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Xenodiagnóza infekcí Leishmania major u symptomatických a asymptomatických hlodavců. / Xenodiagnosis of Leishmania major infections in symptomatic and asymptomatic rodents.Vojtková, Barbora January 2016 (has links)
Leishmaniasis is a disease circulating in endemic areas between sand flies (Diptera: Phlebotominae) and reservoir hosts, which - in the case of Leishmania major - are principally rodents (Rodentia). Unlike in human patients, leishmaniasis is often asymptomatic in animal hosts. For transmission and maintenance of the parasite in nature, infectiousness of hosts for sand flies is essential; and the only method to directly test the infectiousness is xenodiagnosis. The main objective of this thesis is to establish a laboratory model for studying xenodiagnosis with L. major on inbred BALB/c mice and then to apply this model to potential reservoir ro- dents from the genus Mastomys. BALB/c mice were infected by intradermal inoculation of infective stages of L. major (iso- lated from sand fly guts) together with salivary gland homogenates from Phlebotomus duboscqi; infected mice were then exposed to P. duboscqi females for a period of ten weeks. Two inbred lines of BALB/c mice differed significantly in both the manifestation of the disease and infectiousness for sandflies. In BALB/c OlaHsdmice, great lesions were formed (up to 10 mm), mice were able to infect sand flies from the 2nd week after infection and their infec- tiousness reached up to 20.1% during the experiment. In BALB/c AnNCrl mice, only small...
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Epidémiologie et formes cliniques atypiques de la leishmaniose à Leishmania infantum. : Apport du génotypage parasitairePomares, Christelle 11 December 2012 (has links)
La leishmaniose à Leishmania infantum est une zoonose transmise de mammifère à mammifère par la piqûre d'un insecte vecteur, le phlébotome femelle. S'il est classiquement décrit la leishmaniose viscérale avec la triade classique fièvre, pâleur et splénomégalie, de nombreuses formes cliniques peuvent être associées à ce parasite. Le portage asymptomatique est la forme la plus fréquente et la plus répandue dans l'Ancien Monde ou le Nouveau Monde. Entre la leishmaniose viscérale et le portage asymptomatique, plusieurs formes cliniques sont présentes. Ainsi certains sujets vont exprimer la leishmaniose sous forme d'adénopathies isolées. Ces formes sont intermédiaires entre une expression pauci symptomatique et une leishmaniose viscérale larvée. Alors que L. infantum n'est pas classiquement retrouvé dans des formes muqueuses, des cas ont été récemment décrits. Ces formes muqueuses isolées ne sont pas rares puisque sur les 3 CHU Marseille, Montpellier et Nice, entre 1997 et 2009, 10 cas de leishmaniose muqueuse à L. infantum ont été diagnostiquées principalement chez des sujets immunodéprimés. Il est important de faire le diagnostic de ces formes cliniques particulières puisqu'elles ont pour diagnostic différentiel des néoplasies (lymphome pour la première et néoplasie de la sphère ORL pour la seconde). Afin d'appréhender le rôle du parasite dans l'expression clinique, il a été réalisé le typage par les microsatellites de neuf souches isolées de sujets porteurs asymptomatiques. Il s'avère que ces neuf souches sont très peu polymorphes et que sept d'entre elles possèdent un génotype unique. / Leishmaniasis due to Leishmania infantum is a zoonotic disease transmitted from mammal to mammal through the bite of an insect vector the sandfly female. Beside the classical triad of visceral leishmaniasis symptoms: fever, pallor and splenomegaly, many clinical forms could be associated with this parasite infection. Asymptomatic carriage of L. infantum is the most common and the most widespread in the Old World and New World. Many other clinical forms are present and some subjects will develop only isolated lymphadenopathy. These forms are intermediate between pauci symptomatic and visceral leishmaniasis forms. Whereas L. infantum is not typically associated with mucosal forms, several cases have been described. Indeed, in the 3 academic hospitals of Marseille, Montpellier and Nice from 1997 to 2009, 10 cases were revealed mainly in immunocompromised patients. To understand the role of parasite in clinical expression, nine strains isolated from asymptomatic carriers were genotyped using microsatellite. The nine strains have few polymorphisms and seven of them are identical with a unique genotype. In addition, those strains are very different from strains of HIV-positive subjects. If the strains genetic appears to have a role in the clinical expression of the disease, the environment in which individuals live in endemic areas is associated with an excess of risk to develop visceral leishmaniasis. While in Marseille, cases of visceral leishmaniasis occur in an urban environment, they take place in Nice in a rural environment, as it is classically described. To investigate differences between parasite strains form Nice and Marseille studies with microsatellites are ongoing.
