As peroxirredoxinas (Prx) são enzimas antioxidantes que se destacam pela capacidade de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos com elevada eficiência (106-108M-1s-1), mantendo essas moléculas em níveis adequados à homeostase celular. Entretanto, já foi demonstrado que em diversos tipos tumorais os níveis de Prx são extremamente aumentados e experimentos envolvendo sua inativação resultam na diferenciação ou apoptose de células tumorais. Recentemente, foi descoberto um diterpenóide denominado adenantina que seria o primeiro inibidor para as Prx1 e Prx2 de humanos e foi demonstrada que sua aplicação em células de leucemia mieloide aguda promoveu diferenciação ou apoptose dessas células. Nesse contexto, o presente trabalho apresenta duas vertentes: 1) A caracterização das alterações estruturais e funcionais promovidas pela ligação da adenantina ao sítio ativo das Prx utilizando Tsa1 de Saccharomyces cerevisiae como modelo biológico, em função da sua alta similaridade com Prx2 de humanos; 2) Avaliação da atividade antitumoral dose dependente de adenantina sobre as linhagens celulares REH e MOLT-4 de leucemia linfoide aguda. No que concerne à primeira linha de investigação, nossos resultados revelam que Tsa1 é suscetível à inibição por adenantina, uma vez que o tratamento reduziu em ~66 % a velocidade de decomposição de peróxido de hidrogênio. Adicionalmente, a mutação da Thr44 de Tsa1, pertencente à chamada tríade catalítica, por uma Ser resultou em uma proteína mais suscetível a alterações na estrutura secundária e à inibição da atividade peroxidásica em função da ligação com adenantina, apresentando uma diminuição de ~85% na velocidade de reação. Características semelhantes foram observadas para a proteoforma Tsa2 de S. cerevisiae, que carreia naturalmente a substituição da Thr44 pela Ser. Análises de sequências de Prx em bancos de dados revelaram que majoritariamente proteínas contendo Ser são encontradas em organismos procariotos, muitos deles patogênicos. Finalmente, demonstramos por meio de ensaios citotoxicidade que as bactérias Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, que possuem uma Ser na tríade catalítica, têm seu crescimento inibido pelo tratamento com adenantina (IC50 de 460µM e 77µM, respectivamente), enquanto que para Escherichia coli, que possui Thr nessa posição, a toxicidade da adenantina foi bastante baixa (não foi possível determinar o IC50 nas condições utilizadas). Dessa forma, os dados apresentados neste trabalho demonstram o potencial da utilização da adenantina tanto como antibiótico quanto como antileucêmico. / Peroxiredoxins (Prx) are antioxidant enzymes which stand out due the ability to decompose a wide variety of hydroperoxides with high efficiency (106-108M-1s-1) maintaining these molecules at suitable levels to cellular homeostasis and participating in several signaling events. However, it has been shown that, in many tumor types, Prx levels are extremely increased and experiments involving its inactivation have resulted in differentiation or apoptosis of tumor cells. It was recently found a diterpenoid, called adenanthin, that would be the first human Prx1 and Prx2 inhibitor and it was demonstrated that its application in acute myeloid leukemia cells was able to promote differentiation or apoptosis. In this context, this work presents two lines of research: 1) Characterization of structural and functional changes promoted by adenanthin binding to Prx active site using Tsa1 from Saccharomyces cerevisiae as biological model, due to its high similarity to human Prx2. 2) Evaluation of adenanthin dose-dependent antitumor activity over the acute lymphoid leukemia cell lines REH and MOLT-4. As regards the first line of research, our result reveal that Tsa1 is susceptible to inhibition by adenanthin, since the treatment with this binder reduced the hydrogen peroxide decomposition velocity in ~ 66%. In addition, the replacement of Thr44 from Tsa1, aminoacid belonging to the so-called catalytic triad, by a Ser resulted in a protein more susceptible to alterations in secondary structure and to peroxidase activity inhibition in function of adenanthin binding, presenting ~85% of decrease in reaction velocity. Similar characteristics were observed for Tsa2 proteoform from S. cerevisiae, which naturally carries the substitution of Thr44 by Ser. Prx sequences analyzes in databases revealed that mostly Ser-containing proteins are found in prokaryotic organisms, many of them pathogenic ones. Finally, we demonstrate through cytotoxicity assays that the bacteria Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, which have a Ser in catalytic triad, have their growth inhibited by adenanthin treatment (IC50 of 460µM and 77µM, respectively), whereas for Escherichia Coli, which has Thr at that position, the tocyxicity of adenanthin was quite low (it was not possible to determine the IC50 under the used conditions). Regarding the second line of investigation, we found that adenanthin is able to induce the death of leukemic cell lines REH and MOLT-4, and for the last one, there was an unexpected proliferation of cells treated by the longest incubation period (72 hours), characterizing a possible indication of differentiation process. In this sense, the data presented here demonstrate the potential of adenanthin use in both antibiotic and antileukemic treatments.

