Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont les principales causes de mortalité et de morbidité à travers le monde. En Amérique du Nord, on estime à 90 millions le nombre d’individus ayant une ou plusieurs MCV, à près de 1 million le nombre de décès reliés par année et à 525 milliards de dollars les coûts directs et indirects en 2010. En collaboration avec l’équipe du Dre. Boileau, notre laboratoire a récemment identifié, le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie familiale. Une étude publiée dans le New Engl J Med a révélé que l’absence de la convertase PCSK9 réduit de 88% le risque de MCV, corrélé à une forte réduction du taux de cholestérol plasmatique (LDL-C). Il fut démontré que PCSK9 lie directement le récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLR) et, par un mécanisme méconnu, favorise sa dégradation dans les endosomes/lysosomes provoquant ainsi une accumulation des particules LDL-C dans le plasma. Dans cet ouvrage, nous nous sommes intéressés à trois aspects bien distincts : [1] Quels sont les cibles de PCSK9 ? [2] Quelle voie du trafic cellulaire est impliquée dans la dégradation du LDLR par PCSK9 ? [3] Comment peut-on inhiber la fonction de PCSK9 ? [1] Nous avons démontré que PCSK9 induit la dégradation du LDLR de même que les récepteurs ApoER2 et VLDLR. Ces deux membres de la famille du LDLR (fortes homologies) sont impliqués notamment dans le métabolisme des lipides et de la mise en place de structures neuronales. De plus, nous avons remarqué que la présence de ces récepteurs favorise l’attachement cellulaire de PCSK9 et ce, indépendamment de la présence du LDLR. Cette étude a ouvert pour la première fois le spectre d’action de PCSK9 sur d’autres protéines membranaires. [2] PCSK9 étant une protéine de la voie sécrétoire, nous avons ensuite évalué l’apport des différentes voies du trafic cellulaire, soit extra- ou intracellulaire, impliquées dans la dégradation du LDLR. À l’aide de milieux conditionnées dérivés d’hépatocytes primaires, nous avons d’abord démontré que le niveau extracellulaire de PCSK9 endogène n’a pas une grande influence sur la dégradation intracellulaire du LDLR, lorsqu’incubés sur des hépatocytes provenant de souris déficientes en PCSK9 (Pcsk9-/-). Par analyses de tri cellulaire (FACS), nous avons ensuite remarqué que la surexpression de PCSK9 diminue localement les niveaux de LDLR avec peu d’effet sur les cellules voisines. Lorsque nous avons bloqué l’endocytose du LDLR dans les cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques pour l’étude endogène de PCSK9), nous n’avons dénoté aucun changement des niveaux protéiques du récepteur. Par contre, nous avons pu démontrer que PCSK9 favorise la dégradation du LDLR par l’intermédiaire d’une voie intracellulaire. En effet l’interruption du trafic vésiculaire entre le réseau trans-Golgien (RTG) et les endosomes (interférence à l’ARN contre les chaînes légères de clathrine ; siCLCs) prévient la dégradation du LDLR de manière PCSK9-dépendante. [3] Par immunobuvardage d’affinité, nous avons identifié que la protéine Annexine A2 (AnxA2) interagit spécifiquement avec le domaine C-terminal de PCSK9, important pour son action sur le LDLR. Plus spécifiquement, nous avons cartographié le domaine R1 (acides aminés 34 à 108) comme étant responsable de l’interaction PCSK9AnxA2 qui, jusqu’à présent, n’avait aucune fonction propre. Finalement, nous avons démontré que l’ajout d’AnxA2 prévient la dégradation du LDLR induite par PCSK9. En somme, nos travaux ont pu identifier que d’autres membres de la famille du LDLR, soit ApoER2 et VLDLR, sont sensibles à la présence de PCSK9. De plus, nous avons mis en évidence que l’intégrité du trafic intracellulaire est critique à l’action de PCSK9 sur le LDLR et ce, de manière endogène. Finalement, nous avons identifié l’Annexine A2 comme unique inhibiteur naturel pouvant interférer avec la dégradation du LDLR par PCSK9. Il est indéniable que PCSK9 soit une cible de premier choix pour contrer l’hypercholestérolémie afin de prévenir le développement de MCV. Cet ouvrage apporte donc des apports considérables dans notre compréhension des voies cellulaires impliquées, des cibles affectées et ouvre directement la porte à une approche thérapeutique à fort potentiel. / Cardiovascular disease (CVD) is the primary cause of death and morbidity worldwide, claiming about 900 000 lives yearly in North America alone. A high level of circulating LDL-cholesterol