Orientador: Jörg Kobarg / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T00:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_EduardoCruz_M.pdf: 2623796 bytes, checksum: 858f8566bae7879895e451ce06ad3bfb (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Cinases desempenham um papel importante na ativação de vias bioquímicas em células eucarióticas. Neks (NIMA related kinases) são uma família conservada de proteínas cinases relacionadas à progressão do ciclo celular e divisão celular, contendo em torno de 40% de identidade no domínio catalítico N-terminal com a proteína NIMA (Never in Mitosis, gene A) de Aspergillus nidulans. As cinases Neks são também descritas como relacionadas a patologias, particularmente câncer. Por estas características, as Neks são alvos potenciais para o tratamento de cânceres e desenvolvimento de drogas anti-câncer. Neste trabalho foram selecionados compostos em uma biblioteca de 87 compostos para os domínios de cinase mutados de hNek1, hNek2, hNek6, hNek8 e hNek9 e o domínio de cinase selvagem de hNek7, através de um ensaio de deslocamento térmico. Neste ensaio, foi identificado pelo menos um composto com um deslocamento da Tm significativo para a hNek1 ('delta'262-1258)-(T162A), E08 ('delta'Tm = 4.0ºC); outro, E04 ('delta'Tm = 6.5ºC) para a hNek6(S206A), e vários compostos para a hNek7wt e hNek2(_272-445)-(T175A). Destes compostos, B03 e F04 foram validados por docking no sítio de ligação de ATP da hNek7wt, enquanto B08 e E03 foram validados por reduzir a atividade da hNek7wt até 26,4% e 43,3%, respectivamente, na concentração de 312,5 nM. Além disso, o composto E04 foi capaz de reduzir a atividade da hNek6(S206A) pela metade com um IC50 próximo de 1,25 ?M. São necessários experimentos funcionais adicionais para validação desses dados, e estudos estruturais com resolução atômica serão importantes para caracterizar a associação de hNek1('delta'262-1258)-(T162A), hNek6(S206A) e hNek7 selvagem com esses e outros compostos / Abstract: Kinases play an important role in the activation of biochemical pathways in eukaryotic cells. Neks (NIMA related kinases) are a conserved kinase protein family related to cell cycle progression and cell division, containing about 40% identity in the N-terminal catalytic domain with the protein NIMA (Never in Mitosis, gene A) of Aspergillus nidulans. Nek kinases are also described as related to pathologies, particularly cancer. For these characteristics, Neks are potential targets for treatment of cancers and development of anti-cancer drugs. Here we screened the recombinant activation loop mutant kinase domains of hNek1, hNek2, hNek6, hNek8 and hNek9 and wild-type hNek7 against 87 compounds using thermal shift denaturation and identified at least one compound with significant Tm shift for hNek1('delta'262-1258)-(T162A), E08 ('delta'Tm = 4.0ºC), another one, E04 ('delta'Tm = 6.5ºC) for hNek6(S206A), but not for the other hNek6 variants, and several hit compounds for hNek7wt and hNek2('delta'272-445)-(T175A). From these, compounds B03 and F04 were validated by docking into the ATP-binding site of hNek7wt, while B08 and E03 were validated by reducing hNek7wt activity up to 26.4% and 43.3%, respectively, at a 312.5 nM concentration. We also found that mutant hNek6, without the activation loop conserved phosphorylation, is a better target for inhibitor stabilization than an activated more phosphorylated hNek6 kinase. Moreover, compound E04 was later confirmed to reduce hNek6(S206A) activity by half with IC50 near to 1.25 ?M. Further functional experiments in living cells are required to validate this findings, and structural studies with atomic resolution will be important to characterize the association of hNek1('delta'262-1258)-(T162A), hNek6(S206A) and wild-type hNek7 with these and other compounds / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2972_1.pdf: 1280234 bytes, checksum: 8c3bb88a2475f18d3fb212903634e177 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho, estudou-se a interação dos efeitos cerebrais da cafeína e da desnutrição. Ratas Wistar foram desnutridas no aleitamento pela dieta básica regional (DBR, com 8% de proteínas de origem predominantemente vegetal). Seus filhotes receberam, aos 70-75 dias de idade, 30 mg/kg de cafeína ou solução salina, por via intraperitoneal. Parte desses animais foi testada no modelo comportamental conhecido como inibição latente (IL). A outra parte foi submetida ao estudo do fenômeno da depressão alastrante da atividade elétrica cerebral (DAC). A cafeína bloqueou a IL, tanto no grupo DBR8 quanto em um grupo