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Análise in vitro do efeito da associação da pentamidina com verapamil, anfotericina B e miltefosina contra linhagens suscetíveis e resistentes de Leishmania (Leishmania) amazonensis / In vitro analysis of the effect of the combination of pentamidine with verapamil, amphotericin B and miltefosine against susceptible and resistant strains of Leishmania (Leishmania) amazonensisBrito, Mariane Pereira 12 February 2019 (has links)
A leishmaniose é uma protozoonose que apresenta diferentes manifestações clínicas, associadas a fatores relacionados ao parasita, a resposta imune do hospedeiro e epidemiologia da doença. Esses fatores podem influenciar no desfecho da doença e na efetividade da terapia antileishmania que até hoje se baseia no uso de fármacos de alto custo, alta toxicidade e que podem causar diversos efeitos colaterais. A pentamidina é um fármaco de segunda escolha no tratamento da leishmaniose utilizada em casos específicos de Leishmaniose Tegumentar nas regiões da América do Sul. Por causa dessas limitações, novos fármacos ou novos regimes terapêuticos vêm se mostrando cada vez mais necessários no tratamento contra as leishmanioses devido ao surgimento de falhas terapêutica e resistência aos fármacos existentes. Linhagens de L. amazonensis resistentes a PMD superexpressoras ou não do gene PRP1 tiveram o fenótipo de resistência revertido após a associação de pentamidina com verapamil. Deste modo, propomos verificar o efeito da associação de pentamidina com verapamil, anfotericina B e miltefosina contra parasitos de L. (L.) amazonensis suscetíveis (La M2269) e resistentes à pentamidina (La PRP1 e La PEN 0,5). O efeito das interações entre a pentamidina e os demais fármacos foi avaliado pelo método modificado de isobolograma e a natureza da interação foi classificada através da análise dos valores de Concentração Inibitória Fracionada (CIF). As associações de pentamidina com o verapamil, anfotericina B e miltefosina contra promastigotas de La M2269 foram classificadas como indiferente a partir da análise dos valores de CIF. Interações indiferentes também foram observadas contra promastigotas de La PRP1 e La PEN 0,5 quando tratadas com as mesmas associações. Macrófagos foram infectados com parasitos de La M2269 e tratados com diferentes concentrações de PMD. Nossos resultados sugerem que altas concentrações de PMD (17,5uM) foram tóxicas contra macrófagos e apresentaram baixa atividade quando utilizada contra amastigotas de La M2269 em até 72 horas de incubação. Observamos que ao prorrogar a incubação para 120 horas, concentrações inferiores a 1uM de PMD reduziram a taxa de infecção para aproximadamente 30%. Já ao analisarmos o efeito das combinações de pentamidina com o verapamil observamos baixa atividades desses fármacos quando combinado, indicando possivelmente uma interação indiferente/ antagônica. A associação de pentamidina com anfotericina B contra amastigotas de La M2269 foi avaliada pelo método de isobolograma e a natureza da interação foi classificada como indiferente por apresentar um valor de CIF = 0,65. / Leishmaniasis is a protozoan disease that presents different clinical manifestations, associated to factors related to the parasite, the host immune response and the epidemiology of the disease. These factors may influence the outcome of the disease and the effectiveness of antileishmania therapy, which is still based on the use of high-cost, high toxicity drugs that can cause several side effects. Pentamidine is a second-choice drug in the treatment of leishmaniasis used in specific cases of cutaneous leishmaniasis in the South American regions. Because of these limitations, new drugs or new therapeutic regimens are proving increasingly necessary in the treatment of leishmaniasis due to the emergence of therapeutic failures and resistance to existing drugs. L. (L.) amazonensis strains resistant to PMD overexpressors or not of the PRP1 gene had the resistance phenotype reverted after the association of pentamidine with verapamil. Thus, we propose to verify the effect of the association of pentamidine with verapamil, amphotericin B and miltefosine against parasites of L. (L.) amazonensis susceptible (La M2269) and resistant to pentamidine (La PRP1 and La PEN 0,5). The effect of the interactions between pentamidine and other drugs was evaluated by the modified isobologram method and the nature of the interaction was classified through the analysis of the Fractional Inhibitory Concentration (FIC) values. The associations of pentamidine with verapamil, amphotericin B and miltefosine against La M2269 promastigotes were classified as indifferent from the analysis of FIC values. Indifferent interactions were also observed against La PRP1 and La PEN 0.5 promastigotes when treated with the same associations. Macrophages were infected with parasites of La M2269 and treated with different concentrations of PMD. Our results suggest that high concentrations of PMD (17.5uM) were toxic against macrophages and showed low activity when used against La M2269 amastigotes within 72 hours of incubation. We observed that by extending the incubation to 120 hours, concentrations below 1uM PMD reduced the infection rate to approximately 30%. When analyzing the effect of the combinations of the pentamidine and the verapamil we observed low activities of these drugs when combined, possibly indicating an indifferent / antagonistic interaction. The association of pentamidine with amphotericin B against amastigotes of La M2269 was evaluated by the isobologram method and the nature of the interaction was classified as indifferent because it presented a FIC = 0.65.
