Orientador: André Rodrigues / Coorientador: Priscila Cintra Socolowski / Banca: Mauricio Bacci Junior / Banca: Dartanhã José Soares / Resumo: Em interações parasita-hospedeiro é esperado que o parasita obtenha a maior parte de sua nutrição a partir do hospedeiro. Colônias de formigas atíneas podem ser utilizadas como modelo para estudar diferentes mecanismos envolvidos em interações de parasitismo. Esses insetos cultivam um fungo basidiomiceto, o qual é alvo de micoparasitas do gênero Escovopsis. É sabido que o jardim de fungo, local onde as formigas praticam a fungicultura, apresenta uma alta concentração de fontes de carbono simples, de fácil assimilação. No presente estudo investigamos se o parasita se beneficia desses recursos nutricionais e se esses influenciam na infectividade frente ao hospedeiro. Para tanto, realizamos ensaios para avaliar o desenvolvimento de seis isolados de Escovopsis em diferentes fontes de carbono tanto na ausência, quanto na presença do fungo cultivado pelas formigas. Além disso, observamos a interação Escovopsis - fungo cultivado com microscopia de epifluorescência, a fim de verificar em que momento é iniciada a degradação do micélio do hospedeiro. No geral, o parasita apresentou esporulação abaixo de 59 % quando somente uma fonte simples de carbono estava disponível. Quando interagindo com seus hospedeiros em meio com apenas uma ou duas fontes de carbono, três dentre seis isolados do parasita foram menos infectivos do que o esperado. Observamos que a adição de uma fonte nutricional não aumenta a infectividade do parasita, mas influencia seu crescimento, mesmo na presença do hospedei... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In parasite-host interactions it is expected from the former to rely mostly on nutrients derived from the host. Attine ant colonies may be considered as a model system for studying different mechanisms of parasitism. These insects cultivate a basidiomycetous fungus, which is threatened by mycoparasites in the genus Escovopsis. It is known that the fungus garden, the substrate where the ants cultivate the fungal cultivar, has a high concentration of simple carbon sources. Here we investigated whether the parasite benefits from these nutritional resources and whether these nutrients influence host infectivity. We performed bioassays to evaluate the development of six Escovopsis isolates in different carbon sources in the absence as well as in the presence of the ant fungal cultivar. In addition, we observed the interaction Escovopsis - fungal cultivar with epifluorescence microscopy, to assess when the degradation of the host mycelium begins. Overall, the parasite showed sporulation below 59 % when only one carbon source was available. When interacting with their hosts in culture medium with one or two carbon sources, three out of six Escovopsis isolates were less infective than expected, probably due to nutritional stress. We observed that the parasite's infectivity did not increase with the addition of one nutritional source, however, influenced its growth, even in the presence of the host (the expected primary source of nutrition). Our results suggest that in addition to the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ana Carolina de Souza Chagas / Coorientador: Cintia Hiromi Okino / Banca: Maria Cristina de Sena Oliveira / Banca: Alessandro Francisco Talamini do Amarante / Resumo: Tendo em vista o impacto da infecção por Haemonchus contortus na ovinocultura, é crescente o número de estudos acerca da resistência a esse parasita, sendo essencial a compreensão dos mecanismos imunes diretamente relacionados. A resposta a infecções por helmintos é predominantemente de perfil Th2, embora o conjunto de mecanismos imunes que conferem resistência aos ovinos não sejam completamente elucidado. O presente estudo objetivou avaliar as respostas imunes locais (abomaso) associados à resistência à infecção por H. contortus em cordeiros Morada Nova, raça considerada resistente. Um rebanho composto por 287 ovinos foi fenotipado, por meio de contagens de ovos nas fezes, volume globular e peso corporal, após dois desafios parasitários com 4000 L3. Os 20 extremos de infecção (10 mais resistentes e 10 mais susceptíveis) foram submetidos a um terceiro desafio e abatidos sete dias após. Foram quantificados, por RT-qPCR, os níveis de expressão de 22 genes associados às respostas imunes, em abomaso e linfonodos abomasais. Além disso, eosinófilos e mastócitos foram quantificados, e os níveis de IgG e IgA no muco abomasal mensurados. Genes relacionados à resposta inata (TLR2 e CFI) foram superiormente expressos na região pilórica dos animais resistentes. Esses animais também apresentaram, na região fúndica, IL33 (promotor da polarização Th2) e MS4A2 (receptor de IgE) em níveis superiores aos verificados nos susceptíveis. Marcadores pró-infl... