Determina la peroxidación generada por luz ambiental, de las emulsiones lipídicas parenterales administradas a recién nacidos en la unidad de cuidado intensivo neonatal del INMP. Es un estudio cuasi-experimental, prospectivo, longitudinal. Utiliza una muestra de 60 emulsiones lipídicas al 20% las cuales estuvieron dividas en 2 grupos. Grupo 1: Emulsiones lipídicas parenterales al 20%, expuestas a luz ambiental por un periodo de 24 horas, bajo condiciones de temperatura y humedad ambiental, que fueron administradas a recién nacidos en bolsas y líneas de infusión transparentes. Grupo 2: Emulsiones lipídicas parenterales al 20%, expuestas a luz ambiental por un periodo de 24 horas, bajo condiciones de temperatura y humedad ambiental, que fueron administradas a recién nacidos en bolsas protegidas y líneas de infusión fotosensibles. La peroxidación lipídica se determinó la a través del dosaje de malondialdehido (MDA) y su reacción con el ácido thiobarbitúrico (TBA) y su posterior lectura en un espectrofotómetro. Se realizó comparación intergrupos mediante estadística descriptiva e inferencial con un nivel de significancia menor de 0.05. Encuentra que un incremento significativa del MDA de 57 umol/l, cuando la emulsión lipídica fue infundida sin proteger, en comparación con la emulsión lipídica infundida con protección que fue solo de 21 umol/l. Concluye que las emulsiones lipídicas al 20% usadas en nutrición parenteral de recién nacidos, sufren peroxidación lipídica al ser infundidas en la UCIN en un periodo de 24 horas, la peroxidación es mayor, al ser infundidas sin protección, en comparación a la infundidas con protección. La protección de dichas emulsiones, puede traer beneficios a los recién nacidos. / Tesis

Busca probar si la concentración de L-carnitina plasmática tiene correlación con el metabolismo de los lípidos. Para tal efecto se comparará los niveles plasmáticos de dos grupos poblacionales (el sexo masculino y femenino con actividad sedentaria, sin enfermedades metabólicas) con diferentes condiciones de altitud. Un grupo poblacional fue tomado de las grandes alturas del Perú del Centro de Salud Asistencial de Pampa Cangallo, departamento de Ayacucho a 3,900 msnm, que por condiciones naturales viven en un medio hipóxico, mientras el otro grupo son pobladores que habitan en la costa de Lima Metropolitana. En ambos grupos se separó el plasma para la medición de L-carnitina, los niveles de colesterol (colesterol total, HDL, LDL) y triglicéridos fueron medidos por métodos convencionales. La glucosa se determinó en sangre, obtenida por punción dactilar con ayuda de un glucómetro. Al final del estudio, los resultados indican que la concentración de carnitina plasmática en el sexo masculino es mayor en pobladores de las alturas que en los del nivel del mar (p<0.05) a pesar que los valores encontrados para el género masculino se encuentran por debajo de las concentraciones normales reportadas. Con respecto al género femenino existe diferencia entre las muestras de altura y las de nivel del mar (p<0.05) siendo las concentraciones del nivel del mar mayores respecto a las que habitan en la altura. No se encontró correlación entre la L-carnitina y su perfil lipídico (p>0.05). / Tesis

En esta tesis se estudia la adsorción de los ácidos oleico y cis-3-hexenoico sobre las superficie Ni(111) y PtNi(111) mediante el método semiempírico de Hückel extendido implementado con el programa de Superposición Atómica y Deslocalización Electrónica (ASED) y el método de primeros principios basado en la teoría del funcional de la densidad (DFT) utilizando el programa de cálculo Viena Ab-initio Simulation Package (VASP). Se establecen las características estructurales en el proceso de adsorción de los ácidos monoinsaturados oleico y cis-hexenoico sobre catalizadores de Ni(111) y bimetálicos PtNi(111). Se determina la geometría de adsorción para obtener la energía mínima total y el sitio preferencial de adsorción. Se estudia la rotura de enlaces y se analiza la estructura electrónica y el enlace químico entre las especies involucradas en el proceso de adsorción. Se estudia el efecto catalítico que produce el agregado de promotores de diferentes elementos químicos en la superficie. Se realizan estudios teóricos sobre el espectro de frecuencias de vibración del ácido adsorbido. Se realizan estudios sobre la selectividad de los enlaces COOH y C=C. Se compara la actividad catalítica de los catalizadores estudiados. / In this thesis it is presented the study of the oleic and cis-3-hexenoic acids adsorption on Ni(111) and PtNi(111) surfaces through the extended semi-empirical Hückel method used within the Atomic Superposition and Electronical Delocation (ASED) program, and the first principles method based on the Density Functional Theory (DFT) using the Viena Ab-initio Simulation Package (VASP) calculation program. It is established the structural characteristics of the oleic and cis-hexenoic monounsaturated acids adsorption on Ni(111) and bimetallic PtNi(111) catalysts. The adsorption geometry is determined in order to obtain the total minimal energy and the adsorption preferential site. The bond breaking is studied and the electronic structure and the chemical bond are analyzed. It is studied the catalytic effect produced by the different chemical promoters added on the surface. Theoretical studies about the adsorbed acid vibration frequencies spectrum are developed. Studies about the COOH and C=C bonds selectivity are presented. A comparison of the catalytic activity of the studied catalysts is performed.