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Estudo da presença e influência de antígenos parasitários na sorologia da Leishmaniose visceral / Study of the presence and influence of parasite antigens in the serology of visceral leishmaniasisCarvalho, Camila Aparecida de 31 May 2012 (has links)
A Leishmaniose visceral é uma doença parasitária crônica em homens e cães, causada por protozoários da espécie L. (Leishmania) chagasi. O diagnóstico parasitológico é confirmado pelo achado do agente em aspirados de medula óssea, linfonodo, baço e fígado, enquanto que a sorologia IgG especifica é usada em geral para estudos epidemiológicos, apesar dos altos níveis séricos de anticorpos IgG anti-Leishmania. Existem relatos anedóticos de resultados sorológicos negativos em doença ativa, atribuído à formação de imunocomplexos. Dado que imunocomplexos podem ser dissociados por tratamento ácido, nós buscamos a padronização de um teste simples de dissociação ácida dos imunocomplexos de amostras de soro, por tratamento ácido e neutralização em poços adsorvidos com antígenos de Leishmania, seguida de ELISA (ELISA dissociativo). A confirmação da presença de antígenos foi realizada pela detecção após adsorção ácida por DOT-ELISA, usando soro de coelho hiperimune anti-Leishmania. Amostras de hamsteres infectados experimentalmente com L. (L.) chagasi mostraram a presença e interferência de imunocomplexos na sorologia principalmente nas fases iniciais da infecção, por ELISA dissociativo e DOT-ELISA. Em amostras maiores de áreas endêmicas, o ELISA dissociativo aumentou a soropositividade em 10% em amostras de cães negativas e 3,5% de amostras humanas negativas, com confirmação por DOT-ELISA. Os resultados mostram que este teste poderia ser usado no diagnóstico da LV, como abordagem alternativa para a identificação sorológica de casos assintomáticos e para indicação de métodos parasitológicos invasivos confirmatórios. / Visceral leishmaniasis, caused by Leishmania (Leishmania) chagasi, is a chronic parasitic disease of humans and dogs. Confirmation of the protozoal agent in bone marrow, lymph node or spleen aspirate is diagnostic, while specific-IgG serology is used mainly for epidemiology despite the general presence of high levels of serum immunoglobulins. Anecdotal reports of false-negative serology in active disease cases are known and are ascribed to the formation of immune complexes. Because dissociation of immune complexes can be accomplished by acid treatment, we devised a simple, routine enzyme immunoassay (ELISA) for the dissociation of immune complexes in serum samples using acid treatment and neutralization in wells adsorbed with Leishmania antigen (dELISA). Confirmatory acid DOT-ELISA was also developed for antigen detection by anti-Leishmania rabbit antiserum. In experimental L. (L.) chagasi hamster models, immune complexes interfered with ELISA mostly in the early stages of infection, according to both dELISA and antigen DOT-ELISA results. In larger samples from endemic areas, dELISA increased seropositivity by 10% in negative dog samples (7/70) and 3.5% in negative human samples (3/85), showing that dELISA could be used in the serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Moreover, dELISA could be used as an alternative approach to screening asymptomatic visceral leishmaniasis patients, instead of invasive confirmatory testing.