Neste trabalho está descrito a síntese e avaliação biológica de uma série de compostos de selênio(IV) e telúrio(IV). Esta série foi planejada para que diferentes fatores estruturais pudessem ser avaliados e as possíveis relações entre a estrutura e atividade biológica dos compostos pudessem ser determinadas. Para tanto, selênio, telúrio, cloro e bromo foram diferentemente combinados em um esqueleto carbônico simples, contendo ou não um centro assimétrico. Os compostos de interesse foram sintetizados empregando metodologias quimio-enzimáticas, quando necessário, e reações clássicas da química do selênio e telúrio, levando aos compostos de interesse em poucas etapas e com bons rendimentos. No caso dos ensaios biológicos, parâmetros como potência relativa, constante de inibição de segunda-ordem, mecanismo de inibição, CI50 e viabilidade celular foram determinados dentro das possibilidades experimentais envolvendo cada enzima. As possíveis combinações deram origem a 12 compostos que foram avaliados como inibidores de cisteíno catepsinas B, K, V e S onde a potência relativa dos mesmos pode ser determinada. Para as cisteíno catepsinas V e S, as constantes de inibição de segunda-ordem foram determinadas e ficou evidenciado que a combinação entre telúrio e bromo leva aos compostos mais potentes para estas proteases, enquanto que a combinação entre selênio e cloro origina os inibidores menos potentes. A combinação, selênio e bromo, ou telúrio e cloro forneceu inibidores com potências intermediárias. Este foi o primeiro estudo descrevendo compostos de selênio(IV) como inibidores de proteases. Os mesmos compostos também foram avaliados como inibidores do proteassomo 20S, uma treonino protease, onde se pode observar pela primeira vez que compostos de selênio e telúrio atuam como inibidores desta protease. Os valores de CI50 dos compostos foram determinados e novamente os compostos de telúrio mostraram-se mais potentes do que seus congêneres de selênio. Por outro lado, ensaios em células demonstraram que os compostos de telúrio são direcionados a outro alvo biológico, diferentemente dos compostos de selênio que continuaram a inibir o proteassomo em um lisado celular. Em ensaios de viabilidade celular ficou evidenciado que os compostos de selênio foram mais citotóxicos do que os de telúrio, o que se mostrou muito interessante para desenvolvimento de um agente anticancer onde a resposta biológica desejada é a morte celular. / The synthesis and biological evaluation of a series of selenium(IV) and tellurium(IV) compounds have been described in this research. This series was designed to allow different structural factors to be evaluated, and the possible strutucture-activity relationships determinated. Selenium, tellurium, chlorine and bromine were differently combined in a carbon backbone with or without an asymmetric center. The compounds were synthetized by using both chemo-enzymatic methodology and classical selenium and tellurium chemistry. From biological assays, relative potency, second-order inactivation constant, inhibition mechanism, IC50 and cell viability were determinated according to the experimental possibilities involving each enzyme protocol. The 12 compounds synthesized from the possible combinations among selenium, tellurium, chlorine and bromine were evaluated as cysteine cathepsins B, K, V and S inhibitors, and their relative potencies were determined. By determining the second-order inactivation constant for cysteine cathepsins V and S, it was shown that a tellurium and bromine combination led to most powerfull inhibitors. Selenium and chlorine combination led to less potent inhibitiors, while selenium and bromine, and tellurium and chlorine led to inhibitors with intermediate potency. Those compounds were also evaluated as 20S proteasome inhibitors, a threonine protease. We first observed selenium and tellurium-containing compounds acting as inhibitors of 20S proteasome. The IC50 values were determinate and tellurium compounds were more potent again. On the other hand, tellurium compound did not inhibit proteasome in cells, while selenium-containing compound does it. By cell viability assays it was verified that selenium-containing compounds were more cytotoxic than their tellurium analogs. This data is interesting for someone that wishes to develop an anti-cancer agent where the biological response desired is death of cancerous cells.

