aumento no limiar nociceptivo significativamente maior que os animais que receberam fenobarbital, no entanto ambos os fármacos reverteram a hiperalgesia induzida pela exposição ao modelo de dor. Na análise bioquímica, em córtex e tronco encefálico foi observado aumento nos níveis de BDNF tanto nos animais submetidos ao modelo de NT quanto aos que foram expostos a cirurgia sham (ANOVA de uma via/SNK, F(2,22)=13,46; F(2,25)=6,08, P<0,05, respectivamente. Em nível periférico foi observado aumento nos níveis de BDNF em gânglio trigeminal nos animais submetidos ao modelo de NT (ANOVA de uma via/SNK,F(2,22)=4,09; P<0,05). Em soro não foi observada diferença nos níveis de BDNF entre os grupos (ANOVA de uma via, P>0,05). Com base nos resultados encontrados, este estudo sugere que há o envolvimento das vias gabaérgica, glutamatérgica e opioidergica no processamento da dor neuropática orofacial (neuralgia trigeminal) sugerindo que há funcionalidade dos receptores testados. No entanto, estes agonistas gabaérgicos não induziram analgesia nos animais controles e cirurgia sham sugerindo uma alteração na liberação ou na síntese de GABA nos animais com NT. Neste estudo, não foram realizadas análises de expressão e quantificação de receptores, apenas avaliou-se a resposta nociceptiva e os níveis de BDNF centrais e periféricos. De acordo com estes achados a via gabaérgica teve uma resposta mais rápida que a via glutamatérgica. Alguns estudos demonstram que os receptores glutamatérgicos estão localizados em fibras não mielinizadas na periferia isto pode justificar o atraso na resposta dos animais que receberam antagonista glutamatérgico em nosso estudo. Quanto aos níveis de BDNF observamos que há um aumento desta neurotrofina nos animais submetidos ao modelo de NT sugerindo um envolvimento deste neuromodulador em eventos neuroplásticos da NT. / Trigeminal neuralgia (TN) is a type of intense and debilitating orofacial neuropathic pain felt along the trigeminal nerve. The diagnosis is purely clinical, without specific tests, which makes the promptness and effectiveness of treatment. The most characteristic symptom is mechanical allodynia related to central sensitization. Its treatment is pharmacological and / or surgical treatment, however can bring few benefits and / or significant side effects without the guarantee of complete remission of symptoms. In drug treatment, the anticonvulsant drug are first-line treatment, but also enhances responses are obtained with the use of anxiolytic drugs and opioids. The difficulty in treating NT is due in part to the lack of understanding of the mechanisms involved in the generation of pain; It is thus essential to search for a better understanding of the pathophysiology NT seeking to identify the pathways involved in pain process. Thus, the aim of this study was to evaluate the possible involvement of GABAergic pathways, glutamatergic and opioidergic in the pathogenesis of a model of trigeminal neuralgia in rats. The nociceptive response of the animals was assessed using the von Frey test eletrônicoantes and after administration of opioid agonists and GABAergic and glutamatergic antagonist. In the nociceptive response was evaluated derived neurotrophic factor levels in the brain (BDNF) in the trigeminal ganglia, brainstem, and prefrontal cortex. All experimental procedures were performed in the Animal Experimentation Unit (UEA), Unit of Analysis and Molecular Protein (UAMP) Porto Alegre Clinical Hospital (HCPA). The induction of neuropathic pain was by chronic constriction of the infraorbital nerve (CCI-ION) proposed by Imamura in 1997 adapted. For that they were used 112 male Wistar rats divided into the surgical procedure into 3 groups: Full Control, Pain and Sham. Fourteen days after surgery, time required for the development of neuropathic pain, performed two protocols and divided groups: Protocol 1: vehicle control, sham surgery vehicle, sham surgery benzodiazepine agonist, sham surgery glutamatergic antagonist, vehicle pain, agonist benzodiazepine pain and antagonist glutamatergic pain. Protocol 2: vehicle control, vehicle sham surgery, sham surgery gabaergic agonist, sham surgery opioid agonist, vehicle pain, gabaergic agonist pain, opioid agonist pain. The animals of the sham group underwent only surgical incision without nerve constriction. During surgery anesthesia was induced with ketamine (50 mg / kg) and xylazine (5 mg / kg) and maintained with isoflurane 2-3%. The control of postoperative pain has been obtained with tramadol hydrochloride (10mg / kg) at 12h intervals for 48 hours. The mechanical hyperalgesic response (von Frey) was assessed before induction model (baseline measurement), 7 and 14 days after surgery, pre-administration of drugs, 15,30 and 60 minutes after drug administration: Vehicle - saline; benzodiazepine agonist - diazepam (2 mg / kg); glutamatergic antagonist - MK-801 (0.25mg / kg), opioid agonist - Morphine (5.0 mg / kg) and gabaergic agonist - phenobarbital (100 mg / kg). Data were analyzed by Equation Generalised Estimates and expressed as mean ± SEM. All procedures were approved by CEUA / HCPA and CEUA / UFRGS under number: 14-0604 and 29310, respectively. Initially tests were carried out to verify the pain model, it was observed that 14 days after infraorbital nerve constriction surgery, animals pain group showed a reduction in the face withdrawal thresholds to von Frey facial test compared to control and sham groups [ GEE: group x time interaction (Wald 2 = 15.81; 2, P <0.05)]. After the model category, nociceptive tests were performed to assess the pathways involved in the trigeminal neuralgia, observed group x time interaction (Wald _2 = 175.74; 18 P <0.01). In protocol 1, the animals in the group who received pain benzodiazepine agonist (diazepam) showed an increase in nociceptive threshold from 15 minutes after administration and this result remained for up to 60 minutes. Animals of group pain that received glutamate antagonist (MK-801) showed an increase in the withdrawal threshold of the face only in the assessment was performed 60 minutes after drug administration. In protocol 2, statistical analysis showed interaction between the variables time x group (Wald χ2 = 657.53; 18, P <0.01), the animals showed increased nociceptive threshold from 15 minutes after administration of phenobarbital and morphine and this result remained for up to 60 minutes. On the other hand, animals receiving morphine showed an increased nociceptive threshold significantly higher in the animals receiving phenobarbital, however both drugs reversed hyperalgesia induced by exposure to pain model. In biochemical analysis, cortex and brainstem was observed increase in BDNF levels in both animals subjected to NT model and those who were exposed to sham surgery (one-way ANOVA / SNK, F (2,22) = 13.46 ;. F (2,25) = 6.08, P <0.05, respectively, at the peripheral level increase was observed in BDNF levels in trigeminal ganglion of animals subjected to the NT model (one-way ANOVA / SNK F ( 2,22) = 4.09; P <. 0.05). In serum was no difference in BDNF levels between groups (one-way ANOVA, P> 0.05) based on the results, this study. suggests that there is involvement of gabaergic pathways, glutamatergic and opioidergic processing orofacial neuropathic pain (trigeminal neuralgia) suggesting that there is functionality of the tested receptors. However, these GABAergic agonists did not induce analgesia in control animals and sham surgery suggesting a change in release or GABA synthesis in animals with NT. in this study, were not realized expression analysis and quantification of receptors, only evaluated the nociceptive response and the central and peripheral levels of BDNF. According to these findings, gabaergic pathways had a faster response than glutamatergic pathways. Some studies have shown that glutamate receptors are located in non-myelinated fibers in the periphery that can justify the delay in the animals that received glutamatergic antagonist in our study. As for BDNF levels we observed that there is an increase of this neurotrophin in animals subjected to NT model suggesting an involvement of this neuromodulator in neuroplastic events NT.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Excessive formation of reactive oxygen species (ROS) and disruption of glutamate uptake have been hypothesized as key mechanisms contributing to quinolinic acid (QA)- induced toxicity. Thus, here we investigate if the use of diphenyl diselenide (PhSe)2, guanosine (GUO) and MK-801, alone or in combination, could protect rat brain slices from QA-induced toxicity. QA (1 mM) increased ROS formation, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and decreased cell viability after 2 h of exposure. (PhSe)2 (1 μM) protected against this ROS formation in the cortex and the striatum and also prevented decreases in cell viability induced by QA. (PhSe)2 (5 μM) prevented ROS formation in the hippocampus. GUO (10 and 100 μM) blocked the increase in ROS formation caused by QA and MK-801 (20 and 100 μM) abolished the pro-oxidant effect of QA. When the non effective concentrations were used in combination produced a decrease in ROS formation, mainly (PhSe)2 + GUO and (PhSe)2 + GUO + MK-801. These results demonstrate that this combination could be effective to avoid toxic effects caused by high concentrations of QA. Furthermore, the data obtained in the ROS formation and cellular viability assays suggest different pathways in amelioration of QA toxicity present in the neurodegenerative process. / A formação excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) e alterações na captação de glutamato têm sido associadas como mecanismos chave que contribuem para toxicidade induzida pelo ácido quinolínico (AQ). Assim, nós investigamos se a utilização do disseleneto de difenila (PhSe)2, guanosina (GUO) e MK-801, isoladamente ou em combinação, podem proteger as fatias de regiões cerebrais de ratos da toxicidade induzida por AQ. AQ (1 mM) aumentou a formação de ROS, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e diminuiu a viabilidade celular após 2h de exposição. (PhSe)2 (1 μM) protegeu contra esta formação de ROS no córtex e no estriado e além disso preveniu a diminuição da viabilidade celular induzida pelo AQ. (PhSe)2 (5 μM) preveniu a formação de ROS no hipocampo. GUO (10 e 100 μM) bloqueou o aumento na formação de ROS causada pelo AQ e MK-801 (20 e 100 μM) aboliu o efeito pró-oxidante do AQ. Quando as concentrações não-efetivas foram usadas em combinação produziram uma diminuição na formação de ROS, principalmente (PhSe)2 + GUO e (PhSe)2 + GUO + MK-801. Estes resultados demonstram que esta combinação pode ser eficaz para evitar os efeitos tóxicos provocados por concentrações elevadas do AQ. Além disso, os dados obtidos nos ensaios de formação de ROS e viabilidade celular sugerem diferentes vias de atuação na melhora da toxicidade induzida pelo AQ presente no processo neurodegenerativo.