La apoA-I cumple un rol muy importante en el transporte reverso del colesterol (TRC), es el componente mayoritario de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) que desempeñan diversas funciones en las distintas etapas del TRC. Resultados previos de este laboratorio permiten postular la hipótesis de que la región central de la apoA-I, formada por el par de hélices tipo Y, estaría involucrada en la interacción con la membrana celular, que sería importante para el eflujo de lípidos y la movilización de depósitos intracelulares de colesterol (como el disponible a ser esterificado por ACAT) hacia la membrana plasmática. Como la conformación del dominio central es influenciada por el tamaño y composición lipídica (contenido de colesterol) de las HDL, también se postula que esto podría modular la capacidad de interacción con la membrana celular y el consecuente eflujo lipídico. El objetivo general de este trabajo fue someter a prueba esta hipótesis y aportar información relevante para entender los mecanismos implicados en las etapas iniciales del TRC, como en la interacción de las HDL con membranas celulares y el eflujo celular de lípidos. Como objetivos específicos, nos propusimos: 1) Reconstituir partículas discoidales HDL similares a las pre-β-HDL del plasma, de diferente composición y tamaño, mediante la técnica de diálisis con el detergente colato. Estas fueron comparadas en cuanto a su capacidad de unirse a la membrana celular, y de promover el eflujo de colesterol y fosfolípidos de dos líneas celulares diferentes: CHO-K1 (células de ovario de hámster chino) y RAW 264.7 (macrófagos murinos). 2) Estudiar en comparación con apoA-I salvaje, la funcionalidad y las respuestas celulares a dos mutantes de deleción de un residuo de lisina en las regiones de hélices tipo Y: una con la deleción en la región central de la hélice 4 (ΔK107) y la segunda con la deleción en la posición homóloga de la hélice 10 (ΔK226). La primera de estas mutantes es una variante natural cuyos portadores presentan un metabolismo alterado de las HDL e incrementado riesgo aterogénico, por lo que los resultados de estos estudios también podrían ayudar a la comprensión de los síntomas presentados por estos pacientes. Es de esperar que estas mutaciones desplacen en ~100º la orientación relativa entre las caras hidrofílica e hidrofóbica de la hélice anfipática a ambos lados de la mutación, lo que puede afectar tanto la interacción con lípidos como con los receptores celulares.

Los parásitos nematodos producen diversas proteínas solubles que unen lípidos (LBPs) estructuralmente distintas a las del huésped. Las funciones que cumplen se desconocen pero se hipotetiza que estarían involucradas en las funciones típicas internas de organismos multicelulares, como la utilización y transporte de compuestos no solubles, y en externas especializadas. Algunas de estas proteínas participarían en la modificación del entorno local en el tejido del huésped, posibilitando la modulación y la evasión de la respuesta inmune. Entre las LBPs producidas por nematodos se encuentran las FAR (Fatty Acid and Retinol binding proteins), una clase novedosa de proteínas que unen ácidos grasos y retinol. Tienen un tamaño aproximado de 19 kDa y sus estructuras que parecen ser ricas en alfa-hélices aún no han sido completamente dilucidadas. La comprensión del rol que cumple esta familia de proteínas tiene gran interés fisiopatológico ya que podrían desempeñar funciones relevantes en la biología de los parásitos que las producen y dadas las diferencias estructurales que presentarían con respecto a las LBPs de sus huéspedes, servirían como potenciales blancos para el diseño de nuevas terapias antiparasitarias. Con la finalidad de contribuir a la caracterización de las proteínas FAR y avanzar de este modo en la determinación de su función biológica, se llevaron a cabo estudios biofísicos y estructurales que permitieron resolver la estructura de Na-FAR-1 en solución por espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Determinándose que consta de once hélices que conforman una cavidad interna de gran tamaño, donde podrían ubicarse ligandos hidrofóbicos. La estequiometría de unión de los complejos formados por Na-FAR-1 estaría dada por cuatro moléculas de ácido oleico por molécula de proteína, pero se limitaría a una única molécula de ligando en el caso del retinol y de los análogos fluorescentes de ácidos grasos empleados para su estudio. A su vez se evidenció que además de los ligandos esperados como ácidos grasos y retinol, esta proteína es capaz de unir fosfolípidos y diacilglicéridos. La amplia diversidad de unión a ligandos, sumada a su localización en el intestino del nematodo, indicarían que podría participar en el direccionamiento hacia los distintos tejidos de los lípidos ingeridos.

Queda claro que los efectos de la insulina son tan complejos, inter-relacionados y diversos que es muy difícil explicar el cambio final observado en nuestros pacientes DM2 tras la administración de la hormona. Esto se agrava por la falta de estudios previos de este tipo de problemática desde una perspectiva mecanística. Por un lado la hormona podría ejercer efectos pro-aterogénicos, pero por otro sus actividades directa o indirectamente anti-aterogénicas se hacen prevalentes y el resultado final resulta ser protectivo. Esta conclusión debe ser necesariamente acompañada de una consideración especial sobre el nivel de hiperinsulinismo y resistencia periférica a la hormona que exhiba el paciente. La suplementación estaría indicada cuando el nivel de insulina circulante no es excesivo o en términos mas sencillos cuando los marcadores convencionales superen ciertos valores de referencia que aún no han sido investigados (por ejemplo Hb A1c ≥ 7%). De modo que se requieren estudios más exhaustivos y con un mayor n para decidir cual sería la línea de corte y la condición de hiper-insulinismo que desacosejarían su implementación. En general, podemos decir que la administración de insulina en combinación con hipoglucemiantes orales modifica significativamente y de manera beneficiosa a todos los biomarcadores de inflamación, y a la mayoría de los marcadores de riesgo aterogénico y disfunción endotelial. Estos efectos son independientes del tipo de insulina administrada, pero correlacionan con otras variables sustentando la idea de obtener un beneficio tras su administración. Existe una clara dependencia entre el deterioro evaluado por cualquiera de los marcadores y el tiempo de evolución clínica, y una compleja inter-relación entre ellos que se ve mejorada por efecto de la hormona siempre y cuando se considere exceptuar a los pacientes con muy significativa hiperinsulinemia. Los resultados apoyan la implementación de una terapia combinada de hipoglucemiantes orales e insulina como una mejor opción para disminuir las complicaciones de la DM2, siempre que se tomen los recaudos pertinentes para evitar el riesgo de hipoglucemia (sobre todo en pacientes susceptibles). Asimismo, podría favorecer una mayor expectativa funcional de las células beta que de este modo no se verían tempranamente agotadas para acometer con la demanda creciente de insulina a nivel periférico. Se justificaría ampliar este tipo de investigaciones longitudinales a grandes poblaciones de pacientes DM2 cuidadosamente seleccionadas a fin de rectificar o ratificar estos hallazgos como generadores de hipótesis de trabajo, las cuales conducirían finalmente a una descripción mecanística clara sobre los eventos sobre los cuales se sustentan. Tras la dilucidación de estas cuestiones podría ser posible entonces admitir su inclusión como un protocolo o una recomendación farmacológica sentada sobre bases mucho más convincentes.

