Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-17T11:54:09Z No. of bitstreams: 1 claudineiapereiramaranduba.pdf: 2369971 bytes, checksum: 5d3276b2ce5d5c8e84547574a817bad2 (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-08-24T11:25:37Z (GMT) / Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-24T15:12:23Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-30T14:21:07Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-08-30T14:21:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2017-02-20 / O Resveratrol, uma fitoalexina presente nas uvas e em outras plantas e, dada as propriedades terapêuticas, tais como anticâncer, antiviral, anti-inflamatório, antioxidante e neuroprotetor, tem chamado atenção de muitos pesquisadores. A atividade anticâncer, ou antiproliferativa, contribui para uma ação quimiopreventiva e estudos mostram que o Resveratrol afeta células tumorais. Os mecanismos do efeito antitumoral do Resveratrol não são completamente compreendidos, mas para uma variedade de células tumorais tratadas com Resveratrol é observado apoptose. O presente projeto de pesquisa teve como objetivo geral validar o modelo para estudo de doenças humanas usando as células-tronco da polpa dentária decídua, em especial para a doença Neurofibromatose Tipo I, observando os efeitos do resveratrol na proliferação e diferenciação osteogênica dessas células. Concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM de Resveratrol foram adicionadas aos meios de cultivo e após 3, 5 e 7 dias, a proliferação celular foi avaliada pela técnica de MTT. Para avaliar os efeitos do Resveratrol na diferenciação osteogênica, as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM foram suplementadas nas culturas de células por 21 dias, sendo posteriormente coradas com Vermelho de Alizarina para quantificação das áreas mineralizadas através do espectrofotômetro. Foram observadas que nas células-tronco de dentes decíduos saudáveis, as quais foram usadas como controle, houve inibição significativa (p<0,05) nas concentrações de 25 e 50 µM no dia 7, enquanto nas células NF1 houveram inibições nas concentrações de 10, 25 e 50 µM no dia 5, e de todas as concentrações testadas no dia 7 (p<0,05). De acordo com uma revisão sistemática realizada nesse projeto, observamos que, dependendo do tipo celular, células saudáveis podem apresentar tanto proliferação quanto inibição, dependendo das concentrações de Resveratrol. Existe um consenso entre os pesquisadores quanto a propriedade antitumoral do Resveratrol, e nossos resultados com as células NF1 corroboram com outros da literatura em função do perfil tumoral dessas células. Na parte de mineralização, o Resveratrol apresentou melhores depósitos de cálcio (>90%) para as concentrações de 10 e 25 µM. Mesmo afetando a proliferação celular nessas concentrações, observamos que o Resveratrol contribui para mineralização das células e apresenta potencial terapêutico para controle do crescimento dos neurofibromas e melhora da condição óssea dos pacientes. / Resveratrol, a phytoalexin present in grapes and other plants and, due the therapeutic properties, such as anticancer, antiviral, anti-inflammatory, antioxidant and neuroprotective, has attracted attention of many researchers. The anticancer activity, or antiproliferative, contributes to a chemopreventive action and studies show that Resveratrol affects tumor cells. The mechanisms of the antitumor effect of Resveratrol are not fully understood, but apoptosis is observed for a variety of tumor cells treated with Resveratrol. The present research project had a general objective to validate the model for the study of human diseases using stem cells of deciduous pulp, especially for the disease Neurofibromatosis Type I, observing the effects of resveratrol on the proliferation and osteogenic differentiation of these cells. Concentrations of 5, 10, 25 and 50 μM Resveratrol were added to the culture media and after 3, 5 and 7 days, cell proliferation was assessed by the MTT technique. To evaluate the effects of Resveratrol on osteogenic differentiation, concentrations of 5, 10, 25 and 50 μM were supplemented in cell cultures for 21 days, and were subsequently stained with Alizarin Red for quantification of the mineralized areas by the spectrophotometer. It was observed that in the stem cells of healthy primary teeth, which were used as control, there was significant inhibition (p <0.05) at concentrations of 25 and 50 μM at day 7, while in NF1 cells there were inhibitions at concentrations of 10, 25 and 50 μM on day 5, and all concentrations tested on day 7 (p <0.05). According to a systematic review in this project, we observed that, depending on the cell type, healthy cells may exhibit both proliferation and inhibition, depending on the concentrations of Resveratrol. There is consensus among researchers regarding the antitumor property of Resveratrol, and our results with NF1 cells corroborate with others in the literature as a function of the tumor profile of these cells. In the mineralization part, Resveratrol presented better deposits of calcium (> 90%) for concentrations of 10 and 25 µM. Even affecting cell proliferation at these concentrations, we observed that Resveratrol contributes to cell mineralization and has therapeutic potential to control the growth of neurofibromas and improve bone condition in patients.

