Reaktive Sauerstoffspezies sind die entscheidenden Faktoren der pulmonalen Toxizität unter Radio-Chemotherapie. Sie induzieren eine akute pulmonale entzündliche Reaktion, unter der es zur Ausschüttung einer sich selbst verstärkenden Zytokinkaskade im Sinne eines multifaktoriellen Zytokinnetzwerkes und in der Folge unter einer persistierenden Zytokinkaskade zur Generierung von sekundären reaktiven Sauerstoffspezies kommt. Die Aktivierung dieser Zytokinkaskade ist noch Monate nach Chemotherapie oder Strahlentherapie auch bei Patienten, die klinisch keine Symptome der Lungenschädigung zeigen, nachweisbar. Dieser Prozeß kann, ähnlich wie bei der fibrosierenden Alveolitis, mit einer Fibrosierung des Lungengewebes und mit Ablagerung von extrazellulärer Matrix einhergehen. Die vorliegende Arbeit hat durch die systematische Analyse an 261 Lavagen von 199 Bronchialkarzinom-Patienten vor, unter und nach zytoreduktiver Therapie die Determinanten des oxidativen pulmonalen Stress untersucht. Als Meßparameter des akuten oxidativen Stress ist die Gesamtzellzahl in der BALF, der Methioninsulfoxidgehalt sowie die Konzentration von Glutathion, IL-1, IL-6 und IL-8, TNF-alpha, weiterhin die VEGF-Konzentration in der ELF geeignet. Erstmalig gezeigt werden konnte hierbei, daß VEGF nicht nur im Rahmen der Neoangiogenese, sondern auch durch reaktive Sauerstoffspezies hochreguliert wird und oxidativen Stress sensitiv anzeigt. Bei manifester Lungenfibrosierung könnte P-III-P ein sensitiver Marker der Fibroblasten-aktivierung und der Produktion extrazellulärer Matrix sein. Die Untersuchungen ergaben zwischen den Folgen der Strahlentherapie und Chemotherapie lediglich quantitative, keine qualitativen Unterschiede. Die vorliegende Arbeit möchte die Grundlage schaffen, dosisintensivierte multimodale Therapien bezüglich der oxidativen pulmonalen Belastungen bei Patienten mit Bronchialkarzinom invasiv zu monitoren. Dies könnte eine individuelle Dosisoptimierung durch die Bestimmung der oxidativen pulmonalen Kapazität, insbesondere der Glutathionkonzentration in der ELF, schaffen. / Induction of reactive oxygen is the main pathway of acute pulmonary injury during radio-chemotherapy. This release of cytokines during inflammation leads to a self perpetuating cytokine cascade as a cytokine network, resulting in the generation of secondary oxidative stress. This cytokine activation is detectable during therapy as well as months after therapy, even if the patient is clinically asymptomatic. This activated cytokine network can be accompanied by the deposition of extracellular matrix (similar as in lung fibrosis). In our study, we analysed 261 bronchoalveolar lavages (BAL) from 199 patients with lung carcinoma under, before and after chemotherapy and / or radiotherapy. The following BAL parameters indicating oxidative stress were found: total cell count, concentration of methionine sulfoxide, gluthatione, IL-1, IL-6, IL-8, TNF-alpha and VEGF. It was shown for the first time that VEGF is also upregulated by oxidative stress. If lung fibrosis is manifest, P-III-P could be a marker of activation of fibroblasts and of the production of extracellular matrix. In general, differences found in measured parameters during chemotherapy or radiotherapy were of quantitative, not of qualitative nature. Our study wants to lay the groundwork in monitoring pulmonary stress invasively in lung cancer patients. This could lead to better individual dose application by defining the antioxidative capacity, especially the gluthatione concentration in the BAL.

KRAS ist eines der am häufigsten mutierten Onkogene in Darmkrebspatienten. Dies macht es zu einem guten Ansatzpunkt für gezielte Krebstherapien. Trotz jahrzehntelanger Forschungsbemühungen hat sich jedoch keines der zur Inhibition des mutierten KRAS entwickelten Medikamente klinisch etablieren können. Um eventuelle Schwachstellen von KRAS mutierten Darmkrebszellen aufzudecken, wurde in der vorliegenden Studie ein shRNA basierter Screen in CaCo2 Zellen mit konditioneller KRAS(G12V) Expression ausgeführt. Die maßangefertigte shRNA-Bibliothek umfasste 121 ausgewählte Gene, die zuvor nach MEK Inhibition als stark hoch- oder herunterreguliert identifiziert wurden. Der Screen sowie die Screen-Validierung zeigten, dass KRAS(G12V) exprimierende CaCo2 Zellen besonders sensitiv für den Knockdown des DNA Replikationslizensierungsfaktors Minichromosome Maintenance Complex Component 7 (MCM7) waren, wohingegen sich KRAS(wt) CaCo2 Zellen als weitestgehend resistent gegenüber des MCM7 Knockdowns erwiesen. Ähnliche Ergebnisse wurden im isogenen DLD 1 Zellmodell erzielt. Des