La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial que depende en gran parte de factores ambientales, pero con una fuerte base genética que puede predisponer a padecerla. Además de la susceptibilidad individual, en el desarrollo de esta patología tienen una gran importancia las modificaciones en la expresión génica que se producen en las células como una respuesta homeostática ante estímulos de tipo pro-aterogénico. Esta respuesta es un intento de corregir o adaptar la función celular ante el estímulo, pero puede acabar contribuyendo al desarrollo de la enfermedad. Por otra parte, muchos de los fármacos empleados en el tratamiento y prevención de la aterosclerosis y sus complicaciones actúan en gran parte modificando la expresión o actividad de algunos de los genes relacionados con esta patología. La complejidad de estos procesos y el elevado número de genes que pueden estar implicados constituyen un reto para la comunidad científica. Su conocimiento permitirá una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo de la aterosclerosis, y por tanto, permitirá diseñar estrategias terapéuticas para prevenirla o frenarla. En este contexto, el objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido contribuir al estudio de la regulación de la expresión génica en monocitos y macrófagos, células clave en todas las etapas de la aterogénesis, como respuesta ante diferentes condiciones pro-aterogénicas y/o fármacos. La consecución de este objetivo ha llevado a la realización de los cuatro trabajos que se presentan, cuyos objetivos específicos fueron: I. Determinar el perfil de expresión génica en monocitos de pacientes con hiperlipemia familiar combinada (HFC), antes y después de un tratamiento con atorvastatina, mediante la utilización de microarrays de cDNA. II. En un modelo in vitro (monocitos THP-1 diferenciados a macrófagos), determinar el efecto de estímulos pro-aterogénicos sobre la expresión de los genes más relevantes identificados en el anterior objetivo, explorando las vías de señalización intracelulares que resultan afectadas. III. En el mismo modelo, estudiar el efecto del inhibidor de proteasas ritonavir sobre la expresión de genes que controlan la acumulación de colesterol en el macrófago. Las principales conclusiones del trabajo experimental de la presente tesis doctoral han sido las siguientes: I. Los monocitos de pacientes con HFC presentan un perfil de expresión génica diferente de los individuos controles sanos. Los genes diferencialmente expresados corresponden a proteínas con funciones clave en los monocitos, relacionadas con el proceso aterosclerótico. El tratamiento de los pacientes con ATV durante un mes es capaz de revertir algunos de los cambios inducidos por la HFC en el patrón de expresión génica de los monocitos circulantes. II. La expresión de IL-1R2 se halla reducida en monocitos de sangre periférica de pacientes con HFC, en macrófagos THP-1 tratados con LDL acetiladas o con VLDL, y también en lesiones ateroscleróticas humanas. La represión génica de IL-1R2 observada en los tratamientos con lipoproteínas se relaciona con la acumulación intracelular de lípidos en el macrófago. Además, las lipoproteínas evitan el incremento en la expresión de receptores de IL-1 y reducen la expresión proteica de la cinasa asociada IRAK-1 en macrófagos activados por LPS. III. La expresión de TFPI-2 se encuentra incrementada en monocitos de pacientes con HFC en comparación con sujetos control. El tratamiento con trombina provoca el aumento de la expresión, tanto génica como proteica, de TFPI-2 en macrófagos THP-1 y macrófagos derivados de monocitos humanos, mediante un mecanismo en el que se encontrarían implicados NF-kB, ERK1/2 y JNK. IV. El tratamiento de macrófagos THP-1 con ritonavir induce un incremento en la expresión de genes implicados en el transporte de colesterol (CD36, ABCA1 y CYP27), por un mecanismo en el que intervendrían SREBP-1, PPARγ y LXR. / Atherosclerosis is a multifactorial disease, in which development are very important changes in gene expression that occur in cells as a homeostatic response to pro-atherogenic stimuli. Moreover, many of the drugs used in the treatment and prevention of atherosclerosis and its complications largely act by modifying the expression or activity of some genes associated with this pathology. In this context, the objective of this thesis was the study of regulation of gene expression in monocytes and macrophages, in response to different pro-atherogenic conditions and/or drugs. Achieving this goal has led to the creation of four works presented, whose specific objectives were: I. Determine the profile of gene expression in monocytes from patients with familial combined hyperlipidemia, before and after treatment with atorvastatin. II. In an in vitro model, determine the effect of pro-atherogenic stimuli on the expression of most relevant genes identified in the above objective, exploring intracellular signaling pathways that are affected. III. In the same model, study the effect of the protease inhibitor ritonavir on the expression of genes that control the accumulation of cholesterol in the macrophage. The main conclusions of the experimental work are: I. Monocytes from patients with FCH have a different gene expression profile of healthy control individuals. Treatment with ATV is able to reverse some of the HFC-induced changes in the pattern of gene expression in circulating monocytes. II. IL-1R2 expression is reduced in peripheral blood monocytes from patients with HFC, in THP-1 macrophages treated with lipoproteins, and also in human atherosclerotic lesions. Repression of IL-1R2 gene observed in treatments with lipoproteins is associated with intracellular accumulation of lipids in the macrophage. In addition, lipoproteins modify LPS-induced expression of IL-1R2 and IL-1 signalling. III. TFPI-2 expression is increased in monocytes from patients with FCH compared with control subjects. Thrombin treatment causes increased expression in THP-1 macrophages and human monocyte-derived macrophages through a mechanism that would be found involved NF-κB, ERK1/2 and JNK. IV. Treatment of THP-1 macrophages with ritonavir induces an increased expression of genes involved in cholesterol transport (CD36, ABCA1 and CYP27), by a mechanism which would involve SREBP-1, PPARγ and LXR.