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Avaliação da resposta imune celular desencadeada por antígenos protéicos isolados de Leishmania (Viannia) shawi / Analysis of cellular immune response induced by proteic antigens isolated from Leishmania (Viannia) shawiPassero, Luiz Felipe Domingues 09 June 2011 (has links)
A espécie Leishmania (Viannia) shawi foi caracterizada recentemente pelo grupo de Lainson. Estudos recentes indicam o importante papel médico epidemiológico deste parasito no Brasil. Portanto, os objetivos do presente estudo foram caracterizar o modelo experimental murino desta infecção, purificar antígenos protéicos e avaliar seus graus de proteção após desafio. Para caracterizar o modelo murino de infecção, camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 foram infectados na pata com formas promastigotas e os achados histopatológicos e imunológicos foram avaliados durante a evolução da infecção. Para os estudos de imunização foram utilizados 10 diferentes antígenos: três secretados/excretados pelas formas promastigotas de L. (V.) shawi, dois intracelulares solúveis das formas amastigotas (AgAma) e promastigotas (AgPro), e cinco frações protéicas purificadas a partir do antígeno intracelular solúvel das formas promastigotas. Estes antígenos foram utilizados para imunizar camundongos da linhagem BALB/c duas vezes, subcutaneamente no dorso. Após uma semana da última imunização, os animias foram desafiados com formas promastigotas. O desenvolvimento das lesões nos animais foram acompanhadas por seis ou oito semanas pós desafio (PD), quando os animais foram sacrificados para análise da carga parasitária e dos aspectos relacionados às respostas imune celular e humoral. Camundongos da linhagem BALB/c foram altamente susceptíveis à infecção, uma vez que as mudanças histopatológicas e da imunidade humoral foram mais pronunciadas nos camundongos BALB/c que em C57BL/6. Os antígenos secretados/excretados de baixa massa molecular induziram alta taxa de proteção em comparação aos animais não imunizados, já os antígenos secretados/excretados de média massa molecular protegeram intermediariamente os animais, possivelmente pela alta expressão de IFN-g e IL-4 nos linfócitos T CD8+. AgAma e AgPro tiveram uma resposta antagônica nos animais, pois o AgAma suprimiu a produção de IFN-g e IL-12, contudo houve maior produção de TGF-b, facilitando o aumento do parasitismo na pele e em linfonodos. A despeito da detecção de TGF-b nos animais imunizados com AgPro, houve um balanço entre a produção de citocinas, com a participação de IL-12 e IFN-g, que levou a um controle do parasitismo em pele. Através da purificação do AgPro foi visto que os antígenos F1 e F5 protegeram os animais da infecção na pele após desafio, e ainda F1 também protegeu os linfonodos destes animais. Os antígenos F3 e F4 levaram a exacerbação das lesões de pele. A identificação, por espectrometria de massa, do antígeno F1 revelou a presença de 67 componentes, sendo que a maioria deles não possui identificação. Ainda, o antígeno F1 protegeu duradouramente os animais associado à estimulação de linfócitos T CD8+ de memória, contudo a presença de baixos números de parasitos pode ser o reflexo da alta produção de IL-10. Estes dados indicam que o antígeno F1 pode representar um importante candidato vacinal contra a Leishmaniose Tegumentar Americana / Leishmania (Viannia) shawi specie was recently characterized by Lainson group. Currently, studies indicate important medical and epidemiological role of this parasite in Brazil. Therefore, the aims of this study were to characterize the experimental murine model of this infection, purify proteic antigens and evaluate their protection degrees after challenge. To characterize the murine model of infection, BALB/c and C57BL/6 mice were infected in the footpad with promastigote forms, and the histopathological and immunological findings were evaluated during the evolution of infection. For the immunization studies, 10 different antigens were used, as follow: three released/excreted by promastigote forms of L. (V.) shawi; two intracellular soluble antigens from amastigote (AgAma) and promastigote forms (AgPro), and 5 proteic fractions purified from soluble intracellular antigens from promastigote forms. These antigens have been used to immunize BALB/c mice twice, subcutaneously in the rump. After 1 week of last immunization, the animals were challenged. The lesion developments in animals were followed during either six or eight weeks post-challenge (PC), when the animals were sacrificed to evaluate the parasite load and aspects of cellular and humoral immune responses. BALB/c mice were the most susceptible to L. (V.) shawi infection, since the histopathological and humoral changes were higher in BALB/c than C57BL/6 mice. Secreted/excreted antigens of low molecular mass induced high protection rate compared to non-immunized mice, already mice immunized with secreted/released antigens of medium molecular mass showed mild protection, possibly caused by high expression of IFN-g and IL-4 by CD8+ T lymphocytes. AgAma and AgPro showed antagonic response in animals, since AgAma suppressed the IFN-g and IL-12 production, however high level of TGF-b has been detected, allowing the increasing of parasitism in the skin and lymph nodes. In spite of the detection of TGF-b in AgPro-immunized mice, there was a balance in the cytokines production, with the participation of IFN-g and IL-12, leading to parasite control in skin. Through the purification of AgPro, it was observed a protective effect of F1 and F5 antigens in the skin after challenge; in addition, F1 also protected the lymph nodes of BALB/c mice. Both F3 and F4 antigens exacerbated the skin infection. The identification, by mass spectrometry, revealed that F1 was composed by 67 components, and the majority has not been identified till now. Moreover, F1 induced long-lasting immunity in BALB/c mice, associated to generation of memory CD8+ T lymphocytes, however low parasitism could be the reflect of high production of IL-10. These data indicate which F1 antigen could be an important vaccine candidate against American Tegumentar Leishmaniasis