is a major risk factor positively correlated with premature development of complex CVD mainly due to a rapid buildup of lipid deposition in the arteries. In collaboration with Dre Boileau, we recently discovered that the convertase PCSK9 is the third locus of familial hypercholesterolemia. A study published in the New Eng J Med revealed that the absence of PCSK9 reduces the risk of CVD by ~88%, resulting from a strong reduction of cholesterol in the bloodstream (LDL-C). It has been shown that PCSK9 directly binds the low-density lipoprotein receptor (LDLR) and by an unknown mechanism, reroutes it towards degradation in late endosomes/lysosomes, resulting in the accumulation of LDL-C particles in plasma. In this thesis, we addressed three different aspects of PCSK9 biology: [1] What are the targets of PCSK9? [2] Which cellular trafficking components are involved in PCSK9-induced LDLR degradation? [3] How can we inhibit the function of PCSK9? [1] We first demonstrated that PCSK9 induces the degradation of the LDLR and two of its closest family members. These include the very-low-density-lipoprotein receptor (VLDLR) and apolipoprotein E receptor 2 (ApoER2) implicated in neuronal development and lipid metabolism. In addition, we demonstrated that these receptors enhance the cellular association of PCSK9 independently of the presence of the LDLR. This study represents the first evidence that PCSK9 could target other proteins for degradation, reinforcing its role as a key regulator of some members of the LDLR family. [2] Since PCSK9 is a secreted protein, we decided to investigate the contributions of both the intra- and extracellular trafficking pathways in LDLR degradation. Using conditioned media derived from mice primary hepatocytes, we showed that endogenously secreted PCSK9 was not able to influence LDLR levels of PCSK9-deficient primary hepatocytes (Pcsk9-/-). By flow cytometry (FACS), we observed that overexpression of the gain-of-function PCSK9-D374Y, but not wild type PCSK9, decreases cell surface LDLR on adjacent cells suggesting that its spectrum of action is local. We also noticed that blockade of endocytosis in HepG2 cells (commonly used to study endogenous LDLR degradation by PCSK9) does not affect total LDLR protein levels. In contrast, disruption of the intracellular trafficking between the trans-Golgi network (TGN) and endosomes (siRNAs against clathrin light chains; CLCs) prevented LDLR degradation in a PCSK9-specific manner. [3] By Far Western blotting, we identified that Annexin A2 (AnxA2) specifically interacts with the C-terminal domain of PCSK9, which is crucial for its function in LDLR degradation. Moreover, we determined that the R1 domain (amino acids 34 to 108) is responsible for the PCSK9AnxA2 interaction, which confers a new function for this protein. Finally, we showed that addition of AnxA2 prevents PCSK9-induced LDLR degradation. In summary, this work allowed us to identify that PCSK9 induces the degradation of the LDLR and its closest family members, ApoER2 and VLDLR. We also highlighted that the integrity of the intracellular trafficking pathway is crucial for endogenous PCSK9-induced LDLR degradation. Furthermore, we discovered that AnxA2 is a unique, natural inhibitor capable of interfering with the action of PCSK9 in LDLR degradation. It is undeniable that PCSK9 is a genetically validated target to reduce circulating LDL-cholesterol and prevent CVD. This thesis brings forth important contributions in our understanding of the cellular pathways involved and opens the door for novel therapeutic approaches.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’excès des particules de LDL dans le sang constitue un facteur de risque majeur dans le développement des maladies cardiovasculaires. Dans ce contexte, nous étudions la protéine PCSK9 qui favorise directement ce facteur de risque. Cette protéine est sécrétée en majorité au niveau du foie par les hépatocytes et possède la capacité de reconnaître et de lier le récepteur LDLR. Le rôle premier de ce dernier est d’éliminer les particules de LDL circulant dans le plasma. Ainsi, lorsque la PCSK9 forme un complexe avec le LDLR et l’amène à la dégradation, la conséquence directe de la diminution des ces récepteurs est une accumulation malsaine des particules LDL dans le plasma. L’importante implication de la PCSK9 dans le métabolisme des lipides nous a menés vers des recherches de caractérisation de cette