Made available in DSpace on 2015-10-23T12:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thiago_pinto_ioc_mest_2013.pdf: 2486105 bytes, checksum: 868a236b9a638adc77cfb2312e1f391d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A indução da via de interferon (IFN) do tipo I (IFN-\03B1 e -\03B2) é crucial para uma resposta protetora contra infecções virais. Entretanto, estudos recentes demonstraram que esta classe de IFNs tem a ativação mediada por receptores citoplasmáticos de DNA e regula negativamente a resposta protetora contra a infecção por bactérias intracelulares, com destaque para o Mycobacterium tuberculosis, criando um nicho favorável para a replicação micobacteriana. Um estudo anterior do nosso grupo, utilizando uma abordagem de expressão gênica global por microarranjos, demonstrou que a infecção de células de Schwann com Mycobacterium leprae induz genes ativados por IFN do tipo I, com destaque para o gene OASL, o qual codifica a proteína 2\2019 5\2019 oligoadenilato sintetase like. No presente estudo, esses resultados foram estendidos e validados utilizando o modelo de macrófagos derivados de célulasTHP-1. Nossos dados demonstram que a OASL foi induzida por M. leprae vivo, mas não M. bovis BCG ou M. leprae morto. Adicionalmente, a transfecção de DNA de M. leprae, mas não de RNA, induziu a produção de OASL. Em nosso modelo, a infecção por M. leprae não foi capaz de induzir a produção de IFN-\03B1, assim como o tratamento CpG não induziu OASL, excluindo assim a sinalização de DNA mediada por TLR9 Além disso, mostramos evidências da permeabilização fagossomal mediada pelo fator de virulência micobacteriano ESAT-6, a qual permite acesso do conteúdo do fagossomo ao citoplasma e, consequente, produção de IFN-\03B2. O bloqueio farmacológico de TBK1 foi capaz de inibir a produção de OASL mediada pela infecção com M. leprae, indicando, dessa forma, que a indução de IFN-\03B2 e seus genes a jusante, como o OASL, ocorre através do eixo de sinalização STING/TBK1/IRF3. Interessantemente, o silenciamento gênico de OASL resultou na redução da viabilidade intracelular do M. leprae juntamente com redução da liberação da quimiocina CCL2/MCP-1 induzida por M. leprae. Entretanto, a transfecção de DNA seguida por infecção com M. bovis BCG foi capaz de reverter o fenótipo avirulento dessa bactéria, aumentado sua viabilidade intracelular e induzindo altos níveis de CCL2/MCP-1. Dessa maneira, nossos dados sugerem que a ativação da via de IFN tipo I é, de fato, capaz de inibir a reposta protetora do hospedeiro contra micobactérias, criando um ambiente favorável para a sobrevivência da micobactéria no ambiente intracelular, representando assim um potencial alvo para intervenções farmacológicas e/ou prevenção / The induction of interferon pathway (IFN) type I (IFN - α and - β ) is crucial for a protective response against viral infections. However, emergent research has shown that type I IFNs and cytoplasmic DNA signaling ar e negative regulators of the protective response against infection by in tracellular bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis , and provide a favorable niche for mycobacterial replication. Recently, using an approach of global gene expression by microar r ay, our group showed that Schwann cells infection with Mycobacterium leprae induced genes activated by IFN type I, highlighting the OASL gene, which encodes the 2 '5' oligoadenylate synthetase like protein. In the present work , these results were extended and validated using the THP - 1 - derived macrophages m odel . Our data demonstrate that OASL and type I IFN pathway was upregulated by M. leprae , but not M. bovis BCG or dead M. leprae , in macrophage - like THP - 1 infected cells. In addition, M. leprae DNA transfection but not RNA, was able to induce OASL production . In our model, M. leprae infection was not able to induce IFN - α and OASL was not induced by CpG, therefore excluding a TLR9 dependent pathway. Furthermore, we show evid ence of fagossomal permeabilization mediated by mycobacterial virulence factor ESAT - 6, which enables access of contents of the phagosome to host cytoplasm and subsequent induction of IFN - β. Pharmacological blockag e of TBK1 was able to inhibit M. leprae - ind uced OASL mRNA expression, indicating thereby that the IFN - β induction and its downstream genes, such as OASL occur through the STING/TBK1/IRF3 pathway . Interestingly, OASL targeted silencing directly decreased intracellular M. leprae survival and impaired the CCL2/MCP - 1 secretion. Furthermore, M. leprae DNA transfection followed by infection with M. bovis BCG has reverted the avirulent infection phenotype of this mycobacteria, increasing its intracellular viability and inducing high levels of CCL2/ MCP - 1. Together , these results suggest that OASL plays an important role in the response to mycobacteria and provide a potential pharmacological target for prevention or intervention

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:18:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andres_quesne_ioc_mest_2014.pdf: 2284982 bytes, checksum: 60f23c8536661b9357f727cee49ed7ee (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Giardia intestinalis (G. intestinalis) é o parasita gastrointestinal mais comum que coloniza o trato intestinal humano onde permanece extracelular e aderido às células intestinais. O parasita tem uma distribuição mundial, causando um número estimado de 2.8x108 casos por ano e recentemente a doença foi incluída como parte da Iniciativa das Doenças Negligenciadas da Organização Mundial de Saúde. As manifestações clínicas da giardíase são variáveis, e vão desde a ausência de sintomas até diarreias agudas ou crônicas. Adicionalmente, estudos recentes indicam que distúrbios gastrintestinais funcionais, tais como a síndrome do intestino irritável, e o déficit de crescimento em crianças podem ser associados com a infecção por G. intestinalis. Apesar da alta prevalência e das consequências desta doença, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes na giardíase ainda permanecem incompreendidos. Os trofozoítos causam a doença sem penetrar no epitélio intestinal, nem entrar na corrente sanguínea e sem secretar nenhuma toxina conhecida. Nos últimos anos, tem sido descrito que as vesículas extracelulares podem participar na interação parasita-célula hospedeira. As vesículas extracelulares podem