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Considering the impact of Haemonchus contortus infection on sheep breeding, there is an increasing number of studies addressing host resistance against to this parasite, and the understanding of directly related immune mechanisms is essential. The response to helminth infections is predominantly Th2- polarized, although the immune mechanisms that confer resistance to sheep are not fully elucidated. The present study aimed to evaluate the local immune responses (abomasum) associated with resistance to H. contortus infection in Morada Nova lambs, a breed considered resistant. A 287 sheep flock was phenotyped, by means of fecal egg counts, packed cell volume and body weight, after two parasitic challenges with 4000 L3. The 20 extremes of infection (10 most resistant and 10 most susceptible) were submitted to a third challenge and slaughtered seven days later. 22 immune-related genes were quantified (RT-qPCR) in abomasum and abomasal lymph nodes. In addition, abomasal eosinophils and mast cells were quantified, and IgG and IgA levels were measured (ELISA) in abomasal mucus. Genes related to innate response (TLR2 and CFI) were superiorly expressed in the pyloric region of the resistant animals. IL33 (Th2 polarization promoter) and MS4A2 (IgE receptor) were also at higher levels in this group. Proinflammatory cytokines (TNFα and IL1β) were superiorly expressed in the fundic region of the susceptible group, which also had IL4 (Th2 response) superiorly expressed in their abomasal lym... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-20Bitstream added on 2014-06-13T19:46:42Z : No. of bitstreams: 1 cruz_ld_dr_rcla.pdf: 1201063 bytes, checksum: cc322ba66d3b7aeaa96f2e1ae46979e9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Ácaros mesostigmatídeos e seus roedores hospedeiros compreendem um dos mais ricos e diversos sistemas parasito-hospedeiro da região Neotropical. A maior parte do conhecimento disponível sobre este sistema refere-se a listas de ocorrências, descrições de espécies parasitas e relações de especificidade hospedeira em escalas locais. Estudos ecológicos com o objetivo de procurar padrões de estruturas de comunidades de espécies parasitas, bem como investigar os possíveis processos subjacentes à organização destas comunidades são escassos. Dessa forma, o presente estudo tenta contribuir para o conhecimento ecológico deste sistema parasito-hospedeiro. No Capítulo 1, investigou-se a existência de padrões organizacionais nas infracomunidades de mesostigmatídeos em duas populações do hospedeiro roedor Oligoryzomys nigripes, bem como possíveis fatores subjacentes aos padrões observados. Demonstrou-se que as infracomunidades de mesostigmatídeos podem apresentar variações na sua organização, indo desde infracomunidades completamente aleatórias, a infracomunidades estruturadas. Fatores relacionados à história de vida dos hospedeiros podem ser responsáveis pela estruturação das infracomunidades de mesostigmatídeos; todavia, a proposição de padrões gerais não foi possível, principalmente devido a grande diversidade de espécies parasitas e hospedeiras envolvidas na região Neotropical. No Capítulo 2, investigou-se a existência de padrões de similaridades entre as comunidades de mesostigmatídeos em duas escalas observacionais: comunidade componente e comunidade composta. Os resultados obtidos demonstraram que as similaridades entre as comunidades componentes e entre as comunidades compostas geralmente são baixas, não sendo influenciadas pela distância geográfica e pela dissimilaridade ambiental entre as localidades... / Mites and their rodent hosts mesostigmatídeos comprise one of the richest and most diverse host-parasite systems of the Neotropical region. Most of the knowledge available about this system refers to occurrence lists, parasite species descriptions and host specificity relationships at local scales. Ecological studies with the aim looking for structure patterns of parasite communities, as well as investigate the possible processes underlying the organization of these communities are scarce. Thus, this study attempts to contribute to the ecological knowledge of this host-parasite system. In Chapter 1, we investigated the existence of organizational patterns in infracommunities of Mesostigmata mites of the two populations of the rodent host Oligoryzomys nigripes as well as possible factors underlying the observed patterns. It was demonstrated that the infracommunities of Mesostigmata mites may vary in their organization, ranging from completely random infracommunities to structured infracommunities. Factors related to the hosts life histories may be responsible for structuring Mesostigmata mites infracommunities. However, the proposition of general patterns was not possible, mainly due to the great diversity of parasites and host species involved in Neotropical region. In Chapter 2, we investigated the existence of similarity patterns among Mesostigmata mites communities in two levels: component community and compound community. The results showed that the similarities among the component communities and among the compound communities generally are low, not being influenced by geographical distance and environmental dissimilarity among the localities. However, the similarities of Mesostigmata mites among the compound communities were positively related to the host faunas similarities among the localities... (Complete abstract click electronic access below)

