Le cytomégalovirus humain (CMVH) est un pathogène opportuniste majeur en cas d’immunodépression et représente la principale cause d’infection congénitale d’origine virale. Bien qu’efficaces, l’utilisation des molécules conventionnelles est limitée par l’émergence de résistance et leur toxicité. Il devient alors nécessaire de développer de nouveaux traitements.L’étude des nouvelles mutations émergeant sous traitement antiviral demeure donc essentielle. L’introduction de ces nouvelles mutations, par mutagénèse « en passant », dans un chromosome bactérien artificiel contenant le génome viral nous permet, après transfection en cellules humaines, de tester la sensibilité de la souche recombinantes aux antiviraux.Différentes mutations de résistances ont ainsi été caractérisées. Afin de mettre en évidence de nouvelles cibles antivirales, des analyses bio-informatiques et la production de virus recombinants ont permis d’identifier de potentiels motifs fonctionnels essentiels à la réplication au sein du complexe terminase et hélicase-primase. Ainsi, nous avons montré quela sous-unité pUL56 du complexe terminase appartient à la famille des LAGLIDADG Homing Endonuclease. En effet, pUL56 contient un motif LATLNDIERFL et un motif de liaison à l’ADN. La technologie Alpha utilisant des protéines purifiées a permis de valider le caractère essentiel du fragment WMVVKYMGFF de pUL56 pour l’interaction avec pUL89. Enfin, nous avons mis en évidence les résidus impliqués dans la fixation de l’ATP au sein de l’hélicase et dans la stabilisation du zinc de la primase. Ainsi, la compréhension de la structure de ces protéines pourrait permettent de mieux appréhender leur fonctionnement au sein du processus de réplication du CMVH et le développement de nouvelles thérapies ciblant ces domaines. / Human cytomegalovirus (HCMV) is an important opportunistic pathogen for immunecompromised patients and is the leading cause of congenital viral infection. Although they are effective, using of conventional molecules is limited by the emergence of resistance and their toxicity. Then it becomes necessary to develop new treatments. Study of new mutationsemerging under antiviral treatment is therefore essential. Introduction of these new mutations, by « en passant » mutagenesis, into an artificial bacterial chromosome containing the viral genome allows us, after transfection into human cells, testing antivirals sensitivity of the recombinant. Different mutations of resistances have been characterized. In order tohighlight new antiviral targets, bioinformatics and recombinant viruses production allowed to identify potential functional patterns essential for viral replication within terminase and helicase-primase complex. Thus, we have shown that pUL56 subunit of the terminase complex belongs to the LAGLIDADG Homing Endonuclease family. Indeed, pUL56 contains aLATLNDIERFL motif and a DNA binding motif. Alpha technology using purified proteins allowed to validate the essential character of the WMVVKYMGFF fragment of pUL56 for the interaction with pUL89. Finally, we highlighted the residues involved in ATP binding within the helicase and in the stabilization of zinc within the primase. Thus, understanding of these proteins structure could allow us to better understand their role within the viral replication process and the development of new therapies targeting these domains.