protéine ainsi que dans l’étude de son mode d’action. La PCSK9 est composée de trois domaines et notre intérêt s’est porté sur l’étude structure-fonction des deux domaines dont la fonction était inconnue, soit le domaine en N-terminal : le prodomaine et de son domaine en C-terminal : CHRD. Le premier article présenté dans cette thèse révèle l’importance d’une région acide (acide aminés 33-58) régulatrice de l’activité de la PCSK9 localisée en N-terminal du prodomaine ainsi que l’effet du pH acide, équivalent à celui des endosomes tardifs, qui accroît la capacité de la PCSK9 à induire la dégradation du LDLR. Le deuxième article dissèque davantage la structure de la PCSK9 et met en lumière la différence des prérequis structurels de la région ‘’Hinge’’ ainsi que du module M2, composant du domaine CHRD, dans la voie intracellulaire et la voie extracellulaire d’activité de la PCSK9. La mutation R434W localisée dans la région ‘’Hinge’’ résulte dans une inhibition totale de l’activité intracellulaire de la PCSK9 tandis que son activité extracellulaire est réduite à ~70%. Contrairement, la perte du module M2 du domaine CHRD est bien tolérée par la PCSK9 lors de son activité intracellulaire mais totalement inhibitrice pour son activité extracellulaire. Le troisième article se distingue en présentant une nouvelle stratégie d’inhibition de l’activité de la PCSK9 en utilisant une chimère composée de la fraction Fc de l’immunoglobuline IgG1 humaine couplée avec le prodomaine de la PCSK9. La protéine fusion Fcpro lie directement la PCSK9, crée un encombrement structurel qui résulte dans une régulation négative l’activité de la PCSK9. En résumé, nous présentons dans cette thèse, trois manuscrits qui apportent une contribution à la connaissance des composantes structurelles de la PCSK9 et leur implication dans le rôle de la protéine en tant que régulateur négatif du LDLR. / Hypercholesterolemia is one of the major risk factors leading to cardiovascular disease. In this context, we focused our study on a protein that directly influences hypercholesterolemia: PCSK9. Since 2003, the coding gene for PCSK9 has been identified as the third locus responsible for familial hypercholesterolemia (FH3). PCSK9 is a protein secreted mostly from the liver by hepatocytes and has the capacity to recognize, bind and direct to degradation the LDLR receptor. The latter is responsible for the elimination the LDL particles from the plasma. The direct consequence of the LDLR degradation induced by PCSK9 is the harmful accumulation of the bad cholesterol in the blood. Since PCSK9 activity has undesirable consequences on lipid metabolism homeostasis, we directed our research to characterize this protein to better understand its mechanism of action. Three domains compose PCSK9 structure and we focused on the ‘’structure-function study’’ of two domains, of which roles were still unknown: the prodomain located at the N-terminal extremity and the CHRD domain at the C-terminus of PCSK9. The first manuscript presented in this thesis brings to light the importance of the acidic N-terminal sequence of the prosegment (amino acids 33-58) and its effect on the activity of PCSK9. It also presents a novel mechanism for fine-tuning the activity of PCSK9, which is enhanced at acidic pHs close to those of late endosomes. The second manuscript dissects further the PCSK9 structure, revealing that the structural requirements of the hinge and the M2 module located in the CHRD domain are not the same for the intracellular and extracellular pathways of PCSK9-induced LDLR degradation. Although the R434W natural mutation in the hinge region is absolutely deleterious for the intracellular activity of PCSK9, it reduces by ~70% the extracellular one. In contrast, the loss of M2 module of the CHRD domain is tolerated for the intracellular activity of PCSK9 but not for the extracellular one. The third manuscript demonstrates for the first time that a chimera containing the prosegment (Fcpro) directly binds PCSK9 and effectively acts as a negative regulator (inhibitor) of its ability to induce LDLR degradation. Our work presents a new strategy to develop such inhibitors by interfering with the structure of PCSK9 and exploiting the properties of the PCSK9 prosegment and the advantage of its fusion to a humanized Fc of IgG1. In summary, the present research data sheds new light on the functional contribution of the prodomain and the CHRD domain of PCSK9.