O transplante de células tronco hematopoiéticas (TCTH) é uma terapia bem estabelecida para o tratamento de diversas doenças hematológicas benignas e malignas, sendo amplamente realizado em vários países, inclusive no Brasil. Com a sobrevivência dos pacientes transplantados por tempo longo, verifica-se o desenvolvimento de complicações tardias, geralmente causadas pelo uso prévio de quimioterapia, radioterapia, imunossupressores ou, ainda, por distúrbios imunológicos específicos desta população. Alguns estudos prévios demonstraram um aumento no risco de desenvolvimento de osteopenia e osteoporose após o TCTH, acarretando maior risco de fraturas nos indivíduos que receberam TCTH, quando comparado com a população em geral. A perda óssea nesta população ocorre com maior velocidade no primeiro ano, acomete especialmente a cabeça do fêmur e pode piorar progressivamente por pelo menos quatro anos após o transplante. Fatores de risco previamente identificados são uso de glicocorticóides, ciclosporina, sexo e idade. O presente estudo teve por objetivo avaliar as alterações do metabolismo ósseo e fatores associados em pacientes após TCTH alogênico no Rio Grande do Sul. Foram avaliados através de corte transversal 47 indivíduos. Os fatores estudados foram 25-hidroxi-vitamina D (25(OH)D), hormônio da paratireóide (PTH), ferritina, vitamina B12, insulina, triglicerideos, glicose, colesterol e dados clínicos. A secreção e a resistência insulínica foram estimadas pelo “Homeostatic model assessment for beta-cell function (HOMA-B) e “Homeostatic model assessment for insulin resistance” (HOMA-IR), respectivamente. A avaliação da massa óssea foi obtida através de densitometria óssea. A mediana de tempo após o transplante foi 47,7 (12 – 115) meses. Osteoporose foi encontrada em 8 pacientes (17%) dos pacientes, enquanto osteopenia foi observada em 22 pacientes (46,8%). Os níveis séricos de ferritina (p=0,002), insulina (p<0,001), glicose (p=0,003), triglicerídeos (p=0,018) e o índice HOMA-IR (p<0,001) foram maiores em indivíduos com osteopenia ou osteoporose, enquanto o índice HOMA-B (p<0,001) foi menor nos indivíduos com osteopenia/osteoporose. Os demais fatores estudados não se associaram com o desfecho. Após análise multivariada, os níveis séricos de ferritina e 25(OH)D e o índice HOMA-IR permaneceram independentemente associados com osteopenia ou osteoporose. Os resultados do estudo apresentam novos fatores, os níveis séricos de ferritina e o índice HOMA-IR, possivelmente associados com a presença de redução da massa óssea em pacientes após TCTH.

Estudos referentes à dinâmica espaço-temporal da interação hospedeiro-parasitóide são de fundamental importância para o desenvolvimento de técnicas de manejo de insetos em agroecossistemas. Uma recente abordagem têm sido o estudo de populações através da simulação computacional dos indivíduos que a compõem. Este método tem possibilitado a incorporação de importantes características como individualidade e estrutura espacial nos modelos teóricos. Neste sentido, o presente estudo visou a elaboração de um modelo baseado no comportamento individual para simular a dinâmica espaço-temporal da interação Spartocera dentiventris (Berg) (Hemiptera: Coreidae), inseto associado à cultura do fumo, e de seu inimigo natural, o parasitóide de ovos Gryon gallardoi (Brethes) (Hymenoptera: Scelionidae). Para a elaboração do modelo, estudos sobre a bioecologia de G. gallardoi foram desenvolvidos, de modo a investigar (i) o efeito da temperatura no seu desenvolvimento e viabilidade, (ii) a mortalidade de imaturos em campo, (iii) os parâmetros reprodutivos e a longevidade dos adultos, (iv) os padrões de dispersão em campo e (v) a resposta funcional e a interferência mútua dos parasitóides em diferentes densidades de ovos de S. dentiventris. No intuito de avaliar a capacidade de predição do modelo elaborado, a dinâmica espaço-temporal de ovos sadios e parasitados de S. dentiventris foi acompanhada em um cultivo de fumo, estabelecido em área experimental do Departamento de Fitossanidade da Faculdade de Agronomia da UFRGS, Porto Alegre (30o01’S e 51o13’O), RS, Brasil A viabilidade do desenvolvimento dos parasitóides na faixa de 20 a 30oC não diferiu significativamente, alcançando 98,8%. O tempo de desenvolvimento ovo-adulto de machos e fêmeas foi inversamente proporcional ao aumento da temperatura. Os valores estimados para o limite térmico inferior de desenvolvimento e para a constante térmica foram 15,5oC e 185,19GD para machos e 15,6oC e 192,31GD para fêmeas. Diversos fatores afetam o sucesso de imaturos de G. gallardoi em campo, sendo que o malogro e a predação por sugadores são os principais responsáveis pela emergência de apenas 37,87% dos adultos. Foi observado um período médio de oviposição de 10,1 ± 1,74 dias, com o pico de oviposição no segundo dia, sendo depositados ao longo dos mesmos uma média de 67,5 ± 11,29 ovos por fêmea. Fêmeas de G. gallardoi foram significativamente mais longevas que os machos, vivendo, respectivamente, 13,7 ± 1,94 e 10,6 ± 1,78 dias. A razão