Le virus Epstein-Barr (EBV) est un gamma herpèsvirus humain infectant plus de 95 % de la population mondiale. Lorsque la primo-infection a lieu pendant l'adolescence ou à l'âge adulte, elle peut induire la mononucléose infectieuse (MNI), cette maladie est le plus souvent bénigne. EBV est aussi associé à un certain nombre de cancers de type lymphome (lymphomes de Burkitt et d'Hodgkin) et de type carcinome (carcinomes gastriques et indifférenciés du rhinopharynx). L'importance des protéines de latence du virus dans l'apparition des tumeurs a été très étudiée. Des études récentes montrent que les protéines lytiques d'EBV sont aussi très importantes pour l'apparition et le développement des tumeurs. Le complexe Hélicase-Primase (H-P) du virus herpès simplex 1 (HSV-1, alpha herpèsvirus) est la cible de nouveaux antiviraux. Les activités ATPase, hélicase et primase du complexe d'HSV-1 ont été largement étudiées, mais aucune information structurale du complexe H-P n'est disponible actuellement pour un membre des herpèsvirus humains. Nous avons entrepris l'étude du complexe H-P d'EBV (BBLF4 : hélicase, BSLF1 : primase et BBLF2/3 : sous-unité accessoire) afin de caractériser sa structure et les activités qu'il porte. Nous avons pu établir les conditions d'expression et de purification du complexe et débuter des études structurales et enzymatiques préliminaires. Nous avons pu observer une activité ATPase basale du complexe indépendante de la présence d'un substrat ADN simple brin. Nous observons deux formes solubles du complexe lors des purifications, une présentant probablement une stœchiométrie proche de 1/1/1 et une seconde forme ayant surement un excès de la protéine Hélicase (BBLF4). Ces premiers résultats apportent des informations nouvelles pour le complexe H-P d'EBV et doivent être poursuivis afin de les confirmer et de pouvoir les comparer avec ceux déjà connus pour le complexe H-P d'HSV-1. / Epstein-Barr Virus (EBV) is a human herpesvirus largely present worldwide. When primary infection occurs during adolescence or adulthood, it could cause infectious mononucleosis (IM). This disease is most of the time minor. EBV is also associated with several cancers like lymphomas (Burkitt's lymphoma and Hodgkin's lymphoma) or carcinomas (gastric carcinoma and nasopharyngeal carcinoma). Latent proteins of the virus are largely studied and are important for apparition of tumors. Recent studies show that lytic proteins are also important for tumor apparition and progression. The Helicase-Primase complex (H-P) of herpes simplex 1 (HSV-1), a well-known herpèsvirus, is a target for new antiviral drugs. ATPase, helicase and primase activities of HSV-1 complex are well studied, but no information is available for the structure of the H-P complex of human herpesvirus. We studied the H-P complex of EBV (BBLF4: helicase, BSLF1: primase and BBLF2/3: accessory subunit) to characterize its structure and enzymatic activities. We describe the expression and purification conditions and begin preliminary studies on structure and activities of the H-P complex. We show a basal ATPase activity that is DNA single strand independent. We were able to purify two forms of the H-P complex, the first has a stoichiometry close to 1/1/1 and the second one has an excess of helicase protein (BBLF4). These preliminary results on H-P complex of EBV have to be validated with other experiments before being compared to information already known for the HSV-1 complex. Key words : EBV, Helicase-Primase complex, BBLF4, BSLF1, BBLF2/3, ATPase, stoichiometry.

Les hélicases sont des enzymes ubiquitaires catalysant la séparation de l’ADN double-brin et impliquées dans la réplication, la réparation de l’ADN et dans le maintien des télomères. Chez l’Homme, 3 hélicases présentent des mutations responsables de syndromes cliniques : WRN pour le syndrome de Werner, BLM pour le syndrome de Bloom et RECQL4 pour le syndrome de Rothmund-Thomson. Tous ces syndromes associent un vieillissement pathologique accéléré à un risque accru de développement de cancer notamment par une augmentation de l’instabilité génomique. Les connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces maladies du vieillissement sont encore très partielles, notamment en ce qui concerne le lien entre l’instabilité génomique et le vieillissement. Au cours de ce projet, l'utilisation de prélèvements sanguins et cutanés de patients atteints de ces pathologies rares a permis de générer des modèles de cellules souches pluripotentes induites (iPS). Ces cellules présentent l’avantage de s’auto-renouveler et de pouvoir théoriquement se différencier dans tous les types cellulaires d’un organisme. Parallèlement, un témoin de sénescence a été généré de la même manière avec des cellules d’un patient souffrant du syndrome