En aquesta tesi s’ha realitzat una aproximació terapèutica per a la malaltia de Gaucher, basada en xaperones farmacològiques. La malaltia de Gaucher és una malaltia d’acúmul lisosòmic d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim anterior, la Saposina C. Fins al moment s'han descrit més de 300 mutacions en el gen GBA causants de la malaltia de Gaucher, que han permès desenvolupar un diagnòstic molecular de la malaltia, i unes poques en el gen PSAP. Aquestes mutacions produeixen una deficiència en alguna d'aquestes dues proteïnes, la glucocerebrosidasa o la Saposina C, que estan implicades en la via de degradació dels glicoesfingolípids. La manca d’una bona correlació genotip-fenotip fa que els estudis d’expressió puguin aprofundir en el coneixement sobre la fisiopatologia de la malaltia de Gaucher. En aquest treball presentem els estudis cel•lulars que han permès expressar els al•lels mutats en cèl•lules COS així com establir l’origen de l’al•lel doble D409H;H255Q. A més a més, hem confirmat l’efecte negatiu acumulatiu d’aquestes dues mutacions a nivell d’activitat enzimàtica, gràcies a l’expressió heteròloga dels al•lels únics i doble mutant. Una de les teràpies que actualment s'està utlitzant en la malaltia de Gaucher és la teràpia de reducció de substrat com a complement o alternativa a la teràpia de reemplaçament enzimàtic. En els darrers anys, una nova estratègia terapèutica basada en l’ús de xaperones farmacològiques ha aparegut. Aquesta nova aproximació es basa en la hipòtesi que les xaperones farmacològiques impedeixen que els enzims amb mutacions que impedeixen el bon plegament podien estabilitzar-se i arribar a seu destí, el lisosoma. Els dos objectius principals han estat: 1. L’expressió in vitro, mitjançant cèl•lules COS-7, de diversos al•lels mutats del gen GBA i la caracterització de les proteïnes GBA mutades. 2. Assajar l’efecte dels iminosucres (NN-DNJ i NB-DNJ), aminociclitols i dels seus derivats com a possibles xaperones farmacològiques sobre les proteïnesmutades, tant en cèl•lules COS-7 transfectades amb cDNAs mutats com en fibroblasts de pacients. Els resultats s’han presentat en els articles següents: 1. Homozygosity for the double D409H+H255Q allele in type II Gaucher disease Autors: Helen Michelakakis, Marina Moraitou, Evagelia Dimitriou, Raül Santamaria, Gessamí Sànchez, Laura Gort, Amparo Chabás, Daniel Grinberg, Maria Dassopoulou, Spyros Fotopoulos, Lluïsa Vilageliu. Publicació: Journal of Inherited and Metabolic Diseases (2006) 29:591 2. Haplotype Analysis Suggests a Single Balkan Origin for the Gaucher Disease [D409H;H255Q] Double Mutant Allele Autors: Raül Santamaria, Helen Michelakakis, Marina Moraitou, Evangelia Dimitriou, Silvia Dominissini, Serena Grossi, Gessamí Sánchez-Ollé, Amparo Chabás, María Gabriela Pittis, Mirella Filocamo, Lluïsa Vilageliu, Daniel Grinberg Publicació: HUMAN MUTATION Mutation in Brief #1010, 29:E58-E67, 2008 3. Promising results of the chaperone effect caused by imino sugars and aminocyclitol derivatives on mutant glucocerebrosidases causing Gaucher disease. Autors: Gessamí Sánchez-Ollé, Joana Duque, Meritxell Egido-Gabás, Josefina Casas, Montserrat Lluch, Amparo Chabás, Daniel Grinberg, Lluïsa Vilageliu Publicació: Blood Cells, Molecules, and Diseases 42 (2009) 159–166 4. Chaperone effects caused by new aminocyclitol derivatives on mutant glucocerebrosidases causing Gaucher disease. Autors: Lucía Díaz, Gessamí Sánchez-Ollé, Josefina Casas, Daniel Grinberg, Antonio Delgado and Lluïsa Vilageliu Publicació: In press. Les dades recents presentades fan pensar que les xaperones farmacològiques podrien arribar a ser un tractament tant per les formes no neuronopàtiques com per a les neuronopàtiques de la malaltia de Gaucher. / Lysosomal storage diseases are a group of disorders caused by the loss of function of lysosomal enzymes, which leads to the intralysosomal storage of non-degraded substrates. Gaucher disease (GD, OMIM 230800) is the most prevalent sphingolipidosis caused by deficiency of glucocerebrosidase (GBA, E.C. 3.2.1.45), which produces the progressive accumulation of glucosylceramide. Clinically, GD is classified into three major types depending on the absence (Type I) or presence (Type II and III) of central nervous system involvement. The main symptoms of GD are anaemia, thrombocytopenia, hepatosplenomegaly and skeletal disease. Two disease-specific therapies have been approved to treat GD. Enzyme replacement therapy (ERT) has been applied for more than 15 years and has proved successful mainly for symptoms of type I patients. The other approved treatment is substrate reduction therapy, which is based on the inhibition of glucosylceramide synthase (GCS), the rate-limiting first step in the glycosphingolipid biosynthetic pathway, by the oral administration of N-butyl-deoxynojirimycin (NB-DNJ). This reduction therapy is used for type I patients for whom ERT is not a therapeutic option. The small size of NB-DNJ makes it of potential use for neurological cases. To date, other alternative strategies, such as gene therapy, have had very limited success in the treatment of GD. However, new experimental approaches in cellular and animal models have been assayed either for conventional gene therapy or based on the partial inhibition of the GCS gene using siRNAs. Recently, a new line of research, using small molecules that act as chemical chaperones, has emerged. This approach is based on the assumption that some mutations cause the misfolding of lysosomal enzymes after their synthesis. Misfolding is responsible for enzyme degradation in the endoplasmic reticulum (ER), thereby preventing enzyme transport to the lysosome. In this scenario, the chaperone stabilizes the mutant protein, thereby allowing that, at least, some molecules reach their final destination. Here we analyzed the effect of iminosugars NB-DNJ and NN-DNJ and aminocyclitols, on COS cells transfected with either the wild-type or mutant GBA cDNAs. The effect of these compounds was also tested on the residual β-glucosidase activity of fibroblasts from patients with diverse genotypes.