sexual total observada foi de 0,79. A dispersão de G. gallardoi em cultivo de fumo não foi sensivelmente influenciada pelo vento, sendo estimada uma capacidade de locomoção diária média para fêmeas de no mínimo 7,62 m. O padrão de parasitismo de G. gallardoi ajustou-se perfeitamente à resposta funcional do tipo II (pseudo-r2= 0,99), sendo obtidos os valores de 0,0557 e 0,9989 h para os componentes a’ e Tm , respectivamente O aumento da densidade de parasitóides acarretou, de maneira geral, uma diminuição no número de ovos parasitados por parasitóide. Foi obtido para o índice de interferência mútua “m” o valor 0,626. A dinâmica temporal de S. dentiventris – G. gallardoi simulada ajustou-se muito bem aos dados obtidos em campo (r2= 0,82 para ovos sadios e r2= 0,72 para ovos parasitados). Da mesma forma, os arranjos espaciais dos ovos e da taxa de parasitismo observados em campo foram satisfatoriamente reproduzidos através das simulações computacionais. Os resultados indicam que G. gallardoi apresenta um bom potencial para controlar populações de S. dentiventris, seja pela sua viabilidade de desenvolvimento em uma larga faixa de temperatura ou pela sua capacidade reprodutiva e padrões de dispersão similares àqueles observados para outras espécies já utilizadas no controle biológico de insetos. Por outro lado, a sensibilidade às baixas temperaturas, a alta mortalidade de imaturos observada em campo e uma resposta funcional do tipo II podem ser fatores que se contrapõe ao sucesso do parasitóide no controle de populações de S. dentiventris. Considerando a independência entre os dados observados e os dados obtidos através de simulações, o modelo elaborado obteve pleno sucesso em simular a dinâmica da interação S. dentiventris – G. gallardoi a partir do comportamento individual dos diferentes agentes Duas importantes características associadas à estabilidade de sistemas hospedeiro-parasitóide foram observadas no estudo de campo e reproduzidas no modelo – um padrão de parasitismo inversamente dependente da densidade dos hospedeiros e uma resposta agregativa dos parasitóides em algumas regiões do sistema. Desta forma, futuros estudos podem avaliar, a partir de um enfoque baseado no indivíduo, quais mecanismos são responsáveis por tais comportamentos e qual é o seu efeito na dinâmica do sistema. Conclui-se, através deste trabalho, que o estudo da dinâmica de populações através de uma abordagem baseada no indivíduo, com base em modelos computacionais, pode ser uma alternativa viável para superar as limitações e a complexidade inerente ao uso de modelos populacionais analíticos. Desta forma, o maior realismo implícito nestes modelos os torna ferramentas muito úteis para diversas áreas da ecologia aplicada, particularmente para a entomologia agrícola.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-13T16:56:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2092738 bytes, checksum: 991c21e0ecefbc7be1990a39f757c9bb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T16:56:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2092738 bytes, checksum: 991c21e0ecefbc7be1990a39f757c9bb (MD5) Previous issue date: 2016-11-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Translationally controlled tumor protein (TCTP) é uma proteína amplamente distribuída em eucariotos. Ela está envolvida na regulação de processos básicos como progressão do ciclo celular, crescimento celular, proteção contra estresses e apoptose. Durante a infecção de tomateiro (Solanum lycopersicum) e Nicotiana benthamiana pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus ocorre aumento dos níveis de seu mRNA. Plantas silenciadas para TCTP acumulam menos vírus do que plantas selvagens, mostrando que esta proteína é importante para a infecção por potyvírus. Neste trabalho, o envolvimento da TCTP na infecção por potyvírus foi analisado detalhadamente utilizando-se o potyvírus Turnip mosaic virus (TuMV). Em plantas de N. benthamiana silenciadas para TCTP também ocorre uma diminuição no acúmulo do TuMV quando comparado com plantas não silenciadas. Além disso, plantas superexpressando TCTP de maneira transiente acumularam mais vírus do que plantas controle, confirmando o efeito positivo desta proteína na infecção por diferentes espécies de potyvírus. Para analisar a localização subcelular de TCTP no contexto da infecção, TCTP fusionada a GFP foi co-expressa com TuMV/6K2:mCherry. TCTP co-localiza-se com as vesículas replicativas e com estrutura a globular perinuclear tipicamente observada em células infectadas. O fracionamento de proteínas celulares demonstrou que TCTP está predominantemente na fração solúvel e uma pequena porção se associa com membranas, tanto em plantas sadias quanto em plantas infectadas. A co- localização com vesículas marcadas por 6K2 e a presença de TCTP em frações membranosas da célula sugerem um possível envolvimento desta proteína na replicação viral. Para verificar esta hipótese, protoplastos obtidos a partir de plantas silenciadas para TCTP foram infectados com TuMV e com o mutante TuMV VNN , o qual não é capaz de replicar-se. Os resultados demonstraram que o acúmulo de TuMV é reduzido em protoplastos silenciados, indicando que TCTP é necessária para a replicação. O acúmulo da proteína TCTP durante a infecção também foi avaliado. A infecção viral induz o aumento dos níveis de mRNA mas não de proteína, sugerindo que o mRNA que codifica TCTP atue na replicação. Desta forma, foi analisado se expressão de um RNA não traduzível de TCTP possui efeito sobre a infecção viral. Os resultados mostraram que apenas a expressão de um RNA traduzível é capaz de aumentar a infecção viral, indicando que a proteína TCTP, ou que a tradução se seu mRNA, é importante para a replicação viral. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is widely distributed among eukaryotes. It is involved in the regulation of basic processes such as cell cycle progression, cell growth, stress protection and apoptosis. During tomato (Solanum lycopersicum) and Nicotiana benthamiana infection by the potyvirus Pepper yellow mosaic virus, an increase of TCTP mRNA levels was observed. Plants silenced for TCTP accumulate fewer viruses than control plants, showing the importance of that gene for potyvirus infection. In this work, TCTP involvement in potyvirus infection was analyzed in details using the potyvirus Turnip mosaic virus (TuMV). N. benthamiana plants silenced for TCTP accumulated fewer viruses than non-silenced plants. In addition, plants overexpressing TCTP transiently accumulated more viruses than control plants, confirming that TCTP has a positive effect on infection by different potyviruses. To study TCTP subcellular localization in potyvirus infected plants, TCTP fused to GFP was co- expressed with TuMV/6K2:mCherry. Confocal analysis has shown that TCTP co- localizes with 6K2-tagged structures such as replicative vesicles and the perinuclear globular structure that is typically observed in potyvirus-infected cells. Cellular fractioning demonstrated that TCTP is mainly present in the soluble fraction but is also associated with membranes. The co-localization of TCTP with 6K2-tagged vesicles and its presence in cellular membranous fractions suggests a possible involvement of TCTP in virus replication. To test this hypothesis, protoplasts obtained from TCTP silenced plants were infected with TuMV and its mutant TuMV VNN , which is defective for replication. The results showed that TuMV accumulation is reduced in silenced protoplasts, indicating that TCTP is necessary for replication. TCTP accumulation during infection was also analyzed. Viral infection induces TCTP mRNA expression, but not protein accumulation, suggesting that the TCTP mRNA and not the protein has a role in viral infection. To check this, we expressed a non-translatable form of TCTP RNA in plants and analyzed its effect in virus accumulation. The results showed that only the expression of a translatable RNA resulting in protein production is able to increase virus infection, indicating that the protein and/or the translation of TCTP is important for potyvirus replication.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-02T18:25:03Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 898935 bytes, checksum: 76e4100a96f4410f999b0f8c2973b39e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T18:25:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 898935 bytes, checksum: 76e4100a96f4410f999b0f8c2973b39e (MD5) Previous issue date: 2015-03-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Os vírus que infectam plantas apresentam um genoma pequeno e codificam um número reduzido de proteínas. A limitação do número de proteínas virais é superada pela modulação da expressão de genes na célula hospedeira. O mapeamento das redes de interações entre fatores do patógeno e do hospedeiro tem fornecido respostas importantes para a compreensão dos processos que favorecem a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição de duas proteínas do tomateiro, a chaperona citosólica Hsp70 e sua co-chaperona DnaJ (classe 1) no estabelecimento da infecção pelo Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Essas duas proteínas foram identificadas com a expressão induzida em células infectadas pelo PepYMV. A sequencia codificadora da Hsp70 de tomateiro (SlHsp70) foi clonada e sequenciada. A análise in silico mostrou a presença de todos os domínios típicos de uma Hsp70. Alinhamento entre a sequencia da proteína SlHsp70, e as Hsps70 de Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum mostrou uma alta conservação na sequência de aminoácidos das quatro proteínas alinhadas. A localização subcelular de SlHsp70 em células infectadas pelo PepYMV foi analisada por microscopia confocal. Células sadias e infectadas apresentaram uma localização nuclear e citoplasmática, entretanto em células infectadas foi possível observar a expressão da Hsp70 em estruturas ancoradas a membrana semelhantes a vesículas replicativas induzidas pela proteína viral 6K2. Para avaliar a ocorrência de interação entre SlHsp70 com proteínas virais, e SlDj1 com proteínas virais foi realizado um ensaio de duplo hibrido em leveduras. Não houve a detecção de nenhuma interação entre as proteínas do PepYMV e as proteínas SlHsp70 e