de la progéria de Hutchinson-Gilford. Après caractérisation de ces cellules, nous avons identifié des ensembles de phénotypes cellulaires et moléculaires dans le but de récapituler in vitro les pathologies. Nous avons également engagé les cellules iPS dans des voies de différenciation proches des tissus atteints dans les pathologies in vivo. Enfin, nous avons étudié la stabilité génomique de ces lignées dans les différents types cellulaires cultivés. Ainsi nous avons observé que la lignée Bloom est le siège de recombinaisons particulièrement fréquentes et est caractérisée par une instabilité du génome dans tous les types cellulaires étudiés. Egalement, la lignée Werner semblerait se distinguer par une instabilité de ses télomères. Enfin, l’ensemble des lignées des pathologies du vieillissement prématuré présenterait un défaut mitochondrial. / Helicases process the double-stranded DNA dissociation. They are involved in replication, DNA repair and maintenance of telomeres. In human, 3 helicases display mutations responsible for clinical syndromes: WRN for the Werner syndrome, BLM for the Bloom syndrome and RECQL4 for the Rothmund-Thomson syndrome. All these diseases cause premature ageing and high risk of cancer. Molecular and cellular mechanisms involved in these diseases are not well defined. Particularly, little is known concerning the link between genomic instability and ageing. During this project, we used blood samples and skin biopsies of affected patients to generate models by reprogramming cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs). These cells have the advantage of self-renewing and theoretically could be differentiated in all cell types. At the same time, an iPSC senescence control was performed from cells of a Hutchinson-Gilford Progeria syndrome patient. iPSCs were characterized for pluripotency. In the aim of recapitulate these pathologies in vitro, we identified sets of cellular and molecular phenotypes. We also engaged differentiation of iPSCs in cell pathways closed to the affected tissues in vivo. Finally, we studied the genomic stability of iPSCs and derived cells. We observed that Bloom cells are susceptible to frequent recombinations and are characterized by a genome instability through all studied cell types. Werner cells showed an instability of telomeres length. Finally, all premature ageing diseases displayed mitochondrial defects.

Purpose: Current DNA detection techniques require complicated procedures, specialized training, expensive equipment, invasive samples and significant amount of sample collection and processing time. The purpose of this research was to develop a rapid, accurate, non-invasive and electronic method of DNA sensing that harnesses natural unwinding properties of DNA helicase by attaching it to Carbon Nanotubes. Methods: a. A literature review on methods of attaching proteins to carbon nanotubes was conducted b. A design of the biosensor was developed based on previously reported attachment methods for other proteins c. A part of the sensor was developed by attaching DNA helicase to carbon nanotubes d. The result was tested for preservation of helicase functionality and carbon nanotube electronic structure integrity Results: a. Helicase was successfully attached to carbon nanotubes b. Helicase was found to retain its NTP hydrolysis function, DNA binding and DNA unwinding ability upon attachment c. Carbon nanotube electronic structure and function was not compromised upon attachment Conclusions: Non-specific attachment of helicase to carbon nanotubes preserves enzyme structure and function, allowing rapid DNA unwinding at an in vitro rate comparable to DNA helicase.

<div>G-quadruplexes (G4s) are non-canonical secondary structures formed in single-stranded guanine-rich nucleic acid sequences, such as those found in oncogene promoters and telomeres. <i>MYC</i>, one of the most critical oncogenes, has a DNA G4 (MycG4) in its proximal promoter region that functions as a transcriptional silencer. MycG4 is very stable and the pathological activation of <i>MYC</i> requires its active unfolding. However, it remains unclear what drives MycG4 unfolding in cancer cells. We have studied the interactions of DDX5 with the MycG4 at both molecular and cellular levels and discovered that DDX5 actively unfolds the MycG4 and is involved in the <i>MYC</i> gene transcriptional regulation, which is described in the first part of this dissertation. DDX5 is extremely proficient at unfolding the MycG4 and ATP hydrolysis is not directly coupled to the G4-unfolding of DDX5. In cancer cells, DDX5 is enriched at the <i>MYC</i> promoter and activates <i>MYC</i> transcription. G4-interactive small molecules inhibit the DDX5 interaction with the <i>MYC</i> promoter and DDX5-mediated <i>MYC</i> activation. The second part of this dissertation describes the study of interactions of indenoisoquinoline anticancer drugs with MycG4. The MycG4 transcriptional silencer is a very attractive therapeutic target. Compounds that bind and stabilize the MycG4 have been shown to repress <i>MYC</i> gene transcription and are antitumorigenic. Indenoisoquinolines are human topoisomerase I inhibitors in clinical testing. However, some indenoisoquinolines with potent anticancer activity do not exhibit strong topoisomerase I inhibition, suggesting a separate mechanism of action. Our studies show that indenoisoquinolines strongly bind and stabilize MycG4 and lower <i>MYC</i> levels in cancer cells. Moreover, the analysis of indenoisoquinoline analogues for their <i>MYC</i> inhibitory activity, topoisomerase I inhibitory activity, and anticancer activity reveals a synergistic effect of <i>MYC</i> inhibition and topoisomerase I inhibition on anticancer activity. Besides the MycG4, human telomeric G4s are also attractive targets for anticancer drugs due to their ability to inhibit telomere extension in cancer cells. The last part of this dissertation reviews two recent solution structural studies on small molecule complexes with the hybrid-2 telomeric G4 and the hybrid-1 telomeric G4. Structural information of those complexes can advance the design of telomeric G4-interactive small molecules in the cancer therapeutic areas.</div>

E. faecalis est une bactérie à gram positif, responsable d’infections nosocomiales. Dans cette étude, nous avons identifié par RNA-seq 65 ARN régulateurs potentiels induits en conditions de stress et/ou d’infection chez ce pathogène opportuniste. Parmi ceux-ci, trois ARN surexprimés in vivo, en présence de sels biliaires et à pH acide ont fait l’objet d’une étude approfondie.Le premier, SRC65, s’est avéré être un petit ARN (sARN) agissant probablement en trans. Il présenterait des fonctions redondantes avec son homologue SRC90. Différentes cibles potentielles ont été identifiées et des expériences de physiologie ont révélé un rôle de SRC65 dans le déclenchement de la phase exponentielle de croissance.Le 2ème ARN étudié est une région 5’ régulatrice non traduite (5’UTR), appelée 5’1515. Elle formerait un atténuateur et agirait de manière répressive sur le gène ef1515. EF1515 est un antiterminateur de la famille BglG/SacY capable de se fixer sur 5’1515 pour réguler son expression et celle du gène ef1516 localisé en aval et codant un système de transport des sucres de type PTS. L’antiterminateur EF1515 contrôle aussi l’expression du gène ef3023 codant une protéine impliquée dans la virulence d’E. faecalis.Le dernier ARN régulateur étudié est également une 5’UTR. Celle-ci participerait à la régulation d’une hélicase à motif DEAD (CshA) codée en aval de la 5’UTR. Sa caractérisation s’inscrit dans une étude plus large concernant les éléments du métabolisme des ARN, impliquant les ribonucléases et les autres hélicases à motif DEAD d’E. faecalis. CshA aurait un rôle prépondérant pour la bactérie, en étant impliquée dans la réponse au stress, le fitness et la virulence. L’identification de l’interactome de CshA a notamment permis d’identifier l’énolase comme partenaire privilégié. / E. faecalis is a gram-positive bacterium responsible for nosocomial infections. Using RNA-seq, we identified 65 putative regulatory RNA induced under stress and/or during infection. Of these, three RNA overexpressed in vivo, in the presence of bile salts and at acidic pH have were more deeply studied.The first, SRC65, was found to be a small RNA (sRNA) probably acting in trans. It would present redundant functions with its homologous sRNA SRC90. Different potential targets were identified and physiology experiments revealed a role for SRC65 in triggering the exponential growth phase.The 2nd studied RNA is a 5’ untranslated region (5'UTR), called 5'1515 which would form an attenuator and act repressively on the ef1515 gene. EF1515 is an antiterminator of the BglG/SacY family capable of binding at 5'1515 to regulate its expression and that of the downstream gene ef1516 encoding a PTS-type sugar transporter. The EF1515 antiterminator also controls the expression of the ef3023 gene encoding a protein involved in E. faecalis virulence.The last regulatory RNA studied is also a 5'UTR. It would participate in the regulation of a DEAD-box helicase (CshA) encoded downstream of the 5'UTR. Its characterization is part of a broader study of the elements of RNA metabolism, involving ribonucleases and other DEAD-box helicases of E. faecalis. CshA would have a prominent role for the bacteria, being involved in stress response, fitness and virulence. The identification of the CshA interactome made it possible to identify enolase as a preferred partner.