Orientador: Eduardo Caruso Machado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T03:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dovis_VeronicaLorena_D.pdf: 1810872 bytes, checksum: 889e3b63cede2d73563ccbfb91cdd3e1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As hipóteses deste estudo foram: a presença de frutos nas variedades de laranja tardia e as variações sazonais no ambiente afetam o desenvolvimento reprodutivo, o metabolismo de carbono e nitrogênio e o acúmulo e remobilização de reservas nos órgãos da planta; cada estádio fenológico tem necessidades nutritivas específicas, que afetariam a assimilação de CO2 e o metabolismo de carboidratos e nitrogênio. Estas hipóteses foram testadas em plantas que sofreram ou não desbaste total de frutos com o intuito de induzir variações na demanda de assimilados. O experimento foi executado em Cordeirópolis (SP) em plantas de laranjeira "Valência? de 2,5 anos de idade, crescidas em vasos de 100 L. Em maio de 2009, a metade das plantas foi completamente desbastada de frutos. A partir de julho e ao longo do ciclo produtivo avaliaram-se a dinâmica de assimilação de CO2, carboidratos e compostos nitrogenados, e a atividade de enzimas da assimilação de nitrogênio. O experimento foi inteiramente casualizado com três ou quatro repetições, segundo o parâmetro avaliado, o tratamento estatístico dos dados foi como parcelas subdivididas no tempo. Em relação à primavera a fotossíntese é reduzida no inverno e no verão, como consequência da ocorrência de temperaturas mais baixas e mais altas, respectivamente. Porém, a condição fisiológica da planta também afeta a assimilação de CO2, a qual é incrementada pela alta demanda de carboidratos antes e durante a floração, mesmo sob baixa temperatura. A presença de frutos inibe parcialmente a brotação e floração visto que plantas desbastadas têm sete vezes mais flores; fixam 31% mais frutos e eles são 6% maiores. A floração é o processo de maior consumo de assimilados, e quanto mais intensa, maior o consumo de amido. Floração e frutificação são os únicos estádios nos quais se observaram diferenças entre os tratamentos; plantas com maior quantidade de flores têm maior consumo de assimilados. O amido continua a ser consumido até o fim da queda fisiológica dos frutos no verão, quando atinge o teor mínimo. Ramos e raízes maiores que 1 mm de diâmetro aportam amido durante o desenvolvimento das brotações e dos frutos. Entre o desbaste e a frutificação há aumento no teor de nitrogênio total nas folhas do último fluxo, ramos e raízes, ainda com baixa temperatura, resultado da maior demanda. O aumento no metabolismo induz maior síntese de proteína nas folhas e raízes menores que 1 mm de diâmetro. A enzima redutase do nitrato (RN) tem a menor atividade quando comparada com o sistema glutamina sintetase/glutamato sintase, sugerindo ser a que limita a taxa de assimilação de NO3-. Nas folhas a atividade in vitro da RN incrementa até a frutificação, e segue o padrão de variação sazonal observado na fotossíntese; nas raízes sua atividade é constante ao longo do ano / Abstract: The hypotheses of the study are that seasonal variations in environmental conditions affect the assimilation rate of resources while there is accumulation and remobilization of reserves in all the organs of plant to attend variations in nutrients demand. Each phenological stage has different needs, which would affect CO2 assimilation rate and metabolism of carbohydrates and nitrogen. To analyzer these hypotheses the objective was to evaluate the photosynthesis, flowering and fruit production, accumulation and remobilization of carbohydrates during of production cycle, in plants with and without fruit. Also it was objective to evaluate the annual dynamics of nitrogenous compounds and activity of enzymes of nitrogen assimilation. The study was conducted in Cordeirópolis (SP) in plants 'Valencia' orange of 2.5 years old, grown in pots of 100 L. In may 2009, at the start of the trial, half of plants was completely defruit, and starting from july and throughout the production cycle were evaluated photosynthesis, budding, flowering and fruit production, status of reserves of sugars, nitrogen compounds and enzymatic activities. The experimental design was completely randomized with three or four replications, with three or four repetitions, depending on the variable assessed, with split plots in time. It is observed that photosynthesis decreased in winter and summer, consequence of low and high temperature and radiation, respectively. However, the physiological condition of plant also affects the uptake, inducing an increase in photosynthesis prior to flowering, even at low temperatures. The largest demand of plants with fruits results in an increase on efficiency of energy use which comes of the assimilation and reserves. The presence of fruits partially inhibits the sprouting and blooming, even with high leaves starch content, defruited plants have seven times more flowers, fruit set is 31% higher and they are 6% greater. The flowering has the greater consumption of all phenological stages, when it