controle, bem-nutrido. Num terceiro grupo, desnutrido pela DBR22, suplementada na quantidade (22%), mas não na qualidade das proteínas (suplementação à custa dos alimentos da DBR), o efeito da cafeína sobre a IL desapareceu. Como, na IL, os animais precisam ser injetados com cloreto de lítio (LiCl), estudou-se também os efeitos do LiCl sobre a DAC. A cafeína não alterou, enquanto o LiCl reduziu a propagação da DAC no grupo DBR8, mas não nos grupos nutrido e DBR22. Nossos resultados demonstram efeitos antagônicos da cafeína sobre a IL e do LiCl sobre a DAC, os quais dependem do estado nutricional durante o desenvolvimento cerebral, sugerindo interação droga-nutrição. Sugere-se também o envolvimento da cafeína na modulação de receptores subcorticais, envolvidos com a atenção seletiva no núcleo acumbens, mas sem ação expressiva no neocortex, onde a DAC foi avaliada

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-05T12:40:14Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Elizabeth definitiva 2013.pdf: 2088443 bytes, checksum: e5072e4e506e5dbf48fdac9e6edd81fc (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T12:40:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Elizabeth definitiva 2013.pdf: 2088443 bytes, checksum: e5072e4e506e5dbf48fdac9e6edd81fc (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE (Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco) / Muitos agentes terapêuticos essenciais no tratamento de diversas doenças atuam através da sua capacidade de interagir com o DNA. Esta interação pode muitas vezes levar à uma alteração nas propriedades estruturais e funcionais do DNA, o que influencia sobre suas funções fisiológicas e causa apoptose celular. Compostos com uma estrutura aromática policíclica, tais como acridina e seus derivados são conhecidos por interagir com o DNA e apresentar aplicações clínicas importantes, especialmente como antitumoral. Além de, atuarem através da inibição da atividade da enzima topoisomerase, bloqueando processos de replicação e transcrição do DNA, o que causa destruição das células. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo a síntese e caracterização de derivados tiazacridínicos e imidazacridínicos para estudo da ligação ao DNA e da inibição da topoisomerase I. Todos os compostos tiveram suas estruturas elucidadas e comprovadas por RMN1H, RMN13C, IV e LC-MS. A análise da ligação ao DNA foi realiza através da espectroscopia de absorção, fluorescência e dicroísmo circular e o estudo da topoisomerase por eletroforese em gel de agarose. Os espectros de Uv-vis, fluorescência e de dicroísmo circular mostraram que os derivados interagem com o DNA tanto por ligação externa quanto por intercalação, apresentando constantes de ligação entre 1.46 – 6.01 x 104 M-1. O ensaio com a topoisomerase I evidenciou que em concentrações a partir de 200 μM, estes compostos apresentam a capacidade de inibir a enzima topoisomerase I humana. Tais resultados permitiram evidenciar um mecanismo de ligação ao DNA com as tiazacridinas e imidazacridinas, refletindo o que é visto na literatura e revelando que, estes derivados, são promissores no desenvolvimento de novos agentes análogos de acridina com potenciais sítios de ligação ao DNA.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-09Bitstream added on 2014-06-13T19:53:58Z : No. of bitstreams: 1 rubio_ml_me_sjrp.pdf: 553575 bytes, checksum: e63be6b1c41d36a603fd12ca20a88442 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Paramyxoviridae, é um vírus envelopado com tamanho médio de 120 a 300nm, de simetria helicoidal, que apresenta um genoma de RNA fita simples não segmentado de polaridade negativa. Este genoma codifica 11 proteínas, dentre as quais as glicoproteínas de membrana que são responsáveis pela infectividade do vírus. A proteína F, em associação com a proteína G e SH, é responsável pela fusão da membrana viral à célula que será infectada, ou seja, esta proteína proporciona a entrada e instalação do vírus na célula. Conhecer a forma de interação das proteínas da membrana viral com a célula que será infectada é importante para propor um mecanismo de inibição deste processo de infecção viral. Existem evidências que os glicosaminoglicanos são potenciais inibidores da infecção causada por vários vírus. A hipótese é de que este processo de inibição ocorra devido à ligação dos glicosaminoglicanos às proteínas da membrana viral, mais especificamente na proteína G, que apresenta um domínio de ligação para heparina, impedindo desta forma, que o vírus se ligue na célula hospedeira e que inicie o processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi verificar a atuação de glicosaminoglicanos como potenciais inibidores da infecção viral. Esta análise foi realizada por meio de experimento de cultivo de células Hep2 na presença dos glicosaminoglicanos heparina e dextrana sulfatada que foram inoculadas com o vírus sincicial respiratório do tipo A (RSVA) e analisados por meio das técnicas de PCR e Imunofluorescência Indireta. Os resultados mostraram que a heparina e a dextrana sulfatada apresentam efeito inibitório da infecção viral em cultivo de células Hep2. / The respiratory sincicial virus (RSV) is part of Pneumovirus genus of the Paramyxoviridae family, is an enveloped virus with average size of 120 to 300nm, helical symmetry, that presents a genome consisting of a single strand, no segmented, RNA negative. This genome codifies for 11 proteins including the membrane glycoproteins which are responsible for the infectivity of the virus. Protein F in association with protein G and SH is responsible for the fusion of the viral membrane with the cell that will be infected, that is, this protein provides the entrance and the virus to settle in the cell. To know the form of interaction of viral membrane proteins with the cell that will be infected is important to propose a mechanism to inhibit of this process of viral infection. Evidences exist that the glycosaminoglycans are potential inhibitors of the infection caused by some viruses. The hypothesis is that this process of inhibition occurs more specifically due to the interation between glycosaminoglycans and the proteins of the viral membrane, more specifically in protein G, that presents a domain of linking for heparin, avoiding the virus to bind to the host cell and initiating the infection process. The aim of this work was to verify the performance of glycosaminoglycans as inhibitors of the viral infection. This analysis was accomplished through experiments of Hep2 cell culture in the presence of these glycosaminoglycans (heparin and dextran sulfate) that was inoculated with the respiratory sincicial virus type A (RSVA) and analyzed through the technique of PCR and Indirect Imunofluorecence. The results had shown that the heparin and the dextran sulfate presented an inhibitory effect of the viral infection in Hep2 cells culture.

Introdução:As adaptações neurais ao treinamento físico vêm sendo amplamente estudadas e a medula espinhal é um dos locais de possível adaptação. No entanto nenhuma avaliação longitudinal havia sido feita diretamente sobre as circuitarias inibitórias medulares. Até o presente momento as alterações eram somente suposições. O presente trabalho verificou as circuitarias medulares responsáveis pela inibição recíproca (IR) e inibição pré-sináptica (IPS) em sujeitos submetidos a diferentes treinamentos. Materiais e Métodos: Para o treino aeróbico (resistência) foram avaliados 25 soldados submetidos ao treinamento militar do Exército Militar Brasileiro. Foram feitas 3 avaliações uma pré-treino e outras duas com 3 e 9 meses após o inicio das atividades no ano de 2006. Outros 29 sujeitos foram divididos em 3 grupos: controle (permaneceram 8 semanas sem atividades de reinamento), grupo de treino de força máxima e treino de potência. Eles foram submetidos a 8 semanas de treino, realizado com séries de agachamento livre com peso. Para avaliação das circuitarias medulares foi utilizado o reflexo H do sóleus condicionado com estímulos no nervo fibular comum (NFC) - que inerva o músculo tibial anterior (TA). O intervalo entre o estímulo condicionante e o estímulo teste determinou a avaliação da IR, da inibição D1 e da inibição D2 (IPS). Outras variáveis também foram calculadas como: contração voluntária máxima isométrica (CVM) do sóleus e TA e seus respectivos eletromiogramas (EMG), relação elétrica e mecânica entre Hmax/Mmax e condicionamento do EMG do sóleus por estímulos no NFC. Foram feitas análises pareadas com teste t-student para o grupo militar e ANOVA two-way para comparação dos grupos de força máxima e potência com o grupo controle. Principais Resultados: O grupo do exército apresentou aumento na força do sóleus e do TA, juntamente com aumento no RMS do EMG do sóleus e do torque gerado pela onda Mmax, sem alterações nos relações Hmax/Mmax. O treinamento militar reduziu significativamente a inibição D1 e mostrou tendências a aumento da IPS. O grupo de força máxima não mostrou aumento de força isométrica, no entanto apresentou aumento na relação elétrica Hmax/Mmax, com concomitante redução da IR e aumento da IPS. O grupo de potência mostrou ganho na força máxima isométrica somente do sóleus. A capacidade