Weiteren hat der Knockdown von MCM7 spezifisch in KRAS mutierten Zellen zu erhöhtem Replikationsstress geführt, der durch gesteigerte nukleare RPA Fokalisierung nachgewiesen wurde. Weitere Untersuchungen haben außerdem eine signifikant erhöhte Anzahl an mitotischen Zellen nach gleichzeitigem MCM7 Knockdown und KRAS(G12V) Expression ergeben. Diese Zunahme an mitotischen Zellen wurde zusätzlich von einer stark angestiegenen Anzahl an DNS Schäden in der Mitose begleitet. Das hohe Maß an DNS Schäden in der Mitose kann auf den gesteigerten Replikationsstress zurückgeführt werden, der ungelöst zu einer gestörten Segregation der Chromosomen in der Mitose führt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass KRAS mutierte Darmkrebszellen sensitiv auf den Knockdown von MCM7 sind. Demzufolge könnte die Inhibition von DNS Replikationslizensierung ein geeigneter Ansatz für die gezielte Therapie von KRAS mutierten Darmkrebs sein. / KRAS ist eines der am häufigsten mutierten Onkogene in Darmkrebspatienten. Dies macht es zu einem guten Ansatzpunkt für gezielte Krebstherapien. Trotz jahrzehntelanger Forschungsbemühungen hat sich jedoch keines der zur Inhibition des mutierten KRAS entwickelten Medikamente klinisch etablieren können. Um eventuelle Schwachstellen von KRAS mutierten Darmkrebszellen aufzudecken, wurde in der vorliegenden Studie ein shRNA basierter Screen in CaCo2 Zellen mit konditioneller KRAS(G12V) Expression ausgeführt. Die maßangefertigte shRNA-Bibliothek umfasste 121 ausgewählte Gene, die zuvor nach MEK Inhibition als stark hoch- oder herunterreguliert identifiziert wurden. Der Screen sowie die Screen-Validierung zeigten, dass KRAS(G12V) exprimierende CaCo2 Zellen besonders sensitiv für den Knockdown des DNA Replikationslizensierungsfaktors Minichromosome Maintenance Complex Component 7 (MCM7) waren, wohingegen sich KRAS(wt) CaCo2 Zellen als weitestgehend resistent gegenüber des MCM7 Knockdowns erwiesen. Ähnliche Ergebnisse wurden im isogenen DLD 1 Zellmodell erzielt. Des Weiteren hat der Knockdown von MCM7 spezifisch in KRAS mutierten Zellen zu erhöhtem Replikationsstress geführt, der durch gesteigerte nukleare RPA Fokalisierung nachgewiesen wurde. Weitere Untersuchungen haben außerdem eine signifikant erhöhte Anzahl an mitotischen Zellen nach gleichzeitigem MCM7 Knockdown und KRAS(G12V) Expression ergeben. Diese Zunahme an mitotischen Zellen wurde zusätzlich von einer stark angestiegenen Anzahl an DNS Schäden in der Mitose begleitet. Das hohe Maß an DNS Schäden in der Mitose kann auf den gesteigerten Replikationsstress zurückgeführt werden, der ungelöst zu einer gestörten Segregation der Chromosomen in der Mitose führt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass KRAS mutierte Darmkrebszellen sensitiv auf den Knockdown von MCM7 sind. Demzufolge könnte die Inhibition von DNS Replikationslizensierung ein geeigneter Ansatz für die gezielte Therapie von KRAS mutierten Darmkrebs sein. / With KRAS being one of the most frequently altered oncogenes in colorectal cancer (CRC), it is an obvious target for cancer therapy. However, despite enormous efforts over the past three decades to target mutated KRAS, not a single drug has made it to the clinic. To unravel vulnerabilities of KRAS-mutant CRC cells, a shRNA-based screen was performed in CaCo2 cells harboring conditional oncogenic KRAS(G12V). The custom-designed shRNA library comprised 121 selected genes, which were previously identified to be strongly up- or downregulated in response to MEK inhibition. The screen as well as the subsequent validations showed that CaCo2 cells expressing KRAS(G12V) were sensitive to the suppression of the DNA replication licensing factor Minichromosome Maintenance Complex Component 7 (MCM7), whereas KRAS(wt) CaCo2 cells were largely resistant to MCM7 suppression. Similar results were obtained in an isogenic DLD-1 cell culture model. Knockdown of MCM7 in a KRAS-mutant background led to replication stress as indicated by increased nuclear RPA focalization. Further investigation showed a significant increase in mitotic cells after simultaneous MCM7 knockdown and KRAS(G12V) expression. The increased percentage of mitotic cells coincided with strongly increased DNA damage in mitosis. Taken together, the accumulation of DNA damage in mitotic cells is due to replication stress that remained unresolved, which results in mitotic catastrophe and cell death. In summary, the data show a vulnerability of KRAS mutant cells towards suppression of MCM7 and suggest that inhibiting DNA replication licensing might be a viable strategy to target KRAS-mutant cancers.