ser: microvesículas (MVs) e derivadas da membrana plasmática; exosomos, pequenas vesículas originadas a partir de membranas de endossomos; e corpos apoptóticos contendo material do núcleo celular. As MVs têm sido mostradas como importantes fatores na interação parasita-célula hospedeira No presente trabalho, foi utilizada uma combinação de metodologias, incluindo citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, proliferação celular, análises de proteoma e ensaios de aderência celular para investigar o papel das microvesículas liberadas por trofozoítos de G. intestinalis nas propriedades patogênicas deste parasita. Demonstramos que G. intestinalis produz e secreta microvesículas com exposição superficial de fosfatidilserina. Além disso, o processo de liberação de MVs é dependente do tempo e da concentração de cálcio, envolve microdomínios de membrana e as microvesículas contêm RNA de baixo peso molecular. Observamos também que os microdomínios de membrana estão envolvidos na adesão do parasita à células Caco-2. Nossa análise proteômica preliminar sugere presença de componentes do citoesqueleto, alfa giardinas, enzimas metabólicas e proteínas variáveis de xi superfície (VSP) nas MVs isoladas de G. intestinalis. Foi demonstrado também que as MVs de G. intestinalis interagem com as células do hospedeiro aumentando a proliferação destas e incrementado também o número de trofozóitos aderidas à estas células. O presente estudo é o primeiro a sugerir um papel potencial para as microvesículas de G. intestinalis na colonização do hospedeiro. Uma melhor compreensão do papel das MVs liberadas pelo parasita na interação com a célula hospedeira poderá fornecer novas perspectivas sobre patogênese e possivelmente novas ferramentas para o diagnóstico e a terapia da doença / Giardia intestinalis ( G. intestinalis ) is the most common gastrointestinal parasite that colonizes the human intestinal tract where it remains extracellular and adheres to intestinal cells . The parasite has a global distribution causing an estimated 2.8x10 8 cases per year and the illness was recently included in the World Health Organization Neglected Disease Initiative . Clinical manifestations of giardiasis are quite variable, and range from the absence of symptoms to acute or chronic diarrhea. Aditionally, r ecent studies indicate that functional gastrointestinal disorders , such as irritable bowel syndrome , and failure of children to thrive can be associated with G. intestinalis infection . Even though the high prevalence and consequences of this disease , pathophysiological mechanisms underlying symptomatic giardiasis remain incompletely understood . Trophozoites cause disease without penetrating the intestinal epithelium , entering the bloodstream or secreting toxin s . In recent years it has been described that extracellular ves icles could participate in parasite - host cell interaction. The extracellular vesicles ma y be: microvesicles (MVs) and derived f rom the plasma membrane; exosome s, small vesicles originated from endosomal limiting membrane ; and apoptotic bodies containing nuclear material. MVs have been shown to be important factors in the parasite - host cell in teraction. Here, we used a combination of methodologies including flow cytometry, fl u orescence microscopy, cell proliferation, proteomics analysis and cell adherence assays to investigate the role of released microvesicles from G. intestinalis trophozoites on the pathogenic properties of this parasite . We have found that G. intestinalis produces and secretes microvesicles with superficial exposition of phosphatidilserine. Additionally , the shedding process was calcium and time - dependent , involve s membrane microdomains and the microvesicles contain low - molecular weight RNA . We also observed that membrane microdomains are involved in parasite attachment to Caco - 2 cells. Our preliminary proteomic analysi s suggested the presence of cytoskeleton components, alpha giardins, metabolic enzymes and variant - specific surface protein ( VSP ) in the isolated MVs from G. intestinalis. We demonstrate that G. intestinalis microvesicles interact with host cells xiii increasing their prolifer ation and augment ing the number of trophozoites adhered t o these cells . The present study is the first to suggest a potential role for G. intestinalis microvesicles in host cell colonization. A better understanding of the role of the released microvesicles by the parasite on the host - cell interaction will provide insights into pathogenesis and possibly new tools for diagnosis and therapy

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:16:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ellen_altoe_ioc_mest_2013.pdf: 1397353 bytes, checksum: 107b103e24982f28206bdb6e9749cd60 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A gp63, metalopeptidase altamente abundante na superfície de Leishmania, contribui para uma infinidade de funções bem estabelecidas na interação deste parasito com o hospedeiro mamífero. No entanto, apesar desta molécula ser abundantemente expressa na superfície das formas promastigotas, encontradas no inseto vetor, pouco é conhecido sobre as funções desempenhadas por essa metalopeptidase no flebotomíneo. Nosso grupo de pesquisa, utilizando abordagens bioquímicas, tem demonstrado que moléculas de gp63 de vários tripanosomatídeos não patogênicos ao homem estão implicadas na adesão ao intestino de insetos hospedeiros. Aqui, nós analisamos o papel da gp63 na interação de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, com os seus respectivos insetos hospedeiros, Lutzomyia intermedia e Lu. longipalpis e com a linhagem celular derivada de Lu. longipalpis (LL5). Os intestinos dissecados de insetos foram prétratados ou não com o fosfoglicano (PG) puro derivado do lipofosfoglicano e colocados para interagir com os parasitos. Em paralelo, promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram pré-tratados com anticorpo anti-gp63 ou com inibidores da metalopeptidase. Depois disso, os parasitos foram colocados para interagir com os intestinos dissecados de insetos ou com as células LL5 Como esperado, o PG praticamente elimina a capacidade dos parasitos de se ligarem ao intestino dos insetos. Todos os tratamentos relacionados com a gp63 também provocaram uma diminuição acentuada nestes ensaios de ligação. Além disso, o sobrenadante de