[ES] El equilibrio de la homeostasis de proteínas es esencial para asegurar la funcionalidad celular. La expresión de proteínas propensas a plegarse mal induce la formación de agregados tóxicos que alteran el correcto funcionamiento de estos sistemas de control, lo que conduce a un desequilibrio de la homeostasis de proteínas, y por consiguiente a una afectación patológica. Varias enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Huntington (EH), Parkinson, Alzheimer, entre otras, tienen en común esta marca patológica molecular. Especialmente, la EH pertenece a un grupo de patologías producidas por proteínas que contienen expansiones de poliQs (varias ataxias espinocerebelosas, la atrofia muscular bulbar y espinal y la atrofia dentatorubro-pálidoluisiana), que hacen que estos péptidos sean propensos a la agregación, y causen los problemas que hemos descrito. A pesar de que estas enfermedades son genéticas, y se conoce su causa molecular, se cree que la presencia de variantes alélicas en otros genes puede exacerbar o ralentizar la agregación de proteínas con poliQs. Por tanto, la identificación de estos genes permitirá profundizar en los mecanismos moduladores de la dinámica de agregación de poliQs e identificar dianas terapéuticas frente a la toxicidad de poliQs. También es ampliamente conocido que el ARN que porta tripletes CAG tiene carácter patogénico. En este trabajo hemos desarrollado modelos, empleando C. elegans, que muestran signos indirectos de que están expresando transcritos CAG patogénicos, puesto que los tejidos diana están alterados. Usamos uno de estos modelos, que perturba la función de las neuronas GABAérgicas del gusano, para realizar un cribado de 85 compuestos farmacológicos, que nos llevó a identificar cuatro compuestos que reducían los defectos motores en estos animales. Además de poliQs y transcritos CAG, también se producen péptidos derivados de una traducción no canónica, conocida como traducción RAN. En relación a esto, hemos profundizado en la identificación y modelización de estos péptidos en C. elegans mediante la expresión de expansiones CAG fusionadas a proteínas fluorescentes para su detección in vivo. Además hemos empleado otros modelos ya existentes, para caracterizar potenciales dianas terapéuticas, como AMPK, la cual puede ser activada por diferentes sustancias. Sin embargo, algunas sustancias, como la metformina o el salicilato, son pleiotrópicas. Por tanto, hemos caracterizado la activación sinérgica de AMPK, mediante metformina y salicilato, para reducir el estrés por agregados de poliQs, con lo que podríamos evitar que otras dianas resulten activadas. Por último, hemos demostrado que este tratamiento sinérgico reduce la toxicidad inducida por la α -sinucleína implicada en la enfermedad de Parkinson. Por otro lado, hemos caracterizado en C. elegans un nuevo alelo que potencia la la agregación de poliQs, vlt10, en el gen unc-1. Nuestros resultados sugieren que la mutación unc-1(vlt10) perturba la sinapsis eléctrica entre las neuronas sensoriales IL2 y ASJ, induciendo un exceso de señalización hormonal que requiere la función de la sulfotransferasa SSU-1. También hemos demostrado que la diana de esta señal es un receptor nuclear llamado NHR-1. En este mismo capítulo, hemos identificado otra ruta de señalización hormonal, mediada por otro receptor nuclear (DAF-12), que tiene un papel protector. Se desconoce qué hormona modula la actividad de NHR-1. Sin embargo, hemos identificado que algunos de los genes regulados por NHR-1 están relacionados con el metabolismo lipídico. Además, hemos observado que la disrupción de unc-1 induce la acumulación de lípidos en los gusanos, pero a la vez estos animales contienen menos ácidos grasos totales. Esto sugiere que las grasas juegan un papel fundamental en la modulación de la agregación de poliQs, y quizás señala posibles dianas terapéuticas contra enfermedades causadas / [CA] L'equilibri de l'homeòstasi de proteïnes és essencial per a assegurar la funcionalitat cel·lular. L'expressió de proteïnes propenses a plegar-se malament indueix la formació d'agregats tòxics i altera el correcte funcionament dels sistemes de control, cosa que condueix a un desequilibri de l'homeòstasi de proteïnes, i per consegüent a una afectació patològica. Diverses malalties neurodegeneratives, com la malaltia de Huntington (MH), Parkinson i Alzheimer, entre altres, tenen en comú aquesta signatura patològica. Especialment, la MH pertany a un grup de patologies produïdes per proteïnes que contenen expansions de poliQs (s'inclouen diverses atàxies espinocerebel·loses 1, 2, 3, 6, 7 i 17, l'atròfia muscular bulbar i espinal, i l'atròfia dentatorúbrica-pàl·lidaluisiana), que fan que aquests pèptids siguen propensos a l'agregació, i causen els problemes que hem descrit. Malgrat que aquestes malalties són genètiques i es coneix la seva causa molecular, es creu que la presència de variants al·lèliques en gens pot incrementar o alentir l'agregació de proteïnes amb poliQs. Per tant, la identificació de gens modificadors permet aprofundir en els mecanismes moduladors de la dinàmica d'agregació de poliQs ens permet trobar dianes terapèutiques enfront de la toxicitat de poliQs. També és àmpliament conegut que l'ARN que contenen expansions CAG té caràcter patogènic. Per tant, hem desenvolupat models, utilitzant C. elegans, en els quals es mostren signes indirectes que expressen transcrits patogènics, ja que