Die jährliche Inzidenz von Krebserkrankungen liegt in Deutschland bei 450.000. Angst und Depression können zu jedem Zeitpunkt als Folge der Erkrankung selbst, aber auch der oft schwerwiegenden Behandlungen auftreten. In Studie 1 wurde der Frage nach der Wirksamkeit psychoonkologischer Interventionen im perioperativen Setting nachgegangen. 132 Patienten wurden anhand des kritischen Wertes von 12 in der HADS entweder in eine low-risk- oder eine high-risk-Gruppe eingeteilt. Innerhalb jeder Gruppe wurden diese in einen Arm mit Intervention und in einen Arm ohne Intervention randomisiert. Am Ende des stationären Aufenthaltes wurden Angst und Depression erneut erfasst. Es konnte eine Reduktion von Angst und Depression bei psychisch hoch belasteten Patienten bereits während des stationären Aufenthaltes durch psychoonkologische Intervention nachgewiesen werden. Studie 2 untersuchte die Frage nach der Wirksamkeit zwei verschiedener psychoonkologischer Interventionen. Dazu sollten die Effekte eines einmaligen Gespräches und einer einmaligen Entspannung vergleichend analysiert werden. Die Besonderheit dieser Studie liegt in der Erfassung sowohl subjektiver als auch objektiver Stressparameter. Die Einteilung in low-risk- und high-risk-Gruppe erfolgte analog zu Studie 1. In diese Studie konnten 45 Patientinnen eingeschlossen werden. Innerhalb der high-risk-Gruppe erfolgte die Randomisierung in die Interventionsarme. Beide Interventionen führten zu Reduktion von Angst und Depression. Das Gespräch zeigte sich bezüglich Depression wirksamer. Hinsichtlich subjektiv und objektiv gemessener Stressparameter ergab sich ein Vorteil für den Entspannungsarm. Die Resultate geben jedoch Hinweise darauf, dass bei über einem Drittel der Patientinnen eine einmalige Intervention nicht ausreichend ist. Die Ergebnisse beider Studien werden zusammengefasst und aus stresstheoretischer Sicht diskutiert. Daran schließen sich Empfehlungen für die Praxis und weitere notwendige Untersuchungen. / In Germany the annual incidence rate of cancer is 450,000. Anxiety and depression can occur at any time point as a consequence of the disease itself or as a result of severe therapies. In study 1 the efficacy of psycho-oncological interventions in a peri-surgical setting has been analysed. 132 patients beginning inpatient treatment at a hospital specializing in surgical oncology were either classified as ‘low-risk’ or ‘high-risk’, according to the HADS. Patients from both categories were then randomly placed in either an ‘intervention’ group or an ‘observation’ group. Anxiety and depression levels were measured again prior to the patients discharge from the department of surgical oncology. Thereby a reduction of anxiety and depression in patients with a severe psychological burden has been demonstrated, already during their inpatient stay. Study 2 explored the question if there are any differences in the efficacy of two psycho-oncological interventions. The effects of a single therapy session versus a non-recurring relaxation have been analysed in this present study. The distinctiveness of this study is the collection of subjective and objective stress parameters. The classification in high-risk or low-risk-group took place according to study 1. Both interventions lead to a reduction in anxiety and depression. An advantage concerning depression was found in the conversation arm. With regards to the subjectively and objectively measured stress parameters, an advantage in the relaxation arm has been observed. In cancer patients with a severe psychological burden, psycho-oncological interventions in an inpatient setting represent instrumental support as part of interdisciplinary care. Nonetheless, the results suggest that in more than one third of patients a non-recurring intervention is not sufficient. The findings of both studies are summarised and discussed from a stress-theoretical viewpoint, followed by recommendations on further necessary examinations.

Populationen kanzeröser Zellen können aus verschiedenen Subpopulationen mit distinkten phänotypischen Profilen bestehen. Diese Dissertation verwendet mathematische Modellierung sowie die Analyse von Einzelzell-Genexpressionsdaten zur Beantwortung von Fragen über die Entstehung, das Wachstum und die Behandlung von Tumoren im Kontext einer solchen intratumoralen Heterogenität. / Tumoural cell populations may consist of different subpopulations with distinct phenotypic profiles. This thesis applies mathematical modelling as well as the analysis of single-cell gene expression data to questions related to the emergence, growth and treatment of tumours in the context of such an intratumoural heterogeneity.

Über die letzten Jahre haben sich Einzelzelldaten als Trend in der Bioinformatik etabliert, was zu umfangreichen Datensätzen führte. Die Entwicklung von Analysemethoden für solche Daten hat jedoch nicht mit deren Produktion Schritt gehalten. Diese Arbeit befasst sich mit einigen Problemen, die beim Analysieren von Einzelzelldaten auftreten. Das zweite Kapitel enthält eine Analyse von scRNA-seq-Daten von Darmkrebspatienten und Organoiden. Es werden Entwicklungstrajektorien des Darms beschrieben. Anschließend werden Signalgradienten dieser Achsen charakterisiert, insbesondere MAPK- und WNT-Signale. Weiter wird gezeigt, wie RNA velocity basierend auf metabolischen labeling ähnliche Trajektorien in Organoiden aufzeigen kann. Schließlich werden Auswirkungen von Signalwegenhemmung auf die Entwicklungstrajektorien im Detail beschrieben. Das dritte Kapitel bietet einen noch nie dagewesenen Einblick in frühe Stadien von COVID-19 in der Lunge. Verwendete scRNA-seq Daten stammen aus Lungengewebeproben etablierter Hamstermodelle, die mehrere Spezies, SARS-CoV-2-Dosen und Zeitpunkte umfassen, und die ich mit entsprechenden Daten von menschlichen Patienten vergleiche. Für die Analyse zentraler Zelltypen, die den unterschiedlichen Krankheitsverläufen zugrunde liegen, wende ich post-hoc Interpretation auf sonst unzugängliche latent spaces von diffusionmaps an, die neue Einblicke in die zelluläre Pathogenese von