Les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) du récepteur à l’Epidermal Growth Factor (EGFR) constituent un nouveau traitement du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC), particulièrement efficace chez les patients porteurs d’une mutation d’EGFR (EGFR M+). Néanmoins, certains de ces patients peuvent avoir une résistance primaire à ces traitements, et les autres développent inéluctablement une rechute correspondant au phénomène de résistance acquise. L’objectif de ce travail était d’étudier les mécanismes de résistances primaire et acquise chez les patients avec CBNPC EGFR M+.Nous avons montré que le statut mutationnel de KRAS était le même dans la tumeur primitive et les métastases dans la majorité des cas de CBNPC. Dans quelques cas cependant, le statut différait entre tumeur primitive et métastase, ce qui soulève la question d’une dissociation de la réponse aux ITK, les mutations de KRAS étant associées à une résistance primaire au traitement.Nous avons par ailleurs mis en évidence la fréquente inactivation de la voie p53, soit par mutation de TP53 soit par diminution d’expression de p14arf, dans les tumeurs EGFR M+, qui pourrait être une des causes des variations de réponse aux ITK chez les patients EGFR M+. Enfin, nous avons montré que la résistance à deux ITK de nouvelle génération, PF299804 et WZ4002, passait par un phénomène en deux étapes impliquant d’une part l’activation de la voie IGF1R, via la diminution de l’expression d’IGFBP3, et d’autre part celle de la voie des MAP kinases. Ces travaux pourraient déboucher sur des stratégies thérapeutiques innovantes chez les patients présentant une résistance acquise aux ITK de nouvelle génération. / Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) provide clinical efficacy in Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) patients, especially in the presence of an EGFR mutation. However, some EGFR mutated patients display primary resistance to EGFR TKI, and the others will ultimately develop acquired resistance. We focused our work on mechanisms of primary and acquired resistance in EGFR mutated NSCLC.We first showed that KRAS mutational status is the same in primary NSCLC and matched metastases in most of the cases. However, in some patients, we found a discordant KRAS status between primary tumors and metastases, which could translate into a discordant response to EGFR TKI, since KRAS mutations are associated with resistance to EGFR TKI.We also showed that EGFR mutated tumors are associated in most of the cases with an inactivation of the p53 pathway, either through a TP53 mutation or through loss of expression of p14arf, which could account for some of the variations observed in the response to TKI in EGFR mutated patients.Last, we showed that acquired resistance to two new generation EGFR TKI, PF299804 and WZ4002, occurred through a multistep process involving activation of the IGF1R pathway through downregulation of IGFBP3 and activation of the MAP kinase pathway. These results provide new insights into the treatment of NSCLC in EGFR mutated patients with acquired resistance to new generation TKI.

Les métastases hépatiques de tumeurs endocrines digestives sont hypervasculaires et hétérogènes. Les mécanismes de développement de ces métastases hépatiques, en particulier le rôle de l’angiogenèse tumorale associée à ces tumeurs, sont complexes. Ceci explique la difficulté de prédire le profil évolutif de ces tumeurs et de trouver des facteurs prédictifs de réponses aux traitements médicaux utilisés. L’objectif de notre travail a été de mieux comprendre : le rôle de l’angiogenèse dans le développement des métastases hépatiques de tumeurs endocrines digestives ; les mécanismes d’actions et en particulier leur activité anti-angiogénique, de deux types de molécules (analogue de la somatostatine et inhibiteur de mTOR). Nos résultats nous ont permis à travers une double approche expérimentale, in vitro et in vivo de : (a) montrer la complexité de la régulation de la synthèse et de la sécrétion du VEGF par les cellules endocrines néoplasiques ; (b) confirmer expérimentalement la dissociation entre expression du VEGF et capacités angiogéniques d’une part, propriétés invasives et métastatiques d’autre part, dans les tumeurs endocrines digestives ; (c) montrer expérimentalement que l’inhibition de l’angiogenèse peut contribuer à l’effet anti-tumoral de substances d’intérêt thérapeutique dans les tumeurs endocrines digestives / Liver metastases of digestive endocrine tumors are hypervascular and heterogeneous. The mechanisms of development of these metastases, especially the role of angiogenesis, are complex. This explains the difficulty to predict the natural history of these tumors and to find predictive factors of response to medical treatments. Our aim was to evaluate: the role of angiogenesis in the development of liver metastasis from digestive endocrine tumors; mechanisms of action, especially antiangiogenic activity, of two drugs (somatostatin analogues and mTOR inhibitor). We were able to demonstrate through an in vitro and in vivo experimental approach that: (a) the regulation of VEGF synthesis and secretion is complex, with different roles according to the cell studied; (b) there is a dissociation between VEGF expression and angiogenic capacities, on one hand, and invasive and metastatic properties, on the other hand; (c) the inhibition of angiogenesis may contribute to the anti-tumoral effect of several drugs of therapeutic interest in digestive endocrine tumors