Diidroorotato desidrogenases (DHODHs) catalisam a quarta e única reação de oxidorredução na via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, que envolve a oxidação do diidroorotato (DHO) a orotato (ORO) em um mecanismo dependente do cofator FMN e de aceptores de elétrons. A relevância de pirimidinas para a proliferação e manutenção celular determina a DHODH como um potencial alvo terapêutico. DHODHs são divididas em duas classes baseado em comparações estruturais e na sequência de resíduos: classe 1, a qual é subdividida em classe 1A e 1B, e classe 2. A proteína utilizada como modelo em nosso estudo sobre as DHODHs de tripanosomatídeos classe 1A é a enzima de Leishmania major (LmDHODH). As metas principais desse trabalho foram de contribuir para a compreensão sobre o mecanismo de ação das DHODHs de classe 1A e propor estratégias de inibição seletiva. Inicialmente, ensaios no estado estacionário e pré-estacionário foram realizados para caracterização do ciclo catalítico da LmDHODH e permitiram a análise das etapas redutivas e oxidativa de forma independente e sua comparação com o ciclo global. Foi também analisada a interação da LmDHODH com os produtos da reação por meio de ensaios de cinética, titulação espectral e titulação isotérmica calorimétrica. Após análises topológicas baseadas na estrutura cristalográfica da LmDHODH, diferentes mutantes foram construídos e caracterizados estruturalmente e cineticamente a fim de investigar a importância de alguns sítios na conformação protéica. Durante a etapa de busca de inibidores, bibliotecas químicas de compostos foram analisadas por meio de interferometria de biocamada e ensaio enzimático. Considerando os resultados obtidos, foi possível pela primeira vez identificar um mecanismo cinético cooperativamente positivo frente à ligação do DHO com coeficiente de Hill (h) próximo a 2. Além disso, nossos resultados mostram que o grau da cooperatividade na ligação do DHO é afetado pelo ORO. A comparação entre os parâmetros obtidos para o estado estacionário e pré-estacionário aliada aos estudos da interação da LmDHODH com os produtos da reação, sugerem que a liberação do ORO é a etapa limitante na velocidade global da reação, o que não é verdade para a enzima humana (DHODH classe 2). A partir das análises dos mutantes, foi possível correlacionar o comportamento cooperativo da enzima LmDHODH com a conversa cruzada entre os sítios-ativos mediada pela interface dimérica. Além disso, foi possível observar que a dinâmica conformacional do loop catalítico é extremamente relevante no mecanismo global da reação e existe uma correlação entre os rearranjos do loop catalítico e a interface dimérica. Nossos resultados fornecem uma importante contribuição para o entendimento dos detalhes do mecanismo catalítico adotado pelas DHODHs de classe 1A. Eles também revelam diferenças chave no mecanismo adotado pelas enzimas de classe 1A e classe 2, os quais podem ser explorados no desenvolvimento de inibidores potentes e seletivos contra a LmDHODH. No que se refere à busca por inibidores, alguns hits foram obtidos por meio da varredura da biblioteca de fragmentos do Drug Discovery Unit (DDU) utilizando interferometria de biocamadas. Além disso, um ensaio enzimático de larga escala (hightroughtput) foi desenvolvido para a LmDHODH e permitiu a triagem de alto desempenho nas bibliotecas de fragmentos e diversidade química. Hits foram validados por meio de ensaio de potência e bons inibidores foram encontrados em ambas as bibliotecas. As varreduras identificaram diferentes séries de compostos como pontos de partida para química medicinal e investigações estruturais. Dois hits identificados a partir da biblioteca de diversidade química apresentam excelentes valores de IC50, 260 nM e 1,07 ?M. / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) catalyze the fourth and only redox reaction in the de novo pyrimidine biosynthetic pathway, the oxidation of dihydroorotate (DHO) to orotate (ORO) through a mechanism dependent on the FMN cofactor and electron acceptors. The significance of pyrimidine for cell proliferation and maintenance determine DHODH as potential therapeutic target. DHODHs have been distinguished in two major classes based on sequence and structural comparisons: class 1, which is further divided into subclasses 1A and 1B, and class 2. The model protein in our studies on trypanosomatid class 1A DHODHs is the enzyme from Leishmania major (LmDHODH). The essential question in this study was to contribute for the understanding about the catalytic and inhibition