Les ribonucléases et les hélicases à ARN sont des acteurs clé du métabolisme des ARN et jouent donc des rôles cruciaux pour la régulation de l'expression des gènes. Peu de données sont connues concernant ce métabolisme chez les Archées, le troisième domaine du vivant. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse s'intéresse au métabolisme de l'ARN chez les archées et plus particulièrement aux ribonucléases ß-CASP. Dans ce contexte, nous focalisons nos études sur la compréhension physiologique que pourrait jouer les ribonucléases ß-CASP aCPSF1 et aRNase J, orthologue respectivement du facteur de terminaison de la transcription eucaryotes CPSF-73 et RNase J bactérienne. Par analogie avec CPSF-73 et RNase J, qui font partie de complexes multi-protéiques, des indices sur les fonctions des homologues archéens de ces ribonucléases pourraient provenir de l'identification des complexes autour de aCPSF1 et aRNase J. Utilisant des extraits de Pyrococcus abyssi et les protéines recombinantes aCPSF1 et aRNase J comme appâts, nous avons identifié que aRNase J fait partie d'un réseau d'interaction incluant une hélicase de la famille des Ski2-like (ASH-Ski2). En parallèle, des fractionnements d'extrait de P. abyssi sur gradient de saccharose par ultracentrifugation indiquent que aRNase J et ASH-Ski2 sont présentes toutes deux dans les fractions de haut poids moléculaires avec les sous-unités du ribosome et ceux de l'exosome. Nous avons aussi démontré une interaction stable entre aRNase J et ASH-Ski2 ainsi que des motifs impliquées dans cette interaction par des expériences de co- purification par chromatographie d'affinité. De plus, les caractérisations biochimiques de ASH-Ski2 indiquent que cette protéine possède une activité d'hydrolyse de l'ATP dépendant de la présence d'acides nucléiques. ASH-Ski2 possède de plus la capacité d'hybridation et de déroulement de deux brins d'acides nucléiques en présence d'ATP. A notre connaissance, nos résultats sont les premiers à indiquer un complexe contenant une ribonucléase et d'une hélicase à ARN Ski2-like chez les archées. De manière intriguent, aRNase J est orthologue de la RNase J bactérienne et ASH-Ski2 des hélicases Ski2-like des eucaryotes. Cela démontre que les Archées pourraient posséder un système composite impliqué dans le métabolisme des ARN partageant des caractéristiques bactériens et eucaryotes. Ces résultats mettent en lumière l'avantage de l'étude des Archées pour la compréhension des mécanismes moléculaires et évolutives des processus fondamentaux des trois domaines du vivant. / Ribonucleases and RNA helicases are the main actors of RNA processing and have a critical role in gene expression regulation. Little is known about this process in Archaea. Our group focuses in RNA metabolism in Archaea involving ß-CASP ribonucleases. Recently, we published phylogenomic and experimental work demonstrating that archaeal ß-CASP proteins, aCFSF1 and aRNase J, are highly conserved ribonucleases in Archaea. Archaeal aCPSF1, an ortholog of the eukaryal transcription termination factor CPSF73, is ubiquitous in Archaea suggesting an essential conserved function. Archaeal aRNase J, an ortholog of the bacterial ribonuclease RNase J, is conserved through a major phylum of the Archaea, the Euryarchaeota. These findings suggest that the role of these enzymes in RNA processing can be reminiscent of ancient functions that had arisen early in evolution. We now want to focus on understanding the physiological role of aCPSF1 and aRNase J with the hyperthermophilic euryarchaeal Pyrococcus abyssi as model. By analogy to eukaryal CPSF73 and bacterial RNase J, which are part of multiprotein complexes, clues to the function of the archaeal ß-CASP homologs might come from the identification of archaeal multiprotein complex(es) containing aCPSF1 and aRNase J orthologs. Using P. abyssi cell extracts and recombinant aCPSF1 or aRNase J as bait, we have found that aRNase J is a part of protein interaction networks that include Ski2-like RNA helicase (ASH-Ski2). In parallel, fractionation of P. abyssi whole cell extracts in sucrose gradient by ultracentrifugation shows that aRNase J and ASH-Ski2 are present in high sedimentation fractions with ribosomal and exosome sub-units. We also demonstrate a direct interaction of aRNase J with ASH-Ski2 by co-purification affinity chromatography experiments and identify motifs that potentially involve in this interaction. Biochemical characterization of ASH-Ski2 demonstrates a nucleic dependant ATPase activity. ASH-Ski2 also possesses annealing and unwinding activities in presence of ATP. To our knowledge, our results are the first experimental indications of interacting of a complex containing ribonuclease and RNA helicase-like proteins in Archaea. Remarkably, aRNase J is an orthologue of the bacterial RNase J and ASH-Ski2 is an orthologue of the eukaryotic Ski2-like family proteins. This shows that Archaea might possess a composite RNA processing system sharing both eukaryal and bacterial features. This highlights the advantage of an archaeal model to gain further mechanistic and evolutionary information of fundamental processes across the three domains of life.