de gerar torque reflexamente também aumentou neste grupo, com aumento significativo na relação mecânica Hmax/Mmax. Esta melhora na utilização do arco reflexo também foi verificada com redução da IPS e aumento da IR neste grupo.Conclusões: Estes resultados mostraram que a medula espinal sofre plasticidade nas vias inibitórias IR, inibição D1 e D2, e que esta plasticidade é dependente do tipo de tarefa realizada. / Introduction: Neural adaptations with physical training have been widely studied. The spinal cord is a possible locus of adaptation. However, longitudinal studies that evaluate directly the spinal cord pathways have not been found in the literature. Therefore, all reports from the literature justify changes found in measured responses to exercise by hypotheses on spinal cord mechanisms. This study had the objective of measuring features of specific spinal cord pathways to check if they change according to the type of physical training. The pathways related to reciprocal inhibition (RI) and pre-synaptic inhibition (PSI) were investigated in subjects undergoing different trainings. Materials and Methods: For endurance training 25 soldiers were subjected to military training of the Brazilian Army. Evaluations were made three times, one previous to the beginning of the activity and twice post-training (within 3 and 9 months). Other 29 subjects were divided into: control group (with no training), maximal strength group and power group. They were subjected to 8 weeks of training with series of squat movements. The soleus H reflex conditioning with stimuli in the common peroneal nerve (CPN) was used to evaluate the spinal cord pathways. The interval between the conditioning and the test stimulus determine the assessment of RI, D1 inhibition and D2 inhibition (PSI). Other variables were also calculated: maximum voluntary isometric contraction from soleus and tibialis anterior and their electromyograms (EMG), electrical and mechanical Hmax/Mmax ratio and 3 inhibitions over the soleus EMG conditioned by stimuli to the CPN. The results were analyzed with paired t-student test for the military group and with two-way ANOVA to compare the maximal strength and power groups with the control group. Main Results: The military group had increased strength of the soleus and the TA muscles, with an increase in the RMS of the soleus EMG. This group also increased the torque generated by the Mmax-wave, without changes in Hmax/Mmax ratio. The military training significantly reduced D1 inhibition and showed tendencies to increase the PSI. The maximal strength group showed no differences in isometric strength, but had increased Hmax/Mmax ratio with concomitant reduction of RI and increased PSI. The power group increased isometric strength only for the soleus muscle. This group also improved the ability to generate torque by reflex pathways, with significant increase in the mechanical Hmax/Mmax ratio, with a reduction of PSI and increase of RI. Conclusions: These results show that spinal cord plasticity occurs in the inhibitory pathways of reciprocal inhibition, D1 inhibition and D2 inhibition (pre-synaptic inhibition), and that plasticity is dependent on the type of trained movement.

Introdução:As adaptações neurais ao treinamento físico vêm sendo amplamente estudadas e a medula espinhal é um dos locais de possível adaptação. No entanto nenhuma avaliação longitudinal havia sido feita diretamente sobre as circuitarias inibitórias medulares. Até o presente momento as alterações eram somente suposições. O presente trabalho verificou as circuitarias medulares responsáveis pela inibição recíproca (IR) e inibição pré-sináptica (IPS) em sujeitos submetidos a diferentes treinamentos. Materiais e Métodos: Para o treino aeróbico (resistência) foram avaliados 25 soldados submetidos ao treinamento militar do Exército Militar Brasileiro. Foram feitas 3 avaliações uma pré-treino e outras duas com 3 e 9 meses após o inicio das atividades no ano de 2006. Outros 29 sujeitos foram divididos em 3 grupos: controle (permaneceram 8 semanas sem atividades de reinamento), grupo de treino de força máxima e treino de potência. Eles foram submetidos a 8 semanas de treino, realizado com séries de agachamento livre com peso. Para avaliação das circuitarias medulares foi utilizado o reflexo H do sóleus condicionado com estímulos no nervo fibular comum (NFC) - que inerva o músculo tibial anterior (TA). O intervalo entre o estímulo condicionante e o estímulo teste determinou a avaliação da IR, da inibição D1 e da inibição D2 (IPS). Outras variáveis também foram calculadas como: contração