is more intense, largest starch consumption. The flowering and fruiting are the only stages with differences between the treatments; plants with the more fruits and demand have more assimilates consumption. Starch is consumed until the end of june drop, in summer, when it reaches minimum content. Starch for development of flowers and fruits can be contributed by younger shoots, shoots older than one year and roots larger than 1 mm across. From the defruited plants until fruiting the total nitrogen content increases in mature leaves, shoots and roots, even at low temperatures, as result of the higher demand. Soluble protein is accumulated in mature leaves and roots smaller than 1 mm across as a result of increased metabolism. The nitrate reductase enzyme has the lowest activity when compared with the system glutamine synthetase/glutamate synthase, which would indicate that nitrate reductase activity controls the assimilation rate of NO3-. Nitrate reductase in vitro activity in leaves is increased until fruiting, and has seasonal variations similar like was observed in photosynthesis. Nitrate reductase in vitro activity in roots is constitutive throughout the year / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

Submitted by Heitor Rapela Medeiros (heitor.rapela@ufpe.br) on 2015-03-03T18:28:11Z No. of bitstreams: 2 SOUZA, M.P.C- Dissertação de Mestrado.pdf: 1380346 bytes, checksum: 1b3f996a1ee811e62ac14e86cd7864ab (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-03T18:28:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 SOUZA, M.P.C- Dissertação de Mestrado.pdf: 1380346 bytes, checksum: 1b3f996a1ee811e62ac14e86cd7864ab (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / CAPES / Opuntia ficus-indica (L.) Mill. é uma cactácea amplamente cultivada nas zonas áridas e semiáridas do mundo, devido ao seu enorme potencial produtivo e suas múltiplas utilidades na área alimentícia, farmacêutica, agrícola, cosmética e outras. Assim, este trabalho objetivou caracterizar físico-quimicamente o óleo e o extrato nebulizado de Opuntia ficus-indica (L.) Mill. e avaliar as potencialidades deste vegetal, visando sua utilização no desenvolvimento de um novo fitocosmético. A caracterização foi realizada por análise térmica, espectroscopia na região do infravermelho, cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massas, espectroscopia na região do ultravioleta e por testes farmacopéicos. Na avaliação das potencialidades verificou-se a atividade antioxidante, antimicrobiana, fotoprotetora e inibidora da enzima tirosinase. As análises farmacopéicas, espectroscópicas e térmicas do óleo e do extrato nebulizado de Opuntia fícus-indica permitiram caracterizá-los físicoquimicamente e verificar a estabilidade térmica dos mesmos. Através do CG-EM foi detectado que o óleo é rico em ácidos graxos saturados e insaturados, principalmente em ácido linoléico (~65%). Quanto à avaliação das potencialidades dos produtos derivados de Opuntia fícus-indica foi detectado que, nas condições do estudo, os mesmos não apresentaram atividade antioxidante e nem antimicrobiana. Com relação à inibição da enzima tirosinase, apenas o extrato nebulizado demonstrou atividade inibitória. Quanto à avaliação do potencial fotoprotetor do óleo, foi observado que o mesmo não apresentou FPS significativo e nem potencializou o FPS de formulações cosméticas contendo filtros solares orgânicos. Apesar disto, a utilização dos produtos de Opuntia fícus-indica em fitocosméticos pode ser justificada pelas suas propriedades eudérmicas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The acetylcholinesterase enzyme is responsible for the acetylcholine hydrolisis in the synaptic cleft during the transmission of nervous impulse. The investigation of new inhibitors of this important enzyme is very relevant on tentative to minimize the effects due damages on cholinergic transmission, mainly in pathologies as Alzheimer s disease. Therefore, this work has investigated the inhibitory potencial of different classes of heterocyclic compounds (pyrazole, isoxazole and isoxazolinone), in vitro, on the acetylcholinesterase activity on different cerebral structures of rats (cortex, striatum and hippocampus). Among all tested compounds, only the 2c compound did not show any inhibition; all the remaining compounds showed significative inhibition (p<0,05), and the compounds 2a and 3c, that shown the best inhibitory efficacy (51 and 59 %, respectively), were the compounds selected to the kinetic enzimatic assays. From these results it was possible to characterize the kinetic parameters (Km and VMAX) and the inhibition type showed by every compound through the Lineweaver-Burk and Cornish-Bowden plots. The mentioned parameters to the compound 2a were Km = 0.2 mM and VMAX = 7.94 μmoles ASCh/h/mg of protein. The compound exihibited a competitive inhibition type with Ki = 1.46 mM. To the compound 3c, the values of Km and VMAX were 0.05 and 1.42 μmoles ASCh/h/mg of protein, respectively. This compound performed a noncompetitive inhibition type with Ki = 2.2 mM. All the compounds were previously diluted in methanol