SlDj1. Foi detectado a ocorrência de interação entre SlHsp70 e SlDj1. Com o objetivo de avaliar o efeito do silenciamento de SlDj1 na infecção viral, plantas de tomateiro foram transformadas com uma construção que induz o silenciamento de SlDj1 via Agrobacterium tumefaciens. As plantas transformadas silenciadas apresentaram um fenótipo de letalidade e esse fenômeno não permitiu a quantificação do acúmulo do PepYMV em tomateiros transformados. Os resultados deste trabalho sugerem que as proteínas SlHsp70 e SlDj1 favorecem a infecção viral de forma indireta, e que estudos mais detalhados irão formecer informações sobre o envolvimento dessas proteínas no processo de infecção pelo PepYMV. / Viruses are obligate intracellular parasites with a small genome and encode a limited number of proteins. Limitation in the number of viral proteins is overcome by modulating the expression of certain genes in the host cell. Mapping interaction networks between pathogen and host factors has provided important answers to the understanding of the processes that promote viral infection. This study objective is to evaluate the contribution of the tomato proteins chaperone Hsp70 and its co- chaperone DnaJ in infection process with Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). These two proteins were investigated due to the modification of gene expression reports of transcripts in infected cells PepYMV. Initially the coding sequence corresponding to the tomato Hsp70 (SlHsp70) was analyzed in silico, the presence of all the domains of a typical Hsp70 was confirmed. Sequence alignment between the protein SlHsp70, and Hsps70 Arabidopsis thaliana, as well as Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum revealed high conservation in the amino acid sequence alignment of the four proteins. The subcellular localization by confocal scanning microscopy was performed with SlHsp70 and demonstrated a common cytoplasmic and nuclear localization to healthy cells and cells infected by PepYMV. The infected cells showed similar expression of Hsp70 in membrane-anchored structures, similar to replicative vesicles induced by 6K2. Study of protein-protein interaction was performed by two-hybrid assay in yeasts. Due to SlHsp70 chaperone and co-chaperone SlDj1 act together, the interactions between the PepYMV proteins were tested with both the vegetable proteins. There was no detection of any interaction between PepYMV proteins and vegetable proteins, a single interaction was detected between SlHsp70 and SlDj1. Genetic transformation of tomato plants by Agrobacterium tumefaciens was carried out to induce silencing of the gene encoding the protein SlDj1. The silenced plants showed a lethality phenotype, and this phenomenon did not allow the quantification of the PepYMV accumulation in processed tomato. These results suggest that SlHsp70 and SlDj1 proteins promove the viral infection indirectly, and that investigations in the PepYMV replication process can reveal interesting facts about the involvement of these proteins in infection.

MEDEIROS, J. W. T. Monitorização terapêutica da ciclosporina oral em pacientes pós transplantados alogênico de células tronco hematopoiéticas. 2017. 54 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by ciências farmacêuticas pgcf (pgcf.ufc@gmail.com) on 2017-10-24T17:02:19Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_jwtmedeiros.pdf: 514128 bytes, checksum: e5f6763985f67f58c811a4eb79da8de5 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Carvalho (lolitaprado@ufc.br) on 2017-10-25T12:45:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_jwtmedeiros.pdf: 514128 bytes, checksum: e5f6763985f67f58c811a4eb79da8de5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-25T12:45:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_jwtmedeiros.pdf: 514128 bytes, checksum: e5f6763985f67f58c811a4eb79da8de5 (MD5) Previous issue date: 2017-09-28 / In the allogeneic hematopoietic stem cell transplantation the cells come from a non-identical donor, requiring the use of immunosuppressive therapy with the intention to prevent a graft versus host disease, using cyclosporine with this purpose. Its serum determination is used as monitoring and serves of parameter to adjust the dose and guarantee the degree of immunosuppression. A study was carried out in an outpatient clinic of patients undergoing allogenic transplantation in the use of CsA to prevent graft versus host disease, to analyze as clinical and pharmacokinetic characteristics of the population. Therapeutic monitoring was performed based on the sérum dosage of cyclosporin obtained by chemiluminescence method, also, monitoring of the biochemical dosages referring to renal and hepatic functions and the adverse events inherent to CsA. Thus, it was possible to establish a relationship between the occurrence of adverse events events with the study parameter and also with the clinical condition of the patient. Thirteen patients were accompanied, 84.6% (11/13) had CsA serum dosage outside the therapeutic range, and 76.9% (10/13) in the least the biochemical dosage for renal and hepatic. Furthermore, a relationship