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Detecção de antígenos circulantes como abordagem diagnóstica em leishmaniose visceral. / Detection of circulating antigens as a diagnostic approach in visceral leishmaniasis.Carvalho, Camila Aparecida de 25 August 2017 (has links)
A leishmaniose visceral é uma doença parasitária caracterizada por altos níveis de anticorpos IgG, importantes para o diagnóstico da infecção, mas sem discriminar doença ativa. Sem papel efetivo durante a resposta imune, estes anticorpos participam na formação de imunocomplexos circulantes, indicando a presença de antígenos circulantes. Apesar da alta especificidade diagnóstica, a detecção de antígenos em soro é pouco explorada na leishmaniose visceral. A detecção de antígenos e imunocomplexos dependem tanto da especificidade de anticorpos como das características dos antígenos, que podem ser desde grandes proteínas ou pequenos polissacarídeos. Neste estudo, avaliamos a detecção de antígenos circulantes livres ou em imunocomplexos, e as características e especificidade antigênica de anticorpos IgG a proteínas ou carboidratos de L. (L) infantum chagasi em leishmaniose visceral experimental. Amostras de hamster com infecção experimental por L. (L.) infantum chagasi foram avaliadas aos 15, 30, 45, 60 e 90 dias de infecção. Altas concentrações de anticorpos IgG específicos foram detectadas em amostras com leishmaniose visceral experimental e natural, sempre com alta avidez, mesmo em períodos iniciais da infecção. A purificação por imunoafinidade de IgG de baixa avidez também confirmou esta alta concentração. Proteínas e carboidratos foram isolados do extrato antigênico total de promastigotas por cromatografia de exclusão molecular ou precipitação com etanol e marcadas com biotina para aminas ou açucares. Para uso em ELISA, carboidratos foram conjugados a BSA, o que permitiu a detecção de altos níveis de anticorpos IgG específicos para carboidratos. A presença de carboidratos antigênicos também foi demonstrada através da detecção de incremento de IgG em amostras com infecção experimental, o que confirmou a presença de imunocomplexos circulantes específicos a carboidratos. Nossos dados sugerem, que a participação da resposta imune humoral na leishmaniose visceral deve ter o envolvimento de carboidratos do parasita. O desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas para a detecção de carboidratos antigênicos pode permitir a identificação de imunocomplexos e antígenos circulantes na leishmaniose visceral. / Visceral leishmaniasis is a parasitic disease characterized by high levels of IgG antibodies, important for the diagnosis of the infection, but without discriminating active disease. Without effective role during the immune response, these antibodies participate in the formation of circulating immune complexes, indicating the presence of circulating antigens. Despite the high diagnostic specificity, the detection of antigens in serum is poorly explored in visceral leishmaniasis. The detection of antigens and immunocomplexes depend on both the specificity of antibodies and the characteristics of the antigens, which may be from large proteins or small polysaccharides. In this study, we evaluated the detection of free circulating antigens or immunocomplexes, the characteristics and antigenic specificity of IgG antibodies to proteins or carbohydrates of L. (l) infantum in experimental visceral leishmaniasis. Hamster samples with experimental infection by L. (L.) infantum chagasi was evaluated at 15, 30, 45, 60 and 90 days of infection. High concentrations of specific IgG antibodies were detected in samples with experimental and natural visceral leishmaniasis, always with high avidity, even in initial periods of infection. Immunoaffinity purification of low avidity IgG also confirmed this high concentration. Proteins and carbohydrates were isolated from the total antigenic extract of promastigotes by molecular exclusion chromatography or ethanol precipitation and labeled with biotin for amines or sugars. For use in ELISA, carbohydrates were conjugated to BSA, which allowed the detection of high levels of carbohydrate-specific IgG antibodies. The presence of antigenic carbohydrates was also demonstrated by the detection of IgG increase in samples with experimental infection, which confirmed the presence of circulating immunocomplexes specific to carbohydrates. Our data suggest that the involvement of the humoral immune response in visceral leishmaniasis should have the involvement of carbohydrates of the parasite. The development of new diagnostic tools for the detection of antigenic carbohydrates may allow the identification of immunocomplexes and circulating antigens in visceral leishmaniasis.