cultura de L. braziliensis foi concentrado por precipitação com sulfato de amônio e analisado por SDS-PAGE e SDS-PAGE-gelatina. Observamos uma degradação proteolítica, por volta de 63 kDa, que corresponde à enzima gp63 já identificada e caracterizada em várias espécies de Leishmania. Esses resultados em conjunto demonstram uma possível participação da gp63 na interação com o inseto vetor e nos estimulam a continuar estudando o papel dessa metalopeptidase no ciclo de vida de Leishmania / The highly abundant surface metallopeptidase of Leishmania, gp63, contributes to a myriad of well-established functions in the interaction of this parasite with the mammalian host. However, despite this molecule being abundantly expressed on the surface of promastigote forms, found in the insect vector, little is known about the functions performed by this metallopeptidase in the phlebotomine. Our research group, using biochemical approaches, has demonstrated that gp63 molecules from several not pathogenic trypanosomatids to man are implicated in the adhesion to guts of insect hosts. Here, we analyzed the role of gp63 in the interaction of Leishmania braziliensis and Leishmania infantum with their respective insect hosts, Lutzomyia intermedia and Lu. longipalpis and with the cell line derived from Lu. longipalpis (LL5). The dissected insect guts were pretreated or not with purified phosphoglycan (PG) derived from the lipophosphoglycan and placed to bind with the parasites. In parallel, promastigotes of L. braziliensis and L. infantum were pretreated with anti-gp63 antibodies or with metallopeptidase inhibitors. Thereafter, the parasites were placed to interact with dissected insect guts or with the LL5 cells. As expected, PG virtually eliminates parasites ability of bind to the insect guts. All treatments related to gp63 also provoked a pronounced decrease in these binding assays. Moreover, the culture supernatant of L. braziliensis was concentrated by precipitation with ammonium sulfate and analyzed by SDS-PAGE and SDS-PAGE-gelatin. We observed a proteolytic degradation around 63 kDa, which corresponds to the gp63 enzyme already identified and characterized in several Leishmania species. These results together demonstrate a possible role of gp63 in the interaction with the insect vector and stimulate us to continue studying the role of this metallopeptidase in the life cycle of Leishmania.

Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-10-11T17:37:06Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-17T13:57:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-17T13:57:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A esquistossomose mansônica ainda constitui um grave problema de saúde pública no Brasil e, portanto, o conhecimento dos diversos aspectos da interação Schistosoma mansoni-Biomphalaria, são pertinentes e relevantes como subsídios à medidas de controle e prevenção desta parasitose. Estudos in vitro têm mostrado que a suscetibilidade dos hospedeiros intermediários de S. mansoni, Biomphalaria straminea e Biomphalaria glabrata está relacionado à presença de lectinas. Importante transmissor da Esquistossomose no Brasil, B. straminea apresenta baixos índices de infecção em condições experimentais. Apesar disto, existem poucos estudos a respeito das características morfológicas e do comportamento in vitro dos hemócitos deste molusco frente à infecção por S. mansoni. Com o objetivo de caracterizar a resposta hemocitária de B. straminea (cepa Souza-PB) expostas a miracídios de S. mansoni, os moluscos foram expostos em massa e expostos individualmente a cinco miracídios. Exemplares de B. glabrata foram utilizadas como controle positivo. A hemolinfa foi coletada, corada em Azul de Tripan e os hemócitos foram contados em câmara de Neubauer. Alguns hemócitos foram colocados em placa de cultura para observação da interação das células com os parasitos e outros foram submetidos à marcação por lectinas fluoresceinadas de Griffonia simplicifolia e Lens culinaris conjugadas a FITC. As imagens foram obtidas e gravadas através de microscópio AxioObserver e câmera McR5 Zeiss. Os moluscos expostos em massa foram sacrificados logo após a penetração inicial do parasito (0 minuto), 24, 48, 72 horas e 30 dias após exposição (dpe) Moluscos expostos a cinco miracídios foram mortos após 0, 15, 30 e 45 minutos de exposição. Os órgãos foram fixados em formalina Millonig de Carson, incluídos em parafina e corados em HE. Após a exposição em massa verificou-se um aumento de 496,37% de células na hemolinfa de B. straminea e de 230,29% na hemolinfa de B. glabrata logo após a penetração dos miracídios. Na exposição por cinco miracídios houve um aumento de 78,14% de células na hemolinfa de B. straminea e de 36,36% na hemolinfa de B. glabrata logo após a penetração dos miracídios. A maioria das células encontradas na hemolinfa eram células blásticas e seu diâmetro foi em torno de 6\03BCm para B. straminea e 7\03BCm para B. glabrata. Hemócitos de B. straminea exibiram marcação mais intensa para lectina de G. simplicifolia nos tempos iniciais após a exposição, enquanto que aos 30 dias dpe as células estavam mais positivas para L. culinaris. Na análise histológica dos tempos iniciais, não foram observadas reações celulares nem parasitos mortos nos tecidos de ambos os hospedeiros. Entretanto, B. glabrata apresentou esporocistos secundários na região da massa cefalopediosa aos 30 dias após a infecção. Concluímos que a resistência de B. straminea está associada a modulação de lectinas expressas nos hemócitos. Além do mais, verificamos que as células blásticas, as células precursoras de outros hemócitos, são as mais abundantes nos dois hospedeiros estudados / Schistosomiasis still remain as an important parasitic disease under the public health point of view. Thus, studies that involve the interaction between Schistosoma mansoni-Biomphalaria are pertinent and useful to the disease prevention and control. In vitro studies have shown that the susceptibility of Biomphalaria straminea and Biomphalaria glabrata, intermediate hosts of Schistosoma mansoni, is related to the presence of lectins. As an important carrier of schistosomiasis in Brazil, B. straminea presents low infection rates under laboratory conditions. Despite of that, there are few studies regarding the morphological features and in vitro behavior of this mollusc's haemocytes