Les pathologies intestinales sont des maladies multifactorielles dont l’incidence ne cesse d’augmenter. Les maladies organiques regroupent les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin tel que la maladie de Crohn (MC) et les pathologies fonctionnelles digestives comprennent les différentes formes du syndrome de l'intestin irritable (SII). Ces pathologies présentes des caractéristiques communes comme des troubles du transit, des douleurs abdominales, un dysfonctionnement de la barrière intestinale et des modifications de la communication bidirectionnelle de l’axe intestin-cerveau et une altération de la composition du microbiote intestinal (dysbiose). Cette dernière peut être en partie associée à un déficit de production en peptides et protéines antimicrobiennes (PAMs) par les cellules de Paneth. Parmi les cibles thérapeutiques stratégiques, une réduction de la dysbiose dans le but de réduire l’état inflammatoire ou micro-inflammatoire de la muqueuse font aujourd’hui l’objet de différentes études. Ces traitements alternatifs montrent l’efficacité d’un régime nutritionnel adapté, d’un apport en probiotiques ou en prébiotiques sur le microbiote intestinal des patients MC et SII, et sur l’intégrité de leur barrière intestinale. Parmi les matrices alimentaires présentant une composition nutritionnelle intéressante proche du lait maternel humain, le lait d’ânesse (LA) contient également une forte teneur en PAMs (lysozyme). En parallèle, un observatoire économique et social de la filière asine commandité par l’Institut National Âne et Mulet fait le diagnostic d’une activité grandissante autour du LA chez les éleveurs français et montre, face à une concurrence italienne et chinoise importante, la nécessité d’une meilleure organisation de la filière via une meilleure valorisation du LA. L’objectif de cette thèse était d’évaluer un potentiel effet santé du LA et d’apporter des preuves scientifiques robustes pour permettre une meilleure valorisation de ce dernier. Ainsi, l’effet d’une consommation orale chronique de LA a été évalué sur deux modèles précliniques murins distincts : un modèle d’iléite expérimentale induite par une administration per os d’indométacine et un modèle de stress psychologique chronique (Water Avoidance Stress, WAS). Dans ce travail, le rôle clé de l’activité du lysozyme dans les effets observés a également été évalué. Des essais de traitements thermiques ont aussi été réalisés pour optimiser un barème de pasteurisation permettant de proposer un LA répondant aux normes réglementaires microbiologiques et sanitaires tout en conservant l’activité du lysozyme contenue dans le lait. Les travaux de cette thèse montrent que le LA possède des propriétés anti-inflammatoires se traduisant par une réduction significative des lésions inflammatoires macroscopiques et microscopiques de l’iléon. Cet effet est associé à une réduction de la dysbiose intestinale et normalise les niveaux de PAMs dans les cellules de Paneth drastiquement réduits lors de l’iléite. Dans le modèle WAS, le LA et la fraction contenant l’activité en lysozyme réduisent l’hypersensibilité viscérale, l’état micro-inflammatoire induites par le stress et restaurent les niveaux de PAMs dans les cellules de Paneth réduits par le stress. Un traitement thermique de 2 min/72°C permet d’augmenter la durée de vie du LA tout en conservant l’activité du lysozyme et ses propriétés santé sur la muqueuse intestinale chez la souris. / Gut pathologies are multifactorial with a constant increasing incidence. Organic diseases include inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease (CD) and functional pathologies include various subtypes of irritable bowel syndrome (IBS). These pathologies present common features such as transit disorders, abdominal pain, dysfunction of the intestinal barrier associated with bidirectional gut-brain axis modifications and alterations of the gut microbiota composition (dysbiosis). Dysbiosis is generally associated with a lack of production of antimicrobial peptides and proteins (AMPs) by Paneth cells. Among the alternative treatment strategies, it has been proposed to reduce gut inflammation by correcting intestinal dysbiosis. Recent studies show the efficacy of a suitable diet, probiotics or prebiotics interventions on gut microbiota and on the integrity of their intestinal barrier in CD and IBS patients. Among interesting food matrices, donkey milk (DM) is a good candidate with a nutritional composition close to human breast milk and contains high levels of AMPs like lysozyme. An economic and social observatory of the donkey industry was ordered by the Institut National Âne et Mulet for a better support of growing French activity around DM against Italian and Chinese competitions. The objective of this thesis was to evaluate the potential beneficial healthy effect of DM and to provide robust scientific evidences for a better valorization of this product. Thus, the effect of chronic oral intake of DM was evaluated on two distinct murine preclinical models: a model of experimental ileitis induced by an oral administration of indomethacin and a model of chronic psychological stress (Water Avoidance Stress, WAS). In these studies, the key role of lysozyme activity in the observed effects was highlighted. In order to develop the DM market in France, thermal treatments have been carried out to optimize a pasteurization process to obtain a DM in accordance with the regulatory microbiological and sanitary standards while preserving the activity of the lysozyme contained in milk. The work of this thesis shows that DM exerts anti-inflammatory properties resulting in a significant reduction of the macroscopic and microscopic inflammatory lesions of the ileum. This effect is associated with a reduction of gut dysbiosis while normalizing the level of drastically reduced AMPs contained Paneth cells in the ileitis model. In the WAS model, DM and the fraction containing activity of lysozyme reduce visceral hypersensitivity, stress-induced gut microinflammatory status and also restore the level of AMPs in Paneth cells . A heat treatment at 2 min/72 °C allows to increase the shelf-life of DM while preserving the activity of lysozyme and its gut beneficial healthy properties in mouse.