PA in concentrations of 0.031 mM, 0.0625 mM, 0.125 mM, 0.250 mM and 0.500 mM. The inhibitors selected to the kinetic assays were also diluted in methanol PA in the concentrations of 0.125, 0.250, 0.500 and 1.0 mM. / A enzima acetilcolinesterase é responsável pela hidrólise de acetilcolina na fenda sináptica durante a transmissão do impulso nervoso. A investigação de novos inibidores dessa importante enzima é de grande relevância na tentativa de minimizar os efeitos causados por danos na transmissão colinérgica, principalmente em patologias como a doença de Alzheimer. Frente a isto, este trabalho investigou o potencial inibitório de diferentes classes de compostos heterocíclicos (pirazóis, isoxazóis e isoxazolinonas), in vitro, sobre a atividade da enzima acetilcolinesterase de diferentes estruturas cerebrais de ratos (córtex, estriado e hipocampo). Dos onze compostos testados, apenas o denominado aqui como 2c, foi o único a não apresentar inibição significativa da enzima em nenhuma estrutura testada; todos os dez compostos restantes apresentaram inibição significativa (p< 0,05), sendo que os compostos 2a e 3c, por possuírem maior eficácia inibitória (53 e 59%, respectivamente) foram os compostos selecionados para os ensaios de cinética enzimática. A partir destes ensaios foi possível a caracterização dos parâmetros cinéticos (Km e VMÁX) e do tipo de inibição apresentada por cada composto através da plotagem dos dados em gráficos de Lineweaver-Burk e Cornish-Bowden, sendo que os parâmetros citados encontrados para o composto 2a foram: Km = 0,2 mM e VMÁX = 7,94 μmoles ASCh/h/mg de proteína. O composto apresentou inibição competitiva com um Ki = 1,46 mM. Já o composto 3c apresentou valores de Km e VMÁX iguais a 0,05 mM e 1,42 μmoles ASCh/h/mg de proteína, respectivamente. A inibição exercida por este composto foi do tipo não-competitiva com Ki = 2,2 mM. Todos os compostos foram diluídos em metanol PA, nas concentrações de 0,031; 0,062; 0,125; 0,250 e 0,500 mM. Os compostos selecionados para os ensaios de cinética enzimática foram diluídos também em metanol PA, nas concentrações de 0,125; 0,250; 0,500 e 1,0 mM.

Os vírus da Influenza Equina (EIV) (H3N8 e H7N7) pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A. Apesar de existirem poucos relatos de infecção humana pelo EIV, é conhecido o risco zoonótico e infecção interespécies. Serviços de vigilância epidemiológica da OIE e WHO informam que o subtipo H3N8 é isolado de surtos que ocorrem mundialmente, enquanto o subtipo H7N7, menos patogênico, não é isolado desde 1980, sendo então considerado um vírus extinto. Embora o EIV seja endêmico em nosso meio, há poucos trabalhos nacionais que tenham versado sobre a avaliação atual de anticorpos (Ac) anti-EIV presentes nos equídeos do Estado de São Paulo, o que motivou a realização do presente estudo. Os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar a ação de diferentes tratamentos de soro descritos pela OIE e WHO para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação em soros de 10 equinos vacinados (H3N8 A/Equi/Kentucky/1/1997), sendo eles: a) TPH: tripsina, metaperiodato de potássio seguido de adsorção de hemácias; b) KH: kaolin 20% seguido de adsorção de hemácias; e c) RDEH: RDE seguido de adsorção de hemácias; 2) avaliar a presença de Ac contra os vírus H3N8 e H7N7, em 84 equídeos não vacinados do Estado de São Paulo; 3) comparar a frequência de Ac contra H3N8 entre equídeos amostrados do estado de SP e de um painel de soros de equídeos do município de Mossoró - RN, região onde não há estudos sobre a circulação do EIV. Constatou-se que não houve diferença estatística entre os tratamentos de soro para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação (p>0,05; confiança de 95%), todavia o tratamento RDEH apresentou resultados mais consistentes, corroborando a recomendação da OIE e da WHO de utilizar preferencialmente este tratamento. O perfil sorológico dos animais amostrados de SP sugere que circule o subtipo H3N8 e que o subtipo H7N7 circule de forma subclínica nos equídeos, o que é sustentado por outros trabalhos realizados no Brasil. Há evidências no Brasil sobre a detecção de anticorpos em equinos contra o subtipo H7N7, mesmo não havendo o isolamento deste no mundo desde 1980. No painel de soros do RN, onde a espécie Equus asinus era maioria, verificou-se a igualdade estatística entre as frequências de Equus caballus e Equus asinus positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 (p>0,05; confiança de 95%), dado inédito em nosso meio. A frequência dos equídeos positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 foi estatisticamente maior (p<0,05; confiança de 95%) em SP do que em RN. / The Equine influenza Virus (EIV) (H3N8 and H7N7) belong to Orthomyxoviridae family and Influenza A genus. Although there are few reports of human infection with EIV zoonotic and interspecies infection risk is known. OIE and WHO services on epidemiological surveillance report that H3N8 subtypes are isolated and characterized from worldwide outbreaks while H7N7 subtype less pathogenic has not being isolated since 1980 