challenged by S. mansoni miracidia. For this purpose, we analyzed the haemocyte response of B. straminea (Sousa \2013 PB strain) challenged by the parasite, so the molluscs were put under mass exposure and individual exposure to five miracidia. B. glabrata molluscs were used as positive controls. The molluscs had their haemolymph drawn, the haemocytes were stained in Trypan Blue and counted in Neubauer chamber. Some haemocytes were put into cell culture plates in order to observe the interaction between the cells and the parasites and other cells were stained by FITC conjugated lectins from Griffonia simplicifolia and Lens culinaris. The images and films were made at the microscope AxioObserver with McR5 camera from Zeiss. The mass exposed molluscs were killed at 0 minutes (first penetration of the miracidia), 24, 48, 72 hours and 30 days after exposure (dae) and the five miracidia exposed molluscs were killed after 0, 15, 30 and 45 minutes The organs were fixed in Carsons's Millonig Formalin, embedded in paraffin and stained with Hematoxylin and Eosin. After mass exposure, an increase of 496,37% in the haemolymph cells from B. straminea and an increase of 230,29% in the haemolymph cells from B. glabrata right after the miracidia penetration was observed. Most cells observed were blast cells and their diameter was 6\03BCm for B. straminea and 7\03BCm for B. glabrata. In the histological analysis of the earlier times, there were no cell reactions nor dead parasites found as the result of the exposure in both hosts tissues. Whereas at 30 dae B. glabrata shown parasites in its cephalopedal region. B. straminea haemocytes showed an intense staining for G. simplicifolia at the initial times of the exposure whereas 30 dae the cells were positive for L. culinaris lectin. Our conclusion is that B. straminea resistance to S. mansoni is associated with lectin modulation expressed by haemocytes and the fast response to miracidial penetration. Furthermore, we have seen that blast cells, precursor cells that origin other types of haemocytes, are more plentiful among both hosts studied

Acanthamoeba spp. são patógenos protistas de vida livre, capazes de causar ceratite grave e encefalite granulomatosa fatal. Trofozoíto é a forma infectiva de Acanthamoeba spp. e pode provocar infecções em uma variedade de hospedeiros mamíferos e seres humanos, como resultado da complexa interação patógeno-hospedeiro. O dano causado por trofozoítos em infecções da córnea ou do cérebro é o resultado de vários mecanismos patogênicos diferentes não elucidados a nível molecular até agora. Neste trabalho, descrevemos os resultados da caracterização genotípica de isolados ambientais de Acanthamoeba spp. e a identificão por análises proteômicas do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Nossos resultados permitiram a caracterização de 13 isolados ambientais de Acanthamoeba spp. obtidos da água de piscinas, que foram classificados em nível de genótipo com base na análise da sequência do gene da subunidade menor do rDNA. Nove dos 13 isolados foram identificados como pertencentes ao genótipo T5, três ao genótipo T4 e um ao genótipo T3. Vários genótipos têm sido relatados em todo o mundo como agentes causadores de ceratite amebiana, incluindo os genótipos T3, T4 e T5. O presente estudo indica que o genótipo T5 é um contaminante comum na água de piscinas. Este trabalho também estabeleceu uma ampla análise do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de A. polyphaga, baseado no conjunto de estratégias por 2-DE MS/MS e LC-MS/MS. Foram identificadas 192 proteínas não redundantes. Um mapa proteômico de referência de A. polyphaga na faixa de pH 3-10 foi produzido e de 370 spots resolvidos, 136 proteínas foram identificadas. A classificação funcional das proteínas revelou diversas proteínas com relevância potencial para a sobrevivência do parasita e infecção de hospedeiros mamíferos, incluindo proteínas de superfície e proteínas relacionadas aos mecanismos de defesa. Este estudo descreveu a primeira análise proteômica abrangente do estágio de trofozoíto de Acanthamoeba spp. e fornece bases para estudos prospectivos, comparativos e funcionais de proteínas envolvidas nos mecanismos moleculares de sobrevivência, desenvolvimento e patogenicidade de Acanthamoeba spp. / Acanthamoeba spp. are free-living protist pathogen, capable of causing a blinding keratitis and fatal granulomatous encephalitis. Trophozoite is the form infective of Acanthamoeba spp. and can provoke infections in a variety of mammalian hosts and humans, as result of complex interaction host-pathogen. The damage caused by trophozoites in human corneal or brain infections is the result of several different pathogenic mechanisms not elucidated at the molecular level so far. Here, we describe the results of the characterization genotypic of environment isolates of Acanthamoeba spp. and we performed proteomic analysis to identify the repertoire of proteins expressed by trophozoites of an environmental strain of Acanthamoeba polyphaga. Our results allowed the characterization of 13 Acanthamoeba isolates from swimming pools water that were classified at the genotype level based on the sequence analysis of the small-subunit rDNA gene. Nine of the 13 isolates were genotype T5, three were genotype T4, and one was T3. Several genotypes have been reported worldwide as causative agents of keratitis, including genotypes T3, T4, and T5. The present study indicates that genotype T5 is a common contaminant in swimming-pool water. This work also established a comprehensive analysis of the proteins expressed by A. polyphaga trophozoites based on complementary 2-DE MS/MS and gel-free LC-MS/MS approaches. Overall, 192 nonredundant proteins were identified. An A. polyphaga proteomic map in pH range 3-10 was produced, with protein identification for 136 out of 370 resolved spots. Functional classification of identified proteins revealed several proteins with potential relevance for parasite survival and infection of mammal hosts, including surface proteins and proteins related to defense mechanisms. This study describes the first comprehensive proteomic survey of the trophozoite infective stage of an Acanthamoeba species, and provides foundations to prospective, comparative and functional studies of Acanthamoeba proteins involved in molecular mechanisms of survival, development, and pathogenicity.