mechanisms of class 1A DHODHs . First, steady-state and pre-steady state kinetic approaches have been used to characterize the catalytic cycle of LmDHODH and have allowed the comparison between the global cycle and each independent half-reaction. Also, the interaction of LmDHODH with the products of the reaction was analyzed by kinetic, spectral titration and isothermal titration calorimetry assays. After topographical analysis based on the LmDHODH crystallographic structure, different mutants were constructed and structurally and kinetically characterized. For inhibitor search, chemical libraries of compounds were screened by using biolayer interferometry binding and enzymatic assays. Based on our results, for the first time, steady-state kinetics analysis of class 1A allowed the observation of a positive cooperativity for DHO binding with a Hill coefficient (h) value close to 2. Moreover, our results show that the degree of cooperativity in DHO binding is affected by ORO. Comparison between steady and pre-steady-state parameters together with studies of interaction for LmDHODH with both products, suggests that ORO release is the rate-limiting step in overall catalysis with is not true to the human enzyme (class 2 DHODH). The hybrid approach used to characterize LmDHODH mutants allowed us to propose that the cooperative behavior is related with the cross-talk between the two active sites mediated by the dimer interface. Also, the conformational dynamics of the catalytic loop is very relevant in the global mechanism of the reaction and there is a correlation between catalytic loop rearrangement and dimer interface. Our results bring an important contribution for a better understanding of the detailed catalytic mechanism adopted by class 1A DHODHs. They also reveal key differences in the enzymatic mechanism adopted by class 1A and class 2 DHODHs, to be exploited in the development of potent and selective LmDHODH inhibitors. Regarding to inhibitors search, few hits were obtained by using screening of Drug Discovery Unit (DDU) fragment library with biolayer interferometry binding assay. Also, an end-point enzymatic assay was developed for LmDHODH and the optimisation carried out at the DDU provided a reliable HTP assay using both DDU\'s fragment library and small diversity set. Hits were validated using a potency assay with good inhibitors found using both libraries. The screens identified a number of series as starting points for medicinal chemistry and structural investigations. Two hits identified from small diversity set exhibit great IC50 values, 260 nM and 1.07 ?M.

Em tarefas de tempo de reação, uma pista visual pode engatilhar diversos processos, que facitam ou inibem diferentes estágios do processamento do estímulo-alvo. As características da tarefa podem modular os efeitos da pista. Neste estudo, investigamos as possíveis causas dos efeitos inibitórios da pista. Em experimentos em que foi usada uma tarefa de discriminação vai/não-vai, um efeito inibitório foi encontrado quando um valor fixo assincronia entre o início pista e o início do estímulo-alvo (SOA) foi usado, mas não quando o valor de SOA foi variado no decorrer da tarefa. Na tarefa de discriminação de escolha, nenhum efeito initório da pista foi observado, enquanto na tarefa de detecção houve facilitação. Nós propomos que o efeito inibitório na tarefa do tipo vai-não/vai se origina da inibição da tendência de responder automaticamente ao aparecimento da pista. Essa inibição tornaria mais lenta a resposta ao estímulo-alvo subsequente. / In reaction time tasks, a visual cue can trigger several processes and each of these processes can have either a facilitatory or inhibitory influence on different stages of target processing. It has been suggested that task set might modulate cuing effects. In the present study, we investigated the possible causes of inhibitory cueing effects. In experiments involving a go/no-go discrimination task, an inhibitory cueing effect on reaction time was found when a fixed asynchrony between cue onset and target onset (SOA) was used, but not when varied SOAs was used. In a choice discrimination task no inhibitory cueing effect was observed, while in a detection task there was a facilitatory cueing effect. We propose that the inhibitory cueing effect in the go/no-go task arises from the inhibition of an automatic tendency to respond to the cue. This would slow responding to the subsequent target stimulus. Our results suggest that a response inhibition to the cue may contribute to the inhibition of return effect.