considered an extinct virus. Although the EIV is endemic in our country there are few national studies that had versed on the current evaluation of horses antibodies (Ab) from São Paulo State which motivated the present study. The study objectives were: 1) to evaluate the effects of different serum treatments described by OIE and WHO for the removal of nonspecific inhibitors of hemagglutination in 10 vaccinated (H3N8 - A/Equi/Kentucky/1/1997) horses sera being: a) TPH: trypsin, potassium metaperiodate followed by adsorption of erythrocytes b) KH: kaolin 20% followed by adsorption of erythrocytes and c) RDEH: RDE followed by adsorption of erythrocytes; 2) investigate the presence of antibodies against H3N8 and H7N7 viruses in 84 unvaccinated equines in São Paulo State; 3) compare the frequency of antibodies against H3N8 sampled between São Paulo State and a panel of equines sera from Mossoró - RN where there are no studies on EIV circulation. There was no statistical difference between the treatments for serum nonspecific inhibitors of hemagglutination removal (p>0.05; 95% confidence) however RDEH treatment showed results more consistent confirming OIE and WHO recommendation to use this treatment with priority. The serological profile of SP samples suggests H3N8 subtype circulates in those animals and H7N7 subtype might circulate in a subclinical form in equines, which is supported by other studies conducted in Brazil. There is evidence of antibodies detection against equine H7N7 subtype in Brazil, even without since 1980 isolation in the world. In animals from RN State which had Equus asinus representing a major fraction there was statistical equal frequencies of Equus caballus and Equus asinus positivity in HI test against H3N8 subtype (p>0.05; 95% of confidence), as unprecedented in the world. The frequency of positive equine against H3N8 subtype on HI test in SP was statistically higher (p<0.05; 95% of confidence) than in RN.

A eficiência do processo de digestão anaeróbia dos resíduos sólidos orgânicos pode ser alterada com a recirculação do percolado. Considerado esse aspecto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a taxa da recirculação do percolado na eficiência do processo de digestão anaeróbia da fração orgânica dos resíduos sólidos urbanos. Assim, foram montados reatores de 3,45 litros preenchidos com resíduo padrão (fração orgânica de resíduos sólidos urbanos padrão) e inóculo (percolado). O valor de referência foi o teor de sólidos totais de 13%. Analisou-se o desempenho dos reatores variando taxas de recirculação (10, 30 e 50% em volume de inóculo). Foram realizados análises físico-químicas e exames microscópicos em amostras de percolado para avaliar o desempenho desses reatores. Os resultados dessas análises indicaram inibição da fase metanogênica nos reatores com maiores taxas de recirculação (30 e 50%). O reator com taxa de recirculação de 10%, comparado aos demais reatores, obteve maior eficiência na partida, com elevada produção de metano e maior percentual de degradação de sólidos. Os exames microscópicos realizados em amostras de percolado desse reator revelaram predominância de organismos de morfologia com características de Methanococcus, enquanto nos demais reatores foi observada maioria de organismos com morfologia semelhante a fungos. Concluiu-se que a taxa de recirculação de percolado influi significativamente nos biorreatores degradando a matéria orgânica, e que altas taxas de recirculação podem levar à inibição total do ecossistema existente no reator. / The performance of the anaerobic digestion process of organic solid residues can be modified by the leachate recirculation. Considering this aspect, the present paper aims to evaluate the leachate recirculation rate in the eficiency of the anaerobic digestion process of the organic fraction of urban solid residues. Thus, 3,45 liter reactors were constructed and filled with standard waste (standard organic fraction of urban solid residues) and seed (leachate), having the total solid content of 13% as a value of reference. The performance of the reactors was analyzed by varying recirculation taxes (10, 30 and 50% in volume of seed). Leachate samples from these reactors were examined through microscopic and physical-chemical analyses to evaluate theirs performance. The results of these analyses indicated an inhibition of the metanoghenic phase in the reactors with larger rates of recirculation (30 and 50%). The reactor with 10% recirculation rate obtained larger efficiency in the start, methane production and percentage of solid degradation, compared to other reactors. The microscopic examinations in the leachate samples from this reactor presented a predominance of organisms with characteristics Methanococcus morphology, whereas in the others reactors most organisms prsented a similar morphology to fungus. It was possible to conclude that the leachate recirculation rate has a significant influence on the degradaion of the organic material from bioreactors and that high recirculation rates can lead to the total inhibition of the ecosystem existig in the reactor.