O transplante de Células Tronco Hematopoéticas alogênico é o tratamento curativo para diversas doenças hematológicas malignas, benignas e imunodeficiências, porém é acompanhado de grande morbidade e mortalidade. Uma das principais complicações é a doença do enxerto contra hospedeiro aguda que, se não controlada rapidamente, pode ser fatal. A Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda tem como tratamento o uso de esteróides, no entanto, em cerca de 30 a 50% dos casos se revela resistente à esta terapia, sendo considerados com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária ou resistente. O tratamento para Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária ou resistente à esteróides não está ainda estabelecido sendo alta a mortalidade desses pacientes. Nesse contexto, começou-se a pesquisar o papel das células-tronco mesenquimais em pacientes com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteróides, devido a capacidade de imunomodulação que aquelas possuem. As células-tronco mesenquimais são células-tronco adultas, com capacidade de autorrenovação, proliferação e diferenciação em diferentes linhagens celulares. As propriedades imunomoduladoras das células-tronco mesenquimais ainda não são totalmente conhecidas, mas sabe-se por estudos in vitro que elas interagem com diversos tipos celulares e citocinas, sendo sua aplicabilidade terapêutica muito pesquisada em diversas doenças inflamatórias; ainda assim, poucos se conhece sobre o efeito modulador das células-tronco mesenquimais in vivo. Inúmeros estudos piloto ou séries de casos sobre a aplicabilidade de célula-tronco mesenquimal para o tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda foram publicados com resultados animadores, no entanto, não há até o momento na literatura estudo prospectivo randomizado em pacientes com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária comparando célula-tronco mesenquimal com o tratamento padrão. Finalmente, dentre os problemas decorrentes da intensa imunossupressão necessária para controlar a Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteroides, se destacam o aumento da incidência de infecções graves e a possibilidade da diminuição do Efeito Enxerto Versus Leucemia, ao qual se atribui o poder curativo do transplante de células-tronco hematopoético alogênico. As células Natural Killer com sua capacidade anti-tumoral inata, parecem ser os principais linfócitos envolvidos no Enxerto Versus Leucemia. Esse estudo teve como objetivo determinar o papel das células-tronco mesenquimais no tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteroides comparando, de forma randomizada, com a terapia com anticorpos monoclonais padrão; e estudar aspectos relacionados à imunomodulação decorrente da terapia com célulatronco mesenquimal, in vivo, com particular atenção à citocinas a ao comportamento das células Natural Killer neste contexto. Nossos resultados confirmam que a infusão de célula-tronco mesenquimal levam a um aumento significativo da Interleucina 10 de efeito anti-inflamatório, e indicam pela primeira vez, que as células Natural Killer aumentam gradativamente durante e após as infusões de células-tronco mesenquimais tanto em proporção dentre os linfócitos, como no seu grau de ativação, resultando em uma atividade citotóxica significativamente elevada no 280 dia após o início das infusões. Postulamos, inclusive, que a ativação das células Natural Killer seria o mecanismo pelo qual não se observa aumento de recidiva ou das infecções com o emprego de infusões de células-tronco mesenquimais para o tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteróides. / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the curative therapy for several malignant and non-malignant hematological diseases as well as for immunodeficiences. Although curative, morbidity and mortality are high, been acute Graft versus Host Disease and infections amongst the most frequent life threatening complications. Treatment for acute Graft versus Host Disease is high dose steroids, however, 30 to 50% of the cases are resistant or refractory to it. Steroid resistant or refractory Graft versus Host Disease is a very difficult condition to treat and effective treatment strategies are still to be defined. In this scenario, the intravenous infusion of Mesenchymal Stem Cells has emerged as a tool to rescue patients from that condition because of its immunomodulatory potential. Mesenchymal Stem Cells are adult stem cells with capacity for self-renewal, proliferation and differentiation in mesodermal tissues, particularly chondrocytes, osteoblasts and fibroblasts. Its immunomodulatory proprieties and effectiveness in several inflammatory diseases are still a matter of intense debate and mostly studied in in vitro conditions. There are several published or ongoing studies on the role of Mesenchymal Stem Cells for steroid resistant acute Graft versus Host Disease, but none randomizing it with monoclonal antibody therapy frequently utilized as treatment with variable results, and complicated by an intense cellular immunodeficiency and severe infections. Since hematologic malignancies are the number one indication for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and the secondary Graft versus Leukemia effect mediated by immune effector cells recognized as responsible for its curative potential, an intense cellular immunodeficiency is not desirable in this scenario. In the last few years, Natural Killer cells have emerged as an effector involved in Graft versus Leukemia sparing the patient of Graft versus Host Disease, however, in vivo Mesenchymal Stem Cells and Natural Killer crosstalk have not been studied although severe infections and relapse are not increased after Mesenchymal Stem Cells cellular therapy. Here we show that, in spite of the results of most of the in vitro studies suggesting that Mesenchymal Stem Cells inhibits Natural Killer cell activity, in vivo evidences points to an increment of Natural Killer cells number and activity during the several Mesenchymal Stem Cells infusions, particularly at the 28th day after the beginning of infusions, thereby explaining the apparent infection and relapse protection promoted by Mesenchymal Stem Cells.