voluntária máxima isométrica (CVM) do sóleus e TA e seus respectivos eletromiogramas (EMG), relação elétrica e mecânica entre Hmax/Mmax e condicionamento do EMG do sóleus por estímulos no NFC. Foram feitas análises pareadas com teste t-student para o grupo militar e ANOVA two-way para comparação dos grupos de força máxima e potência com o grupo controle. Principais Resultados: O grupo do exército apresentou aumento na força do sóleus e do TA, juntamente com aumento no RMS do EMG do sóleus e do torque gerado pela onda Mmax, sem alterações nos relações Hmax/Mmax. O treinamento militar reduziu significativamente a inibição D1 e mostrou tendências a aumento da IPS. O grupo de força máxima não mostrou aumento de força isométrica, no entanto apresentou aumento na relação elétrica Hmax/Mmax, com concomitante redução da IR e aumento da IPS. O grupo de potência mostrou ganho na força máxima isométrica somente do sóleus. A capacidade de gerar torque reflexamente também aumentou neste grupo, com aumento significativo na relação mecânica Hmax/Mmax. Esta melhora na utilização do arco reflexo também foi verificada com redução da IPS e aumento da IR neste grupo.Conclusões: Estes resultados mostraram que a medula espinal sofre plasticidade nas vias inibitórias IR, inibição D1 e D2, e que esta plasticidade é dependente do tipo de tarefa realizada. / Introduction: Neural adaptations with physical training have been widely studied. The spinal cord is a possible locus of adaptation. However, longitudinal studies that evaluate directly the spinal cord pathways have not been found in the literature. Therefore, all reports from the literature justify changes found in measured responses to exercise by hypotheses on spinal cord mechanisms. This study had the objective of measuring features of specific spinal cord pathways to check if they change according to the type of physical training. The pathways related to reciprocal inhibition (RI) and pre-synaptic inhibition (PSI) were investigated in subjects undergoing different trainings. Materials and Methods: For endurance training 25 soldiers were subjected to military training of the Brazilian Army. Evaluations were made three times, one previous to the beginning of the activity and twice post-training (within 3 and 9 months). Other 29 subjects were divided into: control group (with no training), maximal strength group and power group. They were subjected to 8 weeks of training with series of squat movements. The soleus H reflex conditioning with stimuli in the common peroneal nerve (CPN) was used to evaluate the spinal cord pathways. The interval between the conditioning and the test stimulus determine the assessment of RI, D1 inhibition and D2 inhibition (PSI). Other variables were also calculated: maximum voluntary isometric contraction from soleus and tibialis anterior and their electromyograms (EMG), electrical and mechanical Hmax/Mmax ratio and 3 inhibitions over the soleus EMG conditioned by stimuli to the CPN. The results were analyzed with paired t-student test for the military group and with two-way ANOVA to compare the maximal strength and power groups with the control group. Main Results: The military group had increased strength of the soleus and the TA muscles, with an increase in the RMS of the soleus EMG. This group also increased the torque generated by the Mmax-wave, without changes in Hmax/Mmax ratio. The military training significantly reduced D1 inhibition and showed tendencies to increase the PSI. The maximal strength group showed no differences in isometric strength, but had increased Hmax/Mmax ratio with concomitant reduction of RI and increased PSI. The power group increased isometric strength only for the soleus muscle. This group also improved the ability to generate torque by reflex pathways, with significant increase in the mechanical Hmax/Mmax ratio, with a reduction of PSI and increase of RI. Conclusions: These results show that spinal cord plasticity occurs in the inhibitory pathways of reciprocal inhibition, D1 inhibition and D2 inhibition (pre-synaptic inhibition), and that plasticity is dependent on the type of trained movement.