FORTES, S.S. Estudo de metabolismo in vitro e inibição enzimática do produto natural Licarina A empregando microssomas hepático de humanos. 2017. Tese (Doutorado) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Muitos fármacos comercializados tiveram sua origem em produtos naturais e seus derivados. Devido ao grande potencial farmacológico destas novas moléculas pesquisadas, uma etapa importante e inicial no desenvolvimento de um novo fármaco é a avaliação do seu comportamento frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450), incluindo os estudos de interações medicamentosas. Neste contexto, um substrato que merece destaque é a Licarina A (Lic A). Este composto é uma neolignana encontrada em algumas espécies de plantas e vêm demonstrando várias propriedades biológicas promissoras, dentre elas destaca-se a atividade anti-leishimania. No entanto, para que esta substância com comprovada atividade se torne um fármaco é necessário realizar, na fase pré-clínica, estudos sobre seu perfil metabólico frente às enzimas do CYP450 e estudos de interação medicamentosa. Portanto, esta Tese teve como objetivo determinar os parâmetros enzimáticos utilizando microssomas hepáticos de humanos através do estudo de metabolismo in vitro com esta molécula e realizar estudos de interação medicamentosa através dos estudos de inibição enzimática e pesquisar a isoforma do CYP450 que metaboliza predominantemente este produto natural através do emprego de enzimas recombinantes de humanos. Primeiramente, foi desenvolvido um método analítico para a determinação do produto natural Licarina A em meio microssomal. As análises foram realizadas por cromatografia liquida de alta eficiência empregando a coluna Ascentis C18 e fase móvel composta por metanol: solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (75:25, v/v); a vazão empregada foi de 1,0 mL min-1. O método foi validado na faixa de concentração de 0,383 a 76,65 ?mol L-1, com coeficiente de correlação linear de 0,99 e limite de quantificação de 0,383 ?mol L-1. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. Após validação do método, estabeleceram-se as condições lineares para a depleção da Lic A no meio microssomal e posteriormente, a cinética foi determinada em condições de velocidade inicial utilizando para tanto 0,20 mg mL-1 de concentração de proteínas microssomais e 20 minutos de tempo de incubação. O comportamento observado na cinética enzimática para a depleção da Lic A foi um comportamento atípico, caracterizada pelo modelo cinético de Hill. Os valores de Vmax, S50 e coeficiente de Hill foram, 1,651 ?mol mg-1 min-1, 3,87 ?mol L-1 e 2,0 respectivamente. A partir dos parâmetros cinéticos o valor de clearance intrínseco (CLint) para a Lic A foi de 0,22 mL min-1 mg-1. Posteriormente, a correlação in vitro in vivo foi realizada e foi observado um clareance hepático (CLhep) de 20 mL min-1 kg-1 e taxa de extração hepática (E) de 1. As isoformas do CYP450 envolvidas no metabolismo da Lic A foram CYP 1A2 e 2B6. Os estudos de inibição mostraram que a Lic A é um inibidor fraco frente as isoformas do CYP450 estudadas, com valores de IC50 maiores do que 80 ?mol L-1. Embora já tenha sido estudada diferentes vias metabólicas da licarina A com vários metabólitos identificados, esta foi a primeira vez que foi observado a formação de um metabólito in vitro com o uso de microssomas hepático humano. Com o auxílio da espectrometria de massa foi possível a identificação do metabólito de m/z 343 [M+H]+, possivelmente um composto epoxidado, da licarina A. / FORTES, S.S. In vitro metabolism and enzymatic inhibition study of the natural product Licarin A employing human liver microsomes. 2017. Thesis (Doctoral) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Many marketed drugs had their origin in natural products and their derivatives. Due to the biological potential of these new molecules, an important initial step in the development of a new drug is the evaluation of its behavior in front of cytochrome P450 enzymes (CYP 450), including studies of drug interactions. In this context, a substrate that deserves attention is Licarin A (Lic A). This compound is a neolignan found in some species of plants and several promising biological properties have been describing for this natural product, among them anti-leishimania activity. However, for this substance to become a drug, it is necessary to perform, in the preclinical phase, studies regarding its metabolic profile and drug interactions. Therefore, this thesis aimed to determine the enzymatic parameters by using human liver microsomes through in vitro metabolism study with this molecule and to conduct drug interaction studies through the enzyme inhibition studies and finally, to investigate the CYP450 isoforms that metabolize predominantly this natural product through the use of recombinant human enzymes. Firstly, an analytical method was developed for the quantification of the natural product Licarin