COVID-19 bieten. Im letzten Kapitel stelle ich scperturb vor, die größte Sammlung von perturbierten Einzelzelldaten. Ich zeige, wie E-Statistik verwendet werden kann, um solche Daten auf statistisch fundierte Weise zu analysieren. Verzerrungen werden mittels eines neuen Term zur Korrektur der E-Distanz beseitigt. Anschließlich untersuche ich Robustheit der E-Statistiken für einige Analyseszenarien, wie die COVID-19 Daten aus vorherigen Kapitel. Schließlich leite ich Richtlinien für die experimentelle Planung von Einzelzell-Perturbationsstudien mit robuster Statistik ab. / In recent years, single-cell data has emerged as leading trend in bioinformatics, resulting in the generation of substantial datasets. However, development of analysis methods for single-cell data has not kept pace with its production, presenting challenges for analysts. This thesis addresses some of the most pressing issues encountered during the analysis of single-cell data. After a short introductory chapter, the second chapter deals with the problem of arranging single-cell transcriptomes based on biological trajectories, and how these correlate with signaling pathways, specifically those relevant as targets for potential treatments. This thesis demonstrates how RNA velocity based on metabolic labeling can recover similar trajectories in organoids, identifying WNT and MAPK as underlying signaling pathways for development in normal and colon cancer organoids. The third chapter provides an unprecedented view into early stages of COVID-19 in the lungs. For the analysis of key cell types underlying divergent COVID-19 outcomes I apply post-hoc interpretation methods to otherwise inaccessible latent spaces of diffusion maps, revealing new insights into the cellular pathogenesis of COVID-19. Used scRNA-seq data is derived from lung tissue samples of established hamster models, encompassing multiple species, varying SARS-CoV-2 doses, and time points, which I then compare to data from human patients. In the fourth chapter, I present scperturb, the largest collection of single-cell perturbation data. I show how E-statistics can be used to analyze such data in a statistically sound way. After introducing a new bias-correction term to the calculation of E-distances, I investigate the robustness of resulting E-statistics for various analysis scenarios, such as the COVID-19 data from the previous chapter. Finally, I derive guidelines for the experimental design of single-cell perturbation studies such that robust statistics can be achieved.

Neueste Arbeiten zeigen, dass die Selbsterneuerung und Pluripotenz von Stammzellen durch hochkonservierte Signalwege kontrolliert werden. Störungen dieser Prozesse verursachen Tumoren, die von Zellen mit stammzellähnlichen Eigenschaften ausgehen, den sog. Krebsstammzellen. Diese Arbeit zeigt, dass erhöhte Wnt/beta-Catenin- und erniedrigte Bmp-Signalgebung eine wichtige Rolle in der Entstehung humaner Plattenepithel-Karzinome der Speicheldrüsen spielen. Es wurde ein Mausmodell hergestellt, bei dem die Aktivierung der Wnt/beta-Catenin und der Verlust der Bmp-Signalgebung ebenfalls Speicheldrüsenkarzinome verursachen. Die Speicheldrüsen-Tumoren der Maus enthielten eine erhöhte Zahl von CD24+CD29+-Stammzellen, von denen bereits 500 Zellen transplantierbare Tumoren in NOD/SCID-Mäusen induzierten, d. h. dass sie Krebsstammzellen darstellen. Die Veränderung nur eines Signalweges, Wnt/beta-Catenin oder Bmp allein, war nicht tumorigen, resultierte aber in einer erhöhten Anzahl von CD24+CD29+-Stammzellen in der Speicheldrüse und einer fünffach schnelleren Geweberegeneration nach Verwundung. Die Krebsstammzellen der Speicheldrüsen zeigten eine erhöhte Expression von Pluripotenzgenen und globale Veränderungen von trimethyliertem Lysin 4 und 27 des Histons 3. Diese Veränderungen korrelieren häufig mit einer Zunahme aktiven und einer Abnahme repressiven Chromatins. Die Krebsstammzellen wuchsen in vitro als undifferenzierte Salisphären und konnten durch Inhibierung des Wnt/beta-Catenin-Signalweges in drüsenartige Strukturen differenziert werden. Dieser Prozess war von repressivem Chromatin abhängig, da DNA-Methylierungs- oder Histon-Deazetylase-Inhibitoren den ursprünglichen Krebsstammzell-Status wieder reaktivieren konnten. Diese Arbeit zeigt, dass ein aktiver Wnt/beta-Catenin-Signalweg die Transformation von normalen Stammzellen zu Krebsstammzellen durch einen epigenetischen Mechanismus fördert. Die Ergebnisse eröffnen neue Strategien für die Tumortherapie beim Menschen. / Little is known about the processes by which cancer stem cells arise in the different tissues. Our analysis of aggressive squamous cell carcinomas (SCCs) of the salivary gland in human patients suggested a link to the Wnt/beta-catenin and Bmp signaling systems. Using a genetically modified mouse strain in which Wnt signaling is up-regulated and Bmp is suppressed, we found that Wnt/beta-catenin promotes the transformation of normal stem cells into cancer stem cells through an epigenetic mechanism. Mouse SCCs of the salivary gland contained high numbers of CD24+CD29+ cancer stem cells. As few as 500 of these cells sufficed to cause tumors when transplanted into NOD/SCID mice. Mice in which only one of the signaling systems was altered had higher numbers of stem cells in the salivary gland, more efficient tissue regeneration, and no apparent tumors. We discovered that the difference of normal compared to cancer stem cells in the salivary gland is an up-regulation of specific pluripotency genes, e.g. Dppa5, as well as global changes in trimethylated Lysine 4 and 27 of histone 3. This indicates an increase of active chromatin and a decrease in the repressive form, which suggests a mechanistic explanation for the change of cell fate. Cancer stem cells of the salivary gland grew as non-adherent spheres and retained the capacity for differentiation if beta-catenin is inhibited. This depended on repressive chromatin, as shown by the fact that 5-azacytidine or HDAC inhibitors restored stemness. Our data opens new strategies for future cancer therapies in humans.