Depuis le début des années 2000, la connaissance précise du kinome a entraîné l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant des protéines kinases impliquées dans de nombreuses pathologies en oncologie et dans les maladies du système nerveux central. Afin de cibler les kinases d’intérêts identifiées au sein de ces travaux, nous avons effectué, dans une démarche orientée vers la diversité moléculaire, la synthèse de nouveaux hétérocycliques a fort potentiel de valorisation. Nous nous sommes appuyé sur la création et la fonctionnalisation de bicycles à 5 ou 6chaînons de type [6-5] ou [5-5], ces espèces chimiques représentant la voie d’accès à des inhibiteurs compétitifs du substrat naturel des kinases, l’ATP. Nous avons dans un premier temps travaillé autour des imidazo[1,2-b]pyridazines puis des[1,2,4] triazolo[4,3-b]pyridazines, scaffold plus original, pour concevoir des inhibiteurs plus actifs et spécifiques de la kinase HASPIN, nouvelle cible prometteuse en oncologie.Nous avons ensuite poursuivi les études précédentes du laboratoire sur les imidazo[2,1-b][1,3,4]thiadiazoles. Nous basant sur une méthodologie de synthèse bien développée, nous avons créé une librairie de composés dirigés contre les kinases DYRK1A et CLK1 impliquées dans les processus de neuro dégénération, notamment dans la maladie d’Alzheimer. Ainsi, au travers d’analogues des imidazothiadiazoles originaux, nous avons proposé des méthodologies de synthèses de ces nouveaux hétérocycles permettant des pharmaco modulations aisées.Ces divers projets de chimie médicinale ont pu être entrepris de façon à améliorer les connaissances des relations structure-activité, et concevoir de nouveaux inhibiteurs puissants des kinases HASPIN, DYRK1A etCLK1. / Since the early 2000s, precise knowledge of kinome has induced the emergence of novel therapies targeting kinases involved in several kinds of pathologies in oncology and nervous central systems disorders.In order to target original kinases of interest identified in this work, we have developed diversity-oriented synthesis to create new high-valuable heterocycles. We have focused our efforts on the design and functionalization of [6-5] or [5-5] fused ring bicycles. Those chemical species representing a great pathway tocreate competitive inhibitors of ATP; the natural substrate of kinases.First-of-all, we have worked on imidazo[1,2-b]pyridazines and then on [1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazinesscaffolds, to create more active and selective HASPIN kinase inhibitors, a new hot-target in oncology.Then, we have pursued previous laboratory studies on imidazo[2,1-b][1,3,4]thiadiazoles. Based on a well-built methodology, we have synthesized severals DYRK1A and CLK1 kinases inhibitors involved in neurodegenerative disorders, as Alzheimer’s disease. Thus, through original imidazothiadiazoles analogues,we have proposed synthetic methodologies to design these novel heterocycles allowding esay pharmacomodulations.These medicinal chemistry projects have been undertaken to improved knowledge of structure-activityrelashionship, and providing novel strong inhibitors of HASPIN, DYRK1A or CLK1 kinases.

Chez les patients présentant un syndrome métabolique, le développement des comorbidités cardiaques et rénales associées au diabète de type 2 sont liées à des altérations au niveau vasculaire. Afin d’évaluer l’effet protecteur rénal et cardiaque de nouvelles molécules, le modèle de rat Zucker fatty/Spontaneously hypertensive heart failure F1 hybrid (ZSF1) semblait approprié. Cependant, son développement lent et les impacts rénaux et cardiaques modestes en limitaient son utilisation. Notre but fut d’exacerber ces altérations par deux méthodes. Nous avons d’abord effectué une néphrectomie unilatérale chez le rat ZSF1 et évalué l’évolution des fonctions cardiaque et rénale en fonction de l’âge. Seule une exacerbation de la dysfonction rénale a été mise en évidence. Néanmoins nous avons pu démontrer l’effet protecteur rénal de l’inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine lisinopril ainsi que d’un composé antioxydant, le bardoxolone. Notre seconde stratégie a consisté à infuser de l’angiotensine II (AngII) à des rats ZSF1. L’hypertension déjà existante dans ce modèle a été fortement accrue, et le niveau d’aldostérone circulante a été significativement augmenté. Dans ce contexte, les fonctions cardiaque et rénale ont été dégradées de manière importante. Enfin nous avons montré que dans ce modèle, un inhibiteur de l’aldostérone synthase induisait une meilleure protection rénale que l’antagoniste des récepteurs à l’aldostérone éplérénone. Nous avons donc mis en évidence que le rat ZSF1-AngII est un