Le gène Cdx2 exerce de nombreuses fonctions au cours du développement embryonnaire. Son expression est maintenue spécifiquement dans l’épithélium intestinal adulte. Cdx2 est diminué dans les cancers colorectaux (CCR), favorisant la migration et la dissémination des cellules tumorales. Cette diminution de Cdx2 est réversible, suggérant une dérégulation du gène. Nous avons étudié d’une part les fonctions intestinales de Cdx2 au cours du développement et surtout chez l’adulte, et d’autre part les mécanismes moléculaires associés à la dérégulation de Cdx2 dans les CCR.Une approche d’invalidation conditionnelle de Cdx2 chez la souris a été choisie. Nous montrons que Cdx2 est nécessaire pour l’établissement de l’identité intestinale au cours du développement. De plus, dans l’intestin adulte il contribue au maintien de l’identité des cellules souches et intervient dans la différenciation terminale des cellules épithéliales. Le croisement du modèle murin transgénique pCdx2-9LacZ avec le modèle de cancérogénèse colique spontanée Apc∆14/+ indique que les éléments nécessaires à la diminution d’expression de Cdx2 dans les CCR sont sur le promoteur de 9kb de Cdx2. Par ailleurs, nous montrons une corrélation d’expression entre les protéines HNF4α, régulateur transcriptionnel de Cdx2, et Cdx2 dans des échantillons de tumeurs intestinales humaines et murines. L’invalidation conditionnelle de Hnf4α dans l’intestin est associée à une réduction d’expression de Cdx2 et à une plus grande susceptibilité des animaux à la tumorigenèse colique chimio-induite. HNF4α constitue un facteur important de la dérégulation de Cdx2 dans les CCR et exerce une fonction suppresseur de tumeur dans l’intestin / The Cdx2 gene exerts many functions during embryonic development. Its expression is maintained specifically in the adult intestinal epithelium. Cdx2 expression is reduced in colorectal cancers (CRC); moreover, this reduction promotes migration and the spread of colon tumor cells. The alteration of Cdx2 in CRC is reversible, suggesting a deregulation of the gene. The objectives of my project were to study the functions of Cdx2 during intestinal development and in adults and to study the molecular mechanisms associated with the deregulation of Cdx2 in CRC. An approach of conditional invalidation of Cdx2 in mice has been used. We show that Cdx2 plays a key role in establishing the intestinal identity during development. In addition, at the adult stage Cdx2 is involved in the maintaining of the intestinal stem cells identity and in the control of terminal differentiation of intestinal epithelial cells. Crossing the transgenic mouse model pCdx2-9LacZ with spontaneous colon carcinogenesis model ApcΔ14/+ indicates that the elements necessary for the decrease of Cdx2 expression are located on the Cdx2 promoter of 9kb. Earlier team works have highlighted HNF4α as a transcriptional regulator of Cdx2 expression. In this work, we have demonstrated a correlation between HNF4α and Cdx2 protein expression in samples of human and mouse intestinal tumors. The conditional invalidation of Hnf4α in the intestine is associated with a reduction of Cdx2 expression, and a greater susceptibility for mice to chemo-induced colonic tumorigenesis. HNF4α is an important factor in the deregulation of Cdx2 in CRC and it exerts itself a tumor suppressor function in the gut.