A descoberta de inibidores seletivos é extremamente importante para o desenvolvimento de novos fármacos que possam ser usados no tratamento de pacientes diagnosticados com a doença de Alzheimer (DA). Neste contexto, o desenvolvimento de métodos de triagem para a identificação de novos compostos biologicamente ativos se torna interessante. Butirilcolinesterase (BChE, EC 3.1.1.8) é uma serina hidroxilase que está classicamente associada à hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh) formando colina e ácido acético. Este trabalho descreve a imobilização covalente da BChE de soro humano nas paredes internas de capilares de sílica fundida utilizando o agente espaçador glutaraldeído, e sua aplicação na triagem de inibidores seletivos. O ICER-BChE resultante foi conectado a um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência com monitoramento on line da atividade catalítica, envolvendo detecção UV. Após os estudos das melhores condições cromatográficas, variações de pH e vazão e a influência de solventes orgânicos na atividade enzimática o método foi validado com o uso de inibidores padrões. O maior valor obtido com o ICER-BChE no parâmetro cinético, constante de Michaelis KM = 33,6 ± 6,9 mM, comparado com a enzima em solução, KM = 0,12 ± 0,02 mM, evidencia o efeito da imobilização sobre a afinidade pelo substrato. No entanto, houve retenção da atividade catalítica e seletividade frente a inibidores padrão. O método foi aplicado na triagem de novos ligantes utilizando cinco coleções de diferentes classes de compostos, entre derivados cumarínicos, complexos metálicos com cobre (Cu), complexos metálicos com cobalto (Co) e zinco (Zn), glicosídeos, e derivados de fenilpropanóides e ácido barbitúrico. Desta triagem foram selecionados sete compostos promissores com os quais foram realizados os estudos sobre a potência mínima inibitória (IC50) e destes quatro foram escolhidos para estudos de mecanismos de ação utilizando o ICER-BChE. Dos complexos metálicos os melhores compostos foram o HPTBCu (IC50 = 8,74 ± 1,5 µM, Ki = 9,6 ± 0,5 M), o NarBCu (IC50 = 8,0 ± 1,4 µM, Ki = 2,0 ± 0,1 M) ambos com mecanismo competitivo o HesFCu (IC50 = 13,6 ± 2,9 µM), o NNINABCu (IC50 = 94,8 ± 16) e o NarFCu (IC50 = 81,7 ± 13). Dos derivados cumarínicos os compostos 17 (IC50 =109 ± 21 µM, Ki = 108 ± 10 M) e 19 (IC50 =128 ± 28 µM, Ki =36.0 ± 5.0 M) apresentaram mecanismo incompetitivo. Os resultados demonstraram que a abordagem proposta é útil na triagem on line de inibidores seletivos, pois fornece resultados rápidos, precisos e reprodutíveis. / The discovery of selective inhibitors is extremely important for the development of drugs that can be used in the treatment of patients diagnosed with the Alzheimer disease (AD). In this context, the development of screening methods for the identification of new, biologically active compounds is a challenging task. Butyrylcholinesterase (BChE, EC 3.1.1.8) is a serine hydroxylase that is classically associated with the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh), which yields choline and acetic acid. This paper describes the development of capillary enzyme reactors (ICERs) containing BChE from the human serum, covalently immobilized onto silica fused capillaries, using glutaraldehyde as spacer, and its application in the screening of selective inhibitors. The resulting BChE-ICER was connected to a liquid chromatography system high efficiency where monitoring of activity was online involving UV detection. After studying the best chromatographic conditions, pH variations, flow-rate and the influence of organic solvents on enzyme activity method was validated using standard inhibitors. The higher value obtained with the BChE-ICER in kinetic parameter, constant Michaelis KM = 33.6 ± 6.9 mM, compared with the enzyme in solution, KM = 0.12 ± 0.02 mM, shows the effect of immobilized on the affinity substrate. However, there was retention of catalytic activity and selectivity towards standard inhibitors. The method was applied in the screening of new ligands using collections of five different compounds, among coumarin derivatives, metal complexes with copper (Cu) metal complexes with cobalt (Co) and zinc (Zn), glycosides, phenylpropanoids and derivatives, and barbituric acid. These screenings were selected seven promising compounds with which the studies were made on the minimum inhibitory potency (IC50) and these four were chosen for studies of mechanisms of action using the ICER-BChE. Of the compounds metal complexes best were HPTBCu (IC50 = 8,74 ± 1,5 µM, Ki = 9,6 ± 0,5 M), NarBCu (IC50 = 8,0 ± 1,4 µM, Ki = 2,0 ± 0,1 M) both competitive mechanism, the HesFCu (IC50 = 13.6 ± 2.9 µM), NNINABCu (IC50 = 94.8 ± 16 µM) and NarFCu (IC50 = 81.7 ± 13 µM). Of coumarin derivatives, 17 (IC50 =109 ± 21 µM, Ki = 108 ± 10 M) and 19 (IC50 =128 ± 28 µM, Ki =36.0 ± 5.0 M) showed mechanism uncompetitive. The results demonstrated that the proposed approach is useful in screening for selective inhibitors online because it provides quick results, accurate and reproducible.