modèle de dysfonction cardio-rénale permettant d’évaluer l’effet protecteur de composés sur les fonctions rénale et cardiaque, dans un contexte de syndrome métabolique / In the context of metabolic syndrome, development of Type 2 Diabetes is associated with (and influenced by) cardiac and renal comorbidities linked to micro- and macro-vasculature alterations. To assess the efficacy of new compounds on targeted organs in the context of metabolic syndrome, the Zucker fatty/Spontaneously hypertensive heart failure F1 hybrid (ZSF1) rat model could be suitable assuming cardiorenal alterations would develop in a short timeframe. Actually, the ZSF1 rat model recapitulates features of human metabolic syndrome, but develops relatively late (1year-time) and moderate cardiac and renal dysfunctions. The aim of our work was to exacerbate cardiorenal impairments in terms of onset and extent. Two options were explored. On one hand, unilateral nephrectomy was performed in ZSF1 rats, and cardiac and renal functions were longitudinally assessed. This surgical insult only significantly deteriorated renal function, which was prevented by standard of care, lisinopril and new renal protective agent, bardoxolone. On the other hand, subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) was used in the aim to induce hemodynamic and hormonal stress and thus to enhance cardiorenal impairments. AngII-infused ZSF1 rats displayed significant hypertension and increased levels of circulating aldosterone. Moreover, renal and cardiac functions dropped, concomitantly. We showed in this model that an aldosterone synthase inhibitor induced overall better renal protection than the mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Our data showed that ZSF1-AngII rat is a suitable model to evaluate the cardio and renoprotective effects of drugs in the context of metabolic syndrome

Cette thèse s'inscrit dans le cadre du programme PentoRaf, dans la thématique « Transformation par voie chimique d'agromolécules en produits bioactifs ». Le travail de ce projet porte sur la synthèse de nouveaux azépanes tétrahydroxylés comportant un bras anomérique fonctionnel et sur l'évaluation des propriétés inhibitrices sur des glycosidases. La séquence réactionnelle a la particularité de valoriser les co produits issus du son et de la paille de blé.Dans une première partie, l'accès à un synthon polyfonctionnel, développé à partir des travaux précédents, a été réalisé avec des groupements protecteurs pivaloylés et méthoxyméthylés sur les hydroxyles communs aux sucres de départ (D-xylose et L-arabinose).La deuxième partie de ce travail consiste d'abord à introduire les différents groupements électroattracteurs : CO2Et, CN, PO(OEt)2, (CO2Et)PO(OEt)2 via une réaction de Wittig-Horner-Emmons. Les problèmes rencontrés lors de l'addition de l'allylamine ont clôturé les travaux sur la préparation d'azépanes avec un substituant phosphonate. Seuls les azépanes insaturés, comportant les fonctions : ester et nitrile, sont isolés.Une stratégie visant à obtenir les différentes distributions des hydroxyles (cis et trans) sur l'insaturation des azépanes obtenus est établie, dans une troisième partie, sur les composés fonctionnalisés avec un ester. Une réaction de déprotection finale donne ainsi accès à une famille de diastéréoisomères d'azépanes comportant un bras anomérique avec une fonction acide carboxylique, dont un composé a montré une activité biologique intéressante. Cette stratégie a été reproduite sur les azépanes comportant un nitrile jusqu'aux tétrahydroxyazépanes cis protégés. / This thesis is part of the PentoRaf program, in the theme “Chemical Transformation of agromolecules into bioactive products”. The aim of this project is the synthesis of new tetrahydroxylated azepanes containing a functional anomeric arm and the evaluation of their inhibitive properties on glycosidases. The reactive sequence advantageously values the co-products obtained from wheat bran and wheat straw.In the first part, the access to a polyfunctional synthon, developed from previous research, is carried out by protecting the common hydroxyl groups of the starting sugars (D-xylose and L-arabinose) with pivaloyl and methoxymethyl groups.The second part of this work is to introduce the various electroattracting groups: CO2Et, CN, PO(OEt)2, (CO2Et)PO(OEt)2 via a Wittig-Horner-Emmons reaction. The problems encountered during the addition of the allylamine ended our approach to prepare azepanes with a phosphonate substituent. Only the unsaturated azepanes containing ester and nitrile functions are isolated.A strategy is developed in the third part in order to achieve a specific distribution (cis and trans) of the hydroxyl groups on the unsaturation of the resulting azepanes by functionalizing these compounds with an ester. A final deprotection reaction leads to a family of azepane diastereoisomers containing an anomeric arm with a carboxylic acid function, among which one compound showed an interesting biological activity. This strategy was applied to azepanes containing a nitrile and lead to cis-protected tetrahydroxyazepanes.