Au début de ce doctorat, plusieurs études avaient identifié l'intestin grêle, siège de l'absorption du glucose, en tant que premier organe impliqué dans le contrôle de l'homéostasie glucidique lors d'un repas. En particulier, il a été démontré que la détection entérique de glucose permettait d'impacter son utilisation par le muscle et le foie, via un relai central impliquant une libération hypothalamique de monoxyde d'azote (NO). De plus, notre groupe a également démontré qu'une altération de la détection entérique du glucose, associée à une réponse neuronale hypothalamique anormale, participait à la mise en place d'un Diabète de Type 2 (DT2). En plus de ces problèmes de détection de nutriments, les patients obèses et diabétiques souffrent de troubles de la motilité intestinale (en particulier d'une hypercontractilité intestinale), liés à une atteinte du Système Nerveux Entérique (SNE). En effet, ce dernier est constitué d'environ 600 millions de neurones interconnectés chez l'Homme, contrôlant les contractions des muscles lisses intestinaux. D'un point de vue régulation, le SNE communique en permanence avec le Système Nerveux Central (SNC) via des voies nerveuses afférentes et efférentes. L'équipe s'intéresse au rôle de l'apeline en tant que nouvelle cible thérapeutique potentielle pour traiter le DT2. En particulier, notre équipe a récemment montré que l'apeline était libérée par les entérocytes dans la partie proximale de l'intestin, et qu'à ce niveau elle contrôlait l'absorption intestinale du glucose. Cependant, le fait que l'apeline puisse également cibler les neurones du SNE, et donc moduler la contractilité intestinale, n'était pas encore démontré. Lors de ce travail de thèse, nous avons ainsi pu montrer qu'en fonction de sa concentration, l'apeline activait des populations neuronales entériques différentes provoquant une stimulation ou, au contraire, une inhibition des contractions duodénales. La stimulation de cette contractilité duodénale par de faibles concentrations d'apeline entraîne une augmentation de l'absorption intestinale de glucose, mais également une diminution de la libération de NO hypothalamique, aboutissant à une moindre utilisation de ce dernier par le muscle squelettique. A l'inverse, de fortes concentrations d'apeline sont associées à une diminution de cette activité duodénale, entraînant un retour de l'ensemble de ces paramètres à des niveaux contrôles. Dans un second temps, nous avons voulu tester si cette motilité duodénale pouvait être considérée comme une cible thérapeutique pour traiter le DT2. Pour cela, nous avons effectué un traitement oral quotidien, pendant une semaine, avec la concentration d'apeline capable de diminuer l'activité duodénale, chez des souris obèses-diabétiques. Cette stimulation chronique par l'apeline permet de restaurer la contractilité duodénale de ces souris diabétiques au même niveau que celle de souris saines. De plus, cet effet est associé à une amélioration de leur tolérance au glucose ainsi que leur index de résistance à l'insuline. Ainsi, ce doctorat a permis de décrire un nouveau mode de communication entre l'intestin et le cerveau dans le contrôle de l'homéostasie glucidique. En effet, moduler les contractions duodénales en modifiant l'activité du SNE permettrait non seulement d'impacter l'absorption intestinale de glucose, mais également d'activer un axe duodénum-hypothalamus aboutissant au contrôle de l'utilisation périphérique de glucose. Dès lors, ce couplage " SNE-contraction duodénale " représenterait une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de maladies métaboliques telles que le DT2. / Prior to this PhD, several studies had determined that the small intestine, the site of glucose absorption, is the first organ involved in the control of glucose homeostasis during food intake. In particular, enteric glucose detection has been demonstrated to impact its utilization by muscles and liver, via a central relay involving hypothalamic nitric oxide (NO) release. Moreover, our group has also demonstrated that an alteration of enteric glucose detection, associated with an abnormal hypothalamic neuronal response, participates in type 2 diabetes (T2D) development. In addition to these defaults of nutrients detection, obese and diabetic patients suffer from intestinal motility disorders (in particular intestinal hypercontractility), linked to an alteration of the Enteric Nervous System (ENS). The ENS is composed of 600 million interconnected neurons in humans, known to control intestinal smooth muscles. The ENS permanently communicates with the Central Nervous System (CNS) via afferent and efferent nervous messages. Our team studies the role of apelin as a new potential therapeutic target to treat T2D. In this context, our group has recently demonstrated that apelin is released by the enterocytes in the proximal part of the intestine. At this site, apelin controls intestinal absorption of glucose. However, it hadn't been addressed yet whether apelin is also able to target enteric neurons, and consequently modulate intestinal contractility. During this PhD, we have highlighted that, depending of its concentration, apelin activates different enteric neuronal populations, leading to stimulation or, on the contrary, inhibition of duodenal contractions. Stimulation of this duodenal contractility by low concentrations of apelin causes an increase in intestinal glucose absorption, but also a decrease in hypothalamic NO release, leading to a reduced utilization of glucose by skeletal muscle. Conversely, high concentrations of apelin are associated with a decrease in the duodenal activity, leading to the restoration of all these parameters at basal levels. Then, we wanted to test whether duodenal motility could be considered as a therapeutic target to treat T2D. We performed a daily oral treatment, during one week, with the concentration of apelin able to decrease duodenal activity in obese and diabetic mice. We have shown that this chronic apelin treatment restores duodenal contractility in diabetic mice, at a similar level to that observed in normal mice. Moreover, this effect is associated with an improved glucose tolerance and insulin resistance index. Thus, this PhD describes a new mode of communication between the intestine and the brain, in the control of glucose homeostasis. Indeed, the modulation of duodenal contraction by targeting ENS activity could not only impact intestinal glucose absorption, but also activate a duodenum-hypothalamus axis, leading to the control of peripheral glucose utilization. Consequently, the "ENS-duodenal contraction" coupling could represent a promising therapeutic target to treat metabolic diseases such as T2D.