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Les hélicases sont des protéines qui utilisent l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP ou du GTP pour catalyser la disjonction des doubles hélices d'ADN ou d'ARN. Cette activité de déroulement de double brin leur confère un rôle essentiel dans le métabolisme des acides nucléiques, le maintien de la stabilité du génome et les processus de signalisation cellulaire. En conséquence, ils sont impliqués dans des processus aussi divers que le vieillissement, l'apparition de cancers, l'immunité innée. Cette thèse est axée sur la compréhension de la fonction et des mécanismes moléculaires de deux hélicases différentes et le manuscrit est donc divisé en deux parties. Le premier est dédié à l'hélicase RIG-I, une hélicase à ARN, exprimée lorsque les cellules leucémiques cessent de proliférer et sont induites à se différencier en granulocytes, indispensables à la reconnaissance de l'ARN double brin des virus, initiant la protection des cellules contre la réplication des génomes viraux. Le mécanisme d'action de RIG-I est bien décrit dans le contexte d'une infection virale. Mais dans le cas de la différenciation des cellules myéloïdes, l'intervention de RIG-I et son rôle dans la balance la prolifération / différenciation restent incomplets. En effet, les interactions RIG-I en particulier avec les ligands cellulaires ne sont pas totalement comprises. La première partie de mon travail consistait à tenter d'isoler et de caractériser les partenaires de RIG-I lors de la différenciation des cellules leucémiques NB4. La seconde est consacrée à l'étude des mécanismes sous-jacents aux G-quadruplexes résolus par les hélicases. Plusieurs questions subsistent quant aux interactions entre la structure particulière des G-quadruplexes et ces enzymes. Une hélicase de Bacteroides sp 3_1_23, BsPif1, a été choisie pour comparer et caractériser l'interaction entre les G-quadruplexes et l'ADN canonique de Watson-Crick. Dans les deux parties du travail, les interactions ont été étudiées par des techniques biochimiques utilisant soit une lignée cellulaire ou une protéine purifiée et des acides nucléiques synthétiques. / Helicases are proteins that utilize the energy provided by the hydrolysis of ATP or GTP to catalyse the disjunction of double DNA or RNA helices. This double strand unwinding activity gives them an essential role in the metabolism of nucleic acids, the maintenance of the genome stability and cell signalling processes. As a result, they are involved in processes as diverse as aging, the appearance of cancers, innate immunity. This thesis is focused on the understanding of the function and the molecular mechanisms of two different helicases and the manuscript is therefore divided in two parts. The first one is dedicated to the RIG-I helicase, an RNA helicase, expressed when leukemic cells stop proliferate and are induced to differentiate in granulocytes, which are essential in the recognition of double-stranded RNA of viruses, initiating the protection of the cells against the replication of the viral genomes. The mechanism of action of RIG-I is well described in the context of viral infection. But in the case of the differentiation of myeloid cells, the intervention of RIG-I and its influence on the equilibrium proliferation / differentiation remains incomplete. Indeed, RIG-I interactions in particular with cellular ligands are not fully understood. The first part of my work consisted in an attempt to isolate and characterize RIG-I partners during differentiation of NB4 leukemic cells. The second one is devoted to the study of mechanisms underlying G-quadruplexes resolving by helicases. Several questions remain about the interactions between the particular structure of G-quadruplexes and these enzymes. A Bacteroides sp 3_1_23 helicase, BsPif1, was chosen to compare and characterize the interaction between G-quadruplexes and canonical Watson-Crick DNA. In the two parts of the work, the interactions were investigated by biochemical techniques using either a cell line or purified protein and synthetic nucleic acids.

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