Lungenkrebs ist nicht nur eine der häufigsten Krebsarten, sondern auch für die Mehrzahl der krebsbedingten Todesfälle weltweit verantwortlich. Die erheblichen Auswirkungen solcher Tumore werden anhand einer Fünf-Jahres-Überlebensrate von nur 20% und 1,8 Millionen Todesfällen deutlich. Die Mehrzahl aller Fälle (85%) sind als nicht-kleinzellige Lungenkarzinome (non-small-cell lung cancer (NSCLC)) zu klassifizieren. Da solche Tumore häufig mit Rauchen in Zusammenhang stehen, gilt NSCLC als immunogener Krebstyp. Folglich werden charakteristische onkogene Treibermutationen in Genen wie z.B. epidermal growth factor receptor (EGFR) oder anaplastic lymphoma kinase (ALK) häufig beobachtet. In Übereinstimmung mit dieser hohen Mutationsrate hat die Therapie mit Immuncheckpoint-Inhibitoren (immune checkpoint inhibition (ICI)), bei der in erster Linie Antikörper gegen programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) zum Einsatz kommen, in den letzten Jahrzehnten die Therapieoptionen und die Prognose für NSCLC revolutioniert. Eine Ansprechrate von etwa 20% auf eine Monotherapie mit ICIs bedeutet jedoch gleichzeitig, dass die Mehrheit der Patienten, insbesondere solche mit EGFR- oder ALK-Mutationen, überhaupt nicht von ICI-Therapien profitieren. Neben dieser primären Resistenz kommt es ebenfalls vor, dass Tumore nach einem anfänglichen Ansprechen durch sekundäre Resistenzentwicklung weiter fortschreiten. Diese Grenzen der derzeitigen Behandlungsmethoden könnten in Zukunft durch bispezifische Antikörper (bispecific antibodies (biABs)), welche T Zellen mit Tumorzellen verbinden, in Kombination mit ICI erweitert werden. Um den Fortschritt von solchen T Zell-basierten Immuntherapien zu beschleunigen, ist es unerlässlich die molekularen Mechanismen von Resistenzen besser zu verstehen, wirksame Kombinationsansätze zu entwickeln und geeignete Richtlinien für die Patientenstratifizierung aufzustellen. Weitere Forschungsarbeiten dazu, wie Immunität gegenüber Tumorzellen auch in Subtypen mit Treibermutationen erhöht werden kann, sind dringend nötig um die Überlebensrate bei NSCLC zu verbessern. Die vorlegende Arbeit adressiert diese Herausforderungen und zielt darauf ab, biABvermittelte T Zell-Immunantworten in NSCLC zu verbessern. Zu diesem Zweck wurde ein CRISPR/Cas9 Screen in der NSCLC-Zelllinie NCI-H1975, welche EGFR mutiert ist, durchgeführt. Eine fokussierte sgRNA Bibliothek wurde in diese Zellen eingebracht bevor aktivierte CD8+ T Zellen sowie ein biAB zugegeben wurden. Diese Behandlung führte zur Abreicherung von sgRNAs, die Gene editieren, welche T Zell-vermittelten Zelltod hemmen. Durch diese Ausrichtung des CRISPR/Cas9 Screens konnten somit Resistenz vermittelnde Gene identifiziert werden. Nach erfolgreicher Durchführung folgte eine tiefergehende Validierung, welche schließlich die Gene ankyrin repeat and MYND domain containing 1 (ANKMY1) und chromosome 22 putative open reading frame 46 (C22orf46) als bisher unbekannte Regulatoren von Resistenz gegenüber T Zellen bestätigte. Aufbauend auf diesen Ergebnissen zielte der zweite Teil der Arbeit darauf ab, die Funktion sowie wichtige Eigenschaften von C22orf46 eingehender zu analysieren. Dazu wurden sowohl Experimente in weiteren NSCLC-Zelllinien als auch mit Chemotherapeutika durchgeführt, welche eine breitere Beteiligung von C22orf46 in verschieden NSCLC-Subtypen sowie an anti-apoptotischen Signalwegen nahelegten. Außerdem wurde ein eGFP-tagging Ansatz entwickelt um sowohl aufzuklären, ob es sich um ein protein-kodierendes Gen handelt als auch, welche subzelluläre Lokalisierung vorherrscht. Diese Experimente bestätigten zum ersten Mal, dass der offene Leserahmen FLJ2358 von C22orf46 für ein nukleolares Protein kodiert. Weiterhin ergab die RNA-Sequenzierung von C22orf46-Knockout-Zellen eine veränderte Expression mehrerer immunmodulatorischer Moleküle, darunter bekannte Faktoren, die für das Engagement von T-Zellen relevant sind, wie IL-10 oder CXCL11. Des Weiteren wurden Transkriptom-Veränderungen festgestellt, die mit einer schlechteren Prognose bei Lungenkrebs korrelieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das von C22orf46 kodierte und im Nukleolus exprimierte Protein eine entscheidende Rolle in anti-apoptotischen Signalwegen spielt und mit der Immunresistenz von NSCLC-Zellen in Verbindung steht. Diese Ergebnisse bilden eine wichtige Grundlage für künftige Studien, in welchen nachgeschaltete Signalwege und Interaktionspartner im Detail erforscht werden sollten. Da die funktionellen Daten zu C22orf46 aus in vitro Experimenten stammen, sind weitere Untersuchungen in einer