Clostridium difficile est une bactérie enteropathogène responsable d'infections intestinales dont les manifestations cliniques varient d’une simple diarrhée à une colite pseudomembraneuse parfois mortelle. L’une des problématiques majeures rencontrées dans la prise en charge des infections à C. difficile (ICD) est la survenue de récidives. Chez de nombreuses espèces bactériennes, la formation de biofilm est associée à la chronicité de l’infection. Le biofilm est un mode de vie dans lequel les bactéries sont engluées dans une substance polymérique qu'elles secrètent elles-mêmes. L’aptitude de C. difficile à former un biofilm in vitro a été clairement établie depuis 2012. Cependant aucune étude n’a montré jusqu’ici s’il est capable de former un biofilm in vivo. L’objectif de cette thèse était d’une part d’étudier différents paramètres impliqués dans la formation du biofilm in vitro et d’autre part de déterminer si C. difficile est capable de former un biofilm in vivo. Dans un premier temps, nous avons analysé la capacité de différentes souches de C. difficile (souches cliniques et souches de laboratoires modifiées génétiquement) à former un biofilm in vitro. Parmi ces dernières, la souche mutée pour le gène cwp84, codant une protéase de surface responsable de la maturation de la couche S de C. difficile, présente un biofilm particulièrement robuste et épais comparé à la souche parentale 630∆erm. L’activité protéolytique de Cwp84 est donc impliquée dans la formation du biofilm et module certaines propriétés de surface de la bactérie telles que l’hydrophobicité. Nous avons également étudié la composition en sucre de la matrice du biofilm, après une étape de mise au point qui a permis de déterminer les conditions permettant d’obtenir suffisamment de matériel. Les conditions retenues ont été les suivantes : formation de biofilm sur un support en verre, en présence de glucose et en milieu renouvelé. La présence d’un sucre qui possède un profil proche du PSII (polysaccharide associé à la surface des cellules planctoniques de C. difficile) dans la matrice du biofilm a été détecté par spectroscopie infrarouge. Dans un second temps, afin d’étudier l’aptitude de C. difficile à former un biofilm in vivo, différents modèles animaux ont été utilisés : un modèle de souris monoxéniques dans lequel plusieurs souches de C. difficile ont été testées (souches 630∆erm, mutant cwp84, R20291, P30) et un modèle de souris dixénique pour étudier la formation de biofilm mixte (C. difficile/Finegoldia magna et C. difficile/Clostridium scindens). Dans le modèle monoxénique, quelles que soient les souches testées, C. difficile est distribué de manière hétérogène tout au long de la surface du tissu intestinal. Les bactéries sont majoritairement retrouvées isolées sauf pour la souche R20291 qui forme le plus souvent des petits agrégats. Pour cette souche, différents marquages immunohistochimiques réalisés sur des coupes de cecum et de colon ont montré que la majorité des bactéries sont enchâssées dans de petites structures en 3 dimensions adhérentes à la couche du mucus. Le polysaccharide PSII est détecté en grande quantité à l'intérieur de cette structure. Ce composé étant présent dans la matrice de biofilm de C. difficile formé in vitro, ces résultats suggèrent que la souche R20291 pourrait s’organiser en biofilm dans le modèle de souris monoxénique. En modèle de souris dixéniques, nous avons montré que la présence de F. magna n’influe pas sur le niveau de colonisation de C. difficile, alors que l'association avec C. scindens semble être bénéfique aux deux bactéries puisqu'une augmentation de la population globale de deux espèces est observée comparé à la population présente dans chaque modèle mono-espèce. En conclusion, une souche productrice de biofilm in vitro semble être capable de s’organiser en une structure biofilm in vivo. Le rôle du biofilm dans l'étape de colonisation du colon par C. difficile et les rechutes des ICD devra être analysé. / Clostridium difficile is an enteropathogenic bacterium responsible for intestinal infections, the clinical symptoms vary from moderate diarrhea to pseudomembranous colitis, sometimes fatal. One of the major problems encountered in the management of C. difficile infections (DCI) is the occurrence of recurrences. In many bacterial species, biofilm formation is associated with the chronicity of infection. Biofilm is a way of life in which bacteria are entrapped in a polymeric substance secreted by the bacteria themselves. The ability of C. difficile to form an in vitro biofilm has been clearly established since 2012. However, no study has so far shown whether it is capable of forming a biofilm in vivo. The objective of this thesis was to analyze different parameters involved in the formation of biofilm in vitro and to determine whether C. difficile is able to form a biofilm in vivo.We first analyzed the ability of different strains of C. difficile to form a biofilm in vitro (clinical strains and strains genetically modified laboratories). Among the latter, the mutant strain for the cwp84 gene, encoding a surface-associated protease responsible for the maturation of the S layer of C. difficile, forms a particularly robust and thick biofilm compared to the 630Δerm parental strain. The proteolytic activity of Cwp84 is involved in the formation of biofilm and modulates certain surface properties of the bacterium such as hydrophobicity. We have also studied the polysaccharide composition of the biofilm matrix, after a development stage that allowed us to determine the optimal conditions for obtaining sufficient material. The conditions retained were the following: formation of biofilm on a glass support in the presence of glucose and in a renewed medium. We were able to determine by infrared spectroscopy the presence of a sugar which has a similar profile than the PSII (polysaccharide associated with the surface of C. difficile planktonic cells) in the matrix of the biofilm.Second, in order to study the ability of C. difficile to form a biofilm in vivo, different animal models were used: a monoxenic mouse model in which we tested several strains of C. difficile (strains 630Δerm, mutant cwp84, R20291, P30) and a dixenic mouse model to study the formation of mixed biofilm (C .difficile/Finegoldia magna and C. difficile/Clostridium scindens). In the monoxenic model, regardless of the strains tested, C. difficile is distributed heterogeneously throughout the intestinal tissue surface. The bacteria are mostly found isolated except for C. difficile R20291 which usually forms small aggregates. For this strain we have shown, thanks to various immunohistochemical labeling performed on cecum and colon sections, that the majority of the bacteria are embedded in a small 3-dimensional structures overlaying the mucus layer. The PSII polysaccharide is present in a large amount in this structure. As this compound has been detected in the in vitro C. difficile biofilm matrix, these results suggest strongly that the R20291 strain could be organized into biofilm structures in the monoxenic mouse model. In the dixenic mouse model, we have shown that the presence of F. magna does not influence the level of colonization of C. difficile, whereas the association with C. scindens seems to be beneficial to both bacteria since an increase of the global population is observed in this model compared to the population present in each single-species model.To conclude, an in vitro biofilm producing strain appears to be able to organize in a biofilm structure in vivo. The role of biofilm in the colonization step of the intestinal tract by C. difficile and in the occurrence of recurrences should be further analyzed.