Mesmo com o grande número de estudos relacionados à proteases do subtipo B e de como suas mutações podem interferir na estrutura, na resistência a inibidores e na eficiência catalítica da enzima, existe ainda uma lacuna de como as mudanças polimórficas de proteases de HIV de outros subtipos de HIV-1 interferem nesses fatores. Nesse contexto insere-se esse trabalho, que utilizou proteases de HIV-1 isoladas de pacientes brasileiros HIV-1 infectados com o subtipo F, e outros dois mutantes, sendo que um do subtipo F e outro do subtipo B para ensaios frente a seis inibidores comercialmente disponíveis: amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir e saquinavir. Nossos resultados experimentais revelam que os seis inibidores comerciais estudados são significantemente menos ativos para o subtipo F e para as mutantes quando comparados ao subtipo B. Além disso, os valores de vitalidade dessas proteases também são considerados maiores que os obtidos para a proteína selvagem do subtipo B. O acúmulo de mutações comumente detectadas e o polimorfismo natural tornam a protease selvagem do subtipo F cataliticamente suficiente para manter a viabilidade do vírus e garantir alto grau de resistência cruzada frente a todos os inibidores estudados. / Despite years of intense research around the world, HIV continues to represent considerable therapeutical challenge. In order to gain more insights into resistance of polymorphic mutations of existing HIV subtypes toward commercially available pharmaceutics, we studied inhibition of subtypes B and F HIV proteases (PRs) [native and two mutant enzymes clinically identified in Brazilian patients] by six commercial inhibitors (amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir and saquinavir). Our results show that all these inhibitors have significantly higher Ki values for the subtype F HIV PR (Fwt) and both mutant enzymes than that for the B subtype HIV PR (Bwt). Furthermore, the biochemical fitnesses of these proteases, or their vitalities, are also considerably higher than that of Bwt. The accumulation of commonly detected resistant mutations in HIV PRs with natural polymorphisms turns Fwt sufficiently catalytically active to guarantee the virus viability and confers it a large degree of cross resistance against all studied inhibitors.

Estudou-se a influência da concentração inicial de substrato no cultivo em fermentador para produção de biomassa de Candida utilis IZ-1840 em meio sintético tamponado contendo glicerol (1,2,3-propanotriol) como fonte exclusiva de carbono nas seguintes concentrações: 15, 25, 35, 45, 55, 65 e 75 g/L com ensaios em duplicata. Observou-se um comportamento cinético característico de fenômeno de inibição por substrato, tendo-se então ajustada uma equação de modelo de inibição baseada na literatura para os dados de velocidade específica máxima de crescimento celular em função da concentração inicial de substrato. A partir de tal equação determinou-se o valor da concentração inicial de substrato onde não ocorre inibição, definido como S* ( S*=17,511 g/L) e o valor teórico acima do qual a inibição é máxima definido como Sm, (Sm=175,4 g/L). O valor teórico de velocidade específica máxima de crescimento celular, definido como µ* correspondente ao valor S* como concentração de substrato inicial foi calculada em 0,225 1/h. / The influence of initial substrate concentration in the growth of Candida utilis IZ-1840 in a buffered synthetic mediurn was studied utilizing glycerol (1,2,3-propanetriol) as an exc1usive carbon source, in the following concentrations: 15, 25, 35, 45, 55, 65 and 75 of in double assays. Characteristic kinetic behavior of substrate inhibition was detected, then one model equation of inhibition based on literature was adjusted for the maximum specific growth rate in function of the initial substrate concentration. From this equation it was possible to determine the value of the initial substrate concentration that do not occur growth inhibition, defined as S* (S* = 17,511 g/L).and the theoretical value of limit concentration where above this the growth inhibition becomes maximum which was defined as Sm (Sm = 175,4 g/L). The theoretical value for maximum specific growth rate, defmed as µ* corresponding to determined S* as initial substrate concentration was calculated in 0,225 1/h.

A resistência que apresentam as serpentes peçonhentas às suas próprias peçonhas, assim como a resistência observada em alguns animais está bem documentada, e é atribuída a fatores solúveis presentes no seu plasma, soro ou músculo. No caso das serpentes peçonhentas estes fatores as amparam de sofrer danos decorrentes da própria peçonha. No presente trabalho foi isolado do soro da serpente Bothrops alternatus um inibidor de metaloproteases, denominado BaltMPI, mediante cromatografia em DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL e cromatografia de fase reversa em C18, com uma recuperação proteica de 0,3%. A massa molecular determinada para o BaltMPI por SDS - PAGE foi de 60,5 kDa, e por espectrometria de massas MALDI/TOF de 42,4 kDa. Seu ponto isoelétrico, determinado por focalização isoelétrica, é 