Ce travail de thèse a pour objectif la simplification de la préparation d’un nouveau type d’inhibiteur d’entrée du VIH conçu, synthétisé et validé dans le cadre d’une collaboration entre l’équipe de Glycochimie Moléculaire et Macromoléculaire dont je dépends, l’Institut de Biologie Structurale de Grenoble et l’Institut Pasteur de Paris. Ce prototype est constitué d’un mime fonctionnel de CD4 lié de façon covalente à un fragment dodécasaccharidique d’Héparane Sulfate dont la synthèse est complexe. Nous avons donc proposé de préparer des oligomaltosides sulfatés afin de déterminer s’ils pouvaient se comporter comme des mimes d’Héparane Sulfate.Dans un premier temps, nous avons mis au point la synthèse, en huit étapes et 38 % de rendement global, d’un précurseur trisaccharidique oligomérisable à partir de maltotriose, un trisaccharide biosourcé commercial. Au cours de ce travail, nous avons résolu trois points particulièrement délicats : l’allylation de l’extrémité réductrice du maltotriose, l’installation d’un groupement paraméthoxybenzylidène en position O-4III et O-6III et la protection sélective des positions O-6I et O-6II par un groupement silylé. Les optimisations menées nous ont permis de limiter la formation de produits secondaires, d’augmenter le rendement de chaque étape et de pouvoir mener sans problème cette synthèse sur une échelle d’une dizaine de grammes. Dans un deuxième temps, le précurseur trisaccharidique a été transformé en différents accepteurs et donneurs de glycosyle dont les comportements dans différentes conditions de glycosylation ont été étudiés. Nous avons ainsi pu démontrer qu’une activation des donneurs sous forme de trichloroacetimidate conduisait à des rendements faibles de part la formation d’une quantité importante des produits de réarrangement en trichloroacétamides anomériques. Une activation sous forme de N-Phényltrifluroacétimidate a permis de résoudre ce problème, sans toutefois que les rendements en soient toujours augmentés. En effet, nous avons pu montrer que la nature du groupement protecteur en O-6I du donneur a une influence déterminante sur l’issue de la réaction de glycosylation, tant au niveau de sa stéréosélectivité que de son rendement. Un groupement encombré ou un ester en O-6I du donneur est ainsi indispensable pour avoir une bonne stéréosélectivité alpha. Le meilleur rendement obtenu est, pour le moment, de 56 %. Des optimisations en cours permettront d’augmenter le rendement et de préparer les oligomaltosides sulfatés visés dans un avenir proche afin de tester leur activité biologique. / This work aims at simplifying the preparation of a new type of HIV entry inhibitor, conceived, synthesized and validated within a collaboration between our group, the "Institut de Biologie Structurale" (Grenoble) and the Institut Pasteur (Paris). This prototype is composed of a CD4 functional mimetic linked to a dodecasaccharide fragment of Heparan Sulfate, whose synthesis is complex. In order to determine if Heparan Sulfate may be replaced by simpler sulfated oligosaccharides, we decided to prepare a set of sulfated oligomaltosides.To this goal, we first optimized the synthesis of an oligomerizable maltotrioside building block in eight steps and 38% global yield from maltotriose, a commercial and biosourced trisaccharide. In this work, we had to address three major points: the allylation of the reducing end of maltotriose, the introduction of a paramethoxybenzylidene group between positions O-4III and O-6III and the selective protection of the remaining primary positions O-6I and O-6II by a silylated protecting group. Each step has been optimized to minimize the amount of secondary products and thus to enhance its yield. The resulting synthesis was thus shown to be highly reproducible up to ten grams scale.Then, glycoside acceptors and donors were prepared from the oligomerizable maltotrioside building block and we studied their behaviors in glycosylation reactions. We found that trichloroacetimidate activation led to poor glycosylation yields, due to the competitive formation of trichloroacetamidyl glycoside rearrangement product. Gratifyingly, N-phenyltrifluroacetimidate activation solved the rearrangement problem, but yields sometimes remained low. Indeed, we were able to demonstrate that the nature of the protecting group in position O-6I of the donor strongly influenced both the stereoselectivities and yields of the glycosylations: a bulky or ester group is needed in this position to obtain a full alpha stereoselecticity. To date, the highest yield obtained is 56 %.Ongoing optimizations will allow us to enhance the yields and to prepare the targeted sulfated oligomaltosides in a near future in order to test their biological activity.