Le renouvellement de l’épithélium intestinal repose sur la prolifération incessante de cellules souches intestinales (CSI) capables de régénérer l’intégralité de l’épithélium en 3 à 5 jours. Des altérations de ces dernières sont à l’origine de la transformation tumorale. L’étude des mécanismes impliqués dans la protection des CSI face à différents stress est donc essentielle pour mieux comprendre l’homéostasie et les pathologies intestinales. Dans un modèle de souris prédisposées à développer des tumeurs suite à la perte du gène Apc, notre équipe a pu précédemment démontrer une activation de l’autophagie nécessaire à la croissance tumorale. Nos travaux visent à étudier le rôle de ce processus catabolique dans l’homéostasie des CSI. Pour ce faire, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés et des cultures d’organoïdes afin d’étudier les effets de l’inhibition de l’autophagie dans l’homéostasie intestinale et en particulier dans les CSI.Nos travaux indiquent que l’inhibition de l’autophagie par l’invalidation du gène Atg7 conduit à une activation de p53 et de l’apoptose spécifique des CSI. L’invalidation simultanée du gène Tp53 empêche la mort des CSI déficientes en autophagie. De plus, au long terme, ces souris développent des tumeurs, contrairement aux souris invalidées uniquement pour les gènes Atg7 ou Tp53. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’inhibition de l’autophagie sensibilisait les CSI à l’apoptose suite à une accumulation de dommages cytotoxiques. Par une analyse d’expressions géniques des CSI issues de cryptes contrôles et invalidées pour le gène Atg7, nous avons mis en évidence une altération des réponses associées au stress oxydant et à la réparation de l’ADN. Confirmant ces signatures, nous avons observé des dommages de l’ADN dans les cryptes déficientes en autophagie et un défaut de réparation de ces dommages suite à une irradiation. Nous observons également une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène dans les CSI déficientes en autophagie associée à une atténuation de la réponse antioxidante médiée par NRF2. Des traitements antibiotiques à large-spectre ou antioxydants améliorent la survie des CSI déficientes en autophagie et soutiennent l’influence des espèces réactives de l’oxygène et de la flore intestinale sur la mort des CSI. Nos travaux indiquent donc un rôle important de l’autophagie dans la protection et le maintien des CSI, de par son contrôle des espèces réactives de l’oxygène, du microenvironnement bactérien et des voies de réparation de l’ADN. / The renewal of the intestinal epithelium relies on the continuous proliferation of stem cells capable of regenerating the entire epithelium every 3 to 5 days. These intestinal stem cells (ISC) are thought to be the cell of origin for colorectal cancer. Thus, characterizing the mechanisms involved the protection of ISC against different stresses is key to understanding both intestinal homeostasis and tumor development. In tumoral tissue from mice predisposed to intestinal tumor development following the loss of the tumor suppressor gene Apc, our laboratory previously showed an upregulation of autophagy required for tumor growth. Our work aims to understand the role this catabolic mechanism in the homeostasis of ISC. To this end, we use genetically modified mouse models and intestinal organoid culture to study the effects of autophagy inhibition in intestinal homeostasis and in particular in ISC.We found that the inhibition of autophagy upon deletion of the gene Atg7 results in p53 activation and apoptosis of ISC specifically. The simultaneous deletion of Tp53 prevents the death of autophagy-deficient ISC. Moreover, over time, mice deficient for both Atg7 and Tp53 develop tumors, contrary to those deficient for either Atg7 or Tp53 alone. We therefore hypothesized that the inhibition of autophagy sensitizes ISC to p53-mediated apoptosis as a result of accumulated pro-tumorigenic damages. Transcriptomic analysis on sorted control or Atg7-deficient ISC revealed aterations in oxidative stress and DNA damage responses. Confirming these signatures, we observed DNA damages in autophagy-deficient crypts along with a defect in the repair of induced damages following irradiation. We additionally observed an accumulation of reactive oxygen species in autophagy-deficient ISC linked to a downregulation of the NRF2-mediated antioxidant response. Wide-spectrum antibiotic or antioxidant treatments improve the survival of autophagy-deficient ISC and support the contribution of both reactive oxygen species and the intestinal microbiota to the death of ISC. Our work therefore reveals we find an important function of autophagy in the integrity and maintenance of ISC by controlling reactive oxygen species, the microbial microenvironment and DNA repair pathways.