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Transmissão da leishmaniose tegumentar americana / Transmission of American cutaneous leishmaniasisGomes, Almerio de Castro 07 August 1975 (has links)
Tem-se atribuído ao flebotomíneo o papel de transmissor das leishmanioses. Com relação a leishmaniose tegumentar americana, 23 espécies parecem estar incriminadas na transmissão. Contudo, somente em Psychodopygus trapidoi, Ps.ylephiletor, Ps. intermedius, Ps. welcomei, Ps. flaviscutellatus, Ps. panamensis, Ps. olmecus, Lutzomyia gomezi e Pinzomyia pessoai, foi possível o isolamento da Leishmania. O caráter zoonótico desta doença denota uma situação ainda complexa devido aos escassos conhecimentos sobre os hospedeiros, vetores e epidemiologia das diversas Leishmania. A presente revisão confirma que esta função é desempenhada por dípteros da subfamília Phlebotominae. / The function of transmitting Leishmaniasis is generally attributed to phlebotomine sandfly. In relation to American Cutaneous Leishmaniasis, 23 species appears to be involved in the transmission process. However, Leishmania organisms could be isolated from only Psychodopygus trapidoi, Ps. ylephiletor, Ps. intermedius, Ps. welcomei, Ps. flaviscutellatus, Ps. panamensis, Ps. olmecus, Lutzomyia gomezi and Pintomyia pessoai. The zoonotic charater of this disease is yet a complex situation due to lack of adequate knowledge about host, vector and epidemiology of various Leishmania. The present revision confirms that the function is perfomed by diptera of sub-family, Phlebotominae.
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Análogos fluorescentes de agentes anti-parasitários: interações com agregados anfifílicos / Fluorescent analogues of antiparasitic agents: interactions with amphiphilic aggregatesBerardi, Marina 26 August 2010 (has links)
Esse trabalho é sobre a agregação da droga leishmanicida miltefosina e um análogo fluorescente e sua interação com vesículas fosfolipídicas. A leishmaniose é uma doença tropical causada por diferentes espécies do gênero Leishmania que atinge boa parte do mundo e, nas duas últimas décadas, sua manifestação visceral reapareceu de forma preocupante, uma vez que sua letalidade vem aumentando de forma gradativa. Vários medicamentos estão sendo testados, incluindo o análogo lipídico sintético hexadecilfosfocolina (miltefosina), que é um agente antitumoral e antileishmania administrado oralmente que age nas membranas celulares e pode induzir apoptose. O primeiro local de interação dos análogos de fosfolipídios é a membrana celular e eles apresentam atividade citotóxica não específica em concentrações acima da sua concentração micelar crítica, sendo importante o conhecimento de suas propriedades de agregação em meio aquoso e sua forma de interação com outros agregados presentes no meio. Além disso, derivados fluorescentes da miltefosina permitem o uso de técnicas de fluorescência para a caracterização de sua atividade leishmanicida. Neste trabalho examinamos propriedades de agregação da miltefosina (MT) e de seu análogo fluorescente MT-BODIPY em meio aquoso, utilizando técnicas baseadas em medidas de tensão superficial e de espectroscopia de fluorescência, tanto estática como com resolução temporal. Os resultados de cmc da miltefosina, a 25oC utilizando diferentes métodos, foram 60M em meio aquoso puro (água Milli-Q), 50M em tampão fosfato 10mM (pH 7,4), e 35M em tampão fosfato com NaCl 150mM. Através do estudo de vários parâmetros de fluorescência, verificamos que para a MT-BODIPY, um limite superior para sua cmc é de 10M. Utilizando a sonda fluorescente amino-hexadecil-benzamida (Ahba) estudamos a interação entre a miltefosina e vesículas fosfolipídicas de DMPC e DPPC, analisando os espectros de absorção e emissão fluorescente, a anisotropia estática e os decaimentos da intensidade fluorescente e da anisotropia. O conjunto de resultados mostrou que os efeitos do acréscimo de miltefosina às vesículas, no intervalo de razões molares entre 1:100 e 5:100, não são monitorados pela sonda Ahba, uma sonda localizada na região das cabeças polares. Por outro lado, a análise da fluorescência intrínseca da MT-BODIPY mostrou que seu acréscimo, no mesmo intervalo de razões molares, promove desorganização da bicamada lipídica. Como nesse caso o grupo fluorescente localiza-se no final da cadeia alifática, concluimos que os maiores efeitos da miltefosina sobre as bicamadas ocorrem na região interna das cadeias apolares. / This work is about the aggregation of the leishmanicidal drug miltefosine and a fluorescent analogue and their interaction with phospholipid vesicles. Leishmaniasis is a complex of tropical diseases caused by different species of the genus Leishmania which reaches almost the whole world, including Brazil, and, on the last decades, its visceral form reappeared with hundreds of million people at risk of infection, and the mortality rate increases every year. Several drugs have been used to treat the disease, and miltefosine, a synthetic phospholipid analogue, has been tested and it is already used in some countries. This drug has a confirmed antitumor and orally antileishmanial action on the cell membranes, which is the first local of interaction of a phospholipid analogue. The cytotoxic activity is not specific on concentrations above its critical micelle concentration (cmc), and the knowledge of the aggregation properties of the drug in aqueous medium becomes important, as well as its interaction with other aggregates presents in the environment. Fluorescent analogues of miltefosine allow the use of