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-07-29T21:29:41Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-07-30T17:43:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-30T17:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) Previous issue date: 2013 / microRNAs (miRNAs) são uma classe de reguladores pós-transcricionais com aproximadamente 22 nucleotídeos. Estas moléculas regulam a expressão gênica por se ligarem a sequências complementares existentes na região 3’UTR de mRNAs específicos, induzindo sua degradação ou silenciamento. Utilizando abordagens computacionais, nosso grupo de pesquisa identificou 42 novos miRNAs precursores em Schistosoma mansoni, sendo que 5 destes, eram de origem intrônica. Considerando que cerca de metade dos miRNAs humanos conhecidos estão localizados em íntrons de genes codificantes de proteínas e que muitos deles são expressos somente quando o gene é transcrito, levantamos a hipótese de que parte do repertório de miRNAs de S. mansoni poderia ser de origem intrônica. Para investigar esta hipótese foi utilizada a versão 5.1 do genoma deste parasito, bem como analisada o perfil de expressão utilizando a metodologia de qRT-PCR nos seguintes estágios evolutivos do parasito: cercárias, esquistossômulos jovens (3,5 e 24h de cultivo in vitro), vermes adultos, ovos e miracídios. Após a recuperação do arquivo contendo as sequências de íntrons presentes nos genes de S. mansoni, foram recuperadas somente as que continham entre 50 a 120 nucleotídeos e que apresentavam o mínimo de energia livre de ΔG<-25 Kcal/mol, estimado pelo software RNAfold. Essas análises mostraram um conjunto de 38 candidatos a moléculas precursoras de miRNAs. Posteriormente utilizando a ferramenta Mature Bayes foram preditos os miRNAs maduros, e a seguir, utilizados para busca de homologia no o banco de dados miRBase. Os resultados mostraram que os miRNAs preditos não apresentam homólogos no mirBase, levantando a hipótese de que este conjunto seja específico da espécie S. mansoni. A análise do perfil de expressão mostrou que dos 38 miRNAs preditos, 19 apresentaram expressão em pelo menos um estágio evolutivo analisado. Não foram identificados miRNAs estágios específicos, apesar de todos serem diferencialmente expressos. Com relação ao perfil de expressão dos genes hospedeiros, também foi observado uma expressão diferencial entre os estágios analisados. Finalmente para a predição dos alvos, foi utilizado o programa miRanda, evidenciando um conjunto de 993 alvos potenciais, sugerindo que 10% dos genes preditos em S. mansoni poderiam ser regulados por miRNAs. Em conjunto os resultados sugerem que parte dos miRNAs de S. mansoni estão localizados em genes que codificam proteínas. Esta observação levanta uma série de questões interessantes que serão futuramente investigadas __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: microRNAs (miRNAs) are a class of post-transcriptional regulators with approximately 22 nucleotides. These molecules regulate gene expression by interaction to complementary sequences in the 3'UTR region of specific mRNA and inducing its degradation or silencing. Using computational approaches, our research group has identified 42 new miRNAs precursor in Schistosoma mansoni, and 5 of these were of intron origin. Whereas about half of the known human miRNAs are located in introns of protein coding genes and many of them are express only when the gene is transcribed, hypothesized was that part of the miRNAs repertoire in S. mansoni could be intron origin. To investigate this hypothesis we used version 5.1 of this parasite genome and analyzed the expression profile using qRT-PCR methodology in the following evolutionary stages of the parasite: cercariae, schistosomula young (3.5 and 24 hours of in vitro culture), adult worms, eggs and miracidium. After recovery of the file containing the sequence of introns present in the genes of S. mansoni, the sequences that contained between 50 and 120 nucleotides and who had at least ΔG<-25 Kcal/mol free energy, estimated by RNAfold software were recovered. Together, these analyzes revealed a set of 38 miRNA precursor candidates. Subsequently, the software Mature Bayes was used to miRNAs mature candidates and searched for homology using the miRBase database. The results showed that predicted miRNAs have no counter parts in mirBase, suggesting that this miRNA set is S. mansoni species-specific. The expression profile analysis showed that the 38 predicted miRNAs, 19 were expression in at least one developmental stage analyzed. miRNAs were not identified as stage specific expression, despite all being differentially expressed. Regarding the profile of expression of host genes was also observed a differential expression between stages analyzed. Finally for the prediction of targets, we used the software miRanda, revealing a set of 993 potential targets, suggesting that 10% of the predicted genes in S. mansoni could be regulated by miRNAs. Together these results suggest that parts of S. mansoni miRNAs are located in genes that encode proteins. This observation raises a number of interesting questions that will be further investigated.