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'intestin est reconnu comme un organe métabolique clé impliqué dans le développement des complications de l'obésité et du diabète. En présence d'obésité, l'intestin grêle développe un état local de résistance à l'insuline, un métabolisme lipidique altéré et une inflammation ainsi qu'une perméabilité paracellulaire accrue. En raison de l'environnement complexe des cellules épithéliales intestinales, il n'est pas clair à ce jour si la dyshoméostasie intestinale peut être induite par des altérations endogènes liées à l'obésité de l'hôte. L'objectif de cette étude était d'évaluer l'impact individuel de l'hyperglycémie, la dyslipidémie et l'inflammation sur les fonctions épithéliales intestinales en utilisant des organoïdes de crypte intestinale. Les organoïdes, dérivés du duodénum de souris mâle C57BL/6, ont été incubés 24 h dans des conditions inflammatoires, dyslipidémiques avec un taux élevé d'acide gras libres et hyperglycémiques. L'expression génique ainsi que la sensibilité à l'insuline ont été mesuré par qPCR et analyse densitométrique, respectivement. Nous montrons que les organoïdes, et donc les cellules de l'épithélium intestinal, répondent bien à l'insuline car cette hormone induit une activation dose-réponse de la phosphorylation d'Akt, un effecteur clé de cette voie de signalisation. La signalisation de l'insuline a été réduite par le cocktail inflammatoire et par la dyslipidémie, alors que l'hyperglycémie réduit la sensibilité à l'insuline à des niveaux élevés de glucose. L'état inflammatoire affecte l'expression des gènes liés à la perméabilité paracellulaire intestinale, à la réponse immunitaire et inflammatoire, au métabolisme des lipides et des lipoprotéines et au transport des nutriments, alors que la dyslipidémie a eu peu d'effet sur ces gènes. Cette étude suggère que les changements endogènes de l'hôte liés à l'obésité représentent un mécanisme important dans le développement des altérations de l'intestin grêle lors du développement de l'obésité. Ces altérations auraient à leur tour un impact sur les complications systémiques, notamment en augmentant le taux de lipoprotéines et de glucose libéré en circulation.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les lipides polaires (LP) laitiers (~2% des lipides du lait) présentent un potentiel bioactif élevé, notamment lié à leur richesse en sphingomyéline (SM, ~25% des LP). Nos hypothèses sont que les LP laitiers peuvent exercer certains de leurs effets bénéfiques par l'intermédiaire de la SM, notamment sur l'intégrité de la barrière intestinale et le microbiote, ce qui pourrait contribuer à réduire l'inflammation métabolique. Nous avons testé à long terme in vivo l'impact de régimes hyperlipidiques (HF) supplémentés en LP laitiers. In vitro, nous avons étudié l'effet des LP laitiers et de la SM (laitière ou d'oeuf) sur l'expression génique des protéines de jonctions serrées. Nos travaux in vitro ont également permis de tester que l'interleurkine-8 (IL-8), impliquée dans la maturation de l'épithélium intestinal, serait un acteur des modifications intestinales en réponse aux LP laitiers et/ou à la SM. L'impact à court terme d'un gavage chez la souris avec des LP laitiers ou de la SM laitière a également été étudié. Après 8 semaines de régime HF supplémenté en LP laitiers (1,6%) les souris présentent un moindre gain de poids en comparaison au régime HF. Nous observons une augmentation de Bifidobacterium animalis pour le groupe contenant 1,1% de LP laitiers. Le groupe nourri avec une supplémentation de 1,6% de LP laitiers présente une diminution de Lactobacillus reuteri et des cryptes coliques plus profondes. Nous retrouvons également une plus forte teneur en acide gras spécifiques des LP laitiers (C23:0, C24:0 et C24:1, présents dans la SM laitière) dans les lipides fécaux. Ces acides gras sont corrélés à la teneur en Lactobacillus spp. Parmi les protéines de jonctions serrées impliquées dans la perméabilité paracellulaire, seule l'expression de ZO-1 tend à être augmentée dans le duodénum. In vitro, lorsque les cellules Caco-2/TC7 sont incubées avec des micelles mixtes supplémentées en SM pure, une augmentation de l'expression génique des protéines de jonctions serrées, ainsi qu'une augmentation de la concentration d'IL-8 en apicale et en basolatérale, sont observées. Ces effets sont également retrouvés avec la SM d'oeuf, contrairement aux LP laitiers totaux. L'incubation d'IL-8 recombinante humaine conduit à une augmentation de l'expression génique des protéines de jonctions serrées. Un gavage avec de la SM laitière pure chez la souris induit une augmentation de l'expression des homologues murins de l'IL-8 (KC et Mip-2). Cette étude suggère que les LP laitiers peuvent limiter la prise de poids induite par un régime HF et moduler le microbiote intestinal. La présence de produits d'hydrolyse spécifiques de la SM pourrait expliquer les effets sur le côlon et le microbiote intestinal. Les résultats in vitro, suggèrent un impact spécifique de la SM sur la barrière intestinale. L'IL-8 semble impliquée dans la régulation de l'expression des protéines de jonctions serrées. Ces résultats contribuent à expliquer les effets bénéfiques démontrés des LP laitiers. L'exploration mécanistique des effets directs et/ou indirects de la SM et de l'IL-8 sur la barrière intestinale reste à élucider / Interest is growing for the metabolic impact of milk polar lipids (MPL, ~2% of dairy lipids), which present a high bioactive potential, particularly related to their content in sphingomyelin (SM, ~ 25% of MPL). Our hypotheses are that MPL