els teixits diana revelen una funcionalitat alterada. Utilitzant aquests models, que alteren la funció de les neurones GABAèrgiques del cuc, hem realitzat un cribratge de 85 compostos farmacològics, que ens va portar a identificar quatre compostos que reduïen els defectes motors en aquests animals. A més de poliQs i l'ARN que conté expansions de CAG, es produeixen pèptids derivats d'una traducció no canònica, coneguda com a traducció RAN. En relació amb això, hem aprofundit en la identificació i modelització d'aquests pèptids en C. elegans mitjançant l'expressió d'expansions CAG fusionades a proteïnes fluorescents per a la seva detecció in vivo. A més hem emprat models ja generats, per a caracteritzar potencials dianes terapèutiques, com AMPK puga ser activat per diversos fàrmacs. No obstant això, alguns activadors, com la metformina o el salicilat, són substàncies pleiotròpiques. Per tant, hem caracteritzat l'activació sinèrgic de AMPK, mitjançant metformina i salicilat, per a reduir l'estrés induït per agregats de poliQs i s'evita l'activació de dianes no desitjades. I finalment, hem demostrat que aquest tractament sinèrgic podria ser utilitzat per a reduir proteïnes tòxiques com la α-sinucleína, causant de la malaltia de Parkinson. D'altra banda, hem caracteritzat un nou modulador de l'agregació de poliQs, vlt10, en el gen unc-1, que produeix un augment d'agregació de poliQs. Els nostres resultats suggereixen que la mutació unc-1(vlt10) pertorba la sinapsi elèctrica entre les neurones sensorials IL2 i ASJ, induint un excés de senyalització hormonal que requereix la funció de la sulfotransferasa SSU-1. També hem demostrat que la diana d'aquest senyal és un receptor nuclear anomenat NHR-1. En el mateix capítol, hem identificat una altra ruta de senyalització hormonal, mitjançada per un altre receptor nuclear (DAF-12), que té un paper protector. Es desconeix l'hormona que modula l'activitat de NHR-1. No obstant això, hem identificat que alguns del genes regulats per NHR-1 estan relacionats amb el metabolisme lipídic. els resultats han sigut confirmats. També hem observat que la disrupció de unc-1 indueix l'acumulació de lípids en els cucs, però simultàniament aquests animals contenen menys àcids grassos totals. Això suggereix que els greixos juguen un paper fonamental en la modulació de l'agregació de poliQs, i potser assenyala / [EN] The balance of protein homeostasis is essential to ensure cellular functionality. The expression of proteins that are prone to misfolding induces the formation of toxic aggregates, which leads to an imbalance in protein homeostasis and pathological consequences. Several neurodegenerative diseases, such as Huntington disease (HD), Parkinson, Alzheimer, among others, have this molecular pathological mark in common. HD belongs to a group of pathologies produced by proteins that contain expansions of polyQs (several spinocerebellar ataxias 1, 2, 3, 6, 7 and 17, bulbar and spinal muscular atrophy and the dentatorubral-pallidoluysian atrophy), which make these peptides prone to aggregation, and cause the problems described above. Although these diseases are genetic, and their molecular cause is known, it is believed that the presence of allelic variants in other genes can exacerbate or slow the polyQ aggregation. Therefore, the identification of these genes will allow delving into the modulating mechanisms of the polyQ aggregation dynamics and find therapeutic targets against the polyQ toxicity. In addition, RNA that contains CAG triplets is pathogenic. In this work we have developed models using C. elegans that show indirect signs of pathogenic transcript expression since altered functionality was observed in target tissues. We use a model, which disturbs the function of the worm's GABAergic neurons, to screen for 85 pharmacological compounds, which led us to identify four compounds that reduced motor defects in these animals. In addition to polyQs and CAG transcripts, also are produced peptides derived from a non-canonical translation, known as RAN translation. In this regard, we have delved into the identification and modelling of these peptides in C. elegans through the expression of CAG expansions fused to fluorescent proteins to investigate them in vivo. Furthermore, we have used models previously generated to characterize potential therapeutic targets, such as AMPK. This enzyme can be activated using different compounds. However, some activators, such as metformin or salicylate, are pleiotropic substances. Therefore, in the second chapter of this thesis, we have characterised the synergistic activation of AMPK, using metformin and salicylate, to reduce the stress induced by polyQ aggregates and prevent possible unwanted targets from being activated. Finally, we have shown that this synergistic treatment could be used to reduce α-synuclein toxicity, which is involved in Parkinson disease. On the other hand, we have characterised a new allele that enhances polyQ aggregation, vlt10, in the unc-1 gene. Our results suggest that the unc-1(vlt10) mutation disturbs the electrical synapse between sensory neurons IL2 and ASJ, inducing an excess of hormonal signalling that requires the function of the sulfotransferase SSU-1. We have also shown that the target of this signal is the nuclear receptor NHR-1. In the same chapter, we have identified another hormonal signalling pathway, mediated by another nuclear receptor (DAF-12), which has a protective role. It is unknown which hormone modulates the activity of NHR-1. However, we have identified several genes that regulate lipid metabolism and whose expression could be modulated by NHR-1. In addition, we have observed that the disruption of unc-1 induces the accumulation of lipids in worms, but at the same time these animals contain less total fatty acids. Thus, our results suggest that the metabolism of fats play a key role in modulating polyQs aggregation, highlighting potential therapeutic targets against diseases caused by aggregation-prone proteins. / Gómez Escribano, AP. (2021). Modelos de toxicidad inducidos por microsatélites CAG y caracterización de dianas terapéuticas en C. elegans [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166783