Le lymphocyte B (LB) joue un rôle important dans la polyarthrite rhumatoïde (PR), en produisant des auto-anticorps qui ont un rôle pathogène, en activant les lymphocytes T, en sécrétant des cytokines pro-inflammatoires et en permettant la formation de centres germinatifs. Plus récemment, il a été montré que le LB pouvait également produire de l'interleukine (IL) 10, une cytokine anti-inflammatoire qui lui procure des fonctions régulatrices. Ces B régulateurs ont notamment la capacité de différencier les lymphocytes T en T régulateurs. De nombreux traitements sont actuellement disponibles dans la PR, notamment les anti-TNF alpha et les inhibiteurs du récepteur de l'IL-6 (tocilizumab). Dans la première partie de cette thèse, nous avons comparé les LB circulants de patients atteints de PR et de contrôles. Nous avons étudié l'influence de l'activité de la maladie et des traitements sur les LB. Nous avons montré qu'il existait une lymphopénie B globale chez les patients atteints de PR avec une répartition des différents sous-types de LB superposable à celle des contrôles. Les patients ayant une maladie active avaient significativement plus de LB mémoires totaux, pré- et post-switch, CD24hiCD27+ et double négatifs que les patients ayant une maladie peu active. Les traitements anti-TNF et le tocilizumab ne modifiaient pas la répartition des sous-types de LB. Nous avons également montré qu'un taux de plus de 26% de LB mémoires CD27+ avant l'instauration d'un traitement par anti-TNF était associé à la réponse clinique à 3 mois. Les LB mémoires semblent produire plus de TNF que les LB naïfs et par ce biais pourraient induire une réponse Th1. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons tout d'abord cherché à mieux définir les LB régulateurs. Nous avons ensuite étudié leur présence et leur rôle dans la PR. Chez les sujets sains, les LB CD24hiCD27+ et CD24hiCD38hi semblent produire plus d'IL-10 que les autres LB, qui peuvent néanmoins en sécréter. Il semble donc plus adapter de définir les B régulateurs comme B producteurs d'IL-10 ou B10. Les patients atteints de PR avaient significativement moins de B10 que les contrôles en pourcentage et en valeur absolue. Chez les patients ayant un facteur rhumatoïde (FR) positif, il y avait une corrélation inverse entre le pourcentage de B10 et le taux de FR. Il y avait une corrélation inverse entre l'activité de la maladie (DAS28) et le pourcentage de B10, qui était particulièrement marquée pour les PR évoluant depuis moins de 5 ans. Chez ces patients, il y avait également une corrélation inverse entre les B10 et l'inflammation biologique (protéine C réactive). L'instauration d'anti-TNF ou de tocilizumab ne modifiait pas le taux de B10. Les CD24hiCD27+ et CD24hiCD38hi induisaient plus de lymphocytes T régulateurs chez les contrôles que les autres LB (CD24lo/-) alors que ça n'était plus le cas chez les patients atteints de PR, montrant que ces sous-types ont perdu cette fonction régulatrice dans la PR. En conclusion, bien qu'il existe une lymphopénie B, la répartition des sous-types de LB ne semble pas différente entre les patients atteints de PR et les contrôles. Néanmoins, il existe des anomalies fonctionnelles avec notamment une perte de la capacité à produire de l'IL-10 et à induire des T régulateurs chez les patients atteints de PR. / B cells play an important role in rheumatoid arthritis (RA), producing autoantibodies which have a pathogenic role, activating T cells, secreting pro-inflammatory cytokines and allowing the formation of germinal centers. More recently, it was shown that the B cells could also produce interleukin (IL)-10, an anti-inflammatory cytokine which provides their regulatory functions. Those regulatory B cells have the ability to differentiate T cell into regulatory T cells. Many treatments are currently available in RA, including TNF-alpha inhibitors and IL-6 receptor inhibitor (tocilizumab). In the first part, we compared circulating B cells in RA patients and in controls, and we studied the influence of disease activity and treatment on B cells. We have shown that there is a global B cell lymphopenia in RA patients with a similar B cell subtype distribution as controls. Patients with active disease had significantly more pre- and post-switch, CD24hiCD27+ and double negative memory B cells than patients with low disease activity. Anti -TNF treatment and tocilizumab did not change the distribution of B cell subsets. We also showed than patient with more than 26% of CD27+ memory B cells prior TNF inhibitor initiation was associated with clinical response at 3 months. Memory B cells produced more TNF alpha than naive B cells and can potentially induce a Th1 response. B cell subtypes were not associated with response to tocilizumab. In the second part, we first sought to better define regulatory B cells. We then studied their presence and role in RA. In healthy subjects, CD24hiCD27+ and CD24hiCD38hi B cells seem to produce more IL-10 than the other B cells that can nevertheless rarely produce some. It seemed more acurate to define regulatory B cells as IL-10 producing B cells also called B10 cells. Patients with RA had significantly less B10 cells than controls in percentage and absolute values. In rheumatoid factor (RF) positive patients, there was an inverse correlation between the percentage of B10 and the rate of RF. There was an inverse correlation between disease activity (DAS28) and the percentage of B10, which was particularly significant for patients with a disease duration of less than 5 years. In these patients, there was also an inverse correlation between B10 and biological inflammation (C-Reactive Protein). TNF inhibitors or tocilizumab did not change B10 cell rate. The CD24hiCD27 + and CD24hiCD38hi induce more regulatory T cells in controls than other LB (CD24lo/-) while it was not the case in patients with RA, indicating that these subtypes have lost this regulatory function in RA. In conclusion, although there are B cell lymphopenia, the distribution of B cell subsets does not seem to differ between RA patients and controls. Nevertheless, there are functional abnormalities including a loss of the ability to produce IL -10 and induce regulatory T in patients with RA.