can exert some of their beneficial effects through SM, including the integrity of the intestinal barrier and the microbiota, which could contribute to reduce metabolic inflammation. We tested the metabolic impact of the addition of MPL in a high-fat (HF) diet in mice on the modulation of the intestinal barrier. In vitro, we studied the effect of SM (milk or egg) on tight junction protein We also tested in vitro, that interleurkin-8 (IL-8), which is involved in the maturation of the intestinal epithelium, is an actor of intestinal changes in response to MPL and/or MSM. The short-term impact in mice of MPL or milk SM was also studied. After 8 weeks of diet, the supplementation with 1.6% of MPL prevented the HF-diet-induced body weight gain. In caecal microbiota, addition of 1.1% of MPL induced a specific increase in Bifidobacterium spp., in particular B. animalis. The group fed with a 1.6% MPL-supplementation showed a specific decrease in Lactobacteria reuteri and colonic crypt depth were greatest. We also found a higher content of fatty acids specific of MPL (C23:0, C24:0 and C24:1, found in milk SM) in fecal lipids of mice. These fatty acids are correlated with Lactobacillus spp. Among the tight junction proteins involved in paracellular permeability, only the expression of ZO-1 tended to be increased in the duodenum. In vitro, when Caco-2/TC7 cells were incubated with mixed micelles supplemented with pure SM, an increase in the gene expression of tight junction proteins (ZO-1, occludin, JAM-1, claudin-1) and an increase in apical and basolateral IL-8 concentration were observed. These effects were also found with egg SM, unlike total MPL. Incubation of recombinant human IL-8 led to an increase in gene expression of tight junction proteins. Gavage with pure milk- SM in mice induced an increase in the expression of murine homologs of IL-8 (KC and Mip-2). Our results show that MPL can limit HF-induced body weight gain and modulate the abundance of beneficial bacteria of the gut microbiota. The presence of SM-specific hydrolysis products may explain the effects on the colon and gut microbiota. In vitro results suggest a specific impact of pure SM on the intestinal barrier. IL-8 appears to be involved in the regulation of tight junction protein expression. This can contribute to explain reported beneficial effects of MPL in mice regarding HF induced metabolic disorders. The mechanistic exploration of direct and / or indirect effects of SM and IL-8 on the intestinal barrier remains to be elucidated

L’intestin joue un rôle clé dans le contrôle de l’homéostasie énergétique. Les entérocytes sont des cellules polarisées qui permettent les échanges entre la lumière intestinale (membrane apicale) et le compartiment lymphatique et sanguin (membrane baso-latérale). Dans cette thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés au contrôle par les entérocytes de deux processus liés au métabolisme des lipides et du cholestérol : l’excrétion trans-intestinale de cholestérol (TICE) et l’absorption des lipides alimentaires.Très récemment, il a été montré que l’intestin contribue à 20-30% de l’excrétion fécale du cholestérol chez la souris. Ce mécanisme, appelé TICE, implique le passage direct du cholestérol provenant de la circulation sanguine à travers les entérocytes vers les fèces. De par son caractère modulable par des substances pharmacologiques comme l’ézétimibe et les statines, le TICE représente une cible thérapeutique potentielle pour corriger les dyslipidémies athérogènes du diabétique. Cependant, les mécanismes moléculaires gouvernant le transport rétrograde du cholestérol (du pôle baso-latéral au pôle apical) dans l’entérocyte lors du TICE, sont complètement inconnus. Dans une première étude, nous avons mis en évidence la lignée entérocytaire humaine Caco-2/TC7 comme un modèle d’étude des processus trans-entérocytaires liés au TICE. Nous avons d’abord montré que suite à l’incubation avec du plasma humain dans le compartiment baso-latéral et des micelles lipidiques dans le compartiment apical, les cellules Caco-2/TC7 miment des caractéristiques du TICE in vivo. De plus, grâce à ce modèle in vitro, nous avons pu identifier les microtubules comme acteurs nécessaires au transport rétrograde du cholestérol dans l’entérocyte. Dans une seconde étude, nous nous sommes intéressés au contrôle par le récepteur nucléaire Rev-erbα de la production des chylomicrons (CM) par les entérocytes. En effet, bien qu’essentiellement vue comme la conséquence d’une clairance retardée, des données émergentes présentent la surproduction de CM par l’intestin comme un contributeur majeur de la dyslipidémie chez l’insulino-résistant. Il existe une balance, au sein de l’entérocyte, entre l’utilisation des lipides absorbés pour un stockage transitoire sous forme de gouttelettes lipidiques (GL) cytosoliques ou pour l’assemblage de lipoprotéines riches en triglycérides (LRT). Le récepteur nucléaire Rev-erbα est un répresseur transcriptionnel impliqué dans le métabolisme énergétique et le rythme circadien. Rev-erbα contrôle particulièrement le métabolisme lipidique au niveau du foie et le catabolisme des LRT. Pour cette seconde étude, une lignée Caco-2/TC7 invalidée pour