Melanoma é o câncer mais agressivo e a mutação BRAF V600E é a mais frequente entre os pacientes. O vemurafenibe foi o primeiro inibidor específico desta mutação aprovado pela Food and Drug Administration. Entretanto, após cerca de seis meses há recidiva e superar os mecanismos de resistência responsáveis por este fenômeno ainda é um desafio. A curcumina é um tumérico com características antitumorais e anti-inflamatórias, entretanto sua baixa biodisponibilidade e estabilidade limitam seu uso e por isso impulsionaram a busca por análogos capazes de serem eficientes e comercializados. O DM-1, é um análogo monocetônico que apresentou efeitos antiumorais in vitro e in vivo em estudos anteriores. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos citotóxicos do DM-1 em células de melanoma sensíveis (naive) e resistentes ao vemurafenibe, bem como na modulação de metaloproteinases. As células de melanoma foram tratadas com diferentes concentrações de DM-1, e este composto foi citotóxico para linhagens sensíveis e resistentes ao vemurafenibe, além de induzir parada de ciclo celular em G1/G0 e diminuir o número de colônias, entretanto ele não foi seletivo em ensaios de citotoxicidade realizados com melanócitos e fibroblastos. O tratamento dessas células em doses subtóxicas resultou na modulação de metaloproteinases importantes no processo de invasão celular. O DM-1 reduziu as concentrações das metaloproteinases -1, -2 e -9 (MMP-1, -2 e -9) em um ensaio de quantificação de MMPs e a atividade das MMP-2 e -9 em um ensaio de zimografia de maneira célula dependente. As modulações negativas do inibidor de MMP TIMP-2 e MMP-14 para SKMEL-28 naive foram associadas a diminuição das atividades de MMP-2 e -9, enquanto que as modulações positivas para SKMEL-19 naive foram relacionadas ao aumento de MMP-2. Este composto ainda inibiu a migração das células e a formação de tubos por células endoteliais. / Malignant melanoma is the most aggressive cancer and the BRAF V600E mutation is the most frequent among patients. Vemurafenib was the first specific inhibitor for this mutation approved by Food and Drug Administration. Therefore around six months later there is relapse and overcoming it is still a challenge. Curcumin is a turmeric and it has been deeply researched because of its anti-inflammatory and antitumoral effects. However the low stability limits its use, therefore, encouraged the investigation of analogues capable to be efficient and commercialized. DM-1 is a monoketone curcumin analog and it showed antitumoral effects in vitro and in vivo in previous studies The aim of this project was to evaluate the cytotoxical effects of DM-1 for vemurafenib responsive (naïve) and resistant melanoma cells, as well as metalloproteinases modulation. Melanoma cells were treated with different DM-1 concentrations, and this compound was cytotoxic for responsive and resistant cell lines, besides inducing G1/G0 cell cycle arrest and reducing the number of colonies, nonetheless it was not selective in assays performed with melanocytes and fibroblasts. Subtoxic treatment of those cells modulated important MMPs in the cell invasion process. DM-1 reduced metalloproteinases -1, -2 and -9 (MMP-1,-2 and -9) in a quantification assay, and MMP-2 and -9 activities by zymography in a cell-dependent way. Negative modulations of MMP inhibitor TIMP-2 and MMP-14 for SKMEL-28 naïve were associated with MMP-2 and -9 reduced activities, whereas positive modulations for SKMEL-19 naïve were correlated to MMP-2 increase. Furthermore, this compound reduced migration of those cells and endothelial cell tube formation.

Neste trabalho está descrito a síntese e avaliação biológica de uma série de compostos de selênio(IV) e telúrio(IV). Esta série foi planejada para que diferentes fatores estruturais pudessem ser avaliados e as possíveis relações entre a estrutura e atividade biológica dos compostos pudessem ser determinadas. Para tanto, selênio, telúrio, cloro e bromo foram diferentemente combinados em um esqueleto carbônico simples, contendo ou não um centro assimétrico. Os compostos de interesse foram sintetizados empregando metodologias quimio-enzimáticas, quando necessário, e reações clássicas da química do selênio e telúrio, levando aos compostos de interesse em poucas etapas e com bons rendimentos. No caso dos ensaios biológicos, parâmetros como potência relativa, constante de inibição de segunda-ordem, mecanismo de inibição, CI50 e viabilidade celular foram determinados dentro das possibilidades experimentais envolvendo cada enzima. As possíveis combinações deram origem a 12 compostos que foram avaliados como inibidores de cisteíno catepsinas B, K, V e S onde a potência relativa dos mesmos pode ser determinada. Para as cisteíno catepsinas V e S, as constantes de inibição de segunda-ordem foram determinadas e ficou evidenciado que a combinação entre telúrio e bromo leva aos compostos mais potentes para estas proteases, enquanto que a combinação entre