komplexeren Immunumgebung, z. B. in einem Modellorganismus, erforderlich, um die Übertragbarkeit der Resultate zu prüfen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erhöhen das Verständnis von Resistenzen gegenüber T Zell-basierten Therapien und sind geeignet die Patientenstratifizierung in Zukunft zu verbessern. / Lung cancer is not only a prevalent cancer type but also accounts for the majority of cancer-related deaths globally, emphasizing its substantial impact. The five-year survival rate stands at only 20%, with 1.8 million deaths recorded annually. Non-small-cell lung cancer (NSCLC) constitutes the most frequent subtype, representing 85% of all cases. As these tumors are often associated with smoking exposure, NSCLC is considered an immunogenic cancer type. Consequently, characteristic oncogenic driver mutations in genes such as epidermal growth factor receptor (EGFR) or anaplastic lymphoma kinase (ALK) are observed. In well accordance with this high mutational burden, immune checkpoint inhibition (ICI) primarily utilizing anti-programmed cell death protein 1 (PD-1) or anti-programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) antibodies, revolutionized the therapy options and prognosis for NSCLC in recent decades. However, an response rate around 20% to ICI monotherapy at the same time means that the majority of patients, especially EGFR- or ALK-mutant ones, are not benefiting at all from ICI (primary resistance) or tumors still progress after an initial response (secondary resistance) which clearly illustrates the limitations of the current treatment pathways. T cell engaging bispecific antibodies (biABs) in combination with ICI could enhance therapy efficiencies in the future. To expedite the progress of T cell based immunotherapies, research aims to better understand molecular mechanisms of resistance, to develop effective combination approaches and to establish suitable guidelines for patient stratification. To date, such strategies to enhance anti-tumor immunity even in subgroups with oncogenic driver mutations and to allow long-term survival remain urgent but unmet clinical needs. To address these challenges, this thesis aimed to provide mechanisms increasing the biAB mediated T cell killing in NSCLC. To this end, pooled loss-of-function CRISPR/Cas9 screening was established in the EGFR-mutant NCI-H1975 cell line with a focused single guide RNA (sgRNA) library. Direct challenging of knockout cells with isolated cytotoxic T cells (CTLs) by means of a biAB led to depletion of sgRNAs targeting genes inhibiting T cell mediated killing. Successful implementation of this functional screening, along with thorough hit gene validation, identified ankyrin repeat and MYND domain containing 1 (ANKMY1) and chromosome 22 putative open reading frame 46 (C22orf46) as previously unknown mediators of T cell resistance in NSCLC. Building on these results, the thesis further aimed to analyze the role and characteristics of C22orf46 in depth. Through experiments with anti-neoplastic drugs and validation in the A549 NSCLC cell line, a broader involvement of C22orf46 in anti-apoptotic signaling across different NSCLC subtypes is suggested. This observation aligns with two recent studies presenting C22orf46’s contribution to tumor progression. Additionally, an eGFP-tagging approach was developed to elucidate both the protein-coding ability and subcellular localization of C22orf46. This approach for the first time confirmed that the open reading frame (ORF) FLJ2358 of C22orf46 encodes a nucleolar protein. Finally, RNA sequencing of C22orf46 knockout cells revealed altered expression of several immunomodulatory molecules, including well established factors relevant to T cell engagement, such as interleukin (IL)-10 or C-X-C motif chemokine ligand 11 (CXCL11), as well as transcriptome alterations correlating with a worse prognosis in lung cancer. In conclusion, the nucleolar protein encoded by C22orf46 plays a crucial role in antiapoptotic signaling and is associated with immune suppression in NSCLC. These findings provide a solid foundation for future studies to elucidate downstream pathways and interaction partners in detail. While the functional data on C22orf46 originates from in vitro experiments, further research in a more complex immune environment, such as a model organism, is required to test the transferability of the findings. The results of this thesis are suited to enhance the understanding of immune resistance but also patient stratification and could thereby provide greatly needed improvements for NSCLC patients in the future.