Rev-erbα (sh Rev-erbα) a donc été développée par infection lentivirale et différenciée sur insert. Les résultats indiquent que suite à l’incubation avec des micelles lipidiques dans le compartiment apical, les cellules Caco-2/TC7 sh Rev-erbα sécrètent plus de LRT dans le milieu baso-latéral et stockent moins de lipides sous la forme de GL cytosoliques. De plus, la lignée Caco-2/TC7 sh Rev-erbα présente une activité lipophagique plus importante et l’inhibition de l’autophagie par la bafilomycine dans cette lignée restaure la sécrétion baso-latérale de LRT et le stockage intracellulaire de GL aux mêmes niveaux que ceux de la lignée sh control. Cette seconde étude montre donc que l’invalidation de Rev-erbα dans l’entérocyte entraîne une augmentation de la mobilisation des lipides des GL via le processus de la lipophagie résultant en une augmentation de la sécrétion de LRT. Notre hypothèse est que Rev-erbα joue un rôle clé dans le contrôle de la balance GL/LRT et donc de la triglycéridémie post-prandiale.Les deux études présentées dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes liés au contrôle du métabolisme lipidique par l’intestin et mettent ainsi en avant l’intestin comme une cible thérapeutique potentielle pour corriger les dyslipidémies du diabétique. / The intestine plays a key role in the control of energy homeostasis. Enterocytes, which constitute the main cellular type of intestinal epithelium (> 90%), are polarized cells allowing exchanges between intestinal lumen (apical membrane) and lymph/blood compartment (basolateral membrane). In this thesis, cholesterol and lipid metabolism control by enterocytes was studied and particularly, trans intestinal cholesterol excretion (TICE) and dietary lipid absorption.Recently, it has been estimated that intestine contributes 20-30% of fecal neutral sterol excretion in chow-fed mice. This pathway called TICE involves the direct luminal secretion of plasma-derived cholesterol by enterocytes. Moreover, TICE can be pharmacologically modulated, for instance by ezetimibe and statins and so, represents a new therapeutic target in order to prevent atherosclerosis in type 2 diabetic patients. However, at present, the molecular mechanisms behind the trans-enterocytic process of TICE are still unknown, especially the steps sustaining cholesterol entry, trafficking and efflux in enterocytes. In the first study of this thesis, we highlighted the human enterocytic Caco-2/TC7 cell line as a suitable model to study the enterocyte-related processes of TICE. We have first shown that upon basolateral incubation with human plasma and apical incubation with lipid micelles, differentiated Caco-2/TC7 cells mimic some of the in vivo TICE features. Moreover, using this model, we have identified a key role of the microtubule network in the process.In the second study of this thesis, chylomicron secretion by enterocytes and its control by the nuclear receptor Rev-erbα were investigated. Indeed, although chylomicron remnant accumulation has been associated to a delayed clearance by the liver, some recent studies show that chylomicron overproduction by the intestine is a major contributor to dyslipidemia in insulin resistant patients. Dietary lipid absorption results from a balance between transient storage in enterocytes as cytosolic lipid droplets (LD) and secretion as triglyceride-rich lipoproteins (TRL). The nuclear receptor Rev-erbα is a transcriptional repressor involved in the energy metabolism and the circadian rhythm. Particularly, Rev-erbα controls lipid metabolism in the liver and thus the catabolism of TRL. The aim of this second study was to investigate the role of Rev-erbα in intestinal lipid metabolism and particularly in TRL secretion. To study that, Caco-2/TC7 cells infected with lentivirus encoding or not a shRNA targeting Rev-erbα (sh Rev-erbα) were grown on transwells. Compared to sh control, sh Rev-erbα Caco-2/TC7 cells secrete higher amounts of micelle-derived LRT in the basolateral medium and exhibit lower quantity of neutral lipids stored as cytosolic LD, whereas the apical uptake is not different. Activation of lipophagy in sh Rev-erbα compared to sh control cells was evidenced by a higher autophagic flux and an increased colocalization of the autophagy marker LC3 with LD. Finally, autophagy inhibition with bafilomycin in sh Rev-erbα cells restores lipid secretion to the same level as in sh control cells. This second study show that Rev-erbα knock-down in enterocytes leads to a higher lipophagy-mediated remobilization of intracellular lipids and an increased TRL secretion. Our hypothesis is that Rev-erbα may be a molecular gear in the control of chylomicron secretion and a major regulator of post-prandial triglyceridemia.In conclusion, these two studies allow to better understand lipid metabolism control by the intestine: the first one by identifying the contribution of the microtubule network in enterocytes for trans-enterocytic retrograde cholesterol transport; the second one by highlighting the nuclear receptor Rev-erbα as a regulator of TRL secretion by enterocytes. These two studies point out the intestine as a potential therapeutic target to treat dyslipidemia in type 2 diabetic patients.