selênio e cloro origina os inibidores menos potentes. A combinação, selênio e bromo, ou telúrio e cloro forneceu inibidores com potências intermediárias. Este foi o primeiro estudo descrevendo compostos de selênio(IV) como inibidores de proteases. Os mesmos compostos também foram avaliados como inibidores do proteassomo 20S, uma treonino protease, onde se pode observar pela primeira vez que compostos de selênio e telúrio atuam como inibidores desta protease. Os valores de CI50 dos compostos foram determinados e novamente os compostos de telúrio mostraram-se mais potentes do que seus congêneres de selênio. Por outro lado, ensaios em células demonstraram que os compostos de telúrio são direcionados a outro alvo biológico, diferentemente dos compostos de selênio que continuaram a inibir o proteassomo em um lisado celular. Em ensaios de viabilidade celular ficou evidenciado que os compostos de selênio foram mais citotóxicos do que os de telúrio, o que se mostrou muito interessante para desenvolvimento de um agente anticancer onde a resposta biológica desejada é a morte celular. / The synthesis and biological evaluation of a series of selenium(IV) and tellurium(IV) compounds have been described in this research. This series was designed to allow different structural factors to be evaluated, and the possible strutucture-activity relationships determinated. Selenium, tellurium, chlorine and bromine were differently combined in a carbon backbone with or without an asymmetric center. The compounds were synthetized by using both chemo-enzymatic methodology and classical selenium and tellurium chemistry. From biological assays, relative potency, second-order inactivation constant, inhibition mechanism, IC50 and cell viability were determinated according to the experimental possibilities involving each enzyme protocol. The 12 compounds synthesized from the possible combinations among selenium, tellurium, chlorine and bromine were evaluated as cysteine cathepsins B, K, V and S inhibitors, and their relative potencies were determined. By determining the second-order inactivation constant for cysteine cathepsins V and S, it was shown that a tellurium and bromine combination led to most powerfull inhibitors. Selenium and chlorine combination led to less potent inhibitiors, while selenium and bromine, and tellurium and chlorine led to inhibitors with intermediate potency. Those compounds were also evaluated as 20S proteasome inhibitors, a threonine protease. We first observed selenium and tellurium-containing compounds acting as inhibitors of 20S proteasome. The IC50 values were determinate and tellurium compounds were more potent again. On the other hand, tellurium compound did not inhibit proteasome in cells, while selenium-containing compound does it. By cell viability assays it was verified that selenium-containing compounds were more cytotoxic than their tellurium analogs. This data is interesting for someone that wishes to develop an anti-cancer agent where the biological response desired is death of cancerous cells.

Dentre as diversas questões envolvendo a tecnologia duplo haploides (DH) em milho, uma que tem sido pouco discutida é a geração em que se deve induzir haploides, no caso, F1 ou F2. Destas, a F1 tem sido a mais utilizada. No entanto, o seu uso constante pode levar a perdas de ganhos genéticos, devido ao menor número de recombinações. Com isso, alguns autores aconselham o uso da F2 na indução, o que possibilitaria maiores ganhos em variabilidade genética. Desse modo, os objetivos foram verificar o efeito das gerações F1 e F2 na expressão do R1-navajo em germoplasma tropical, na eficiência relativa de cada uma das etapas da metodologia e na variabilidade genética das linhagens DH obtidas. Para isso, cinco fontes de germoplasma, em gerações F1 e F2, foram cruzadas com o indutor de haploidia tropicalizado LI-ESALQ. As sementes deste cruzamento foram agrupadas por meio do marcador R1-navajo em três classes: haploides putativos, diploides e inibidas. Após esta etapa, as sementes dos haploides putativos foram submetidas à duplicação cromossômica e as plantas duplicadas foram transplantadas a campo para a obtenção de linhagens DH. As unidades de sementes, plântulas e plantas em cada etapa da metodologia foram quantificadas para o estudo da eficiência relativa na obtenção de DH. Também foram coletadas amostras foliares das linhagens DH para genotipagem por meio de marcadores SNP (Single nucleotide polymorphism). As taxas de indução de haploides (HIR), sementes diploides (DSR) e inibidas (ISR) foram analisadas por meio de um modelo linear generalizado misto considerando distribuição logit multinomial. As eficiências relativas das fontes de germoplasma e gerações em cada etapa da metodologia DH foram estimadas por meio de porcentagem. Os marcadores SNP foram utilizados em estudos de diversidade genética, estrutura populacional e desequilíbrio de ligação. Os valores médios observados para as taxas de HIR, ISR e DSR