fluorescent techniques to characterize the antileishmanial activity of miltefosine. In this work we have investigated the aggregation properties of the drug miltefosine (MT), and the fluorescent analogue MT-BODIPY in aqueous medium, by using techniques of surface tension measurements and both, steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy. The values of miltefosine cmc at 25°C from different methods were about 60M in pure aqueous medium (Milli-Q water), 50M in phosphate buffer 10mM (pH 7,4), and 35M in phosphate buffer with the addition of NaCl 150mM. The fluorescent probe amino-hexadecyl-benzamide (Ahba) was used to study the interaction of miltefosine with phospholipid vesicles of DMPC and DPPC, from absorption and fluorescent emission spectra, steady-state anisotropy and fluorescence and anisotropy decays. The results have shown that the effects of miltefosine addition in the vesicles, with molar ratios between 1:100 and 5:100, are not monittored by the probe Ahba, which is located on the polar head groups region on the bilayer. On the other hand, analysing the intrinsic fluorescence of the analogue MT-BODIPY, we concluded that when the molecule is added, in the same molar ratio intervals, there is a disorder in the lipidic bilayer. The fluorescent group BODIPY is located on the aliphatic chain of MT, therefore, the more accentuated effects of miltefosine in the bilayers occur in the region of the apolar tails.
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Sistema nanoestruturado polimérico contendo hidroximetilnitrofural: preparação, caracterização físico-química e avaliação in vitro da atividade leishmanicida potencial / Nanostructured polymeric system containing hidroxymethylnitrofurazone: preparation, physicochemical characterization and in vitro evaluation of potential leishmanicidal activity.Monteiro, Lis Marie 02 April 2013 (has links)
Na última década o emprego de nanotecnologia tem crescido exponencialmente em função das suas evidentes vantagens: maior eficácia terapêutica, menor toxicidade e liberação modificada do fármaco. Tais características permitem elevar os níveis do fármaco no compartimento intracelular, além de possibilitar sua liberação modificada no sítio específico. Essas vantagens vem ao encontro da otimização do tratamento da leishmaniose devido à falta de medicamentos seguros e de adequada atividade farmacológica. O objetivo do presente projeto constituiu-se na preparação e na avaliação das características físico-químicas da nanopartícula polimérica associada ao novo fármaco hidroximetilnitrofural (NFOH), desenvolvimento e validação do método analítico para a determinação da eficiência de encapsulação, avaliação a atividade leishmanicida in vitro em promastigotas, em macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis e citotoxicidade do NFOH livre e nanoestruturado. As nanopartículas poliméricas de poli (butil cianoacrilato) (PBCA) obtidas apresentaram potencial zeta de -10,1 mV, tamanho médio de 151,5 nm, polidispersividade de 0,104 e distribuição unimodal muito próximos ao encontrado na literatura. O método analítico validado apresentou especificidade, linearidade, precisão, exatidão e robustez, mostrando-se adequado para a quantificação do NFOH em nanopartículas, o resultado final da eficiência de encapsulação foi de 64,5%. Os testes realizados em promastigotas e macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis revelaram a maior atividade do fármaco nanoestruturado em relação ao fármaco livre e ao placebo. Os ensaios de citotoxicidade comprovaram que o fármaco, sistema nanoestruturado contendo NFOH e placebo apresentam baixa toxicidade. Logo, as nanopartículas obtidas contendo NFOH são uma alternativa promissora para o tratamento da leishmaniose. / In the last decade the use of nanotechnology has grown exponentially as a function of its obvious advantages: high therapeutic efficacy, lower toxicity and modified release of the drug. This feature allows raising the levels of the drug in the intracellular compartment, and enables the modified release of the drug in its specific site. These advantages come to meet the optimization of the treatment of leishmaniasis due to lack of drugs that are safe and appropriate pharmacological activity. The goal of this project consisted in the preparation and evaluation of physical and chemical characteristics of polymeric nanoparticle associated with new drug hidroxymethylnitrofurazone (NFOH), development and validation of analytical method for the determination of encapsulation efficiency, evaluating the leishmanicidal activity in vitro in promastigotes and in macrophages infected with amastigotes of L. amazonensis and finally cytotoxicity of free and nanostructured NFOH. The polymeric nanoparticles of poly(butyl cyanoacrylate) (PBCA) obtained showed zeta potential of -10.1 mV, average size of 151.1 nm, polydispersity of 0.104 and unimodal distribution very similar to that found in the literature. The validated method showed specificity, linearity, precision, accuracy and robustness, making it adequate for the quantification of NFOH nanoparticles, the final outcome of the encapsulation efficiency was 64.5%. Tests conducted on promastigotes and macrophages infected with amastigotes of L. amazonensis revealed the highest activity of nanostructured drug compared to free drug and placebo. The cytotoxicity assays showed that the NFOH, nanostructured system containing NFOH and placebo had low toxicity. Thus, the obtained nanoparticles containing NFOH are a promising alternative for the treatment of leishmaniasis.