between serum biochemical levels and serum levels of CsA was observed, with 61.5% (8/13) of the patients studied presented concomitant biochemical and CsA pharmacokinetics. The incidence of cyclosporine related adverse events may be a reflection of changes in CsA serum levels found. It was concluded that, the appearance of GvHD may indicate the non-effectiveness of the treatment and immunosuppression may be associated with a serum level lower than the therapeutic level and, in turn, the appearance of nephrotoxicity and hepatotoxicity, among others, may be associated with therapeutic effect. / No transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas as células são provenientes de um doador não geneticamente idêntico sendo necessário o uso de terapia imunossupressora a fim de prevenir a doença do enxerto contra hospedeiro, enquadrando-se o uso da Ciclosporina. Sua determinação sérica é utilizada como parâmetro de monitorização e serve de subsídio para ajustar a dose e garantir o grau de imunossupressão. Realizou-se um estudo em um ambulatório de pacientes submetidos ao transplante alogênico em uso de CsA para prevenção da doença do enxerto contra o hospedeiro, a fim de analisar as características clínicas e farmacocinéticas desta população. Realizou-se monitorização terapêutica com base nos doseamentos séricos de CsA obtidos por quimioluminescência, bem como, monitorização das dosagens bioquímicas referentes as funções renais e hepáticas e dos eventos adversos inerentes a CsA. Assim, estabeleceu-se uma relação entre os eventos adversos com o parâmetro farmacocinético estudado, bem como, com o quadro clínico do paciente. Foram acompanhados 13 pacientes, destes, 84,6 % (11/13) apresentaram doseamento sérico de CsA fora da faixa terapêutica, e 76,9% (10/13) alterações em pelo menos uma dosagem bioquímica referente as funções renais e hepática. Além do exposto, observou-se uma relação entre as alterações nas dosagens bioquímicas e as dosagens séricas de CsA, já que, 61,5% (8/13) dos pacientes estudados apresentaram concomitantemente alterações bioquímicas e na farmacocinética da CsA. A incidência dos eventos adversos relacionados a ciclosporina podem ser um reflexo das alterações nas dosagens séricas de CsA encontradas. Por outro lado, que o aparecimento de DECH pode denotar a não efetividade do tratamento e imunossupressão podendo ser associado ao nível sérico inferior ao terapêutico e, por sua vez, o surgimento da nefrotoxicidade e hepatotoxicidade, entre outros, podem estar associados ao nível sérico acima do nível terapêutico.

O transplante de células tronco hematopoiéticas (TCTH) é uma terapia bem estabelecida para o tratamento de diversas doenças hematológicas benignas e malignas, sendo amplamente realizado em vários países, inclusive no Brasil. Com a sobrevivência dos pacientes transplantados por tempo longo, verifica-se o desenvolvimento de complicações tardias, geralmente causadas pelo uso prévio de quimioterapia, radioterapia, imunossupressores ou, ainda, por distúrbios imunológicos específicos desta população. Alguns estudos prévios demonstraram um aumento no risco de desenvolvimento de osteopenia e osteoporose após o TCTH, acarretando maior risco de fraturas nos indivíduos que receberam TCTH, quando comparado com a população em geral. A perda óssea nesta população ocorre com maior velocidade no primeiro ano, acomete especialmente a cabeça do fêmur e pode piorar progressivamente por pelo menos quatro anos após o transplante. Fatores de risco previamente identificados são uso de glicocorticóides, ciclosporina, sexo e idade. O presente estudo teve por objetivo avaliar as alterações do metabolismo ósseo e fatores associados em pacientes após TCTH alogênico no Rio Grande do Sul. Foram avaliados através de corte transversal 47 indivíduos. Os fatores estudados foram 25-hidroxi-vitamina D (25(OH)D), hormônio da paratireóide (PTH), ferritina, vitamina B12, insulina, triglicerideos, glicose, colesterol e dados clínicos. A secreção e a resistência insulínica foram estimadas pelo “Homeostatic model assessment for beta-cell function (HOMA-B) e “Homeostatic model assessment for insulin resistance” (HOMA-IR), respectivamente. A avaliação da massa óssea foi obtida através de densitometria óssea. A mediana de tempo após o transplante foi 47,7 (12 – 115) meses. Osteoporose foi encontrada em 8 pacientes (17%) dos pacientes, enquanto osteopenia foi observada em 22 pacientes (46,8%). Os níveis séricos de ferritina (p=0,002), insulina (p<0,001), glicose (p=0,003), triglicerídeos (p=0,018) e o índice HOMA-IR (p<0,001) foram maiores em indivíduos com osteopenia ou osteoporose, enquanto o índice HOMA-B (p<0,001) foi menor nos indivíduos com osteopenia/osteoporose. Os demais fatores estudados não se associaram com o desfecho. Após análise multivariada, os níveis séricos de ferritina e 25(OH)D e o índice HOMA-IR permaneceram independentemente associados com osteopenia ou osteoporose. Os resultados do estudo apresentam novos fatores, os níveis séricos de ferritina e o índice HOMA-IR, possivelmente associados com a presença de redução da massa óssea em pacientes após TCTH.