Bei verschiedenen Krebs-Typen kann die molekulare Behandlung der Krebs-Stammzellen ein effektives Ziel sein, die Therapie-Resistenz und die Metastasierung der Tumore zu hemmen. Basaler Brustkrebs enthält Zellen mit Stammzell-Eigenschaften; hingegen sind rationale Therapien gegen diese Zellen nur wenige etabliert. Ich zeige in meiner Doktorarbeit, dass Rezeptor-Tyrosinkinase-Met-Signalvermittlung die Aktivität der Hippo-Komponente YAP im basalem Brustkrebs verstärkt. Weitere Analysen zeigten erhöhte YAP-Aktivität in den Krebsstammzell-Populationen. Durch Verwendung genetischer und pharmakologischer Methoden konnte ich zeigen, dass die Interferenz mit YAP die Tumor-Bildung verzögert und die luminal-basale Transdifferenzierung verhindert sowie das Krebsstammzell-Überleben reduziert. Gen-Expressions-Analysen von YAP-Knockout-Brustdrüsen zeigten eine starke Reduzierung der Expression der β-Catenin-Zielgene, was indiziert, dass YAP für nukleare β-Catenin-Aktivität essentiell ist. Ich habe weiter gefunden, dass nukleares YAP mit β-Catenin und TEAD4 interagiert und an gemeinsamen regulatorischen Gene-Regionen überlappt. Die Analyse von proteomischen Daten von primären Brustkarzinomen des Menschen zeigte eine signifikante Hoch-Regulation der YAP-Signatur in basalem im Vergleich zu andern Brustkarzinom-Typen, was suggeriert, dass YAP-Aktivität auf den basalen Brustkrebs limitiert ist. Unsere Daten beleuchten die Wichtigkeit von YAP als essentiellen Tumor-Initiator und Krebs-Stammzell-Regulator beim basalen Brustkrebs und zeigt, dass dessen Aktivität als Prognose-Faktor wichtig ist, wenn man basalen mit luminalem Brustkrebs vergleicht. Dies suggeriert, dass Behandlung des YAP/TEAD4/β-Catenin-Komplexes mit neuen, spezifischen Pharmaka, die die Wissenschaftler in Akademie- und Industrie-Instituten im Moment entwickeln, eine potentielle therapeutische Richtung darstellen, um basalen Brustkrebs in der Zukunft zu behandeln. Dies ist der wichtigste Aspekt meiner Doktorarbeit. / In various cancer types, targeting cancer stem cells (CSCs) can serve as an effective approach for limiting therapy resistance and metastasis. While basal breast cancers encompass cells with CSC features, rational therapies remain poorly established. Here, I show that receptor tyrosine kinase (RTK) Met signalling promotes the activity of the Hippo component YAP in basal breast cancer. Further analysis revealed enhanced YAP activity within the CSC population. Utilising both genetic and pharmaceutical approaches, I show that interference of YAP activity delays tumour formation, prevents luminal to basal trans-differentiation and reduces CSC survival. Gene expression analysis of YAP knock-out mammary glands revealed a strong decrease in β-catenin target genes, suggesting that YAP is required for nuclear β-catenin activity. Mechanistically, I find that nuclear YAP interacts and overlaps with β-catenin and TEAD4 at common gene regulatory regions. Analysis of proteomic data from primary breast cancer patients identified significant upregulation of the YAP signature in basal compared to other breast cancers, suggesting that YAP activity is limited to basal breast cancers. Our data highlight the importance of YAP as a crucial tumour initiator and cancer stem cell regulator in basal breast cancer and demonstrates that its activity has prognostic value, when comparing basal with luminal breast cancers. This suggests that targeting the YAP/TEAD4/β-catenin complex through specific new drugs, which researchers in academia and industry are presently developing, is a potential therapeutic avenue for treating basal breast cancers in the future. This is the most important aspect of my thesis.

Im Vergleich zu anderen Krebsentitäten, konnten Patienten mit PDAC bisher kaum von Therapieerfolgen der Präzisionsmedizin profitieren. Um diese Problematik zu adressieren, habe ich eine umfassende molekularbiologische Studie durchgeführt, um prädiktive Biomarker zu identifizieren und die Risikostratifizierung der Patienten zu verfeinern. Mittels gen-spezifischer Sequenzierung und gezielter RNA-Expressionsanalyse wurden 293 R0-resezierte Patienten aus einer multizentrischen Phase-III-Studie untersucht. Ziel der klinischen Studie war der Vergleich von adjuvanter Chemotherapie mit Gemcitabin entweder mit oder ohne Zusatz von Erlotinib. Für meine Arbeit wurden die Patientenproben unter Verwendung einer nicht-negativen Matrixfaktorisierung (NMF) basierend auf ihren Einzelnukleotidvarianten (SNV) und ihren Kopienzahlveränderungen (CNA) gruppiert und auf klinische und molekularbiologische Unterschiede untersucht. Um die biologischen Hintergründe der identifizierten genetischen Besonderheiten zu verstehen, wurden anschließend Zelllinien genetisch modifiziert und in vitro modelliert. Es wurden 1086 SNVs und 4157 CNAs identifiziert. Dabei wiesen 99% aller Patienten mindestens eine genetische Veränderung auf, mit durchschnittlich 18 Aberrationen pro Patient. In Übereinstimmung mit früheren Berichten waren KRAS, TP53, CDKN2A und SMAD4 die am häufigsten betroffenen Gene. Alterationen in diesen Genen konnten in 63-93 % der Fälle nachgewiesen werden. Basierend darauf konnte ich fünf Patientengruppen identifizieren die sich in ihren biologischen Charakteristika unterscheiden und Angriffspunkte für gezielte Therapien bieten. Mittels NMF wurden zudem SMAD4alt MAPK9low als prognostische Biomarker für Erlotinib identifiziert. Anschließende in vitro Experimente zeigten, dass dies nicht auf eine Erhöhung der Erlotinib-Zelltoxizität zurückzuführen ist. Zuletzt definiere ich einen prognostischen Score der genutzt werden kann um das Überleben von R0-resizierten PDAC Patienten abzuschätzen. / In