foram, respectivamente, 1,23%, 23,4% e 75,2% para a geração F1 e 1,78%, 19,6% e 82,3% para a geração F2. O maior valor de HIR na F2 ocorreu devido à segregação dos genes que inibem o marcador R1-navajo durante a indução de haploides. Entretanto, apesar da geração F2 apresentar maior HIR, ela não deve substituir a F1, uma vez que se perde tempo com um ciclo adicional. A eficiência relativa na obtenção de linhagens DH apresentou o mesmo valor (0,4%) para as gerações F1 e F2, indicando que a escolha da geração não interfere na quantidade de DH produzidos. As estimativas dos parâmetros populacionais para as linhagens DH obtidas de geração F1 apresentaram valores para variância genética (VG) de 700,55, tamanho efetivo populacional (Ne) de 43,1, diversidade genética de Nei (GD) de 0,28 e conteúdo de informação polimórfica (PIC) de 0,23. Para a geração F2 as estimativas foram de VG=648,88, Ne=39,61, GD=0,26 e PIC=0,22. Os valores de desequilíbrio de ligação foram de 0,069 na geração F1 e de 0,067 na geração F2. Ou seja, as linhagens DH oriundas destas duas gerações apresentaram magnitudes semelhantes de diversidade genética e de desequilíbrio de ligação. O uso da geração F2 teoricamente permitiria obter maior variabilidade genética, devido à recombinação adicional. Entretanto, neste trabalho esta tendência não foi observada. Com isto, em milho tropical, recomenda-se o uso da geração F1 para a obtenção de DH, por apresentar o melhor balanço entre tempo e variabilidade genética. / Among the several questions involving doubled haploid technology (DH), one that has been little discussed is the generation in which one should induce haploids, in the F1 or F2. Overall, the F1 generation has been the most used. However, their constant use can lead to losses of genetic gains with the selection cycles due to the lower number of recombination. Thereby, some authors advise the use of F2 in inductions, which would allow greater gains in genetic variability. Thus, the objectives were to check the effect of the F1 and F2 generations on the expression of the R1-navajo in tropical germplasm, on the relative efficiency of each step of the methodology and the genetic variability of the DH lines obtained. For this purpose, five germplasm sources, in F1 and F2 generations, were crossed with the tropicalized haploid inducer LI-ESALQ. The seeds from this cross were grouped using the R1-navajo marker into three classes: putative haploids, diploid and inhibited. Then, putative haploid seeds were submitted to chromosome duplication, and the duplicate seedlings were transplanted to the field in order to obtain DH lines. Hence, seed, seedling, and plant at each stage of the methodology were quantified to study the relative efficiency in developing DH lines. Moreover, leaf samples from the D0 lines were collected for genotyping using SNP (Single nucleotide polymorphism) markers. Finally, the haploid inducer rate (HIR), diploid seed rate (DSR) and inhibited seed rate (ISR) were analyzed using a generalized linear mixed model considering multinomial logit distribution. The relative efficiency of germplasm sources and generation in each stage of the DH methodology was estimated by percentage. SNP markers were used in studies of genetic diversity, population structure, and linkage disequilibrium. The observed mean values of HIR, ISR and DSR were, respectively, 1.23%, 23.4% and 75.2% for the F1 generation and 1.78%, 19.6% and 82.3% for the F2 generation. The higher value of HIR in F2 occurred due to the segregation of genes, which inhibit the R1-navajo marker during haploid induction. However, in spite of the higher value of HIR for F2 generation, it should not replace F1 since time is lost with an additional cycle. The relative efficiency observed in the obtention of DH lines was the same value (0.4%) for generations F1 and F2, indicating that the choice between those generations does not interfere with the quantity of produced DH. Estimates of the population parameters for the DH lines obtained from F1 generation presented values for genetic variance (VG) of 700.55, effective population size (Ne) of 43.1, Nei\'s genetic diversity (DG) of 0.28 and polymorphic information content (PIC) of 0.23. For F2 generation the estimates were VG = 648.88, Ne = 39.61, GD = 0.26 and PIC = 0.22. Linkage disequilibrium values were 0.069 in the F1 generation and 0.067 in the F2 generation. Thus, DH lines from these two generations showed similar values of genetic diversity and linkage disequilibrium. Nonetheless, the use of the F2 generation theoretically would allow obtaining greater genetic variability, due to the additional cycle of crossing-overs. However, this trend was not observed in this study. Thus, in tropical maize, the use of the F1 generation to obtain DH lines is recommended, because it performs the best balance between time and genetic variability.

Orientadora: Profa. Dra. Tatiana Lima Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2014.