Tesis por compendio / [ES] El envejecimiento poblacional es un fenómeno sin parangón en la historia de la humanidad. Así, se espera que las personas mayores de 65 años, o población sénior, doblen por primera a la población infantil en 2050. Cumplir años implica una serie de cambios a nivel fisiológico que comprenden, entre otros, una pérdida de funcionalidad de los órganos implicados en el proceso digestivo. En este sentido, el estudio de la digestibilidad de nutrientes, principalmente proteínas, y la bioaccesibilidad de determinadas vitaminas y minerales de interés para la salud de la población sénior, son de especial interés. Solo a partir de evidencias científicas será posible establecer recomendaciones nutricionales de ámbito clínico, y diseñar alimentos funcionales orientados a las necesidades específicas de este grupo poblacional. Entre los nutrientes mayoritariamente afectados por las alteraciones digestivas típicas de personas sénior, las proteínas suponen el reto más importante. Se sabe que las alteraciones orales, gástricas e intestinales afectan su digestión y absorción, contribuyendo al declive del estado general de salud, dando lugar a una pérdida de masa muscular, incremento y cambio de distribución de masa lipídica, huesos y articulaciones más débiles, algunas enfermedades metabólicas y cardiovasculares, entre otros cambios de tipo psicológico y social. El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido evaluar el impacto de las diferentes alteraciones que aparecen con la edad a nivel oral, gástrico e intestinal en la digestibilidad de proteínas, grasas y carbohidratos, así como en la bioaccesibilidad de micronutrientes de interés. Concretamente, se han analizado en alimentos ricos en proteína cuyo consumo está recomendado para mayores de 65 años, y que difieren entre sí en el origen de la proteína (pescados, lácteos, huevo, carne, legumbres y cereales). Para alcanzar este objetivo, se recurrió a modelos digestión in vitro en estático los cuales permiten simular, en condiciones controladas de laboratorio, el proceso digestivo de diferentes grupos de población y muestrear de forma no invasiva. Los resultados más relevantes de esta tesis doctoral se presentan en cinco capítulos, abordando en cada grupo alimenticio, la respuesta digestiva derivada tanto de las alteraciones fisiológicas dados en población sénior, como de ciertos factores inherentes al alimento. En cuanto a las alteraciones digestivas propias de la edad, es posible afirmar que las insuficiencias pancreática y biliar fueron las principales encargadas de reducir de forma significativa la extensión de la proteólisis en casi la totalidad de alimentos estudiados. Los resultados indican una mayor digestibilidad proteica en pescados magros, el huevo duro y escalfado, quesos, carnes de pollo y de vacuno, así como legumbres en general. La digestibilidad de las grasas, en cambio, no resultó negativamente afectada. Por otro lado, los quesos, sardina, así como algunos granos de legumbres y cereales contribuirían satisfactoriamente al aporte de calcio bioaccesible en mayor medida que otras matrices alimentarias. En cuanto a las vitaminas liposolubles, la ingesta de salmón y de quesos fueron una excelente fuente tanto de vitamina A como D3 en su forma bioabsorbible; mientras que la bioaccesibilidad de ambas vitaminas en huevo, dependió del método de cocinado. Además, la carne de cerdo brinda el mayor efecto antihipertensivo, mientras que la de pavo ejerce mayor efecto como antioxidante. Por último, la relación aminoácidos esenciales/ no esenciales aumentó en condiciones alteradas al final de la digestión, en comparación con las condiciones estándar de adulto sano. Por lo que, aun con una digestibilidad de proteínas afectada, los digeridos tendrán efecto contra la sarcopenia. / [CA] L'envelliment poblacional és un fenomen sense parangó en la història de la humanitat. Així, s'espera que les persones majors de 65 anys, o població sènior, dobleguen per primera a la població infantil en 2050. Complir anys implica una sèrie de canvis a nivell fisiològic que comprenen, entre altres, una pèrdua de funcionalitat dels òrgans implicats en el procés digestiu. En aquest sentit, l'estudi de la digestibilitat de nutrients, principalment proteïnes, i la bioaccesibilitat de determinades vitamines i minerals d'interès per a la salut de la població sènior, són d'especial interès. Només a partir d'evidències científiques serà útil establir recomanacions nutricionals d'àmbit clínic, i dissenyar aliments funcionals orientats a les necessitats específiques d'aquest grup poblacional. Entre els nutrients majoritàriament afectats per les alteracions digestives típiques de persones sènior, les proteïnes suposen el repte mes important. Se sap que les alteracions orals, gàstriques i intestinals afecten la seua digestió i absorció, contribuint al declivi de l'estat general de salut, donant lloc a una perduda de massa muscular, increment i canvi de distribució de massa lipídica, ossos i articulacions més febles, algunes malalties metabòliques i cardiovasculars, entre altres canvis de tipus psicològic i social. L'objectiu principal d'aquesta tesi doctoral ha sigut avaluar l'impacte de les diferents alteracions que apareixen amb l'edat a nivell oral, gàstric i intestinal en la digestibilitat de