5,27. Portanto, o BaltMPI, é um SVMPIs com caráter ácido, pertencente aos SVMPIs de baixa massa molecular. Os primeiros 60 aminoácidos da região N-terminal do BaltMPI foram determinados mediante degradação de Edman, e apresentou alto grau de homologia com a sequência para a mesma região de outros SVMPIs isolados a partir do soro de serpentes peçonhentas. Outros segmentos da sequência também foram determinados após clivagem com tripsina e posterior análise por espectrometria de massas. Posteriormente realizou-se o alinhamento da sequência parcial determinada para o BaltMPI, com a sequência do BJ46a, um SVMPI proveniente da Bothrops jararaca, encontrando alta homologia entre elas. Tanto o soro da serpente, quanto o inibidor, BaltMPI, inibiram a atividade hemorrágica da Batroxase, uma SVMP da classe P-I, e a da BjussuMP-I, uma SVMP da classe P-III. Já, em relação à DHM da Batroxase, foi determinado que o BaltMPI tem uma DIHM de 5ug, e uma CE50% de 0,857ug. O BaltMPI também apresentou um efeito inibitório sobre a ação proteolítica da Batroxase, sobre os substratos: fibrinogênio, fibrina e azocaseína. Sobre a atividade fibrinogenolítica da serinoprotease BjSP, o BaltMPI não apresentou um efeito inibitório, corroborando assim com a especificidade descrita para inibir as SVMPs que possuem os SVMPIs. O BaltMPI inibiu a ação hemorrágica e proteolítica da Batroxase, ao formar um complexo mediante ligações não covalentes com esta SVMP. O inibidor BaltMPI, ao igualmente aos demais SVMPIs descritos, é estável em uma ampla faixa de pH (1 - 9), e a temperaturas elevadas, sendo que em temperaturas acima de 60°C foi observada uma diminuição na sua capacidade de inibir a atividade hemorrágica da Batroxase. A inibição da atividade hemorrágica da Batroxase, quando avaliado o potencial do BaltMPI como complemento à soroterapia, foi menor à inibição observada ao realizar os testes com incubação prévia entre o inibidor e a metaloprotease. No entanto, os resultados obtidos são promissores, reforçando o grande potencial que os SVMPIs possuem, tanto como ferramentas moleculares, como opção para o tratamento dos acidentes ofídicos, em especial o acidente botrópico, no qual as SVMPs tem papel fundamental na fisiopatologia observada, e que conduz à alta morbidade associada com este tipo de acidente. / Resistance exhibited by snakes to their own venom, as well as resistance observed in some animals has been well recorded, and has also attributed to soluble factors present in the plasma, serum or muscle. In the case of poisonous snakes, these factors protect them from damages caused by their own venom. An inhibitor, named as BaltMPI, was isolated from the snake´s serum of Bothrops alternates. This inhibitor was isolated through several chromatographic steps including DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL and C-18 reverse phase, with a protein yield of 0.3%. Molecular mass of 60.5 kDa for BaltMPI was determined by SDS - PAGE and 42.4 kDa by MALDI/TOF mass spectrometry. Its isoelectric point, determined by isoelectric focalization, was 5.27. According to the obtained data, it was established that BaltMPI is an SVMPIs of acid character, belonging to low molecular mass SVMPIs. The first 60 aminoacids from the N-terminal region were determined by Edman degradation. This parcial sequence showed high homology to the corresponding sequence of other SVMPIs isolated from poisonous snake´s serum. Other segments from the sequence were also determined after cleavage with tripsine and MS analyses. Consequently, alignment of the partial sequence of BaltMPI with the sequence of BJ46a, a SVMPI from Bothrops jararaca, was made finding high homology. Both, snake´s serum and BaltMPI, inhibited the hemorragic activity of Batroxase, a class P-I SVMP, and of BjussuMP-I, a class P-III SVMP. When compared to the Batroxase DHM, it was determined a DIHM of 5?g and a CE50% of 0.857?g. BaltMPI also exhibited an inhibitory activity against the proteolitic effect of Batroxase on fibrinogen, fibrin and azocasein as substrates. On the fibrinogenolitic activity of serineprotease BjSP, BaltMPI did not showed inhibitory effect, demonstrating its specificity for inhibiting SVMPs that SVMPIs possess. BaltMPI inhibits the hemorragic and proteolitic action of Batroxase by forming a complex through non covalent linkages with that SVMP. BaltMPI, as well as other reported SVMPIs, is stable in a very high range of pH (1-9), and at high temperatures, although above 60°C a decrease in its inhibition capacity to the hemorrhagic activity of Batroxase. Inhibition of the hemorrhagic activity of Batroxase, when BaltMPI potencial as serum-therapy complement was evaluated, was less than the inhibition observed when tests by previously incubating inhibitor and metalloprotease were made. However, the results obtained are encouraging, highlighting the potential that these kind of proteins, SVMPIs, have as molecular tools, optional treatments for ophidic accidents, specially bothropic accident, in which SVMPs have a fundamental role in the observed physiopathology, leading to a high associated morbidity to this kind of accidents.