Submitted by NATHALIE CARDOSO CABIA null (nccabia@gmail.com) on 2017-01-31T17:19:43Z No. of bitstreams: 1 Nathalie Cardoso Cábia Tese.pdf: 2151127 bytes, checksum: 60d4e1411e5b512e9d366d8cdd972d67 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-02-03T18:41:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cabia_nc_dr_bot.pdf: 2151127 bytes, checksum: 60d4e1411e5b512e9d366d8cdd972d67 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-03T18:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cabia_nc_dr_bot.pdf: 2151127 bytes, checksum: 60d4e1411e5b512e9d366d8cdd972d67 (MD5) Previous issue date: 2016-12-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O caqui é um fruto climatérico altamente perecível, e para estender o período de sua comercialização se faz necessário o uso de métodos de conservação pós-colheita. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a qualidade físico-química e enzimática de caquis ‘Rama Forte’ e ‘Kyoto’ tratados com 1-metilciclopropeno (1-MCP). Os frutos após a colheita foram selecionados e expostos a diferentes concentrações de 1-MCP (0 ppb, 500 ppb, 1000 ppb e 1500 ppb) e após o procedimento foram armazenados sob refrigeração a 0 ± 0,5ºC e 90 ± 5% de UR. Foram realizadas análises de perda de massa fresca, taxa respiratória, acidez titulável, potencial hidrogêniônico (pH), sólidos solúveis, índice de maturação (“Ratio”), firmeza, índice de adstringência, ácido ascórbico, açúcares redutores, coloração, capacidade antioxidante, compostos fenólicos totais, atividade das enzimas polifenoloxidase (PFO), poligalacturonase (PG) e pectinametilesterase (PME). As análises foram realizadas nos frutos a cada 7 dias, ao longo de 35 dias de armazenamento refrigerado. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, com 3 repetições por tratamento. Nas condições em que o trabalho foi realizado pode-se concluir que a aplicação de 1-MCP associada ao armazenamento refrigerado foi eficiente no controle do amadurecimento dos caquis ‘Rama Forte’ e ‘Kyoto’. Em caquis ‘Rama Forte’ não destanizados a dose que apresentou melhores resultados foi a de 1500 ppb de 1-MCP. Em caquis ‘Rama Forte’ submetidos à destanização o 1-MCP, independente da dose, mostrou-se eficiente. Já em caquis ‘Kyoto’, a dose que apresentou melhores resultados foi a de 1500 ppb de 1-MCP. / Persimmon is a highly perishable climacteric fruit, and to extend the commercialization period, is necessary to apply post-harvest conservation techniques for its marketing. The objective of this work was to evalueate the physical-chemical and enzymatic quality of ‘Rama Forte’ and ‘Kyoto’ persimmons using 1-metylcyclopropene (1-MCP). Harvested fruits were selected and exposed to different concentrations of 1-MCP (0 ppb, 500 ppb, 1000 ppb and 1500 ppb) and then, they were stored under refrigeration at 0 ± 0,5°C and 90 ± 5% RH. Analyses were conducted to determine the weight loss, respiration, titratable acidity, pH, soluble solids, maturation index (“Ratio”), firmness, astringency index, reducing sugar, ascorbic acid, antioxidant activity for DPPH, total phenolic compounds, polyphenol oxidase activity, poligalacturonase and pectin. The analyzes were carried out on the fruits every 7 days, during 35 days of refrigerated storage. The experiment was completely randomized, with three replicates each treatment. Under conditions in wich the work performed can be concluded that the application of 1-MCP associated witch cold storage was effective in ripening controlling of 'Rama Forte' and 'Kyoto' persimmons. In persimmons 'Rama Forte' witch tannin, the dose that presented the best results was 1500 ppb of 1-MCP. In ‘Rama Forte’ persimmons submitted to destanizacion 1-MCP, regardless of the dose, was efficient. In ‘Kyoto’ persimmons, the dose that presented the best results was 1500 ppb os 1-MCP.

Estudou-se a influência da concentração inicial de substrato no cultivo em fermentador para produção de biomassa de Candida utilis IZ-1840 em meio sintético tamponado contendo glicerol (1,2,3-propanotriol) como fonte exclusiva de carbono nas seguintes concentrações: 15, 25, 35, 45, 55, 65 e 75 g/L com ensaios em duplicata. Observou-se um comportamento cinético característico de fenômeno de inibição por substrato, tendo-se então ajustada uma equação de modelo de inibição baseada na literatura para os dados de velocidade específica máxima de crescimento celular em função da concentração inicial de substrato. A partir de tal equação determinou-se o valor da concentração inicial de substrato onde não ocorre inibição, definido como S* ( S*=17,511 g/L) e o valor teórico acima do qual a inibição é máxima definido como Sm, (Sm=175,4 g/L). O valor teórico de velocidade específica máxima de crescimento celular, definido como µ* correspondente ao valor S* como concentração de substrato inicial foi calculada em 0,225 1/h. / The influence of initial substrate concentration in the growth of Candida utilis IZ-1840 in a buffered synthetic mediurn was studied utilizing glycerol (1,2,3-propanetriol) as an exc1usive carbon source, in the following concentrations: 15, 25, 35, 45, 55, 65 and 75 of in double assays. Characteristic kinetic behavior of substrate inhibition was detected, then one model equation of inhibition based on literature was adjusted for the maximum specific growth rate in function of the initial substrate concentration. From this equation it was possible to determine the value of the initial substrate concentration that do not occur growth inhibition, defined as S* (S* = 17,511 g/L).and the theoretical value of limit concentration where above this the growth inhibition becomes maximum which was defined as Sm (Sm = 175,4 g/L). The theoretical value for maximum specific growth rate, defmed as µ* corresponding to determined S* as initial substrate concentration was calculated in 0,225 1/h.