A in microsomal medium. The analyzes were performed by high performance liquid chromatography employing an Ascentis C18 column and mobile phase composed of methanol: 0.1% formic acid aqueous solution (75:25, v / v); the flow rate used was 1.0 mL min-1. The method was validated in the concentration range of 0.333 to 76.65 ?mol L-1, with a linear correlation coefficient of 0.99 and a quantification limit of 0.333 ?mol L-1. Accuracy and precision showed results in agreement with ANVISA guidelines. After method validation, the linear conditions for depletion of Lic A in the microsomal medium were established. Subsequently, the kinetics were determined under initial velocity conditions using 0.20 mg mL-1 of microsomal protein concentration and 20 minutes of incubation time. The behavior observed in the enzymatic kinetics for the depletion of Lic A was an atypical behavior, characterized by the Hill kinetic model. The values of Vmax, S50 and Hill coefficient were 1.651 ?mol mg-1 min-1, 3.87 ?mol L-1 and 2.0, respectively. From the kinetic parameters, the intrinsic clearance (CLint) for Lic A was 0.22 mL min-1 mg-1. Subsequently, in vitro in vivo correlation was performed and a hepatic clareance (CLhep) of 20 mL min-1 kg-1 and a hepatic extraction rate (E) of 1 was observed. The CYP450 isoforms involved in the metabolism of Lic A were CYP 1A2 and 2B6. Inhibition studies have shown that Lic A is a weak CYP450 inhibitor, with IC50 values greater than 80 ?mol L-1. Although different metabolic pathways of licanin A have been studied and several metabolites were identified, this is the first report about the formation of an in vitro metabolite after metabolism by human liver microsomes. With the aid of mass spectrometry it was possible to identify the metabolite of m/z 343 [M+H]+, possibly an epoxidized compound, of licanin A.

A doença de Chagas, descrita em 1909 pelo médico sanitarista brasileiro Dr. Carlos Chagas, é causada pelo parasito Trypanosoma cruzi. É uma doença tropical negligenciada que afeta aproximadamente entre 12 e 14 milhões de indivíduos em América latina. No ano de 2008 foi responsável pela morte de cerca de 10 mil pessoas no mundo, sendo que a terapia atual consiste no uso dos fármacos benzonidazol e nifurtimox que são eficazes apenas no estágio inicial da doença (fase aguda) e ainda possuem efeitos colaterais severos. Esse quadro justifica a necessidade da busca por substâncias mais eficientes para o tratamento dessa doença. Entre os candidatos em fase pré-clínica, o K777 mostrou-se eficaz em eliminar efetivamente a infeção pelo T. cruzi em modelos animais por meio da inibição irreversível da Enzíma cruzaína, uma cisteíno protease expressada durante todo o ciclo de vida do parasito. Novas técnicas em planejamento computacional de fármacos tem possibilitado a rápida identificação de compostos bioativos com atividade contra essa Enzíma. A abordagem baseada em fragmentos moleculares foi utilizada para identificação de pequenas substâncias bioativas. Aqui, uma junção molecular foi realizada entre fragmentos ativos, obtidos em estudos prévios, com a finalidade de explorar o sítio ativo da cruzaína. Os compostos foram sintetizados por meio de reações de acoplamento, com a finalidade de investigar a relação estrutura atividade (SAR), visando potencializar as interações responsáveis pela inibição no alvo. Os análogos obtidos foram testados in vitro, utilizando-se a espectrometria de fluorescência para a confirmação da inibição da atividade enzimática. / Chagas disease, described in 1909 by the Brazilian physician Carlos Chagas, is caused by the parasite Trypanosoma cruzi, which is a neglected tropical disease that affects approximately 10 million individuals. In 2008, Chagas disease was responsible for the death of about 10 thousand people, and the current therapy consists of the use of benznidazole and nifurtimox drugs that are only effective in the early stage of the disease (acute phase) and still have severe side effects. This scenario justifies the need to search for more efficient substances for the treatment of Chagas disease. Among candidates in pre-clinical phases, the K777 was effective in eliminating the T. cruzi infection in animal models by irreversibly inhibiting the enzyme cruzain, which is a cysteine protease expressed throughout the parasite lifecycle. New techniques in computational drug design have enabled the rapid identification of bioactive compounds with activity against this cruzain. A molecular approach based on fragments was used to identify small bioactive substances of the class. The dipeptidil nitriles were synthesized via coupling reactions, in order to investigate the structure activity relationship (SAR) aimed at enhancing the interactions responsible for inhibition of the target cruzain enzyme. The analogs have been assayed in vitro using fluorescence spectrometry to confirm inhibition of cruzain activity that inhibit cruzain in low-micro molar range.