proteïnes, greixos i carbohidrats, així com en la bioccesbilitat de micronutrients d'interès, en aliments rics en proteïna el consum de la qual està recomanat per a majors de 65 anys, i que difereixen entre si en l'origen d'aquest macronutrient (peixos, lactis, ou, carn, llegums i cereals). Per a aconseguir aquest objectiu, es va recórrer a models digestió in vitro en estàtic els quals permeten simular, en condicions controlades de laboratori, el procés digestiu de diferents grups de població i mostrejar de forma no invasiva. Els resultats més rellevants d'aquesta tesi doctoral es presenten en cinc capítols, abordant en cada grup alimentós, la resposta digestiva derivada tant de les alteracions fisiològiques donats en població sènior, com d'uns certs factors inherents a l'aliment. Quant a les alteracions digestives pròpies de l'edat, és possible afirmar que les insuficiències pancreàtica i biliar van ser les principals encarregades de reduir de manera significativa l'extensió de la proteòlisien quasi la totalitat d'aliments estudiats. Els resultats indiquen una major digestibilitat proteica en peixos magres, l'ou dur i escalfat, formatges, carns de pollastre i de boví, així com llegums en general. La digestibilitat dels greixos, en canvi, no va resultar negativament afectada. D'altra banda, els formatges, sardina, així com alguns grans de llegums i cereals contribuirien satisfactòriament a l'aportació de calci bioaccesible en major mesura que altres matrius alimentàries. Quant a les vitamines liposolubles, la ingesta de salmó i de formatges van ser una excel·lent font tant de vitamina A com D3 en la seua forma bioabsorbible; mentre que la bioaccesibilitat de totes dues vitamines en ou, va dependre del mètode de cuinat. A més, la carn de porc brinda el major efecte antihipertensiu, mentre que la de polit exerceix major efecte com a antioxidant. Finalment, la relació aminoàcids essencials/ no essencials va augmentar en condicions alterades al final de la digestió, en comparació amb les condicions estàndard d'adult sa. Pel que, fins i tot amb una digestibilitat de proteïnes afectada, els digerits tindran efecte contra la sarcopènia. / [EN] Population aging is a phenomenon unparalleled in human history. It is expected that people over 65 years, or the elderly, will double the child population for the first time by 2050. Turning 65 implies a series of physiological changes that include, among others, a loss of functionality of the organs involved in the digestive process. In this sense, the study of the digestibility of nutrients, mainly proteins, and the bioaccessibility of certain vitamins and minerals of interest for the health of the senior population, are of special interest. Only on the basis of scientific evidence will it be useful to establish nutritional recommendations at the clinical level, and to design functional foods oriented to the specific needs of this population group. Among the nutrients most affected by the common digestive disorders of the elderly, proteins represent the most important challenge. It is known that oral, gastric and intestinal disorders affect their digestion and absorption, contributing to the decline of general health status, resulting in a loss of muscle mass, increase and change of lipid mass distribution, weaker bones and joints, some metabolic and cardiovascular diseases, among other psychological and social changes. The main objective of this doctoral thesis has been to assess the impact of the different alterations appearing with age at oral, gastric and intestinal level on the digestibility of proteins, fats and carbohydrates, as well as on the bioaccessibility of micronutrients of interest, in protein-rich foods whose consumption is recommended for people over 65 years of age, and which differ from each other in the origin of this macronutrient (fish, dairy products, eggs, meat, legumes and cereals). To achieve this objective, in vitro static digestion models were used to simulate, under controlled laboratory conditions, the digestive process of different population groups and to sample in a non-invasive way. The most relevant results of this doctoral thesis are presented in five chapters, addressing in each food group, the digestive response derived both from physiological alterations in the senior population, as well as from certain factors inherent to the food. Regarding the digestive alterations associated with age, it is possible to affirm that pancreatic and biliary insufficiencies were the main responsible for the significant reduction in the proteolysis extent in almost all the studied foods. The results indicate a higher protein digestibility in lean fish, hard-boiled and poached eggs, cheeses, chicken and beef meats, as well as legumes in general. Fat digestibility, on the other hand, was not compromised. Moreover, cheeses, sardines, as well as some legume and cereal grains would contribute to a greater supply of bioaccessible calcium than other food matrices. For fat-soluble vitamins, the intake of salmon and cheeses resulted as excellent sources of both vitamin A and D3 in their bioabsorbable form, while the bioaccessibility of both vitamins in eggs depended on the cooking method. In addition, pork provided the greatest antihypertensive effect, while turkey meat exerted the greatest effect as antioxidant. Finally, the essential/non-essential amino acid ratio increased under altered conditions at the end of digestion, compared to standard healthy adult conditions. Thus, even with impaired protein digestibility, digests will have an effect against sarcopenia. / Hernández Olivas, E. (2021). Age-related digestive alterations and their impact on nutrients digestibility [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/175472 / Compendio