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:32:35Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69316.pdf: 16389099 bytes, checksum: 74eb72078f131d9d9be7efc37391f1e6 (MD5) 69316.pdf.txt: 484412 bytes, checksum: 46c33af71747059817ce7b4a20b609af (MD5) 69316.pdf.jpg: 1433 bytes, checksum: 084dde94865696f7af0cab1566875cf5 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que representa um grave problema de saúde pública. Assim, compreender a biologia da interação T. cruzi-hospedeiros constitui um grande desafio, uma vez que o ciclo de vida deste parasito exige um repertório de adaptações para garantir sua dispersão em hospedeiros vertebrados e invertebrados. O presente estudo demonstra o potencial das proteínas com propriedade de ligação à heparina (PLHs) em atuar no ciclo biológico do T. cruzi. Durante este trabalho foi oportuno isolar uma fração de proteínas hidrofóbicas com propriedade de ligação à heparina, com massas moleculares entre 70 kDa e 59 kDa em formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi por cromatografia de afinidade à heparina. A presença destas proteínas na superfície celular destes parasitos foi confirmada por ressonância plasmônica de superfície. Tais ensaios também foram decisivos na determinação da especificidade e estabilidade da ligação das PLHs a heparina, heparam sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS). Os ensaios de competição realizados indicaram que a interação entre PLHs e GAGs pode influenciar a adesão dos epimastigotas à superfície de células epiteliais do trato intestinal de Rhodnius prolixus O envolvimento de GAGs na invasão de amastigotas em cardiomiócitos, célula alvo da infecção pelo T. cruzi, também foi demonstrado através de ensaios de competição com 20 \03BCg/ml de GAGs solúveis, incluindo heparina, HS, CS, dermatam sulfato (DS) e queratam sulfato (KS). Uma drástica redução no nível de infecção foi evidenciada apenas com heparina e HS, atingindo 82% e 65% de redução da invasão, respectivamente. Ensaios com células deficientes em GAGs (CHO-745) corroboraram o importante papel destes componentes de matriz extracelular no processo de reconhecimento e invasão de amastigotas. Na continuidade deste estudo, avançamos na caracterização bioquímica de PLHs, na determinação da expressão e distribuição espacial destas proteínas em tripomastigotas. As análises por citometria de fluxo revelaram que PLHs são abundantes na superfície de tripomastigotas, clone Dm28c, e a detecção destas proteínas por imunofluorescência indireta revelou uma localização predominante na membrana flagelar do parasito. Com os ensaios de zimografia realizados neste trabalho, revelamos que as PLHs de tripomastigotas tem atividade de protease sobre gelatina em uma ampla faixa de pH (5,5 - 8,0). A sensibilidade destas enzimas a presença de inibidores de serino protease indicam que as PLHs de tripomastigotas têm propriedades similares à tripsina. O conjunto de resultados deste trabalho aponta para o importante papel das PLHs em todas as etapas do ciclo biológico do T. cruzi a partir de eventos de adesão e invasão celular, através do reconhecimento de glicosaminoglicanos sulfatados / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected tropical disease that causes a serious public health problem. Thus, understanding the biology of the T. cruzi-hosts interaction is a major challenge, since the life cycle of this parasite requires a repertoire of adaptations to ensure their dispersion in vertebrate and invertebrate hosts. The present study demonstrates the potential of proteins with heparin-binding property (HBPs) to act in the biological cycle of T. cruzi. During this study, it was opportune to isolate a hydrophobic protein fraction with property to bind to heparin, with molecular weights ranging from 70 kDa to 59 kDa, in epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi by heparin affinity chromatography. The presence of these proteins on the cell surface of these parasites was confirmed by surface plasmon resonance. These assays were also decisive in determining the specificity and stability of the binding of HBPs to heparin, heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS). The competition assays indicated that the interaction between HBPs and GAGs can influence the adhesion of the epimastigote to the surface of epithelial cells of the intestinal tract of Rhodnius prolixus. The involvement of GAGs in the invasion of amastigotes in cardiomyocytes, target cell of T. cruzi infection, was also demonstrated by competition assays with 20 μg/ml of soluble GAGs, including heparin, HS, CS, dermatan sulfate (DS) and keratan sulfate (KS). A drastic reduction in the level of infection was observed only with heparin and HS, reaching 82% and 65% reduction of the invasion, respectively. Experimental assays using cells deficient in GAGs (CHO-745) corroborated the important role of extracellular matrix components in the recognition and invasion of amastigotes. In continuation of this study, we advanced in the biochemical characterization of HBPs and also determined the expression and spatial distribution of these proteins in trypomastigotes. The flow cytometric analysis revealed that HBPs are abundant at the surface of trypomastigotes, Dm28c clone, and the detection of these proteins by indirect immunofluorescence revealed a predominant location in the flagellar membrane of the parasite. With the zymography assays conducted in this work, we revealed that HBPs of trypomastigotes have proteinase activity on gelatin in a wide pH range (5.5 - 8.0). The sensitivity of these enzymes in the presence of serine proteinase inhibitors indicates that HBPs of trypomastigotes have properties similar to trypsin. All together, the results of this study points out to the important role of HBPs at all stages of the life cycle of T. cruzi from events of adhesion and cell invasion, through the recognition of sulfated glycosaminoglycans