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Isolamento, caracterização e atividade anti-leishmania chagasi e anti-trypanosoma cruzi de compostos bioativos de venenos de anfíbios brasileiros / Isolation, characterization, antileishmanial and antitrypanosomal activity of bioactive compounds from brazilian amphibian poisonsPinto, Erika Gracielle 29 February 2012 (has links)
Dentre as doenças parasitárias tropicais, as causadas por protozoários se apresentam como um grande desafio para a saúde pública, sendo representadas pela leishmaniose e doença de Chagas. Afetam grandes populações marginais ao processo econômico globalizado, e desta forma, não são vistas como mercados potenciais. O presente projeto visou o isolamento de novos compostos naturais de venenos animais com atividade anti-Leishmania e anti-T. cruzi. O presente estudo fracionou por diferentes técnicas cromatográficas, os venenos dos anfíbios Siphonops annulatus, Corythomantis greeningi, Aparasphenodon brunoi e Phyllomedusa hypochondrialis, visando o isolamento de peptídeos e metabólitos secundários através de ensaios biomonitorados. Utilizando-se a espectrometria de massas e seqüenciamento por degradação química de Edman, foi possível a caracterização bioquímica de cinco peptídeos ativos da secreção de Phyllomedusa hypochondrialis, sendo estes a bradicinina, as dermaseptinas 1 e 4 e as filoseptinas 7 e 8. Os peptídeos apresentaram uma Concentração Efetiva 50% (CE50) variando entre 0,7 a 20 ?g/mL em L. (L.) infantum chagasi e T. cruzi, com baixa ou nenhuma citotoxicidade para células de mamíferos nas concentrações testadas. Além disso, a separação química da secreção do anfíbio Siphonops annulatus forneceu uma fração altamente ativa em promastigotas de L. (L.) infantum chagasi, com CE50 0,065 ?g/mL, porém com toxicidade bastante elevada para macrófagos peritoneais e nenhuma seletividade nas formas intracelulares. Estudos ultraestruturais de Leishmania demonstraram severos danos mitocondriais, além da formação de grande vacúolos citoplasmáticos, levando o parasita a morte em poucas horas. O presente estudo demonstrou o potencial de peptídeos e metabólitos secundários de venenos de anfíbios, que se adequadamente estudados, poderão contribuir como novos protótipos de fármacos para a doenças negligenciadas. / Among the tropical parasitic diseases, those caused by protozoa present a major challenge to public health, being represented by leishmaniasis and Chagas disease. Affect large populations marginal to the global economic process, and thus are not seen as potential markets. This project aimed the isolation of new natural compounds in animal venoms with anti-Leishmania activity and anti-T. cruzi. The present study fractionated by different chromatographic techniques, the poisons of the amphibians Siphonops annulatus, Corythomantis greeningi, Aparasphenodon brunoi and Phyllomedusa hypochondrialis, aiming the isolation of peptides and secondary metabolites through bioguided assays. By using mass spectrometry and sequencing by Edman degradation, it was possible to do the biochemical characterization of five active peptides from the poison of Phyllomedusa hypochondrialis, as bradykinin, dermaseptins 1 and 4 and phylloseptins 7 and 8. The peptides showed a 50% Effective Concentration (EC50) ranging from 0.7 to 20 ?g/mL in L. (L.) infantum chagasi and T. cruzi, with little or no cytotoxicity to mammalian cells at the tested concentrations. In addition, the chemical separation of the poison of the amphibian Siphonops annulatus provided a highly active fraction against promastigotes of L. (L.) infantum chagasi, with an EC50 of 0.065 ?g/mL, but highly toxicity to peritoneal macrophages and without selectivity against the intracellular forms of Leishmania. Ultrastructural studies of Leishmania showed severe mitochondrial damages and the formation of large cytoplasmic vacuoles, leading to parasite death within few hours. The present study demonstrated the potential of peptides and secondary metabolites of amphibian poisons, and if adequately studied, may contribute as prototypes of new drugs for neglected diseases.
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