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318771.pdf: 16152173 bytes, checksum: 56737a2c8ed48b635f3f979d2c95cd94 (MD5) Previous issue date: 2013 / As trans-sialidades de Trypanosoma cruzi (TcTS) são capazes de clivar resíduos de ácidos siálicos da célula hospedeira e transferí-los à superfície do parasito, e portanto, fundamentais nessa interação. Já o Trypanosoma rangeli, considerado não patogênico para mamíferos e com ciclo desconhecido nestes hospedeiros, possui no seu genoma genes similares aos membros da família das Trans-sialidase (TS), embora sem nenhuma atividade catalítica. Uma vez que essa atividade está relacionada a pontos cruciais do ciclo do parasito patogênico e que, a ausência de atividade TS em T. rangeli é apontada como um dos motivos de sua incapacidade de infectar e sobreviver em células de mamíferos, o objetivo do presente trabalho foi estudar o envolvimento da TS a partir daexpressão heteróloga de uma TcTS ativa pelo T. rangeli. Após a transfecção e a confirmação da atividade de TS em T. rangeli transfectado (T. rangeli TcTS), ninfas de 4° e 5° estágio de Rhodnius prolixus (R. prolixus) foram infectadas por inoculação intracelômica com formas epimastigotas de T. rangeli selvagem e T. rangeli TcTS. Observamos uma diferença estatística no número de glândulas infectadas para T. rangeli selvagem (92%), e T. rangeli TcTS (16%), seis semanas p.i.. A infecção em camundongos BALB/c e C57BL/6 não revelou diferenças na de parasitemia entre parasitos selvagens e transfectados. Já nos ensaios de infecção in vitro utilizando-se células Vero, observou-se que o T.rangeli TcTS apresentou maior capacidade de infecção quando comparados ao T. rangeli selvagem, não sendo observado nenhum indício de divisão celular para esses parasitos após 120 horas de interação. Os resultados apontam que a expressão heteróloga da TcTS por T. rangeli embora não altere o tempo e o padrão da parasitemia experimental in vivo em camundongos, promoveu mudanças no comportamento da interação parasito-vetor e parasito-célula, reduzindo sua capacidade de penetração nas glândulas salivares de R. prolixus e facilitando a entrada do parasito em células in vitro. <br> / Abstract: The Trypanosoma cruzi trans-sialidases (TcTS) are able to cut and transfer sialic acid from the host cell to the parasite surface and are important molecules on this interaction. Trypanosoma rangeli is a non-pathogenic parasite to mammal, that posses an unknown life cicle in this host, and it has similar genes to TS family members in the genome, however, with no catalytic activity. Once TS are crucial molecules involved in parasite-host cell interaction in the pathogenic parasite, and the absence of TS activity is pointed as one of the reasons of its inability capacity of infecting and surviving in mammals cells, the aim of this work was to study the roll of TS in the host-parasite interaction using T. rangeli expressing an active TcTS (T. rangeli TcTS). After transfection and assessment of protein activity, 4° and 5° instar nymphs of Rhodnius prolixus were infected by intracelomic inoculation of T. rangeli wild type and T. rangeli TcTS epimastigote forms. A statistically significant difference was observed in the number of salivary gland infected for T. rangeli wild type (92%) and for T. rangeli TcTS (16%) at six weeks p.i.. Parasitemia of BALB/c mice and C57BL/6 infected by T. rangeli TcTS showed no difference from mice infected with non-transfected parasites. For in vitro infection assays with Vero cells, T. rangeli TcTS presented higher infection rates when compared with T. rangeli wild type, but no indication of intracellular division was detected for these parasites up to 120 hours. Despite not altering the parasitemia in mice, our results indicate that TcTS expressed by T. rangeli may be responsible for changes on the interaction between vector-parasite and cell-parasite by reducing the ability to penetrate on R. prolixus salivary glands and facilitating cell entry in vitro.

Resumo: Lepidoptera é considerada a ordem com maior número de espécies prejudiciais à agrossilvicultura. Tortricidae (9757 espécies) se destaca nesse aspecto, tendo em Olethreutinae, uma das subfamílias de Tortricidae, espécies relacionadas a hospedeiros de Euphorbiaceae. Sebastiania brasiliensis Spreng, euforbiácea comum nas matas ciliares da metade sul da América do Sul, teve interação com indivíduos de Grapholita motrix Berg, 1891 observada em Curitiba. Os objetivos desta dissertação foram a realização dos estudos morfológicos externo dos imaturos e adultos de G. motrix visando contribuir para o conhecimento das interações da planta com o lepidóptero. Coletas de frutos, galhos, flores e folhas foram realizadas no Parque Barigui e no Jardim Zoológico de Curitiba entre fevereiro de 2010 e outubro de 2011. Os imaturos e adultos coletados foram fixados, preparados e desenhados com auxílio de microscópio óptico e estereoscópico com acoplamento de câmara clara. Como o acompanhamento de instares não foi realizado, a definição das idades larvais foi efetuada através de uma ANOVA e um Teste de Tukey, tomando medidas das cápsulas cefálicas. Os testes estatísticos apresentaram cinco categorias de tamanho, que foram assumidas como os diferentes instares larvais. Nas larvas estão ausentes a terceira cerda lateral no pronoto e o conjunto que forma o garfo anal. As pupas apresentam projeção no vértice e espinhos nos segmentos abdominais. Após o desenvolvimento larval, a formação da pupa ocorre em um carpelo isolado do fruto, onde a larva de quinto instar prepara uma porta de saída para o adulto. Quando o adulto está prestes a emergir, a pupa se projeta da câmara pupal, deixando metade do corpo para fora e o adulto emerge. Nos adultos, machos e fêmeas podem ser diferenciados pela venação dimórfica, pelas cores mais escuras nos machos e mais homogêneas nas fêmeas. Genitália masculina com fusão entre o anellus, edeago e fultura inferior. Presença de corema no oitavo segmento abdominal do macho.