contrast to other cancer entities, PDAC patients have not benefited from recent improvements in precision medicine. To address this gap, I embarked on a comprehensive molecular study to identify predictive biomarkers and refine risk stratification. I performed targeted sequencing and targeted RNA expression analysis of 293 R0-resected patients from a multicenter phase III trial comparing adjuvant chemotherapy of gemcitabine with or without erlotinib. Patients were clustered using non-negative matrix factorization (NMF) based on their single nucleotide variant (SNV) and copy number alteration (CNA) statuses. Overall (OS) and disease-free survival (DFS) were analysed with the multivariate cox hazard and log rank tests. Finally, using a method based on CRISPR/Cas, findings from the patient cohort where modeled in vitro to assess their biological backgrounds. A total of 1,086 SNVs and 4,157 CNAs were found with at least one genetic alteration in 99% of all patients, and an average of 18 aberrations per patient. In line with previous reports, KRAS, TP53, CDKN2A, and SMAD4 were the most frequently affected genes, detected in 63–93 % of cases. In this thesis, I identified five biologically distinct patient subgroups with different actionable lesions that may serve for refined PDAC classification and tailored treatment approaches. NMF based clustering and subsequent differential expression analysis revealed SMAD4alt (SNV and/or CAN in SMAD4) MAPK9low (MAPK9 expression below median) as prognostic erlotinib biomarker. Modeling of SMAD4alt MAPK9low status in vitro showed that the effect is not based on increased erlotinib toxicity. Finally, I proposed a genetic risk score for prognostic evaluation of newly diagnosed R0-resected PDAC patients.

Das Bronchialkarzinom ist die häufigste Todesursache bei den Krebserkrankungen und weist eine schlechte Prognose auf. Die Behandlung besteht aus einer Chemotherapie mit platinbasierten Medikamenten, doch der Erfolg ist unbefriedigend. In den letzten Jahren wurden zielgerichtete Therapien gegen Proteine wie den EGFR entwickelt. Klinische Studien zeigten, dass nur Subpopulationen von den Medikamenten Erlotinib und Cetuximab profitieren. Eine bessere (Vor-)Selektion der Patienten ist wünschenswert, um unnötige Behandlungen zu vermeiden. Für diese Analysen bedarf es relevanter präklinischer Modelle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 25 Xenograftmodelle des Lungenkarzinoms vergleichend charakterisiert. Ein Schwerpunkt bestand im Vergleich der Xenografts mit ihren Patiententumoren. Die Analyse der Histologie, der Proliferationsmarker als auch der Genexpressionsprofile fand übereinstimmende Ergebnisse in den Patiententumoren und ihren abgeleiteten Xenografts. Mit Hilfe von mRNA-, Protein- und SNP-Profilen ressistenzassoziierter Marker der Chemotherapie konnte die Bedeutung der Modelle zur Charakterisierung von prädiktiven und prognostischen Markern aufklärt werden. Diese Arbeit untersuchte auch Marker der anti-EGFR-Therapien. mRNA- und Proteinprofile der ERBB-Rezeptoren sowie der Liganden wurden erstellt und stimmten mit publizierten klinischen Daten überein. Genexpressionsstudien in Erlotinib Respondern und Non-Respondern zur Therapieoptimierung identifizierten den Wachstumsfaktor VEGFA als Ziel für eine Kombinationsbehandlung mit dem Angiogeneseinhibitor Bevacizumab. Die Kombination von Bevacizumab mit Erlotinib führte zu einem reduzierten Tumorwachstum. Die Ergebnisse dieser Arbeit machten deutlich, dass die individuellen Tumoreigenschaften in den patientenabgleiteten Xenografts auf Gen- und Proteinebene erhalten bleiben und diese als Modelle zur Markeranalyse sowie zur Therapieoptimierung eingesetzt werden können. / Lung cancer is still one of the most frequent cancers worldwide. The treatment option is classical chemotherapy that is based upon the combination of platin-based drugs. But no further improvement seems to be possible. For some years targeted drugs against single proteins like the EGFR were developed. The clinical trials showed that only subpopulations of patients benefit from the treatment. A better selection of patients to avoid treatment would be helpful. Therefore, pre-clinical models that are suitable for analysis and that represent clinical populations of patients are required. In this work 25 patient derived xenografts from lung cancer were intensely studied. First, the xenografts were compared with their corresponding patient tumor. The analysis of the histology and the expression of proliferation and epithelial or mesenchymal markers showed concordance of the patient tumor and the derived xenograft. The gene expression profiles were also maintained. Further analysis should elucidate the relevance of the xenografts as models for the characterisation and validation of predictive and prognostic markers. SNP, mRNA and protein expression profiles of resistance markers for chemotherapy were generated and showed similarities with clinical data. As marker for the anti-EGFR targeted therapies the ERBB receptors and the ligands of the EGFR were analysed. The mRNA and protein expression profiles resemble clinical data sets. An optimisation of the therapy should be achieved with gene expression studies. The vascular endothelial growth factor A was identified for a combination treatment with the anti-angiogenic drug bevacizumab in erlotinib resistant tumors. The combination of erlotinib and bevacizumab reduced the tumor growth in selected models. In summary, the analysis could show that the individual characteristics of the patient tumor were maintained in the xenograft. The models are a reliable tool for studies designed to improve treatment strategies.