Antecedendo movimentos voluntariamente gerados, existe atividade neuronal encefálica que se inicia alguns segundos antes da execução deste movimento. Esta atividade preparatória é responsável pela elaboração de um plano de execução que alcança a via final comum para realização de um ato motor voluntário, os motoneurônios. Entretanto, na última década, evidências apontam para a participação de circuitos neuronais na medula espinhal apresentando padrão de atividade similar aos padrões observados em áreas encefálicas e que, possivelmente, estaria relacionado a uma atividade preparatória para o movimento voluntariamente gerado. Por este motivo, o presente trabalho teve por objetivo verificar a atividade de circuitos neuronais na medula espinhal durante diferentes instantes de proximidade da ação voluntariamente gerada em paradigma de tarefa motora com período de instrução. Para isso, inicialmente, 15 sujeitos saudáveis, sem histórico de doença neuromuscular foram submetidos ao protocolo experimental. O protocolo experimental constituiu-se do processo de recrutamento dos sujeitos, sua preparação para o ensaio dentro do ambiente experimental, bem como as orientações necessárias para execução dos procedimentos e paradigmas. Os procedimentos referem-se às etapas realizadas para captação do reflexo H, bem como desta captação sob a influência de técnica de condicionamento por inibição pré-sináptica. Essa captação ocorreu em janelas de aquisição em que o sujeito encontrava-se em repouso e em três instantes de expectativa para a execução de ação voluntária, estando o músculo sóleo atuando como agonista (flexão plantar) ou antagonista (dorsiflexão), em paradigma de tarefa motora voluntária com período de instrução. Após os registros, por meio de processamento dos sinais coletados, foi possível se calcular a amplitude pico-a-pico do reflexo H nas diferentes condições experimentais de proximidade da execução (1000, 600 e 200 milissegundos) e de atuação do músculo sóleo (agonista e antagonista) que foi usado para: (1) análise da variação da excitabilidade reflexa, em porcentagem da onda M máxima, (2) análise da ocorrência de inibição pré-sináptica e (3) análise da variação da inibição pré-sináptica, em porcentagem de inibição. Os resultados mostram que a porcentagem da onda M máxima aumentou significativamente nos três instantes de proximidade com os sujeitos estando em expectativa da execução da tarefa motora quando o músculo sóleo atuaria como agonista da contração, quando comparados com os registros obtidos nas mesmas condições em repouso. Contudo, somente a 200 ms da execução é que foi observado aumento da porcentagem da onda M máxima quando o músculo sóleo atuaria como antagonista. Inibição pré-sináptica ocorreu em todas as condições experimentais, contudo aumento significativo da porcentagem de inibição pré-sináptica foi somente observado a 200 ms da execução da tarefa motora em que o músculo sóleo atuaria como antagonista. Diferenças entre agonista e antagonista com relação ao padrão de excitabilidade reflexa foi somente observado a 600 ms de proximidade da execução da tarefa e essas diferenças com relação à porcentagem de inibição pré-sináptica foi somente detectada a 200 ms. Nossos resultados nos permitem concluir que circuitos neuronais na medula espinhal apresentam atividade no período preparatório para a execução de tarefa motora voluntária que podem estar relacionadas ao comportamento de expectativa da realização de uma ação motora eminente, bem como relacionada ao planejamento motor para a ação a longa proximidade da execução de movimentos. / There is brain activity preceding voluntary movements a few seconds before the execution of the movement. This preparatory activity is responsible for the execution plan that reaches the final common pathway, i.e., the motoneurons. In the last decade, there have been reports indicating the involvement of spinal cord circuits in the preparatory activity for movement. The present work has the objective of verifying the activity of spinal cord neuronal circuits at different times preceding a voluntary action, under an instructed delay period paradigm. Fifteen healthy subjects participated in the study. The protocol included an explanation of the experimental tasks. Electrophysiological recordings of the H reflex with and without presynaptic inhibition conditioning were employed. The epochs of H reflex recording were associated either with a resting period or with one of three pre-action periods. The subject received a cue at an appropriate time about the type of contraction: plantarflexion or dorsiflexion. Peak to peak H reflex values were computed in the control resting period and at 1000 ms, 600 ms and 200 ms before the action. Percent values of H amplitude with respect to maximum M values were computed as well as the level of presynaptic inhibition. The results have shown that the relative H reflex value increased significantly at the three premovement times for the soleus under an agonist contraction (i.e., plantarflexion) when compared to control. However, when the soleus was an antagonist to the contraction (i.e., dorsiflexion) there was a statistical difference in the H amplitude only at 200 ms before movement. Presynaptic inhibition occurred in all experimental conditions, however only at 200 ms before contraction there was a significant increase. Differences in reflex excitability between agonist and antagonist activity were only observed at 600 ms before action. On the other hand, differences in presynaptic inhibition were only found at 200 ms before contraction. The results indicated that spinal cord neuronal circuits are activated during the preparatory period preceding a voluntary action. These may be correlated with an expectancy behavior for the execution of an imminent motor action and also with the planning of a motor action at larger times preceding movement execution.

Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. / The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.