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Pasquini / Co-orientadora: Profª. Drª. Neiva Isabel Rodrigues Magdalena / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente. Defesa: Curitiba, 27/11/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Hematologia e oncologia pediátrica / Resumo: A anemia de Fanconi (AF) é herdada de maneira autossômica recessiva, excepcionalmente ligada ao cromossomo X e caracterizada por uma falência progressiva de medula óssea, malformações congênitas e uma enorme predisposição ao câncer. O transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) é a única possibilidade de cura para as complicações hematológicas da AF. Os resultados do transplante são excelentes especialmente nos pacientes jovens, em fase de aplasia e com doadores aparentados compatíveis. No entanto, existem poucos dados na literatura em relação às complicações tardias após o TCTH nestes pacientes. Este estudo compreende a avaliação de 157 pacientes que sobreviveram pelo menos 2 anos após o TCTH, cujo seguimento variou de 2 a 25 anos (Mediana de 8,7 anos) e que foram transplantados no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná entre 1988 e 2011. No momento do transplante, 80% dos pacientes encontravam-se em fase de aplasia, 71% foram transplantados com doadores aparentados e 29% com doadores não aparentados. Diversos regimes de condicionamento foram utilizados e a medula óssea foi a fonte de células-tronco em 89% dos casos. Quimerismo completo foi observado em 76% dos casos e a rejeição ocorreu em apenas um paciente após os dois anos. Aos dois anos pós-TCTH, 16 pacientes apresentavam DECH crônica em atividade e 16 estavam em uso de tratamento imunossupressor. A incidência cumulativa do carcinoma espinocelular (CEC) de cavidade oral foi de 8% aos 10 anos e 14% aos 15 anos pós-TCTH. Apenas 2 dos 12 pacientes com CEC estão vivos após 5 anos do diagnóstico do câncer, sem evidência de doença. Os pacientes com DECH crônica desenvolveram o CEC mais jovens e numa fase mais precoce após o TCTH do que aqueles sem DECH crônica. Nos patientes avaliáveis, o hipotireoidismo foi detectado em 25% e o hipogonadismo em 40%. Ao todo, 4 mulheres tiveram gestações normais com fetos saudáveis. Outras complicações neurológicas, auditivas, visuais, pulmonares, hepáticas e renais relacionadas ao procedimento do transplante ou à doença básica também foram descritas em menor frequência. A probabilidade de sobrevida aos cinco anos foi de 95%, aos 10 anos de 90% e aos 15 anos de 79%. A sobrevida global foi influenciada de maneira negativa pela realização de transplantes antes de 2003, pela presença de DECH crônica e pelo diagnóstico do CEC. A maior causa de óbito foi o CEC de cavidade oral seguida pela DECH crônica e suas complicações infecciosas. Esta análise confirma que o TCTH é um tratamento eficaz para os pacientes com AF. A sobrevida foi melhor para os pacientes transplantados recentemente e para aqueles que não tinham DECH ou câncer. A maioria dos pacientes que sobreviveram mais do que 2 anos tinham uma vida normal e com um quimerismo completo. Mais esforços são necessários para diminuir o impacto das complicações tardias relacionadas a doença ou ao procedimento do transplante. A prevenção ou detecção precoce do CEC pode levar a um aumento na sobrevida no futuro. Palavras-chave: Anemia de Fanconi. Complicações tardias. Câncer. Doença do enxerto contra o hospedeiro. / Abstract: Fanconi Anemia (FA) is an autosomal recessive disorder rarely X-linked, characterized by progressive bone marrow failure, congenital abnormalities and a striking predisposition to cancer. Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is the only treatment able to cure the hematological complications associated with FA. Survival after transplant is excellent especially in young patients with aplastic anemia and matched related donors. However, only limited data are available regarding late complications after HSCT for these patients. This study evaluated late effects among 157 patients followed between 2 and 25 years (median 8.7 years) who survived for at least 2 years after transplant. These patients were transplanted at the Hospital de Clínicas - Federal University of Parana between 1988 and 2011. At the time of transplant, 80% of patients were in aplastic phase, 71% received transplants from related donors while 29% were transplanted using unrelated donors. Several preparatory regimens were used and bone marrow was the stem cell source in 89% of patients. Full donor chimerism was observed in 76% of patients and only one patient rejected after 2 years. At the time of study entry, 16 patients had active chronic GVHD and 16 patients were still receiving immunosuppressive therapy. The probability of survival was 95% at 5 years, 90% at 10 years and 79% at 15 years. Overall survival was negatively impacted by transplants performed before 2003, presence of chronic GVHD and diagnosis of squamous cell carcinoma (SCC). The cumulative incidence of SCC of the mouth at 10 years was 8% and at 15 years was 14%. Only 2 patients with SCC are alive, disease free, 5 years after diagnosis. Patients with GVHD developed this complication at a younger age and earlier after transplant when compared to patients who did not have GVHD. In evaluable patients, 25% had hypothyroidism and 40% had the diagnosis of hypogonadism. Normal pregnancies occurred in 4 females with normal offsprings. Other neurological, auditory, visual, pulmonary, hepatic and renal complications related to the disease or to the transplant procedure were also described in a lower frequency. SCC of the mouth was the major cause of death followed by GVHD and its infectious complications. In summary, this analysis confirms that HSCT is an effective treatment for paients with FA. Survival was better for patients transplanted more recently and without chronic GVHD or SCC. The majority of patients who survived beyond 2 years after transplantation had normal lives and full donor chimerism. Further efforts are needed to reduce the burden of late complications related to the disease or to the transplant procedure. Prevention or early detection of SCC may yield further improvement in survival in the future. Keywords: Fanconi anemia. Late complications. Graft versus Host Disease. Cancer. Long term follow up.